JP2014501932A

JP2014501932A - 診断方法

Info

Publication number: JP2014501932A
Application number: JP2013548490A
Authority: JP
Inventors: コプニツキー、マーク
Original assignee: ゼウスサイエンティフィック、インク．
Priority date: 2011-01-05
Filing date: 2012-01-04
Publication date: 2014-01-23
Also published as: AU2012204413A1; CN103460043A; EP2661625A4; CA2860690A1; WO2012094427A1; EP2661625A1

Abstract

【解決手段】本発明は主に従来のＦＡＮＡスライド試験と関連した特徴を結合する新規な方法を提供する、そして、医師および方法の他のユーザに以前は未知の効果（例えば、例えば、自己免疫不全の診断および評価に役立つ使いやすさおよび強化された分析速度）を提供するために、各分析に対する最小の変更態様で、単一の分析への主に従来の多重配列分析のそれらは実質的に同時に実行した。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
この用途は非暫定的なアプリケーションである。そして、それは本願明細書において参照および請求項によって米Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ出願番号第６１／４２９，８９２号および米Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ出願番号第６１／５２４，６３０号の優先権を組み込む。

発明の背景
技術分野
通常、本発明は診断検査法システムの分野に関して、自己免疫不全を診断して、評価することに役立つ特に、そして、より詳しくは、本発明は自己抗体診断検査法を実行する新規な方法に関する。

抗体は、侵入しているか伝染性の材料に反応して本体によってできるタンパク質である。それらは、本体が疾患を予防するために備えている多くの手段のうちの１つを構成する。通常の状況において、「外国の」本体は誓約書を出すことができるから、「自己は、本体とは「合わない」それらの材料に対する抗体を織り上げて、したがって生成するだけである。

本体がそれ自身の組織に対する抗体を生産し始めるときに、自己免疫は発達する。
自己免疫不全の多数の種類が、ある；少し全身その他、特定の器官である。これらの疾患を始める正確な機構は、完全には理解されない。他が全く厳しくありえるおよび致命的でさえありえる間、いくつかは最小の寛容な衝撃で容易に扱われることができる。

自己免疫不全の発症に伴う症状は、変化に富むことがありえる。また、初期の症状のいずれか、多くの他の疾患のそれらに擬態することができる。概して、患者が自己免疫不全で遠隔で示唆的な症状をもつ医師を訪ねる場合、医師が通常それを提案して、反対者―核抗体、（ＡＮＡ）試験は、実行される。ＡＮＡ試験は、誰かが自己組織に対する抗体を有するかどうか見る良好な「第１の円」スクリーニングテストである。ＡＮＡＳｃｒｅｅｎ試験の多くの異なる説明が、ある。方法論は、西の汚点から精巧な微粒子配列までの範囲である。しかしながら、最も人気のあるものは、多分蛍光反対者であるだろう―核抗体分析（ＦＡＮＡ）。

今日では、市販のＦＡＮＡ試験で最も人気のあるものは、いわゆるＨＥｐ―２ＦＡＮＡ試験である。ＨＥｐ―２は、急速に成長して、直ちに固体の表面（例えば組織培養フラスコおよびガラススライド）に付属する、連続、人間の上皮細胞系である。ＨＥｐ―２細胞も、大きな、明確な核を有する。ＨＥｐ―２ＦＡＮＡ試験は、ガラススライド上のＨＥｐ―２細胞を発達させて、永久に細胞をスライドの表面に取り付けることによってなされる。分析は、患者からの血清サンプルが細胞に反応することができることによって実行される。抗核抗体がある場合、それらは細胞と結合する。スライドは洗われる、そして、抗体は蛍光タグについてのラベルがついている反対者―ヒトＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（Ｉｇ）についてのラベルがついている。適切に備えられた顕微鏡を使用して見られるときに、反応性のパターンがそうである特性はいずれが特異性自己免疫不全を伴うかについて注意して見た。これらのパターンの実施例は、図面の図１に示される。

自己抗原（ＡＮＡ試験において使用する）は、全て以外のでない、周知の自己抗原の大多数がＨＥｐ―２細胞に表されることを表す。ＨＥｐ―２細胞で見つかる若干の自己抗原は、複合サスペンションに存在しない。従って、多重ビード方法（例えばＡｔｈｅＮＡＭｕｌｔｉ―ライトＡＮＡＴｅｓｔシステム）（ゼウスＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から市販されている、ブリッジウォーター（ＮＪ）は）ＬｕｍｉｎｅｘｘＭＡＰＲプラットフォームの上に築き上げられるビード混合物を含む非常に精製された自己抗原混合だけを使用することは、多重分析として別々の微小球体および実行上へ接合した（Ｌｕｍｉｎｅｘ社、オースティン、ＴＸから市販されている）。このシステムは、全て以外のでない、ＨＥｐ―２細胞で見つかる自己抗原のほとんどを有する。この理由のために、患者試料が実質的に同時に（すべての周知のおよびこれまでに未知の自己抗原）すべての潜在的自己抗原を見つけるため検査されることを確実にするために多重ビード混合物に加えて実際のＨＥｐ―２細胞を含むことは、望ましい。しかしながら、この種の高度なＡＮＡ試験が通常、ＨＥｐ２細胞を使用している従来のＦＡＮＡより特有である間、それらが感知されることができて、ある―それらが限られたおよび有限数の抗原を組み込んだ時から、影響される。集合的に、これらの自己抗原は、大多数の周知の自己抗原がＨＥｐ―２細胞において表されることを表す；しかしながら、天然ＨＥｐ２細胞は、理論的に、生体内でたぶん存在することができるいずれでもおよびすべての自己抗原を供給する。

ＨＥｐ―２ＦＡＮＡ方法が参照方法になると共に、上述したＡｔｈｅＮＡＭｕｌｔｉ―ライトＡＮＡＴｅｓｔシステムは実質的に等価な結果を提供する、そして、ＡＮＡマルチプレックス配列が十分であるのを感じるものがある、そして、ＨＥｐ２細胞だけがＡＮＡのふるい分けにおいて充分であるのを感じるものがある。しかしながら、それは、通常、受け入れられるふるい分け方法の後に、複合配列から特定のデータを提供することが極度の値の中であることについて同意する。

以前公知の従来の方法論とは対照的に、主に従来のＦＡＮＡスライド試験と関連した特徴を結合する新規な方法を提供することは本発明の目的である、そして、医師および方法の他のユーザに以前は未知の効果（例えば、例えば、自己免疫不全の診断および評価に役立つ使いやすさおよび強化された分析速度）を提供するために、各分析に対する最小の変更態様で、単一の分析への主に従来の多重配列分析のそれらは実質的に同時に実行した。本発明は、加えて、記載されている方法に勝る新しいおよび予想外の利点を提供して、発表されたインターナショナル出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５６３０７において、主張した、これと共に共通に割り当てる、そして、いずれが完全に本願明細書に引用したものとするかという開示。上記において開示されて、請求される本発明とは対照的に―インターナショナル・アプリケーションで示されて、その中で記載されているにつれて、本発明が複合ビードを使用する必要性または計装のない実質的に類似の目的および結果を成し遂げるとわかった、例えば印刷することによって、ガラススライドまたは他の固相に取り付けられる細胞に近接して抗原点の配列を使用することによって、したがって、それが複合ビード配列または計装（例えば前記アプリケーションで関連されるＬｕｎｉｎｅｘ計測器）の関係を必要としないという点で、本発明は予想外に有利である。

このように、上記で示される技術で開示される技術を改善することは本発明の目的である、そして、上述したＰＣＴ出願において開示される本発明に、新規な方法で組み合わさることによって、各々に対する最小の変更態様で、上述した従来のＦＡＮＡは試験および複合配列を単一の分析に摺動させる。これまで周知のように、これらの２つのあまり異なるイムノアッセイを単一の免疫測定法に結合することは、まだ試みられなかった。

本発明によれば、これらの効果は、イムノアッセイのこれらの２つのタイプの実質的に同時のパフォーマンスの組合せから、予想外に達成される。

図１は、陽ＡＮＡ反応の実施例を示す；反応性の特定パターンは、ＨＥｐ―２ＦＡＮＡ（従来の摺動方法を使用して実行される）を使用して示される。図２は、本発明の方法を利用している細胞のための二重まだらのスライド配列を示す。図３はスライドを示す、そして、可撓性格子は本発明の方法を実行するためのウェルを形成したものである。図４は本発明の方法を実行することに役立つスライド上のウェルの形成を示す。その結果、各々はよく２つの領域を含む；細胞をもつものおよび定義済み抗原配列をもつもの。

上記のように、自己免疫不全の発症に伴う症状は、全く変化に富むことがありえる。
また、初期の症状のいずれか、多くの他の疾患のそれらに擬態することができる。ＡＮＡスクリーニングテストは、患者が自己組織に対する抗体を有するかどうか見る良好な「第１の円」スクリーニングテストと、広く認められる、蛍光抗核抗体分析（ＦＡＮＡ）およびＦＡＮＡで現在最も普及しているものであることがテストする現在最も普及している、ＨＥｐ―２ＦＡＮＡ．である分析は、寛容な血清が細胞に反応することができることによって実行される。抗核抗体がある場合、それらは細胞と結合する。寛容な抗体は、それから、蛍光部分についてのラベルがついている反対者―ヒトＩｇを付け加えられる。適切に備えられた顕微鏡を使用して見られるときに、反応性の特定パターンは観察される（ある場合）そして、いくつかは特異性自己免疫不全と非常に関係していた。若干の陽反応の実施例は、図面の図１に現れる。

したがって、各々に対する最小の変更態様で、本発明は、好ましい実施例において、周知のＦＡＮＡスライド試験および複合配列を単一の分析に結合することによって、主題から新規な方法を単一のサンプルの自己抗原の実質的に同時分析に提供する。ＨＥｐ―２ＦＡＮＡ試験には、ガラススライドの表面上のＴＣメディアで成長することができたＨＥｐ―２細胞を使用しているスライド試験が具備されている。スライドはそれからすすがれる、そして、このように、細胞は従来の有機溶剤によって固定した膜をｐｅｒｍｅａｂａｌｉｚｉｎｇして、細胞を保つことは、ガラススライドに付着した。この分析は、例えば、顕微鏡スライドの小さいウェルにおいて実行されることができる。

定義：
１．複合配列プラットフォーム：本願明細書において使われるように、複合配列プラットフォームは同時に複数の分析物に対する検査に１つを可能にするいかなるプラットフォームでもある。一般の配列システムは、固体支持体（例えばガラスまたはプラスチック）上の正確な場所のターゲット分子を汚すことが必要である。広く使われている複合配列プラットフォームの普及している実施例は、開発されて、ＬｕｍｉｎｅｘＲｘＭＡＰＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社、オースティン、ＴＸ）に基づいて市販のシステムである。他の配列は点、ウェル、ポスト、ビード、カンチレバー、導線、電極またはファイバー・オプティックスによって製造されることは公知である（ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙを参照；５６：１２（２０１０））．
２．リポーター分子：本明細書で用いられるリポーター分子が分析の検出分子（ｓ）に縛られている蛍光であるか、視覚であるか、化学発光タグであることを意味する。ヒト抗体を測定するように設計されたイムノアッセイの場合、検出分子は、フィコエリトリン（例えば）についてのラベルがついているヤギ反人間ＩｇＧ（例えば）でもよい。

３．移動電話基板：本明細書で用いられるそれが一般にそうであるいかなる細胞材料もまたは薄紙基板が固体支持体（ガラスであるかプラスチック顕微鏡スライド）に付着して、そうすると、例えば生体分子の分析の生化学検査法の一部として抗体または抗原を使用したことを意味する。

組合せ分析備えられるにつれて、本発明が従って、実行されることができて、例えば実施例（従来のＬｕｍｉｎｅｘｘＭＡＰ計測器）間のｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｉｏｎ、それは、基本的に、多重ビード分析のＬｕｍｉｎｅｘポリスチレン微小球体の使用のために修正された流動血球計算器である。本発明は、従って、すっかり非常に有利である、単純性および高価な計装の必要の不足の態様において、当業者にとって明らかである他の効果の中の類似の分析を実行すること用の技術の方法を公知である。

好ましい実施例において、本発明の場合配列は、分析する関心の中である細胞基板を含んでいる細胞に近接してガラススライド上へ汚された一連の精製された抗原から成る。配列は、問題の分析の性質に応じて、要求されるのと同程度単純でありえるか、同程度複雑でありえる。ＡＮＡ実施例のために、最低１０の非常に精製された自己抗原および好ましくは最高２０〜２５の非常に精製された自己抗原が用いられることは、目下のところ好ましい。

例えば、本発明の方法の実行は、概してガラススライドから開始される。好ましくは、「ウェル」（図面の図２を見る）につき２つの「領域」を有するガラススライドが、用いられる。興味がある細胞は、適用されるエヌであって、このことにより細胞基板をつくっていて、図２に示される画像の円形ウェルに取り付けられる。それから、精製された抗原は、図２に示される正方形のウェルの配列として、基板に近接して汚される。ユーザのニーズに従う患者標本の更なる分析のために、このスライドは、その後で、包装されて、分析システムのユーザに与えた。分析のために、ウェルが患者標本ごとに形成されるように、スライドはユーザによって必要に応じて修正されることができる。例えば、ウェルは構成されることができる。その結果、各々はよく１つの円（ＨＥｐ２細胞）および１つの正方形（精製された抗原配列）を含む。図３および図面のうちの４つは、これらのウェルの形成を表す。このスライドは、それから、実質的にすべて当業者に周知の適切なリポーター分子を使用して同時に、細胞および抗原配列の組合せに反応性のための患者標本（例えば血清、尿、プラズマ、その他）を評価して、新規な方法を、それによって与えることで、固定された細胞または組織（非常に特定の、非常に精製された生体分子の配列と同様に）の範囲内で天然に存在する生体分子に反応性の組合せを集めるために用いることができる。

本発明の好ましい実施態様において、ＨＥｐ―２ＦＡＮＡ試験は、ガラススライドの表面上のＴＣメディアで成長することができたＨＥｐ―２細胞を使用しているスライド試験から成る。それらは、すすがれて、若干の有機溶剤を据えられる、どのｐｅｒｍｅａｂａｌｉｚｅｓ膜、そして、支持してそれらを保つガラススライド。この分析は、従来は、顕微鏡スライドの小さいウェルにおいて実行された。しかしながら、配列（この場合本発明によって）は、すべて実質的に同時に細胞および抗原配列の組合せに反応性のためのガラススライド上へ汚された一連の精製された抗原である。

加えて、上記例が可能な自己免疫不全患者の自己抗体を測定することに集中すると共に、ほんの少し例を挙げれば、本発明が自己免疫、伝染性疾患、癌診断法、細胞学的研究を含む無数の他の実施例に適用されることができると認められる。
他の実施例は、当業者にとって明らかである。

上記の通りの血清サンプルの分析に加えて、本発明の方法および教示が主題から得られることができるいかなる生物流体の分析にも適用されることができるとも認められる；
例えば、血液、尿、脳髄液およびプラズマの全ては、当業者に周知であるのと同程度よく他の生物流体として、本発明の分析の方法を実行するサンプルを得ることに適していることがありえる。

更に、それは感謝された非常に多くの付加的な修正変更であることである、それは明らかで、本願明細書において開示からみて当業者によって認めた、本願明細書において記載されているものとしての本発明およびこの種の変更態様が完全に本発明の範囲内であるその全部の特定実施例においてなされることができる、それは本願明細書に追加される請求項だけによって制限されることを目的とする。

Claims

生物学的サンプル（方法が単一の分析システムを生じるためにＦＡＮＡスライド試験分析および多重配列分析を結合して含む）上の診断検査法を実行する方法。
請求項１（分析が自己抗体イムノアッセイから成る）の方法。
請求項１（分析がガラススライドまたは他の固相に取り付けられる細胞に近接して抗原点の配列から成る）の方法。
請求項１（抗原点が印刷することによって適用される）の方法。
請求項１（分析が実質的に同時に実行される）の方法。
請求項１（分析システムがスライドを含む、そして、可撓性格子がウェルを形成したものである）の方法。
請求項６（ウェルが各々２つの領域、細胞を有する１および定義済み抗原配列を有する１を含む）の方法。
請求項１（少なくとも１０の非常に精製された自己抗原が分析システムで用いられる）の方法。
請求項１（分析システムが自己免疫不全、伝染病または癌診断法からなる群から選択される状況の診断および評価に役立つ）の、または、細胞学的研究のための方法。
他の生物流体と同様に請求項１（サンプルが血清、血液、尿、脳髄液またはプラズマからなる群から選択される）の方法。