CN101017168B - 荧光胶乳定量层析试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速、简便、操作方便的又可利用荧光定量光谱仪实现检测量的化荧光胶乳定量层析诊断试纸条及其制备方法，该试纸条包括在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸，包被膜上设有包被抗体或抗原的检测区和包被有抗鼠抗体控制区，所述玻璃纤维膜涂覆有荧光胶乳微粒标记蛋白。该荧光胶乳定量层析诊断试纸条的制备方法包括荧光胶乳的共价活化；荧光胶乳微粒标记蛋白的制备；抗体或抗原包被到硝酸纤维素膜上及其封闭；在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆荧光胶乳微粒标记蛋白的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸，得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。

Description

荧光胶乳定量层析试纸条及其制备方法

技术领域

本发明属于医学检验领域，涉及一种荧光胶乳定量层析诊断试纸条和其制备方法。

背景技术

在免疫检测中，国内外主要采用放射性免疫、酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金标记等方法实现检测的定量或者定性。这些方法都存在不同程度的缺陷。以目前广泛采用的免疫胶体金层析法试纸条为例，存在以下不足之处：

(1)胶体金是一种纳米颗粒，制备胶体金纳米颗粒较难，且颗粒直径较难控制均匀。

(2)胶体金标记过程中用到强还原剂，同时要接触重金属者离子，对人体健康和安全有一定影响。

(3)胶体金标记过程是物理吸附过程，故液相时稳定性较差。

(4)显色后只能是单一颜色——紫红色，不能根据不同的品种或不同要求变化颜色。

(5)不能实现准确的定量检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种荧光胶乳定量层析试体条。

本发明所述的荧光胶乳定量层析试条，该试纸条为底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆有荧光胶乳微粒标记蛋白玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸，包被膜上设有检测区和控制区，检测区包被抗体或/和抗原，所述控制区包被抗鼠抗体。

优选地，所述玻璃纤维膜上涂覆的荧光胶乳微粒的直径范围为0.1μm～1μm。

所述荧光胶乳微球，可以发射的波长范围是180nm～800nm。荧光胶乳微球含有荧光素，在基态下是稳定的，在激发光源的作用下能够发射不同波长范围的荧光。

优选地，所述玻璃纤维膜涂覆的荧光胶乳微粒标记蛋白为荧光胶乳微粒标记乙肝表面抗原单克隆抗体，包被膜上检测区的包被抗体为乙肝表面抗原单克隆抗体；

优选地，所述荧光胶乳微粒标记蛋白为荧光胶乳微粒标记HIVgp36，gp41和gp120基因工程重组抗原中的一种或多种，包被膜上设有的包被抗原为HIVgp36，gp41和gp120基因工程重组抗原一种或多种。

本发明的另一目的在于提供一种荧光胶乳定量层析试条的制备方法。

本发明所述的荧光胶乳定量层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

A.荧光胶乳的共价活化：超声波处理胶乳微球体30秒后，调节胶乳微球体浓度为1.0×10¹²～1.0×10¹³/ml，10000～15000×g离心5～15分钟，离心后收集沉淀物用蒸馏水或者50mM～200Mm pH6.0～7.0磷酸钠溶液溶解，并超声波200W处理30秒；先加入10～100ul的20～100mg/mlEDC(碳二亚胺)，漩涡振荡(Votex)混匀，再加10～100ul的20～100mg/ml(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)Sulfo-NHS，Votex混匀；室温孵育20—40分钟后10000～15000×g、离心5～15分钟，沉淀用20mM～100mM pH5.0～6.0的柠檬酸缓冲液溶解，放置2～8℃备标记蛋白质之用；

B.荧光胶乳微粒标记蛋白的制备：将上述活化后的荧光胶乳超声波200W处理30秒后，按照1ug～125ug蛋白/100ul荧光胶乳的比例加入需标记的蛋白质，Votex混匀后室温搅拌反应1.5-3小时，2—4次离心洗涤，每次10000～15000×g、离心5～15分钟，沉淀用PBS-TBN溶解并超声波100W处理30秒，用PBS-TBN(磷酸盐缓冲液PB，含氯化钠NaCl，吐温Tween-20，牛血清白蛋白BSA，叠氮钠NaN₃)恢复离心前的体积，放置室温，按照现有技术中的方法以备涂覆玻璃纤维膜之用；

C.抗体或抗原包被到包被膜(包被膜可为聚砜膜或硝基膜等)上及其封闭：分别将抗原或/和抗体和鼠抗lgG调节1.0～3.0mg/ml的浓度，膜液量为20ul/27-35cm，用包被缓冲液稀释包被抗原或/和抗体，浓度为0.1～3.0mg/ml，将抗原或/和抗体及鼠抗lgG喷到包被膜上，两区间隔3—8mm，室温凉干10—30分钟；25℃～37℃在封闭液浸泡50—70分钟，取出后置25℃～37℃烘干处理1—3小时，封袋，以备试纸板贴板之用；

D.在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆荧光胶乳微粒标记蛋白的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸，得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。

本发明的荧光胶乳定量层析试条检测原理是将不同直径范围0.01μm～1μm的荧光胶乳微球与含有羧基、氨基、羟基等酯类或其他生物大分子物质如抗原或/和抗体共价结合，当此荧光胶乳标记的蛋白质(抗原/抗体)与检测样本中足够的相应抗体/抗原结合后形成的复合物，被膜上包被的抗原/抗体捕获，荧光胶乳标物在相应的配体处于大量聚积时，受到激发光源的刺激，形成荧光检测仪器可捕捉的各种波长范围的荧光，通过荧光检测仪将捕捉的荧光信号转化为数字信号，从而可用于准确定量的快速免疫检测中。

本发明所述的荧光胶乳定量层析试条与放射性免疫、酶联免疫法相比，具有操作安全(无放射物污染)、简便(简单操作一步完成)、适合单人/份检测(放免、酶免不适合单人/份或少量样品检测)和快速(10分钟左右即可有结果)等优点；与免疫胶体金标记试纸条相比，本发明具有蛋白质标记过程不需接触重金属离子、而且颜色多样可变(不同波段的荧光胶乳其显示的颜色不同，可实现多指标同步定量检测)、实现精确定量等优点。

本发明所述的荧光胶乳定量层析试条可以使用双抗体夹心法、双抗原夹心法等检测方法的试纸条，应用范围广，能够用于单项检测或者一检多项的快速检测试纸条，能够检测全血、血清、血浆、唾液、尿液、食品等样本；能够用于妊娠检测、疾病诊断、细菌检出等目的蛋白的检测，并能发挥胶乳标记层析检测技术快速、简便、操作方便的优点，避免现有检测技术的缺点和不足，同时，又利用荧光定量光谱仪实现检测的量化。

附图说明

图1是的荧光胶乳定量层析试条的结构示意图；

图1是的荧光胶乳定量层析测试卡的结构示意图；

图3是荧光定量光谱仪的结构示意图；

图4是本发明在实施例1采用双抗夹心法时反应过程的示意图；

附图标记：11、免疫层析反应膜条，111、底衬，112、粘贴样品垫，113、玻璃纤维膜，114、包被膜，115、吸水纸，114a检测区，114b、控制区，12a、塑料上壳，12b、塑料下壳，12、塑料外壳，21测试卡插槽，22、数字显示屏，23、功能操作键，24、荧光光学系统，25检测器系统，26自动软件分析控制系统。

具体实施方式

荧光胶乳标记层析检测技术是继胶体金标记技术以后，在胶乳凝集试验的基础上发展起来的，作为一种免疫学方法，它是免疫亲和技术、印迹技术、免疫标记技术和层析技术的结合，并利用荧光定量光谱仪定量检测荧光信号。由于其同金标技术一样具有快速、操作简便、试剂稳定、可室温储运、不易污染的特点以及利用荧光光谱仪定量检测的优势而发展迅速。

荧光胶乳标记技术是将不同直径范围0.01μm～1μm的胶乳微球与含有羧基、氨基、羟基等酯类或其他大分子物质或各类不同的荧光素共价结合，利用大分子物质具有的羧基、氨基、羟基等基团结合蛋白质物质(抗原/抗体)，利用荧光素在激发光作用下可以发射荧光，当此荧光胶乳标记的蛋白质(抗原/抗体)与检测样本中足够的相应抗体/抗原结合后形成的胶乳标记复合物，被膜上包被的抗原/抗体捕获，荧光胶乳标记物在相应的配体处大量聚积时，利用配套的荧光定量光谱仪，由光源激发膜上检测区聚积的荧光素，发射出的荧光被相应的检测仪器接收，并通过光电变换、光电转化等过程将光电信号转化成电信号，并由仪器中设置的自动控制系统将信号输出，显示出最终的定量结果。由于选择的荧光素的种类的不同，其激发/发射光的波长λ以及自动控制系统也会不同。

所述荧光胶乳定量层析诊断试纸条，可以进一步做成荧光胶乳定量层析诊断卡，包括由塑料上壳和塑料下壳扣合而成的塑料外壳和诊断试纸条，塑料上壳设有对加样窗和信号显示窗，加样窗上设有亲水性的孔状隔膜，塑料外壳内部放置有所述荧光胶乳定量层析诊断试纸条，加样窗对应于所述荧光胶乳定量层析诊断试纸条的样品垫，结果显示窗对应于所述荧光胶乳定量层析诊断试纸条的检测区，该荧光胶乳定量层析诊断试纸条可以从该诊断卡中取出。

荧光胶乳定量层析试纸条11，拥有远端和近端，样品垫112位于试纸条11的近端，它含一个亲水性的孔状隔膜，这个孔状隔膜也是加样区，用于吸取待检测抗原/抗体所存在的检测样本。

第一种材料，即涂覆免疫荧光胶乳颗粒的玻璃纤维膜113，位于上述亲水性孔状隔膜样品垫112和荧光胶乳定量层析试纸条11的远端之间，能够利用毛细作用实现对样本的吸取，而且均匀地吸收一种有颜色标记的能够和待检测抗原/抗体发生特异性结合并且能受激发发出荧光的蛋白(第一种蛋白)；第二种材料，即包被膜114，由一个位于试纸条11的远端之内的阅读区域构成。它与涂覆免疫荧光胶乳颗粒的玻璃纤维膜113接触以允许检测样本从玻璃纤维膜113流动经过包被膜114。包被膜114的上面结合有：(I)检测区(即通常所说的检测线T)蛋白(第二种蛋白)，能特异地结合待检测抗原/抗体；(II)质控区(即质控线C)蛋白，与标记蛋白结合，能够反应系统是否有效。(I)(II)都在包被膜114上，在与上述第一种有颜色标记并能受激发发出荧光的蛋白发生反应之后，根据荧光发射—捕捉—转化系统的荧光定量检测仪器判断反应的强度，能形成两种反应模式[(+)阳性；(—)阴性]中的至少一种，同时对待检测抗原/抗体进行定量的测量，从而获得关于待检测抗原/抗体的准确信息。第三种材料，即为吸水纸115，位于试纸条11近端并贴着包被膜114，它能利用毛细作用吸收检测样本并允许通过上述第二种材料到达上述的第三种材料。一种流量指示剂包含在上述第三种材料里位于上述试纸条11的近端，这中指示剂能够指示检测样本流过上述膜条时是否过量。上述流量指示剂可以是一种化合物，当其接触到检测样本的时候会改变其颜色。该化合物可以是溴酚兰。

其中上述有颜色标记并能发出荧光的第一种蛋白是一种以荧光胶乳微粒标记的抗体或者抗原。上述第二种材料可以是一种硝酸纤维素滤器，上述第一种和第三种材料可以都是纤维质的。

实施例1：诊断乙肝表面抗原的荧光胶乳定量层析试纸条(双抗体夹心)

如图1a所示，荧光胶乳定量层析试纸条11，该试纸条为底衬111上顺次相互搭接地粘贴样品垫112、玻璃纤维膜113、包被膜114以及吸水纸115，包被膜上设有检测区114a和控制区114b，检测区114a包被乙肝表面抗原单克隆抗体，控制区114b包被有抗鼠抗体，检测区114a与指控区114b间隔约5mm。所述玻璃纤维膜113涂覆有荧光胶乳微粒标记乙肝表面抗原单克隆抗体蛋白，如图1和图2所示。

该诊断HBsAg的荧光胶乳定量层析试条的是按以下方法制备得到的：

A.荧光胶乳的共价活化：超声波处理胶乳微球体30秒后，调节胶乳微球体浓度为1.0×10¹³个微球/ml，10000～15000×g离心10分钟，离心后收集沉淀物用蒸馏水或者100Mm pH6.0磷酸钠溶液溶解，并超声波200W处理30秒；先加入50微升的100mg/mlEDC，振荡(Votex)混匀，再加入50微升的50mg/ml(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)Sulfo-NHS，Votex混匀；室温孵育30分钟后10000～15000×g、离心5～15分钟，沉淀用100mM pH6.0的柠檬酸缓冲液溶解，放置2～8℃备标记蛋白质之用；

B.荧光胶乳微粒标记乙肝表面抗原单克隆抗体的制备：将上述活化后的荧光胶乳超声波200W处理30秒后，按照0.5mg蛋白/毫升荧光胶乳的比例加入待标记的乙肝表面抗原单克隆抗体，Votex混匀后室温搅拌反应2小时，3次离心洗涤，每次10000～15000×g、离心10分钟，沉淀用PBS-TBN溶解并超声波100W处理30秒，用PBS-TBN恢复离心前的体积，放置室温，按照现有技术中的方法以备涂覆玻璃纤维膜之用，按现有技术，涂覆玻璃纤维膜；

C.抗体或抗原包被到包被膜(硝酸纤维素膜)上及其封闭：分别将乙肝表面抗原单克隆抗体和鼠抗IgG调节1.5～3.0mg/ml浓度，膜液量为20ul/27cm，用包被缓冲液稀释包被抗原/抗体，浓度为1.0～2.5mg/ml，将抗原/抗体及IgG喷到硝酸纤维素膜上相对应的检测区和质控区上进行包被，两线间隔5mm，应细致均匀，室温凉干20分钟；37℃在封闭液浸泡60分钟，取出后置37℃烘干处理2小时，封袋，以备试纸板贴板之用；

D.在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆荧光胶乳微粒标记蛋白的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸，得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。

所述玻璃纤维膜上涂覆的荧光胶乳微粒的直径范围为0.4μm，上述方法制备中的所述荧光胶乳微球，可以发射的波长范围是200nm～800nm。

所述荧光胶乳定量层析诊断试纸条11，可以进一步按现有技术做成荧光胶乳定量层析诊断卡，包括由塑料上壳12a和塑料下壳12b扣合而成的塑料外壳12和诊断试纸条11。

如图3所示，荧光定量光谱仪是一种捕捉荧光信号的荧光分析设备，它主要包含测试卡插槽21、数据显示屏22、功能操作键23、荧光光学系统24、荧光检测器25及自动软件分析控制系统26等几个部分，基于荧光光学系统一检测器一自动软件分析控制系统来捕捉荧光信号的荧光，

荧光定量光谱仪的检测过程，包括以下步骤：

A.先把预先反应的测试卡插进测试卡插槽21；

B.荧光定量光谱仪中设置的荧光光学系统24，包括光源、外光路、单色器等。光源将光通过外光路汇聚，投射至单色器的入射狭缝上，单色器滤除分析线以外的杂散光。从单色器射出的单一激发光源照射在测试卡的包被膜14的检测区14a，检测区14a上的荧光胶乳在激发光的作用下，发射出荧光信号。

C.检测区14a发射出的荧光信号被荧光定量光谱仪中设置的检测器系统25捕获，由检测器来完成光电信号的转抉。检测器主要由光电倍增管和固态检测器组成。检测器系统25将检测区14a发射出的光通过光电变换，接受入射光，发射出光电子并使其倍增，实现光电子信号的放大，再由固态检测器25b将光电子信号转换为电信号，由电信号读出电路将电信号输出，经过自动软件分析控制系统26处理后，通过数字显示屏22将结果显示出来，实现所检测样本的精确定量。

所示荧光胶乳定量层析试纸条(卡)的双抗体夹心法反应过程如图4所示。

本实施例采用的双抗体夹心法可以使用乙型肝炎表面抗原(HbsAg)诊断，还可以适用于排卵(LH，促黄体生成素)，心肌肌钙蛋白(Tn—I，Tn—T)、肿瘤标记物(AFP、PSA、CEA、FOB)、衣原体(CT)等采用双抗体(单克隆抗体-单克隆抗体或者单克隆抗体—多克隆抗体)夹心法模式的免疫层析检测。

实施例2：诊断艾滋病HIV1/2型抗体的荧光胶乳定量层析试纸条(双抗原夹心)

荧光胶乳定量层析试纸条11，该试纸条为底衬111上顺次相互搭接地粘贴样品垫112、玻璃纤维膜113、包被膜114以及吸水纸115，包被膜上设有检测区114a和控制区114b，检测区114a包被HIVgp36，gp41和gp120基因工程重组抗原，控制区114b包被有抗鼠抗体，检测区114a与指控区114b间隔约5mm。所述玻璃纤维膜113涂覆有荧光胶乳微粒标记HlVgp36，gp41和gP120基因工程重组抗原。

该诊断HIV1/2型抗体的荧光胶乳定量层析试条的是按以下方法制备得到的：

A.荧光胶乳的共价活化：超声波处理胶乳微球体30秒后，调节胶乳微球体浓度为5.0×10¹²/ml，10000～15000×g离心15分钟，离心后收集沉淀物用蒸馏水或者100Mm pH6.0磷酸钠溶液溶解，并超声波200W处理30秒；先加入50微升的100mg/mlEDC，振荡(Votex)混匀，再加入50微升的20～100mg/ml(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)Sulfo-NHS，Votex混匀；室温孵育30分钟后10000～15000×g、离心5～15分钟，沉淀用100mM pH6.0的柠檬酸缓冲液溶解，放置2～8℃备标记蛋白质之用；

B.荧光胶乳微粒标记蛋白的制备：将上述活化后的荧光胶乳超声波200W处理30秒后，按照0.5mg蛋白/毫升荧光胶乳的比例加入需标记的HlVgp36，gp41和gp120基因工程重组抗原，Votex混匀后室温搅拌反应2小时，2—4次离心洗涤，每次10000～15000×g、离心5～15分钟，沉淀用PBS-TBN溶解并超声波100W处理30秒，用PBS-TBN恢复离心前体积，放置室温，以备涂覆玻璃纤维膜之用，按现有技术，涂覆玻璃纤维膜；

C.抗体或抗原包被到包被膜(即硝酸纤维素膜)上及其封闭：分别将HlVgp36，gp41和gp120基因工程重组抗原和鼠抗IgG调节2.0mg/ml浓度，膜液量为20ul/35cm，用包被缓冲液稀释包被抗原/抗体，浓度为1.5～2.0mg/ml，将上述HlVgp36，gp41和gp120基因工程重组抗原及鼠抗IgG喷到硝酸纤维素膜上相对应的检测区和质控区上进行包被，两线间隔5mm，应细致均匀，室温凉干20分钟；37℃在封闭液浸泡60分钟，取出后置37℃烘干处理2小时，封袋，以备试纸板贴板之用；

D.在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆荧光胶乳微粒标记蛋白的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸，得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。

所述玻璃纤维膜上涂覆的荧光胶乳微粒的直径范围为0.2～0.9μm，上述方法制备中的所述荧光胶乳微球，可以发射的波长范围是200nm～800nm。

与荧光定量光谱仪配套检测方式与实施例1相同。

本实施例采用的双抗原夹心法还可以适用于，乙型肝炎表面抗体(HbsAb)，丙型肝炎(HCV)等采用双抗原夹心法模式的免疫层析检测。

实施例三：实现艾滋病、乙肝表面抗原(一检多项)

荧光胶乳定量层析试纸条11，该试纸条为底衬111上顺次相互搭接地粘贴样品垫112、玻璃纤维膜113、包被膜114以及吸水纸115，包被膜上设有检测区114a(检测区114a有两条检测线)和控制区114b(控制线)，一条检测线上包被HIVgp36，gp41或gp120基因工程重组抗原，另一条检测线上包被乙肝表面抗原单克隆抗体，控制区114b包被有抗鼠抗体，两条检测线以及控制线的间隔分别均约5mm。所述玻璃纤维膜113涂覆有荧光胶乳微粒标记HIVgp36，gp41或gp120基因工程重组抗原以及荧光胶乳微粒标记的乙肝表面抗原单克隆抗体。

该诊断HIV-HBsAg的荧光胶乳定量层析试条的是按以下方法制备得到的：

A.荧光胶乳的共价活化：超声波处理胶乳微球体30秒后，调节胶乳微球体浓度为5.0×10¹²/ml，10000～15000×g离心10，离心后收集沉淀物用蒸馏水或者100Mm pH6.0磷酸钠溶液溶解，并超声波200W处理30秒；先加入50微升的100mg/mlEDC，振荡(Votex)混匀，再加入50微升的100mg/ml(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)Sulfo-NHS，Votex混匀；室温孵育30分钟后10000～15000×g、离心10min，沉淀用100mM pH6.0的柠檬酸缓冲液溶解，放置2～8℃备标记蛋白质之用；

B1.荧光胶乳微粒标记HIVgp36，gp41基因工程抗原的制备：将上述活化后的荧光胶乳超声波200W处理30秒后，按照0.5mg蛋白/毫升荧光胶乳的比例加入需标记的蛋白质，Votex混匀后室温搅拌反应1.5-3小时，3次离心洗涤，每次10000～15000×g、离心15分钟，沉淀用PBS-TBN溶解并超声波100W处理30秒，用PBS-TBN恢复离心前的体积，放置室温，以备涂覆玻璃纤维膜之用，按现有技术，涂覆玻璃纤维膜；

B2.荧光胶乳微粒标记乙肝表面抗原单克隆抗体的制备：将上述活化后的荧光胶乳超声波200W处理30秒后，按照0.3mg蛋白/毫升荧光胶乳的比例加入需标记的蛋白质，Votex混匀后室温搅拌反应1.5-3小时，2—4次离心洗涤，每次10000～15000×g、离心5～15分钟，沉淀用PBS-TBN溶解并超声波100W处理30秒，用PBS-TBN恢复一定体积，放置室温，以备涂覆玻璃纤维膜之用；

C.抗体或抗原包被到硝酸纤维素膜上及其封闭：分别将HIVgp36与gp41抗原(检测区1)、乙肝表面抗原单克隆抗体(检测区2)和鼠抗lgG调节2.0～3.0mg/ml浓度，膜液量为20ul/27cm，用包被缓冲液稀释包被抗原/抗体，浓度为1.0～2.5mg/ml，将上述抗原/抗体及鼠抗lgG分别喷到硝酸纤维素膜上相对应的检测区(检测线)和质控区(质控线)上进行包被，任意两线间隔5mm，应细致均匀，室温凉干20分钟；37℃在封闭液浸泡60分钟，取出后置37℃烘干处理2小时，封袋，以备试纸板贴板之用；

D.在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆荧光胶乳微粒标记蛋白的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸，得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。

所述玻璃纤维膜上涂覆的荧光胶乳微粒的直径范围为0.1～0.9μm，上述方法制备中的所述荧光胶乳微球，可以发射的波长范围是200nm～800nm。

与荧光定量光谱仪配套检测方式与实施例1相同。

本实施例采用的双抗原/抗体夹心法还可以适用于其他任何任意组合的夹心法模式的免疫层析检测，如HCG与LH；HCV抗体与梅毒抗体；cTnl与cTnT等。

Claims (4)

1.荧光胶乳定量层析诊断试纸条，其特征是，包括在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆有荧光胶乳微粒标记蛋白的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸，包被膜上设有包被抗体或/和抗原的检测区和包被有抗鼠抗体控制区；所述荧光胶乳定量层析诊断试纸条是通过以下步骤制备得到的：

A.荧光胶乳的共价活化：超声波处理胶乳微球体30秒后，调节胶乳微球体浓度为1.0×10¹²～1.0×10¹³/ml，10000～15000xg离心5～15分钟，离心后收集沉淀物用蒸馏水或者50mM～200Mm pH6.0～7.0磷酸钠溶液溶解，并超声波200W处理30秒；先加入10～100ul的20～100mg/mlEDC，Votex混匀，再加入10～100ul的20～100mg/ml Sulfo-NHS，Votex混匀；室温孵育20-40分钟后10000～15000xg、离心5～15分钟，沉淀用20mM～100mMpH5.0～6.0的柠檬酸缓冲液溶解，放置2～8℃备标记蛋白质之用；

B.荧光胶乳微粒标记蛋白的制备：将上述活化后的荧光胶乳超声波200W处理30秒后，按照1ug～125ug蛋白/100ul荧光胶乳的比例加入需标记的蛋白质，Votex混匀后室温搅拌反应1.5-3小时，2-4次离心洗涤，每次10000～15000×g、离心5～15分钟，沉淀用PBS-TBN溶解并超声波100W处理30秒，用PBS-TBN恢复离心前体积，放置室温，以备涂覆玻璃纤维膜之用；

C.抗体或抗原包被到包被膜上及其封闭：分别将抗原/抗体和鼠抗IgG用包被缓冲液调节0.1～3.0mg/ml浓度，膜液量为20ul/27-35cm，将抗原或/和抗体及鼠抗lgG喷到包被膜上对应的检测区和控制区进行包被，检测区和控制区间隔3-8mm，室温凉干10-30分钟；25℃～37℃在封闭液浸泡50-70分钟，取出后置25℃～37℃烘干处理1-3小时，封袋，以备试纸板贴板之用；

D.在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆荧光胶乳微粒标记蛋白的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸，得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。

2.根据权利要求1所述荧光胶乳定量层析诊断试纸条，其特征是，所述荧光胶乳微球发射的波长范围是180nm～800nm。

3.根据权利要求1-2任一所述荧光胶乳定量层析诊断试纸条，其特征是，所述荧光胶乳微粒标记蛋白为荧光胶乳微粒标记乙肝表面抗原单克隆抗体，包被膜上检测区的包被抗体为乙肝表面抗原单克隆抗体。

4.根据权利要求1-2任一所述荧光胶乳定量层析诊断试纸条，其特征是，所述荧光胶乳微粒标记蛋白为荧光胶乳微粒标记HIVgp36，gp41和gp120基因工程重组抗原中的一种或多种，包被膜上设有的包被抗原为HIVgp36，gp41和gp120基因工程重组抗原一种或多种。

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