CN102053157A - 一种胎膜早破快速检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胎膜早破快速检测试纸条，所述试纸条由样品垫、玻璃纤维膜、包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底衬上构成，所述玻璃纤维膜上涂敷有胶乳颗粒标记的胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)的高特异性单克隆抗体；包被膜包括包被抗-胰岛素样生长因子结合蛋白-1特异性单克隆抗体的检测区和包被抗鼠抗体的控制区。本发明所述的试纸条与放射性免疫、酶联免疫法相比，具有操作安全、简便、适合单人/份检测和快速等优点。本发明试纸条操作简便、快速、不需要专门技术，无创伤，结果易读，可实现对胎膜早破及时现场和家庭自检。

Description

一种胎膜早破快速检测试纸条

技术领域

本发明属于医学检验领域，具体地说，本发明涉及一种用于胎膜早破的快速检测诊断试纸条。

背景技术

胎膜早破(prematureruptureofmembranes，PROM)是在临产前胎膜自然破裂，孕龄＜37孕周的胎膜早破又称为早产(未足月)胎膜早破(pretermPrematureruptureofmembrane，PPROM)。胎膜早破是围生期最常见的并发症，可以对孕产妇、胎儿和新生儿造成严重不良后果。胎膜早破可导致早产率升高，围生儿病死率增加，宫内感染率及产褥感染率均升高。胎膜早破的原因有：创伤，宫颈内口松弛，生殖道病原微生物上行性感染，支原体感染，羊膜腔压力增高，胎儿先露部与骨盆入口衔接不好，胎膜发育不良，孕妇缺乏铜、锌微量元素。PROM约占妊娠的10％，PPROM约占妊娠的3％，80％～90％的PROM在24h内自然临产，90％的PPROM在7天内临产。如在胎膜早破发生24小时以后才进行诊断会增加胎儿出生前患病率和死亡率，而且错误和不及时的胎膜早破诊断将分别增大孕妇患产前和产后综合症的危险，因此对于正确和及时的胎膜早破裂诊断是必需的，相反，不能正确地诊断胎膜早破会导致不能实施恰当的产科治疗措施。

目前胎膜早破检测方法主要有以下几种：

①硝秦(pH)试纸：根据羊膜液呈碱性，因此会使硝秦试纸变成蓝色，从而达到检测的目的，但是根据研究统计此方法容易出现假阳假阴结果，且必需用扩阴镜测试取样。

②树枝化粘液观察方法：通过显微镜观察树枝状(结晶化)的干燥羊水。此方法同样容易出现假阳假阴结果，检测的灵敏度和稳定性不高，且需要扩阴镜检和显微镜等必备仪器。

③羊水池：在阴道后穹隆观察羊水池，此方法仅依靠医生的主观判断，需要扩阴镜；结果判断主观，尿液，精液以及其他液体很容易被认为是羊水。

④超声波：超声波技术可以检测出羊水过少，从而显示出因胎膜破裂导致的羊水流失。如果单独使用的话并不是一个可靠的过滤方法，只能用来确诊，非常耗时；需要仪器和专家操作；只能检测出显著的羊水流失；不能确认羊水流失的原因；并不是所有的医疗机构都能提供每周7天，每天24小时的专业超声服务。

⑤检验胎膜破裂的“黄金标准”——羊膜-染料灌注：将稀释过的靛青洋红溶液滴入羊膜腔。如果在20到30分钟之内染料进入阴道(棉球染色)便可以断定胎膜破裂的发生。此方法虽然是很准确，但是却具有高度入侵性(要求羊水诊断技术)，昂贵。羊水诊断可能导致孕期出血，感染，治疗性胎膜破裂，以及流产(可能性为1/270)。

上述检测方法都存在入侵性或不准确，非常耗费精力，同时大概有3％左右的亚临床/无症状胎膜早破是不能被上述任何一种流行方法检测到的(除了染料灌注方法以外，但是基本很少用到)。在胎膜早破检测目前已有利用胎盘阿尔法微球蛋白(PAMG-1)作为标记物判断胎膜早破的胶体金免疫层析试剂盒，但继续开发更精确、简单和家庭检测胎膜早破的试剂和方法具有非常重要的意义。

自从20世纪70年代开始，羊水中的多种蛋白质就已经被发现了，包括胎盘阿尔法微球蛋白1(PAMG-1)；胎盘阿尔法微球蛋白2(PAMG-2)；人甲胎蛋白；泌乳刺激素；胎儿纤连蛋白和和胎膜破裂较少关联的其他蛋白质。在羊水中上述很多蛋白质都具有较高的浓度，在血浆中则浓度较低。

胰岛素样生长因子结合蛋白-1(Insulin-like growth factor bindingprotein-1，IGFBP-1)是人子宫内膜基底细胞蜕膜化培育的分泌蛋白。妊娠期IGFBP-1浓度增加，是妊娠中晚期羊水中主要的蛋白质，在不同体液和组织中，IGFBP-1磷酸化结构不同。已发现蜕膜细胞和人的肝脏分泌大量磷酸化的IGFBP-1，而羊水、胎儿血清和母体血浆中含有丰富的非磷酸化IGFBP-1。

由于人脱膜细胞主要分泌磷酸化IGFBP-1，宫颈成熟临近分娩时，胎膜开始从蜕膜壁上分离，蜕膜和黏附其上的绒毛膜被相互分解成小碎片，蜕膜细胞分泌磷酸化IGFBP-1的水平显著增加，磷酸化的IGFBP-1漏到宫颈分泌物中，宫颈阴道分泌物中的IGFBP-1高磷酸化异构体与宫颈成熟度有关，可作为预测宫颈成熟和分娩即将发动的标志。当宫颈阴道分泌物中高磷酸化IGFBP-1的含量≥50μg/L时，可作为早产预测。

在胎膜早破的早期诊断方面，存在现有技术有专利申请号为：PCT/US2003/0251252003.8.12，检测引导分泌物中羊水的装置和方法；该发明以胎盘阿尔法微球蛋白1(PAMG-1)为标志物，使用了双抗体夹心的胶体金免疫层析法。另有专利申请号为200810046729.7的专利，该发明同样使用双抗体夹心的胶体金免疫层析法，以AMNI-PROTEIN为标志物检测胎膜早破。上述现有技术的缺陷在于，使用胶体金标记标志物，制备过程需要接触重金属，且胶体金分离纯化过程复杂，并难以实现定量检测，无法判断胎膜破裂的时间和所处的阶段。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供了一种胎膜早破快速检测试纸条。

为实现上述目的，本发明采取了以下的技术方案：

一种胎膜早破快速检测试纸条，所述试纸条由样品垫、玻璃纤维膜、包被膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底衬上构成，所述玻璃纤维膜上涂敷有胶乳颗粒标记的胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)的高特异性单克隆抗体；包被膜包括包被抗-胰岛素样生长因子结合蛋白-1特异性单克隆抗体的检测区和包被抗鼠抗体的控制区。

优选地，所述胰岛素样生长因子结合蛋白-1的高特异性单克隆抗体与胶乳颗粒的比例为1μg～125μg/100μl，所述胶乳颗粒标记的胰岛素样生长因子结合蛋白-1的高特异性单克隆抗体涂敷在玻璃纤维膜上的稀释参数为20cm²/ml～30cm²/ml。

优选地，所述抗-IGFBP-1特异性单克隆抗体的浓度为10μg/ml，在所述检测区的用量为20μl/35cm；所述抗鼠抗体的浓度为10μg/ml，在所述控制区的用量为20μl/35cm。

优选地，所述胶乳颗粒为彩色胶乳颗粒、荧光胶乳颗粒或磁胶乳颗粒；胶乳颗粒是利用化学结合的方式与蛋白质结合，形成免疫诊断试剂。

优选地，所述胶乳颗粒的直径为0.1～1μm。

本发明以高磷酸化胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)为检测标志物。检测原理是将胶乳颗粒与IGFBP-1高特异性单抗结合标记，抗-IGFBP-1单克隆抗体和抗鼠抗体包被到包被膜上，分别形成检测区(T线)和质控区(C线)，把试纸样本加样区放入待测样本中(液面不得超过MAX线)，由于毛细管作用样品将沿着试纸条向吸水纸移动，当移动到IGFBP-1单抗标记的玻璃纤维膜时，如果样品中IGFBP-1量足够与IGFBP-1单抗标记探针发生特异结合形成复合物，复合物移至检测区(T线)时，就被膜上抗-IGFBP-1单抗包被的抗体捕获，胶乳颗粒标记物在相应的配体处大量聚积，通过肉眼观察或者通过读取仪器测定来判断是否发生胎膜早破。

当使用彩色胶乳标记IGFBP-1单抗，所形成的检测带是一条肉眼可见的显色带；说明样本中含有较高浓度的IGFBP-1，致使试纸条上积聚的颜色颗粒为肉眼所见，说明出现胎膜早破。

如果试纸条T线不显色或者非常浅时，表明待测样本IGFBP-1量很低(以是否超过50μg/L为检测限)，在检测区形成的双抗夹心复合物特别的少，不能在彩色胶乳标记条件下呈现出来，以致试纸条上积聚的彩色胶乳复合物不能为肉眼所见，即可以认定为未出现胎膜早破。根据此原理，以T线和C线同时显色为阳性，T线不显色，C线显色时为阴性进行结果判断。

本发明控制C线包被的是抗鼠抗体，当样品通过胶乳颗粒标记的IGFBP-1单抗移动至控制线时，无论样品中有没有IGFBP-1，都会与抗鼠抗体结合滞留，在控制线(C线)显示颜色。因此如果控制线无色带产生则为操作错误或者检测时样品液面超过MAX线或试纸已经过期。

本发明以胰岛素样生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)为标志物，采用间接法取代常用的双抗体夹心法，提高检测的准确性，且以胶乳颗粒代替胶体金颗粒，优化制备方法，提高检测灵敏度，可以实现定量检测，以推断胎膜破裂的阶段，为医护患者提供更加充足的信息。

本发明所述的试纸条与放射性免疫、酶联免疫法相比，具有操作安全(无放射物污染)、简便(简单操作一步完成)、适合单人/份检测(放免、酶免不适合单人/份或少量样品检测)和快速(10分钟左右即可有结果)等优点。本发明试纸条操作简便、快速、不需要专门技术，无创伤，结果易读，可实现对胎膜早破及时现场和家庭自检，且在蛋白标记过程中，不需要接触重金属离子，颜色可变多样，采用荧光胶乳标记时，可以实现定量检测等优点。

附图说明

图1是本发明的结构示意图；

图2是本发明阳性结果示意图；

图3是本发明阴性结果示意图；

附图标记：1、样品垫；2、玻璃纤维膜；3、包被膜；4、吸水纸；5、检测区；6、控制区；7、底衬。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

实施例1  胎膜早破彩色胶乳快速检测试纸条

如图1所示，本发明所述的胎膜早破快速检测试纸条，该试纸条是在底衬7上顺次相互搭接地粘贴样品垫1、涂覆彩色胶乳颗粒标记IGFBP-1单抗的玻璃纤维膜2、包被膜3以及吸水纸4而成，包被膜3具有检测区5和控制区6，检测区5包被抗-IGFBP-1单抗，控制区6包被抗鼠抗体。

IGFBP-1单抗与胶乳颗粒的比例为10μg/100μl，胶乳微粒标记的IGFBP-1单抗涂敷在玻璃纤维膜上的稀释参数为25cm²/ml。抗-IGFBP-1特异性单克隆抗体和抗鼠抗体的浓度为10μg/ml，在检测区和控制区的用量为20μl/35cm。

该实施例中的检测试纸条的制备方法为：

1、制备IGFBP-1和抗-IGFBP-1高特异性单抗

利用常规方法从体液(羊水)中分离IGFBP-1，用IGFBP-1免疫的小鼠，与骨髓瘤细胞融合，用ELISA方法鉴别，鉴别出来的杂交瘤在腹水中培养，筛选阳性克隆，分离纯化IGFBP-1单抗。

抗-IGFBP-1单抗的制备方法与IGFBP-1单抗制备方法相同，免疫原采用上述生产制备的IGFBP-1单抗。

ELISA鉴定IGFBP-1单抗和抗-IGFBP-1单抗的活性和效价，纯化备用。

2、彩色胶乳的制备及与IGFBP-1单抗的结合

通过控制反应物二乙烯苯用量和介质、引发剂和染料等合成聚苯乙烯彩色微球，并在控制晶核的大小，聚合时间与染料颜色的过程中，将微球的表面乙烯基团酰肼化，引入酰胺基再将此酰胺基羧基化、氨基化合成合格的彩色胶乳。在该实施例中，彩色胶乳微球表面基团为羧基(-COOH)、粒径：200nm(偏差＜5％)。

首先，超声波处理彩色胶乳微球体30秒，调节胶乳微球体浓度为1.0×10⁶～1.0×10⁷/ml，8000×g离心4分钟，离心后收集沉淀物用100MmpH6.0～7.0磷酸钠溶液溶解，并超声波处理30秒；加入浓度为60mg/ml的EDC，混匀；室温孵育30分钟后8000×g、离心4分钟，收集沉淀物，用20mM～100mM的pH5.0～6.0的柠檬酸缓冲液溶解，放置于2～8℃环境。

将上述活化后的彩色胶乳微球超声波处理30秒后，按照10μg IGFBP-1单抗/100μl彩色胶乳的比例，混匀后室温搅拌反应2小时，然后进行离心洗涤3次，每次8000×g、离心4分钟，沉淀用PSB-TBN溶解并超声波处理30秒，加入磷酸缓冲液，形成蛋白探针；将单抗蛋白探针喷洒到玻璃纤维膜上，稀释参数为20cm²/ml～30cm²/ml，并在温度30～35℃，湿度30％以下，已标记探针玻璃纤维膜干燥12个小时以上，备用。

3、膜的固相化

抗-IGFBP-1单克隆抗体包被到硝酸纤维素膜上及其封闭方法是：膜上包被的检测区和控制区是用包被缓冲液将抗-IGFBP-1单克隆抗体和抗鼠抗体稀释至浓度为10μg/ml，硝酸纤维素膜孔径为5.0μm～12.0μm，按膜液量为20μL/35cm，将单抗及抗鼠抗体喷到硝酸纤维膜上，两区间隔5mm，应细致均匀，室温凉干20分钟；25℃～37℃在封闭液浸泡60分钟，取出后置25℃～37℃烘干处理2小时，封袋，以备贴板用。

检测线：抗-IGFBP-1单抗。

控制线：抗鼠抗体。

4、试纸条各部分依序粘贴在一起，形成试纸条。

该实施例中的试纸条的使用方法及结果判断

如图2和图3所示，加样后，反应1～2分钟即可看到检测区(T线)5和质控区(C线)6相应的位置上出现颜色条带，如果C线和T线均出现颜色条带，如图2，结果为阳性，说明样品IGFBP-1含量高，出现了胎膜早破；T区不出现红色条带，如图3，结果为阴性，说明样品IGFBP-1含量低，没有胎膜早破。如果C线不出现颜色条带，说明试纸条失效。

实施例2  胎膜早破磁胶乳快速检测试纸条

该实施例中的检测试纸条除了玻璃纤维膜2上涂覆磁胶乳标记IGFBP-1单抗，其他结构均与实施例1相同。其中磁胶乳颗粒是核壳式二氧化硅磁性微球，表面基团为羧基(-COOH)，固含量：10％，粒径：500nm(偏差＜10％)，磁含量为20％。

IGFBP-1单抗与磁胶乳颗粒的比例为100μg/100μl，胶乳颗粒标记的IGFBP-1单抗涂敷在玻璃纤维膜上的稀释参数为30cm²/ml。抗-IGFBP-1特异性单克隆抗体和抗鼠抗体的浓度为10μg/ml，在检测区和控制区的用量为20μl/35cm。

该实施例中的检测试纸条的制备方法为：

1、制备IGFBP-1和抗-IGFBP-1高特异性单抗

与实施例1中步骤1的制备方法相同。

2、磁胶乳与IGFBP-1单抗的结合

磁胶乳颗粒购自Bangs Laboratories，Inc.

以100μg IGFBP-1单抗/100μl磁胶乳的比例标记形成蛋白探针，单抗蛋白探针喷洒到玻璃纤维膜上，稀释参数为30cm²/ml，并在温度30～35℃，湿度30％以下，已标记探针玻璃纤维垫干燥12个小时以上，备用。

3、膜的固相化

与实施例1中步骤3的制备方法相同。

4、试纸条各部分依序粘贴在一起，形成试纸条。

该实施例中的试纸条的使用方法及结果判断

如图2和图3所示，加样后，反应1～2分钟，通过配套的磁定量分析仪读取试纸条上即可看到检测区(T线)5和质控区(C线)6相应的位置上磁性颗粒的的信号大小，并根据相关曲线实现对待测物的定量检测。

实施例3  胎膜早破荧光胶乳快速检测试纸条

该实施例中的检测试纸条在玻璃纤维膜2上涂覆荧光胶乳标记IGFBP-1单抗，其他结构均与实施例1相同。荧光胶乳颗粒与IGFBP-1抗体偶联，通过对抗体偶联量、检测线划膜抗体浓度与检测信号的关系曲线，实现对IGFBP-1定量检测。

其中荧光胶乳颗粒是将荧光素与以苯乙烯为单体的聚合物结合形成的荧光高分子微球，平均粒径在200-250nm，最大激发波长在550nm。

IGFBP-1单抗与荧光胶乳颗粒的比例为50μg/100μl，荧光胶乳颗粒标记的IGFBP-1单抗涂敷在玻璃纤维膜上的稀释参数为20cm²/ml。抗-IGFBP-1特异性单克隆抗体和抗鼠抗体的浓度为10μg/ml，在检测区和控制区的用量20μl/35cm。

该实施例中的检测试纸条的制备方法为：

1、制备IGFBP-1和抗-IGFBP-1高特异性单抗

与实施例1中步骤1的制备方法相同。

2、荧光胶乳与IGFBP-1单抗的结合

荧光胶乳标记是将胶乳微球与含有羧基、氨基、羟基等脂类或其他大分子物质和各类不同的荧光素共价结合所形成的荧光胶乳颗粒，利用大分子物质具有的羧基、氨基等基团结合待标记蛋白物质(抗原/抗体)的技术。以50μgIGFBP-1单抗/100μl荧光胶乳的比例标记形成蛋白探针，单抗蛋白探针喷洒到玻璃纤维膜上，稀释参数为20cm²/ml，并在温度30～35℃，湿度30％以下，已标记探针玻璃纤维垫干燥12个小时以上，备用。

3、膜的固相化

与实施例1中步骤3的制备方法相同。

4、试纸条各部分依序粘贴在一起，形成试纸条。

该实施例中的试纸条的使用方法及结果判断

加样后，反应1～2分钟即可看到检测区(T线)5和质控区(C线)6相应的位置上出现荧光条带，如果C线和T线均出现荧光条带，结果为阳性，说明样品IGFBP-1含量高，出现了胎膜早破；T区不出现荧光条带，结果为阴性，说明样品IGFBP-1含量低，没有胎膜早破。C线不出现荧光条带，说明试纸条失效。

该实施例中的胎膜早破荧光胶乳快速检测试纸条如与荧光定量仪器配套使用，将可实现定量检测。

Claims (5)

1.一种胎膜早破快速检测试纸条，所述试纸条由样品垫(1)、玻璃纤维膜(2)、包被膜(3)、吸水纸(4)顺次搭接粘贴在底衬(7)上构成，其特征在于，所述玻璃纤维膜(2)上涂敷有胶乳颗粒标记的胰岛素样生长因子结合蛋白-1的高特异性单克隆抗体；包被膜(3)包括包被抗-胰岛素样生长因子结合蛋白-1特异性单克隆抗体的检测区(5)和包被抗鼠抗体的控制区(6)。

2.根据权利要求1所述的胎膜早破快速检测试纸条，其特征在于，所述胰岛素样生长因子结合蛋白-1的高特异性单克隆抗体与胶乳颗粒的比例为1μg～125μg/100μl，所述胶乳颗粒标记的胰岛素样生长因子结合蛋白-1的高特异性单克隆抗体涂敷在玻璃纤维膜上的稀释参数为20cm²/ml～30cm²/ml。

3.根据权利要求1所述的胎膜早破快速检测试纸条，其特征在于，所述抗-胰岛素样生长因子结合蛋白-1特异性单克隆抗体的浓度为10μg/ml，在所述检测区的用量为20μl/35cm；所述抗鼠抗体的浓度为10μg/ml，在所述控制区的用量为20μl/35cm。

4.根据权利要求1-3任一项所述的胎膜早破快速检测试纸条，其特征在于，所述胶乳颗粒为彩色乳胶颗粒、荧光胶乳颗粒或磁胶乳颗粒。

5.根据权利要求4所述的胎膜早破快速检测试纸条，其特征在于，所述胶乳颗粒的直径为0.1～1μm。

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