CN103149182A

CN103149182A - 一种荧光分析方法和装置

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Publication number: CN103149182A
Application number: CN2011104004987A
Authority: CN
Inventors: 王雅杰; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: Individual
Current assignee: SHANGHAI XINPU BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-12-06
Filing date: 2011-12-06
Publication date: 2013-06-12

Abstract

本发明涉及一种荧光分析方法和装置，具体地，公开了一种定量检测待测物的检测方法和一种基于所述检测方法的检测装置。

Description

一种荧光分析方法和装置

技术领域

本发明属于体外检测技术领域，具体地涉及一种基于测量荧光强度的分析方法和装置。

背景技术

在免疫检测领域中，常常需要对各类抗原或抗体进行定性或定量检测，现有技术中，以“竞争抑制和双抗夹心”为基础衍生出多种免疫反应分析方法，如：放射免疫法、酶联免疫法、化学发光法、时间分辨荧光法和荧光免疫法等，可用于确定病原微生物，对人体的特异性蛋白定量检测从而对疾病进行辅助诊断或监测等等，用途非常广泛。这类免疫反应分析方法的通常作法是：将捕获抗体固定于固相载体，然后与抗原(目标蛋白)反应，洗涤后再与标记抗体反应，洗涤，最后检测放射性强度、溶液吸光度或光信号，从而报告检测样本中目标蛋白的浓度，上述方法的自动化免去了人工洗涤的烦琐，但正因为自动化，使得仪器体积庞大价格昂贵，一般只在大型实验室使用。

1990年，Beggs等综合胶体金和免疫分析技术，建立了胶体金免疫层析法(GICA)，用于检测人尿和血清中的HCG(BEGGS M，NOVOTNY M，SAMPEDRO S.A selfperforming chromatographic immunoassay for thequalitative determination of human chorionicgonadotrophin(HCG)in urine andserum[J].Clin Chem，1990，36：1084-1085)。此后20年，人们在GICA的基础上，开发出了用于病原体(CN 03115143.4)、激素(CN 200610014168.3)、心脏标志物(CN 200410011165.5)、肿瘤标志物(CN 200510104796.6)、自身免疫病标志物(CN 200410027291.X)、毒品(CN 201010578686.4)等的检测试剂；同时也应用到食品、环境(CN 03116692.X)和兽医(CN 02139704.X)领域。由于该方法快速、简便、成本低廉、无需仪器，非专业人士也可操作，只需肉眼观察即可，使急诊、基层医院、病人床边和现场等远离大型实验室的地方开展相关检测成为可能，所以应用范围相当广泛。

虽然这种免疫分析技术经超过20年的发展，但其基本的工作原理并未改变，这决定了到目前为止，它只用于定性或半定量检测(根据检测线灰度深浅定量)，且灵敏度也不如前述的定量免分析方法，其进一步的应用遇到了瓶颈。

因此，本领域急需对现有的胶体金层析方法进行变革，在保持其诸如快捷、简便、成本低廉等原有的一切优势的前提下，又赋予其高灵敏度和定量准确的新优势，进一步深入而广泛地扩展其应用领域。

发明内容

本发明提供了一种测试片，用于定量检测样品中的待测物。

本发明提供了一种定量检测待测物的检测方法，所述方法灵敏度高，定量准确。

本发明还提供了一种定量检测待测物的检测装置。

本发明第一方面提供了一种测试片，用于定量检测样品中的待测物，该测试片包括：

可加入样品的加样区；

位于加样区近端的结合区，所述结合区包含一种或多种可流动的、可与待测物结合的结合剂，所述结合剂中至少一种被吸光物质标记，所述结合剂能与待测物或其等同物结合形成含有吸光物质的复合物；

位于结合区近端和加样区远端的测试区，所述测试区包含固定化的检测剂，所述检测剂被荧光物质标记，所述检测剂用于捕获从结合区移动至测试区的含有吸光物质的复合物；和

位于测试区近端和结合区远端的样品吸收区，其中吸收区具有吸收能力，从而使得加至加样区的样品从加样区扩散至末端样品吸收区；

其中，当所述检测剂捕获含有吸光物质的复合物时，所述吸光物质影响所述荧光物质的荧光强度。

在另一优选例中，所述待测物为抗原或抗体。

在另一优选例中，所述结合剂特异性结合待测物或其等同物；较佳地，所述结合剂为抗原、抗体或寡核苷酸。

在另一优选例中，所述含有吸光物质的复合物可以含有待测物，也可以含有其等同物。

在另一优选例中，所述检测剂特异性结合所述含有吸光物质的复合物；较佳地，所述检测剂为荧光标记的抗原或抗体。

在另一优选例中，所述结合区可以包含两种结合剂，其中，一种被吸光物质标记的结合剂，另一种被生物素标记的结合剂，所述两种结合剂同时与待测物结合，从而形成一种被生物素标记的含有吸光物质的复合物。

在另一优选例中，所述测试区的检测剂为荧光标记的链亲和素。

在另一优选例中，所述结合剂的数量大于所述待测物的数量；所述检测剂的数量大于含有吸光物质的复合物的数量。

在另一优选例中，所述结合区包括第一结合区和第二结合区，其中，所述第一结合区位于加样区近端，包含被吸光物质标记的结合剂；所述第二结合区位于加样区的远端，包含被生物素标记的待测物等同物；

其中，所述被吸光物质标记的结合剂的数量大于待测物的数量，所述结合剂与待测物结合后，剩余的结合剂移动至第二结合区，与所述被生物素标记的待测物等同物结合形成被生物素标记的含有吸光物质的复合物。

在另一优选例中，所述被生物素标记的待测物等同物的数量大于所述剩余的结合剂的数量。

在另一优选例中，所述的待测物包括：蛋白、核酸或小分子化合物。

在另一优选例中，所述的待测物是液相(溶液)、悬浮液或固相。

在另一优选例中，当待测物为固相时，步骤(2)还包括加入溶剂(如水或缓冲液)。

在另一优选例中，所述的待测物包括肿瘤标志物、心肌标志物等特异性的蛋白。

在另一优选例中，所述结合剂和待测物或其等同物、检测剂和复合物的结合为特异性结合。

在另一优选例中，所述的待测物或其等同物是抗原，且所述的结合剂和检测剂是可同时结合于所述抗原的抗体；或者

所述的待测物或其等同物是抗体，且所述的结合剂和检测剂是可同时结合于所述抗体的抗原或所述抗体的抗体(抗抗体)。

在另一优选例中，所述结合剂为被生物素标记的结合剂，所述检测剂为荧光标记的链亲和素。

在另一优选例中，所述待测物等同物被生物素标记，所述检测剂为荧光标记的链亲和素。

在另一优选例中，所述荧光物质的激发或发射光谱与所述吸光物质的吸收光谱全部或部分重叠。

在另一优选例中，所述荧光物质选自下组：荧光素、羧基荧光素、2-甲氧基荧光素、4，5-二甲氧基荧光素、罗丹明、藻红蛋白、量子点、或稀土元素离子或其螯合物。

在另一优选例中，所述的吸光物质选自下组：胶体金、纳米金棒、纳米银棒或其组合。

在另一优选例中，所述的吸光物质为纳米金棒。

在另一优选例中，所述的纳米金棒的纵横比为1.5-10，较佳地为1.5-5。

在另一优选例中，所述的纳米金棒的长度为10-200nm，较佳地为20-100nm。

在另一优选例中，所述的胶体金是平均粒径为10-70nm的胶体金颗粒。

在另一优选例中，在测试区和样品吸收区之间还包含至少一个对照区，所述对照区含有固定化的对照剂，其中，所述对照剂用于特异性结合被吸光物质标记的结合剂。

在另一优选例中，所述对照区用于控制待测物的检测结果的有效性。

本发明第二方面提供了一种定量检测待测物的荧光分析方法，包括步骤：

(1)提供一种本发明第一方面所述的测试片；

(2)将待测物样品加入加样区；

(3)样品中的待测物移动至结合区，与其中的结合剂结合，从而形成含有吸光物质的复合物；

(4)步骤(3)得到的含有吸光物质的复合物移动至测试区，与其中的检测剂结合，从而形成含有吸光物质和荧光物质的复合物；

(5)测量步骤(4)得到的含有吸光物质和荧光物质的复合物的荧光强度F，从而换算为待测物的数量。

在另一优选例中，步骤(3)中所述结合区包括第一结合区和第二结合区，其中，所述第一结合区位于加样区近端，包含被吸光物质标记的结合剂；所述第二结合区位于加样区的远端，包含被生物素标记的待测物等同物；

在另一优选例中，步骤(5)包括：将含有吸光物质和荧光物质的复合物的荧光强度F和标准曲线或者与未加样的初始荧光强度F0进行比较，从而确定待测物的数量。

在另一优选例中，所述的方法还包括用已知浓度的待测物标准品进行测量，从而制作标准曲线的步骤。

本发明第三方面提供了一种定量检测待测物的荧光测量装置，所述的装置包括：

(a)一本发明第一方面提所述的测试片；

(b)一用于检测荧光强度的检测器；和

(c)描述本发明第二方面提所述方法的使用说明。

在另一优选例中，所述装置还包括光源和计算机。

所述光源通过光导纤维照射到检测线处，激发出的荧光通过光导纤维进入检测器，由计算机进行数据处理和分析。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是测试片示意图。

图2是检测装置示意图。

图3是实施例1的AFP标准系列浓度(C)与相应荧光强度(F)标准曲线图。

图4是实施例2的AFP标准系列浓度(C)与相应荧光强度(F)标准曲线图。

图5是实施例3的CRP标准系列浓度(C)与相应荧光强度(F)标准曲线图。

具体实施方式

本发明人通过长期而深入的研究，发现了一种基于荧光淬灭原理的检测方法，所述方法不仅可以通过目测测试区的颜色来判断是否含有待测物，更优秀的是可以通过测量测试区荧光强度的方式来定量检测待测物，不仅快捷、简便、成本低廉，而且具有灵敏度高，定量准确的优点。所述方法是基于本发明提供的一种测试片，通过一种含有光源和检测器的装置实现了对待测物的定量检测。在此基础上，发明人完成了本发明。

测试片

现在更详细地描述用于制造本发明测试片的方法和材料。应注意，测试片的具体构造可以变化，这取决于意图用测试片来进行的具体测试。在实施例之外制造测试片的变动方法，也落于本发明范围之中。

如图1所示，测试片1可包括背衬片2，其长度与测试片相同。

加样区3位于测试片的一端，样品垫片31位于加样区，可通过粘合剂粘贴于加样区。

吸收区7位于测试片的另一端，在加样区的远端，吸水垫片71位于吸收区。

结合区4位于加样区和吸收区之间，在加样区的近端和吸收区的远端，结合垫片41位于结合区。

测试区5(也称检测线)位于结合区和吸收区之间，通常测试区设置在膜片56上，通过所述膜片连接结合垫和吸水垫。优选地，所述膜片上还设置有对照区6(也称质控线)，且通常对照区位于测试区和吸收区之间，与测试区之间有适当的空间。

测试片制造方法，优选地，如图1所示，分别将样品垫片、结合垫片、膜片、吸水垫片通过粘合剂粘贴于背衬板上，即得所述测试片。

背衬片可以用任何稳定的、无孔的材料制成，其强度应足以支承材料和粘于其的测试片。因为许多测定用水作为扩散介质，因此背衬片较佳地是基本上不透水的。在一个优选例中，背衬片是用聚合物膜制成的，更佳地是用聚氯乙烯膜制成的(如PVC胶板)。

样品垫片可用任何吸收性材料制成。可使用的材料例子包括：纤维素、硝酸纤维素、乙酸纤维素、玻璃纤维、尼龙、聚电解质离子交换膜、丙烯共聚物/尼龙、和聚醚砜。

结合垫片或膜片可以用任何材料制成，只要该材料有足够孔隙度从而允许在表面和内部发生流体的毛细管作用。结合垫片或膜片应有足够的孔隙度，从而允许涂有抗体或抗原的颗粒移动。结合垫片或膜片还可被含待检测分析物的样品中所用的液体润湿(例如，对于水性液体具有亲水性，对于有机溶剂具有疏水性)。通过例如在美国专利No.4,340,482或No.4,618,533中所述的方法(这些方法描述了将疏水表面转变成亲水表面)，可以改变其疏水性从而使其具有亲水性以便用于水性液体。可用于制造结合垫片或膜片的材料例子包括：聚脂膜、纤维素、硝酸纤维素、乙酸纤维素、玻璃纤维、尼龙、聚电解质离子交换膜、丙烯共聚物/尼龙、和聚醚砜(polyethersulfone)。在一个优选例中，结合垫片是用聚脂膜制成的，膜片是用硝酸纤维素制成的。

吸收垫片可以用任何能吸收作为样品和缓冲液的液体的材料制成。吸收垫片的吸收能力应足够大，以便吸收添加至测试片的液体。适用于吸收垫片的材料的例子包括纤维素和玻璃纤维。

检测方法

本发明测试片可用于大量不同的侧流分析方法，而这些分析方法涉及使用一种或多种可流动的结合剂和一种固定化的检测剂。其中，所述结合剂中至少一种是被吸光物质标记，所述结合剂能与待测物或其等同物结合形成含有吸光物质的复合物；所述检测剂是被荧光物质标记的，所述检测剂用于捕获从结合区移动至测试区的含有吸光物质的复合物，从而形成含有吸光物质和荧光物质的复合物。具体地，当所述吸光物质影响(部分淬灭或全部淬灭)所述荧光物质的荧光强度时，本发明的检测方法即可通过检测荧光物质的荧光强度来测定待测物的数量。

如本文所用，术语“待测物”、“其等同物”或“分析物”指待用测试片检测以及可任选地被定量测定的、样品中的任何组份，待测物或其等同物或分析物的例子包括：蛋白质，如激素或其他分泌蛋白质、酶和细胞表面蛋白；糖蛋白；肽；小分子；多糖；抗体(包括单克隆抗体或多克隆抗体及其片段)；核酸；药物(包括地高辛等强心甙类药物)；毒素；病毒或病毒颗粒；细胞壁组份；或其他具有表位的化合物。

优选地，所述的待测物包括肿瘤标志物、心肌标志物等特异性的蛋白，所述肿瘤标志物选自下组：甲胎蛋白(AFP)、C-反应蛋白(CRP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)、糖抗原19-9(CA19-9)、总前列腺特异性抗原(PSA)、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、神经原特异性烯醇化酶(NSE)、糖链抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、或人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)。

结合剂

本发明所用的结合剂可以是任何能够结合于待测物或其等同物的物质。具体地，为特异性结合待测物或其等同物的物质。

有各种不同类型的分子可用作分析物结合剂，其中包括例如：寡核苷酸、抗体、工程化蛋白、肽、半抗原、或含有抗原(该抗原具有分析物结合位点)的异源混合物的裂解物。P.Holliger等人，Trends in Biotechnology 13：7-9(1995)；S.M.Chamow等人，Trends in Biotechnology 14：52-60(1996)。如果待检测分析物是配体，那么可使用结合于该配体的受体，反之亦然。

检测剂

本发明所用的检测剂可以是任何能结合从结合区移动至测试区的含有吸光物质的复合物的物质，包括例如：抗体、工程化蛋白、肽、半抗原、或含有抗原(该抗原具有分析物结合位点)的异源混合物的裂解物。

优选地，可以通过抗原和抗体的结合或寡核苷酸与互补核酸单链特异性结合的方式将含有荧光标记的物质与含有吸光物质标记的物质结合；还可以通过生物素(biotin)和链亲和素(Streptavidin，SA)的结合方式，从而将含有荧光标记的物质与含有吸光物质标记的物质结合。

标记物质

连于结合剂或检测剂的可检测标记物包括大量不同物质，只要标记物能够被检测。可检测标记物的例子包括(但并不限于)：颗粒、发光标记物；比色标记物、荧光标记物；化学标记物；酶；放射性标记物；或射频标记物；金属胶体；和化学发光标记物。常用检测方法的例子包括(但并不限于)：光学方法，如测量光散射、单反射、光度计或光电倍增管；放射性(用盖革计数器等进行测量)；导电性或电介质(电容)；电化学法检测所释放的电活性物质，如铟、铋、镓、碲离子[如用Hayes等人(Analytical Chem.66：1860-1865(1994)所述的方法]，或亚铁氰化物[如用Roberts和Durst(Analytical Chem.67：482-491(1995)所提出的方法。其中通过在检测区滴加洗涤剂，使包裹在脂质体中的亚铁氰化物被释放出，然后用电化学法检测释放的亚铁氰化物]。其他常规方法只要合适，也可使用。

在一个优选例中，可检测标记物是颗粒。可使用的颗粒例子包括(但并不限于)：胶体金颗粒；胶体硫颗粒；胶体硒颗粒；胶体硫酸钡颗粒；胶体硫酸铁颗粒；金属碘酸盐颗粒；卤化银颗粒；二氧化硅颗粒；胶体(水合)金属氧化物颗粒；胶体金属硫化物颗粒；胶体硒化铅颗粒；胶体硒化镉颗粒；胶体金属磷酸盐颗粒；胶体金属铁酸盐颗粒；涂有有机或无机层的上述任一种胶体颗粒；蛋白质或肽分子；脂质体；或有机聚合物乳胶颗粒，例如聚苯乙烯乳胶珠。

用于检测剂的标记物，本发明优先选用荧光标记物(简称荧光物质)，用于结合剂的标记物，本发明优先选用吸光物质标记物(简称吸光物质)。当荧光标记物和吸光标记物通过特定的方式结合后，当荧光物质的激发或发射光谱与吸光物质的吸收光谱部分或完全重叠时，吸光物质会影响(部分淬灭或全部淬灭)荧光物质的荧光，从而通过检测荧光物质的荧光强度来测定待测物的数量。

荧光物质和吸光物质的选择

用于本发明标记的荧光物质和吸光物质应配合使用，基本原则是荧光物质的激发或发射光谱与吸光物质的吸收光谱部分或完全重叠。

最优的是完全重叠，如此会有较高的检测灵敏度。

代表性的荧光物质包括(但并不限于)：荧光素、羧基荧光素、2-甲氧基荧光素、4，5-二甲氧基荧光素、罗丹明、藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)、量子点、稀土元素离子(如Eu³⁺)及其螯合物等组合，只要所选荧光物质的激发或发射光谱与所选吸光物质的吸收光谱有重叠即可。

代表性的吸光物质包括(但并不限于)：胶体金、纳米金棒、纳米银棒等组合，只要所选吸光物质的吸收光谱与所选荧光物质的激发或发射光谱重叠即可。

胶体金颗粒可用任何常规方法制造，例如总结于G.Frens，1973 NaturePhysical Science，241：20(1973)中的方法。其他方法描述于美国专利No.5,578,577、5,141,850、4,775,636、4,853,335、4,859,612、5,079,172、5,202,267、5,514,602、5,616,467、5,681,775。

如本文所用，术语“纳米金棒”指具有一定纵横比、且横轴和纵轴处于5-200纳米范围的金颗粒。

一种特别优选的吸光物质是胶体金，尤其是粒径为20-40nm的胶体金。

优选地，本领域技术人员常用荧光标记物质包括PE，PE的吸收光谱在550～650nm之间，最大发射波长为575nm，而30nm胶体金的吸收光谱在300～800nm，较宽泛，最大吸收峰为525～530nm处，与PE的发射光谱有部分重叠，所以选择30nm胶体金作为相应的吸光物质。

荧光淬灭原理

含有荧光标记的物质与含有吸光物质标记的物质结合后，当荧光物质的激发或发射光谱与作为荧光淬灭剂的吸光物质的吸收光谱全部或部分重叠时，因共振能量转移，吸光物质会对该荧光物质的荧光产生淬灭作用。

本发明中，引起荧光淬灭的原因包括两个方面：一是复合物内部吸光物质对荧光物质的淬灭；二是堆积在一起的复合物之间的相互淬灭，如：复合物甲的吸光物质淬灭复合物乙的荧光，复合物乙的吸光物质淬灭复合物丙的荧光，复合物丙的吸光物质淬灭复合物甲的荧光，依此类推。

工作原理

现结合图1和具体的实施方式说明本发明检测方法的工作原理：

方法一、

(1.1)样品加在玻璃纤维样品垫片上，样品中的待测物(如抗原)在毛细作用下向吸水垫片方向移动，途经载有结合剂(如抗原的胶体金标记抗体，简称为抗原的金标抗体)的聚酯膜结合垫片后，将金标抗体完全复溶，同时样品中待测物和结合剂(如抗原与其金标抗体)形成如金标抗体-抗原的2元复合物。

(1.2)上述2元复合物继续前行至硝酸纤维素膜片的检测线处，固定在此的荧光物质标记的针对抗原的检测剂(如荧光标记的第2抗体)捕获2元复合物，形成3元复合物，即“夹心复合物”，其中的金淬灭检测线处的荧光物质的荧光。

(1.3)多余的游离金标抗体继续前移，被固定在质控线处的对照剂(如抗金标抗体的抗体)捕获，呈现红色，说明检测有效。

(1.4)测定检测线处荧光物质的荧光强度，荧光越强说明目标抗原浓度越低，反之则越高；如样本中无抗原时，不能形成“夹心复合物”，则检测线处的荧光强度为原始荧光强度。

方法二、

检测线处也可固定其他能捕获“夹心复合物”的荧光标记物质。

(2.1)样品加在玻璃纤维样品垫片上，样品中的待测物(如抗原)向吸水垫片方向移动，途经载有两种结合剂的(如金标抗体和biotin标记的抗体)的聚酯膜结合垫片后，将金标抗体和biotin标记的抗体完全复溶后，样品中的待测物和所述两种结合剂(如抗原与金标抗体、biotin标记的抗体)形成如金标抗体-抗原-抗体-biotin的3元复合物。

(2.2)上述复合物继续前行至硝酸纤维素膜条的检测线处，固定在此的荧光标记的能与biotin结合的检测剂(如荧光标记的SA)捕获3元复合物，形成4元复合物，其中的金淬灭检测线处的荧光物质的荧光。

(2.3)多余的游离金标抗体继续前移，被固定在质控线处的对照剂(如抗金标抗体的抗体)捕获，呈现红色，说明检测有效。

(2.4)测定检测线处荧光物质的荧光强度，荧光越强说明目标抗原浓度越低，反之则越高；如样本中无抗原时，不能形成“夹心复合物”，则检测线处的荧光强度为原始荧光强度。

方法三、

本发明还适用于竞争抑制法：

(3.1)分别将结合剂(如金标抗体)和待测物等同物(如biotin标记抗原)分别滴加于图1的聚脂膜处，结合剂靠近样品垫，待测物等同物靠近检测线，2者隔开适宜的空间距离。

(3.2)样品加在玻璃纤维样品垫片上，其中的待测物(如抗原)向吸水垫片方向移动，途经载有结合剂(如抗原的金标抗体)的聚酯膜后，将结合剂完全复溶，样品中的待测物和结合剂形成如金标抗体-抗原的“第1二元复合物”，剩余的结合剂又与聚脂膜上的待测物等同物形成如金标抗体-抗原-biotin的“第2二元复合物”。

(3.3)上述2种复合物继续前行至硝酸纤维素膜片的检测线处，固定在此的检测剂(如荧光标记的SA)只捕获“第2二元复合物”，其中的金淬灭检测线处荧光物质的荧光。

(3.4)测定检测线处荧光物质的荧光强度。样品中目标抗原越多，则生成的“第2二元复合物”越少，对检测线处的荧光淬灭越弱，相应地，荧光信号越强，反之，样品中目标抗原越少，检测线处的荧光信号越弱。

检测装置

现结合图2说明本发明的检测装置：

如图2所示，所述装置可以包括：测试片、检测器、光源、光导纤维和计算机。还可以包括一份检测方法的使用说明。其中测试片的工作原理如上所述，荧光强度的检测方法可以如下所述(但不仅限于此)，任何可用于检测荧光强度的方法均可用于本发明的检测装置。

荧光强度的检测

光源通过光导纤维照射到检测线处，激发出的荧光通过光导纤维进入检测器，所得到的数据由计算机进行处理和分析。

所述光导纤维可以是Y型的，分别连接于光源、检测线和检测器。

本发明中，光源用于提供某一发射波长的光线，从而激发荧光物质发出荧光。可选用任何可以提供合适波长的光源，包括(但不限于)：LED、氙灯、卤钨灯、激光等。

一种优选的光源是激光光源，激光光源可用本领域常规的方法和设备(如激光器)产生。代表性的激光器包括(但并不限于)：半导体激光器、氦氖激光器、氩离子激光器、还包括波长可选的激光器、多波长激光器和双波长激光器等。

激光器产生的激光波长与激光介质有关，常见的激光波长见下表1：

表1

激光种类	波长(纳米)
		氩氟激光(紫外光)	193
氪氟激光(紫外光)	248
		氙氯激光(紫外光)	308
氮激光(紫外光)	337
		氩激光(蓝光)	488
氩激光(绿光)	514
		氦氖激光(绿光)	543
氦氖激光(红光)	633
		罗丹明6G染料(可调光)	570-650
红宝石(CrAlO₃)(红光)	694
		钕-钇铝石榴石(近红外光)	1064

本发明中的检测器可以是(但不限于)光电倍增管、CCD或光电池等。

标准曲线

在本发明中，可以直接通过测定检测线处的荧光强度，确定所述待测物的数量。

在优选例中，可通过与标准曲线进行比较，从而获得定量结果。

标准曲线可用以下方法获得：将已知的不同浓度(C)的待测物样品通过上述检测方法后，分别测量其在检测线处的荧光强度(F)，将各浓度的对数值(log C)和相应的荧光强度的对数值(log F)作图，得到标准曲线。

本发明的主要优点有：

(1)本发明提供了一种测试片。

(2)本发明提供了一种上述测试片的检测方法，所述方法基于荧光淬灭原理，通过测量荧光物质的荧光强度从而测定待测物的数量，所述方法快捷、简便、成本低廉，而且灵敏度高，定量准确。

(3)本发明还提供了一种检测装置，所述装置基于上述检测方法，可广泛用于定量检测领域。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例

试剂和设备：

针对AFP的1对单克隆抗体(Ab1和Ab2)，市售品；

针对C-反应蛋白(CRP)的单克隆抗体，市售品；

CRP抗原，市售品；

AFP抗原购自Biodesign；

30nm的胶体金，市售品；

PE购自Invitrogen公司；

SA-PE购自Invitrogen公司；

地高辛(Dig)，市售品；

抗Dig鼠单克隆抗体(Dig-Ab)，市售品；

小牛血清白蛋白(BSA)，市售品；

Biotin，市售品；

检测器：USB4000-FL(美国海洋光学公司)；

光源：532nm激光光源。

实施例1：血清中甲胎蛋白(AFP)的检测(PE标记抗体点于检测线处)

1、金标抗体的制备

1.1胶体金-抗体保存液

四硼酸钠	0.1g
		小牛血清白蛋白(BSA)	0.25g
NaN₃	0.025g

加水溶解后用6N HCl调pH至7.4，补水至250ml，用0.45μm滤膜过滤后，4～8℃保存。

1.2工作液

Na₂HPO₄·12H₂O	6.1g
		NaCl	8.5g
PVP40	5.0g
		硼酸	2.1g
PEG	1.0g
		10％BSA	50ml
NaN₃	0.2g

加水溶解后用6N HCL调pH至7.0～7.5补水至1000ml，用0.45μm滤膜过滤后，4～8℃保存。

1.3金标抗体(Gold-Ab1)的制备

1.3.1取20～30nm颗粒胶体金液20ml，在磁力搅拌下缓慢加入已纯化的Ab1抗体1.0ml(0.6mg/ml)，在室温下搅拌30min；

1.3.2加10％的BSA 0.8ml(终浓度0.4％)，室温搅拌5min；

1.3.3加10％的PEG 0.4ml(终浓度0.2％)，室温搅拌5min；

1.3.4 12000～1500r/min离心60～40min，小心吸离心上清，沉淀溶于0.5ml保存液中，金标抗体的光密度(O.D)约为60 O.D，其中Ab1抗体的浓度为1mg/ml，置4℃保存备用；

2、PE标记Ab2抗体(Ab2-PE)的制备

2.1Ab2预处理

2.2biotin标记Ab2取上述预处理的Ab2 10μL，加入25μL的1mg/mlNHSS-Biotin DMSO溶液，混匀，4℃冰箱避光反应2小时，透析过夜备用。

2.3biotin-Ab2标记PE

取标记好biotin-Ab2，加入pH7.4磷酸盐缓冲液中，Ab2终浓度为5μg/ml，同时加入SA-PE，PE终浓度为60μg/ml，Ab2-PE(即Ab2-biotin-SA-PE)总体积为5ml，4℃避光保存备用。

3、Ab2-PE点膜与上载金标抗体

取Ab2-PE 1μl点在图1检测线位置，取Gold-Ab1 0.5μl滴加在图1的聚脂膜结合垫片上，避光室温干燥。

4、标准曲线制备

4.1用工作液配制AFP系列标准溶液(浓度见表2)；

4.2取5只测试片，水平放置，分别在各样品垫上加5种浓度的50μl标准溶液；

4.310min后，测定各测试片上检测线处的荧光强度，数据见表2，标准曲线见图3。

表2：AFP标准系列浓度与相应荧光强度

标准系列浓度(C ng/ml)	荧光强度(F)
		0	27000
10.58	22500
		32.45	18600
95.32	15400
		301.56	13600

5、样本检测

用血清样本替代标准系列溶液，重复4.2、4.3步骤，将荧光强度值代入标准曲线，测得6个样本的AFP值分别为：6.2、8.9、12.6、40.8、112.3、235.6ng/ml，与酶联免疫法相应检测结果的相关性良好，R²＝0.9128。

实施例2：血清中甲胎蛋白(AFP)的检测(SA-PE点于检测线处)

1.Gold-Ab1的制备

用实施例1的Gold-Ab1。

2.biotin标记Ab2

用实施例1的biotin-Ab2。

3.Gold-Ab1与biotin-Ab2的混合

各取5μl Gold-Ab1与biotin-Ab2，混匀。

4.SA-PE点膜与上载混合抗体

取SA-PE(100μg/ml)1μl点在图1检测线位置，取混合抗体0.5μl滴加在图1的聚脂膜结合垫片上，避光室温干燥。

5.标准曲线制备

5.1用工作液配制AFP系列标准溶液(见表3)；

5.2取5只测试片，水平放置，分别在各样品垫上加5种浓度的50μl标准溶液；

5.3 10min后，测定各测试片上检测线处的荧光强度，数据见表3，标准曲线见图4。

表3：AFP标准系列浓度与相应荧光强度

标准系列浓度(C ng/ml)	荧光强度(F)
		0	18500
10.58	16500
		32.45	12300
95.32	8500
		301.56	4350

6.样品检测

用血清样本替代标准系列溶液，重复5.2、5.3步骤，将荧光强度值代入标准曲线，测得6个样本的AFP值分别为：7.2、13.2、15.6、44.8、102.3、255.6ng/ml，与酶联免疫法相应检测结果的相关性良好，R²＝0.8985。

实施例3：竞争抑制法检测C-反应蛋白(CRP)

1、CRP单抗标金(Gold-CRP)

过程同实施例1，不同点在于，用已纯化的CRP单抗替代Ab1抗体，标记后胶体金O.D值为75，CRP单抗浓度为1mg/ml。

2、CRP抗原标记biotin(biotin-CRP)

过程同实施例1中的步骤2.2，不同点在于，用已纯化的CRP替代经预处理的Ab2，标记后CRP抗原浓度0.4mg/ml。

3、SA-PE点膜与上载Gold-CRP和biotin-CRP

取SA-PE(100μg/ml)1μl点在图1检测线位置，取Gold-CRP 0.5μl滴加在图1的聚脂膜结合垫片靠近样品垫的位置，取biotin-CRP 0.5μl滴加于图1聚脂膜靠近检测线的位置，避光室温干燥。

4、标准曲线制备

4.1用工作液配制0、1、5、10μg/ml的CRP系列标准溶液；

4.2取4只测试片，水平放置，分别在各样品垫上加4种浓度的50μl标准溶液；

4.3 10min后，测定各测试片上检测线处的荧光强度，数据见表4，标准曲线见图5。

表4：标准系列浓度及相应荧光强度

标准系列浓度(C μg/ml)	荧光强度(F)
		0	4650
1	6000
		5	11400
10	17500

5、样品检测

用血清样本替代标准系列溶液，重复4.2、4.3步骤，将荧光强度值代入标准曲线测得6个样本的CRP值分别为：0.53、1.2、1.88、5.8、4.3、9.6μg/ml，与酶联免疫法相应检测结果的相关性良好，R²＝0.9336。

实施例4：竞争抑制法检测血清中地高辛的浓度

1、BSA-Dig

采用本领域技术人员熟知的方法将地高辛(Dig)与BSA连接。

2、biotin-BSA-Dig

参照实施例1制备biotin-BSA-Dig，不同点在于，用已纯化的BSA-Dig替代经预处理的Ab2。

3、Gold-Dig-Ab

参照实施例1制备Gold-Dig-Ab，不同点在于，用已纯化的Dig-Ab替代Ab1抗体。

4、SA-PE点膜与上载biotin-BSA-Dig和Gold-Dig-Ab

取SA-PE(100μg/ml)1μl点在图1检测线位置，取Gold-Dig-Ab 0.5μl滴加在图1的聚脂膜结合垫片靠近样品垫的位置，取biotin-BSA-Dig 0.5μl滴加于图1聚脂膜靠近检测线的位置，避光室温干燥。

5、标准曲线

参照实施例3制作地高辛标准系列浓度及其相应荧光强度的标准曲线。

6、样品检测

参照实施例3检测8个实际样本，测得8个样本中地高辛的浓度分别为：1.32、0.85、2.44、5.35、3.36、1.44、4.18、4.76ng/ml，与微粒子酶免法相应测值的相关性良好，R²＝0.9012。

讨论：

本发明所述测试方法，通过测量荧光物质的荧光强度从而测定待测物的数量，所述方法全程只需加入待测样品，无需洗涤，操作快捷、简便，成本低廉，而且灵敏度高，定量准确。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种测试片，其特征在于，用于定量检测样品中的待测物，该测试片包括：

可加入样品的加样区；

2.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，所述结合区包括第一结合区和第二结合区，其中，所述第一结合区位于加样区近端，包含被吸光物质标记的结合剂；所述第二结合区位于加样区的远端，包含被生物素标记的待测物等同物；

3.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，所述的待测物包括：蛋白、核酸或小分子化合物。

4.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，所述结合剂和待测物或其等同物、检测剂和复合物的结合为特异性结合。

5.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，所述荧光物质的激发或发射光谱与所述吸光物质的吸收光谱全部或部分重叠。

6.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，所述荧光物质选自下组：荧光素、羧基荧光素、2-甲氧基荧光素、4，5-二甲氧基荧光素、罗丹明、藻红蛋白、量子点、或稀土元素离子或其螯合物。

7.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，所述的吸光物质选自下组：胶体金、纳米金棒、纳米银棒或其组合。

8.如权利要求1所述的测试片，其特征在于，在测试区和样品吸收区之间还包含至少一个对照区，所述对照区含有固定化的对照剂，其中，所述对照剂用于特异性结合被吸光物质标记的结合剂。

9.一种定量检测待测物的荧光分析方法，其特征在于，包括步骤：

(1)提供一种如权利要求1所述的测试片；

(2)将待测物样品加入加样区；

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述结合区包括第一结合区和第二结合区，其中，所述第一结合区位于加样区近端，包含被吸光物质标记的结合剂；所述第二结合区位于加样区的远端，包含被生物素标记的待测物等同物；

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(5)包括：将含有吸光物质和荧光物质的复合物的荧光强度F和标准曲线或者与未加样的初始荧光强度F0进行比较，从而确定待测物的数量。

12.一种定量检测待测物的荧光测量装置，其特征在于，所述的装置包括：

(a)一权利要求1所述的测试片；

(b)一用于检测荧光强度的检测器；和

(c)描述权利要求9所述方法的使用说明。