CN101871942B - 以icam-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒及制备方法 - Google Patents
以icam-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒及制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101871942B CN101871942B CN 201010189663 CN201010189663A CN101871942B CN 101871942 B CN101871942 B CN 101871942B CN 201010189663 CN201010189663 CN 201010189663 CN 201010189663 A CN201010189663 A CN 201010189663A CN 101871942 B CN101871942 B CN 101871942B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- icam
- monoclonal antibody
- concentration
- serum albumin
- bovine serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
一种以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒，包括包被有ICAM-1单克隆抗体的多孔板、生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)检测液、与生物素标记的ICAM-1单克隆抗体结合的亲和素-辣根过氧化物酶、显色底物3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺和ICAM-1蛋白标准品。上述试剂盒的制备方法有以下工艺步骤：(1)制备包被有ICAM-1单克隆抗体的多孔板；(2)制备生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)检测液；(3)配备亲和素-辣根过氧化物酶、显色底物3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺和ICAM-1蛋白标准品。
Description
技术领域
本发明属于医用试剂盒领域，特别涉及一种用于检测妊娠期妇女胎膜早破(PrematureRupture of Fetal Membrane，简称PROM)的夹心酶联免疫吸附测定试剂盒及其制备方法。
背景技术
胎膜破裂(Rupture of Fetal Membrane，简称ROM)可能在孕期随时发生，在临产前发生的胎膜破裂称为胎膜早破(PROM)。足月后(37孕周)PROM发生率约为10％；足月前(37孕周前)PROM的发生率为2-3.5％。胎膜早破是引起产科病人产前、产后并发症的主要因素，是导致胎儿早产和新生儿必须入住重症监护室的主要原因。由于医务人员不得不在延长孕周与宫内及孕妇感染的风险和胎儿肺发育问题之间求平衡，因而对胎膜早破患者的管理成本高、难度大，准确及时诊断孕妇是否发生胎膜早破至关重要。
现有技术中，采用金标准是诊断胎膜早破的一种准确方法，即在孕妇羊膜腔内注入染料(如美蓝)，若阴道内有被染料着色的液体流出即可诊断为胎膜早破，但采用金标准检测临床很难操作，并且造成患者的痛苦，故临床很少使用。临床上通常采用询问病史、患者自诉阴道有羊水流出、阴道分泌物pH值变为偏碱性(正常阴道分泌物pH为4.5～5.5)、显微镜下查见阴道分泌物涂片中出现羊水结晶等方法，这些方法虽然操作简单，但准确性、敏感性均较低。
细胞间黏附分子-1(Intercellular Adhesion Molecule 1，简称ICAM-1，权利要求书和说明书中，以“ICAM-1”表示细胞间黏附分子-1)属于黏附分子的免疫球蛋白超家族，是分子量76kD～114kD的单链糖蛋白。ICAM-1广泛表达在机体的血管内皮细胞、胸腺上皮细胞和其他种类的上皮细胞等非血源性细胞的表面，T淋巴细胞、B淋巴细胞和树突状细胞等血源性细胞的表面，以及成纤维细胞的表面，与淋巴细胞的浸润有关。虽然在妊娠晚期(孕周28-40)，受胎膜和羊水中的单核细胞上ICAM-1的表达和中性粒细胞活化的影响，妊娠妇女的羊水中ICAM-1水平升高，但目前尚未发现以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒及其制备方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒及其制备方法，以提高胎膜早破检测的准确性，减轻患者的痛苦。
本专利申请的发明人通过实验发现：ICAM-1是妊娠晚期出现在羊水中的主要蛋白质之一，含量为13.08±6.1lng/mL。胎膜早破时将有羊水从羊膜腔中渗漏至阴道，羊水中的ICAM-1则会出现在阴道分泌物/宫颈粘液(Cervical-Vaginal Fluid，CVF)中。蛋白芯片筛选实验发现：确诊的PROM产妇与确诊的非PROM产妇相比(两组产妇的年龄与妊娠周龄匹配，无基础疾病，无妊娠合并症)，阴道分泌物/宫颈黏液样本中ICAM-1的浓度具有明显差异。因此，可将ICAM-1作为胎膜早破的检测指标。
本发明所述以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒，包括包被有ICAM-1单克隆抗体的多孔板、生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)检测液、与生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-lAb)结合的亲和素-辣根过氧化物酶、显色底物3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺和ICAM-1蛋白标准品。
实验表明，上述试剂盒所含包被有ICAM-1单克隆抗体的多孔板，优选每孔包被ICAM-1单克隆抗体0.9μg～1μg。
上述试剂盒中，所述生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)检测液主要由生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)、牛血清白蛋白、甘油和磷酸盐缓冲液组成，生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)的浓度为24mg/ml，牛血清白蛋白的浓度为1.5g～3g/100ml，甘油的浓度为50ml/100ml。
所述生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)由生物素酰-N羟基丁二酰亚胺酯和ICAM-1单克隆抗体耦联而成，酰-N羟基丁二酰亚胺酯与ICAM-1单克隆抗体的质量比为0.5～1∶7。
为了方便用户使用，本发明所述试剂盒还可配备样本稀释液，所述样本稀释液是在浓度0.01mol/L～0.02mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)或浓度0.01mol/L～0.02mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液，TBS)中加入牛血清白蛋白配制而成，牛血清白蛋白的浓度为1g～2g/100ml。
本发明所述以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒的制备方法，工艺步骤如下：
(1)制备包被有ICAM-1单克隆抗体的多孔板
用pH＝8～10的碳酸盐缓冲液将ICAM-1单克隆抗体稀释为浓度10μg/ml的稀释液，然后将所述ICAM-1单克隆抗体稀释液加入多孔板的各孔内，在4℃包被至少12小时；包被时间届满后，将浓度为1g/100ml的牛血清白蛋白溶液加入多孔板上的各孔并在37℃进行封闭反应，反应时间至少为1小时；封闭反应结束后，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液洗涤多孔板，当多孔板上的未反应物被去除后即获得包被有ICAM-1单克隆抗体的多孔板，其保存温度为4℃；
(2)制备生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)检测液
①以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，生物素酰-N羟基丁二酰亚胺酯为溶质配制浓度为50μg/μl的酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液，以pH＝9.6的碳酸盐缓冲液为溶剂，ICAM-1单克隆抗体为溶质配制浓度为24mg/ml的ICAM-1单克隆抗体溶液，将所述酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液和所述ICAM-1单克隆抗体溶液的混合液在搅拌下于室温反应至少4小时，即获得生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)；反应结束后，将含生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)的反应液装入透析袋中，用pH＝9.2的磷酸盐缓冲液在4℃进行透析，透析时间至少为12小时，其间更换透析液至少3次；继后在透析后的所述反应液中加入牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白的加入量以其浓度达到3g～6g/100ml为限；
②将步骤①制备的含生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)和牛血清白蛋白的透析后反应液与甘油按体积比1∶1计量，在室温下混合均匀即形成生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)检测液，其保存温度为-20℃；
(3)配备亲和素-辣根过氧化物酶、显色底物3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺和ICAM-1蛋白标准品。所述亲和素-辣根过氧化物酶、3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺和ICAM-1蛋白标准品均为市售商品，可直接从市场购买。
本发明所述方法中，制备包被有ICAM-1单克隆抗体的多孔板时，所述ICAM-1单克隆抗体稀释液的加入量优选100μl/孔，所述浓度为1g/100ml的牛血清白蛋白溶液的加入量为120μl/孔。
本发明所述方法中，制备生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)时，优选按酰-N羟基丁二酰亚胺酯与ICAM-1单克隆抗体的质量比＝0.5～1∶7量取所述酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液和所述ICAM-1单克隆抗体溶液形成混合液。
为方便用户，本发明所述方法还配备了样本稀释液，所述样本稀释液是在浓度0.01mol/L～0.02mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)或浓度0.01mol/L～0.02mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液，TBS)中加入牛血清白蛋白配制而成，所述牛血清白蛋白的加入量以其浓度达到1g～2g/100ml为限。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明为胎膜早破的检测提供了一种采用新检测指标的试剂盒及其制备方法。
(2)使用本发明所述试剂盒，可定量检测出妊娠妇女阴道分泌物/宫颈粘液(Cervical-Vaginal Fluid，CVF)中ICAM-1的准确含量。
(3)使用本发明所述试剂盒对确诊胎膜破裂组和确诊胎膜未破组妊娠妇女进行采样检测(见实施例2)，检测结果表明：该试剂盒的敏感性为100％，特异性为90％左右，因而可提高胎膜早破检测的准确性。
(4)由于检测样品是妊娠妇女的阴道分泌物，因而是一种无创检测。
本发明所述试剂盒适用于所有妊娠期妇女，尤其是存在早产风险、腹部受到损伤的妊娠期妇女。
附图说明
图1是本发明所述以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒中多孔板的一种形状构造示意图。
图2为A450值-ICAM-1浓度标准曲线。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明所述以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒及其制备方法和使用方法作进一步说明。
下述实施例中涉及的材料来源如下：
ICAM-1单克隆抗体，购自美国R&D公司；
ICAM-1蛋白标准品，购自美国R&D公司；
碳酸盐缓冲液(CB)，购自美国sigma公司；
磷酸盐缓冲液(PBS)，购自美国sigma公司；
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液，TBS)，购自美国sigma公司；
牛血清白蛋白，购自美国sigma公司；
N，N-二甲基甲酰胺，购自美国sigma公司；
酰-N羟基丁二酰亚胺酯，购自美国sigma公司；
甘油的规格是分析醇，购自美国sigma公司；
辣根过氧化物酶，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；
3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；
多孔板为96孔的多孔板，其形状和构造如图1所示。
实施例1
本实施例中，采用以下工艺步骤制备以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒：
(1)制备包被有ICAM-1单克隆抗体的多孔板
用pH＝9的碳酸盐缓冲液将ICAM-1单克隆抗体稀释为浓度10μg/ml的稀释液，然后将所述ICAM-1单克隆抗体稀释液按100μl/孔的量加入96孔板的各孔内，在4℃包被12小时；包被时间届满后，将浓度1g/100ml的牛血清白蛋白溶液按120μl/孔的量加入多孔板上的各孔并在37℃进行封闭反应，反应时间为1小时；封闭反应结束后，用pH＝7.2、浓度为0.05mol/l的磷酸盐缓冲液洗涤多孔板，当多孔板上的未反应物被去除后即获得包被有ICAM-1单克隆抗体的多孔板，然后将其置于4℃冰箱中保存备用；
(2)制备生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)检测液
①以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，生物素酰-N羟基丁二酰亚胺酯为溶质配制浓度为50μg/μl的酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液，以pH＝9.6、浓度为1mol/l的碳酸盐缓冲液为溶剂、ICAM-1单克隆抗体为溶质配制浓度为24mg/ml的ICAM-1单克隆抗体溶液，按酰-N羟基丁二酰亚胺酯与与ICAM-1单克隆抗体的质量比＝1∶7量取所述酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液和所述ICAM-1单克隆抗体溶液形成混合液，将所述酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液和所述ICAM-1单克隆抗体溶液的混合液在搅拌下(磁力搅拌器，搅拌速度200转/分)于室温反应4小时，即获得生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)；反应结束后，将含生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)的反应液装入透析袋中，用pH＝9.2、浓度为0.05mol/l的磷酸盐缓冲液在4℃进行透析，透析时间为12小时，其间更换透析液3次；继后在透析后的所述反应液中加入牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白的加入量以其浓度达到4g/100ml为限；
②将步骤①制备的含生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)和牛血清白蛋白的透析后反应液与甘油按体积比1∶1计量，在室温下混合均匀即形成生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)检测液，其保存温度为-20℃；
(3)每个试剂盒配备亲和素-辣根过氧化物酶12ml、显色底物3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺12ml、ICAM-1蛋白标准品(ICAM-1的浓度为10ng/ml)1ml和样本稀释液30ml，样本稀释液是在浓度浓度0.02mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris缓冲液，TBS)中加入牛血清白蛋白配制而成，所述牛血清白蛋白的加入量以其浓度达到2g/100ml为限；所述亲和素-辣根过氧化物酶与生物素标记的ICAM-1单克隆抗体检测液的体积比为1∶1。
实施例2
本实施例以实施例1制备的胎膜早破检测试剂盒对待侧样本进行检测。
1、待测样本
(1)标样准备
将实施例1所述试剂盒中配备的ICAM-1蛋白标准品设为含ICAM-1浓度最高的标样，命名为标样1，其ICAM-1的浓度为10ng/ml，然后用实施例1所述试剂盒中配备的样本稀释液将所述ICAM-1蛋白标准品分别稀释成ICAM-1浓度为5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.63ng/ml、0.32ng/ml、0.16ng/ml的标样，依次命名为标样2、标样3、标样4、标样5、标样6和标样7，共计有7个标样。
(2)试样
以四川大学华西第二医院门诊及住院的产妇为实验对象，根据现有检测方法的检测结果将实验对象分为破膜组和未破膜组，收集两组产妇临产发动时的阴道分泌物/宫颈粘液(Cervical-Vaginal Fluid，CVF)作为试样，共计40个试样，其中，试样1-20取自于破膜组，试样21-40取自于未破膜组。
(3)空白对照
实施例1所述试剂盒中配备的样本稀释液——为空白对照。
2、样本检测
(1)检测前将试剂盒的所有试剂、待测样本缓慢均衡至室温(18℃～25℃)；
(2)将步骤1所准备的标样、空白对照、试样分别加入包被有ICAM-1单克隆抗体的96孔板上的相应加样孔中，各标样、空白对照、试样均设复孔对照；各加样孔中的加样量为100μl。用胶膜遮盖所述96孔板，并将所述96孔板置于振摇仪上在振摇状态下室温孵育2.5小时，振摇速度为100转/分。
(3)孵育时间届满后，吸尽各加样孔中的液体，在自动洗板机上设置清洗程序，以400μl/孔洗液(浓度0.02mol/L的磷酸盐缓冲液或浓度为0.02mol/L的Tris缓冲液)将每个加样孔清洗两次，每次清洗时，洗液需在孔中停留10秒～15秒；清洗完毕后，将96孔板翻转，使各加样孔孔口向下，在吸水滤纸上轻拍使各加样孔中残留的洗液完全去除。
(4)向96孔板上的各加样孔中分别加入100μl生物素标记的ICAM-1单克隆抗体(Biotin-ICAM-1Ab)检测液，然后用胶膜遮盖所述96孔板，并将所述96孔板置于振摇仪上在振摇状态下室温孵育1.5小时，振摇速度为100转/分；孵育时间届满后，吸尽各加样孔中的液体，按步骤(3)所述方法清洗所述96孔板。
(5)向所述96孔板上的各加样孔中分别加入100μl亲和素-辣根过氧化物酶，然后用胶膜遮盖所述96孔板，并将所述96孔板置于振摇仪上在振摇状态下室温孵育1.5小时，振摇速度为100转/分；孵育时间届满后，吸尽各加样孔中的液体，按步骤(3)所述方法清洗所述96孔板。
(6)向所述96孔板上的各加样孔中分别加入100μl 3，3，5，5′-四甲基联苯胺，然后在室温避光孵育10分钟，孵育时间届满后，向各加样孔中分别加入100μl终止液，所述终止液为硫酸和亚硫酸钠配制的水溶液，硫酸的浓度为2mol/L，亚硫酸钠的浓度为0.1mol/L。
(7)将所述96孔板放置在酶标仪中，用酶标仪测各孔的A450值(光密度值或吸光度值)，所测结果见下表(表中的A450值为两孔的加权平均值)。
表1：标样的A450值
| 标样 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| A450值 | 2.8376 | 0.9135 | 0.41355 | 0.2383 | 0.17835 | 0.17175 | 0.11982 |
表2：试样1～20的A450值
| 试样 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| A450值 | 0.3638 | 0.16375 | 0.16085 | 0.15165 | 1.0069 | 0.2259 | 0.3693 |
| 试样 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 |
| A450值 | 0.17465 | 0.233 | 0.24265 | 0.5599 | 0.33065 | 0.3933 | 2.7987 |
| 试样 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | |
| A450值 | 0.34275 | 0.24745 | 0.15465 | 0.9791 | 1.2211 | 0.2005 |
表3：试样21～40的A450值
| 试样 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 |
| A450值 | 0.1784 | 0.1328 | 0.1389 | 0.1587 | 0.15935 | 0.1511 | 0.1329 |
| 试样 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 |
| A450值 | 0.20165 | 0.1739 | 0.155 | 0.13795 | 0.20945 | 0.1218 | 0.2691 |
| 试样 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | |
| A450值 | 0.1142 | 0.11415 | 0.16205 | 0.184 | 0.12305 | 0.1255 |
空白对照的A450值为0.11045。
(8)根据各标样的A450值与各标样中ICAM-1的浓度，制作A450值-ICAM-1浓度标准曲线(见图2)，并得到计算公式y＝0.2863x-0.3038，式中，y为被测样品的A450值，x为被测样品中ICAM-1的含量。
(9)根据所测各试样的A450值，用公式y＝0.2863x-0.3038计算各试样中ICAM-1的浓度，计算结果见下表：
表4：试样1～20的计算结果(ICAM-1浓度单位：ng/ml)
| 试样 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| ICAM-1浓度 | 4.038717 | 2.694061 | 2.674569 | 2.61273 | 8.361378 | 3.111809 | 4.075686 |
| 试样 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 |
| ICAM-1浓度 | 2.767327 | 3.159532 | 3.224396 | 5.356823 | 3.815896 | 4.237005 | 20.40514 |
| 试样 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | |
| ICAM-1浓度 | 3.897228 | 3.256659 | 2.632895 | 8.174518 | 9.801145 | 2.94108 |
表5：试样21～40的计算结果(ICAM-1浓度单位：ng/ml)
| 试样 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 |
| ICAM-1浓度 | 1.456039 | 1.214655 | 1.246945 | 1.351757 | 1.355198 | 1.311526 | 1.215184 |
| 试样 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 |
| ICAM-1浓度 | 1.579113 | 1.432218 | 1.332171 | 1.241917 | 1.620402 | 1.156427 | 1.936159 |
| 试样 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | |
| ICAM-1浓度 | 1.116196 | 1.115931 | 1.36949 | 1.485682 | 1.163043 | 1.176013 |
计算表4中试样1～20的ICAM-1平均浓度，其计算结果为5.06±4.17ng/ml。计算表5中试样21-40的ICAM-1平均浓度，其计算结果为1.34±0.20ng/ml。从计算结果可以看出，取自于破膜组的试样1～20中的ICAM-1平均浓度与取自于未破膜组的试样21～40中的ICAM-1平均浓度的差异具有统计学意义。
根据未破膜组的均数±2*标准差的计算结果设为检测限，因此，本发明所述试剂盒设置的ICAM-1检测限为1.8ng/ml，即待测样本中ICAM-1浓度高于1.8ng/ml判定为阳性(即发生胎膜早破)，ICAM-1浓度低于1.8ng/ml判定为阴性(即未发生胎膜早破)。
Claims (6)
1.一种以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括包被有ICAM-1单克隆抗体的多孔板、生物素标记的ICAM-1单克隆抗体检测液、与生物素标记的ICAM-1单克隆抗体结合的亲和素-辣根过氧化物酶、显色底物3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺和ICAM-1蛋白标准品；
所述生物素标记的ICAM-1单克隆抗体检测液主要由生物素标记的ICAM-1单克隆抗体、牛血清白蛋白、甘油和磷酸盐缓冲液组成，生物素标记的ICAM-1单克隆抗体的浓度为24mg/ml，牛血清白蛋白的浓度为1.5g～3g/100ml，甘油的浓度为50ml/100ml，
所述生物素标记的ICAM-1单克隆抗体由生物素酰-N羟基丁二酰亚胺酯和ICAM-1单克隆抗体耦联而成，酰-N羟基丁二酰亚胺酯与ICAM-1单克隆抗体的质量比为0.5～1∶7。
2.根据权利要求1所述的以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒，其特征在于所述多孔板每孔包被ICAM-1单克隆抗体0.9μg～1μg。
3.根据权利要求1或2所述的以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒，其特征在于还包括样本稀释液，所述样本稀释液是在浓度0.01mol/L～0.02mol/L的磷酸盐缓冲液或浓度0.01mol/L～0.02mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中加入牛血清白蛋白配制而成，牛血清白蛋白的浓度为1g～2g/100ml。
4.一种以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒的制备方法，其特征在于工艺步骤如下：
(1)制备包被有ICAM-1单克隆抗体的多孔板
用pH＝8～10的碳酸盐缓冲液将ICAM-1单克隆抗体稀释为浓度10μg/ml的稀释液，然后将所述ICAM-1单克隆抗体稀释液加入多孔板的各孔内，在4℃包被至少12小时；包被时间届满后，将浓度为1g/100ml的牛血清白蛋白溶液加入多孔板上的各孔并在37℃进行封闭反应，反应时间至少为1小时；封闭反应结束后，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲液洗涤多孔板，当多孔板上的未反应物被去除后即获得包被有ICAM-1单克隆抗体的多孔板；
(2)制备生物素标记的ICAM-1单克隆抗体检测液
①以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，生物素酰-N羟基丁二酰亚胺酯为溶质配制浓度为50μg/μl的酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液，以pH＝9.6的碳酸盐缓冲液为溶剂，ICAM-1单克隆抗体为溶质配制浓度为24mg/ml的ICAM-1单克隆抗体溶液，按酰-N羟基丁二酰亚胺酯与ICAM-1单克隆抗体的质量比＝0.5～1∶7量取所述酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液和所述ICAM-1单克隆抗体溶液形成混合液，将所述酰-N羟基丁二酰亚胺酯溶液和所述ICAM-1单克隆抗体溶液的混合液在搅拌下于室温反应至少4小时，即获得生物素标记的ICAM-1单克隆抗体；反应结束后，将含生物素标记的ICAM-1单克隆抗体的反应液装入透析袋中，用pH＝9.2的磷酸盐缓冲液在4℃进行透析，透析时间至少为12小时，其间更换透析液至少3次；继后在透析后的所述反应液中加入牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白的加入量以其浓度达到3g～6g/100ml为限；
②将步骤①制备的含生物素标记的ICAM-1单克隆抗体和牛血清白蛋白的透析后反应液与甘油按体积比1∶1计量，在室温下混合均匀即形成生物素标记的ICAM-1单克隆抗体检测液；
(3)配备亲和素-辣根过氧化物酶、显色底物3′，3′，5，5′-四甲基联苯胺和ICAM-1蛋白标准品。
5.根据权利要求4所述的以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒的制备方法，其特征在于还配备样本稀释液，所述样本稀释液是在浓度0.01mol/L～0.02mol/L的磷酸盐缓冲液或浓度0.01mol/L～0.02mol/L的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中加入牛血清白蛋白配制而成，所述牛血清白蛋白的加入量以其浓度达到1g～2g/100ml为限。
6.根据权利要求4或5所述的以ICAM-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒的制备方法，其特征在于制备包被有ICAM-1单克隆抗体的多孔板时，所述ICAM-1单克隆抗体稀释液的加入量为100μl/孔，所述浓度为1g/100ml的牛血清白蛋白溶液的加入量为120μl/孔。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010189663 CN101871942B (zh) | 2010-06-02 | 2010-06-02 | 以icam-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒及制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010189663 CN101871942B (zh) | 2010-06-02 | 2010-06-02 | 以icam-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒及制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101871942A CN101871942A (zh) | 2010-10-27 |
| CN101871942B true CN101871942B (zh) | 2013-05-22 |
Family
ID=42996928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201010189663 Active CN101871942B (zh) | 2010-06-02 | 2010-06-02 | 以icam-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒及制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101871942B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102297963A (zh) * | 2011-05-30 | 2011-12-28 | 吉权 | 一种胎膜早破胶体金试纸反应缓冲液及其制备方法 |
| CN102426243B (zh) * | 2011-11-17 | 2014-03-19 | 成都创宜生物科技有限公司 | 以补体因子d为检测指标的子痫前期检测试剂盒的制备方法 |
| CN103149362B (zh) * | 2013-02-28 | 2015-10-14 | 成都创宜生物科技有限公司 | 一种检测胎膜早破免疫层析试纸的制备方法 |
| CN103267851B (zh) * | 2013-05-08 | 2015-09-30 | 成都创宜生物科技有限公司 | 一种检测胎膜早破的试剂盒及其制备方法 |
| CN103698537A (zh) * | 2014-01-06 | 2014-04-02 | 天津医科大学总医院 | 定量检测人血清可溶性细胞间粘附分子-1的化学发光免疫分析试剂盒及检测方法 |
| CN110093311A (zh) * | 2018-01-29 | 2019-08-06 | 中国科学院上海生命科学研究院 | Icam-1标记及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101377496A (zh) * | 2008-04-16 | 2009-03-04 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 一种检测甲状腺过氧化物酶自身抗体的化学发光免疫分析测定试剂盒 |
-
2010
- 2010-06-02 CN CN 201010189663 patent/CN101871942B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101377496A (zh) * | 2008-04-16 | 2009-03-04 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 一种检测甲状腺过氧化物酶自身抗体的化学发光免疫分析测定试剂盒 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 张丽珍.细胞间粘附分子-1与胎膜早破的相关研究.《中国优秀硕士学位沦为全文数据库医药卫生科技辑》.2009,(第01期),摘要，第12页2.2.1血清中sICAM-1浓度的测定. |
| 李惠等.细胞间黏附分子-1在早产胎膜早破患者胎膜组织中的表达及意义.《中国妇幼保健》.2009,第24卷(第30期),4301-4303. |
| 细胞间粘附分子-1与胎膜早破的相关研究;张丽珍;《中国优秀硕士学位沦为全文数据库医药卫生科技辑》;20090115(第01期);摘要，第12页2.2.1血清中sICAM-1浓度的测定 * |
| 细胞间黏附分子-1在早产胎膜早破患者胎膜组织中的表达及意义;李惠等;《中国妇幼保健》;20091231;第24卷(第30期);4301-4303 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101871942A (zh) | 2010-10-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101871942B (zh) | 以icam-1为检测指标的胎膜早破检测试剂盒及制备方法 | |
| Nebel | On-farm milk progesterone tests | |
| Rutanen et al. | Evaluation of a rapid strip test for insulin-like growth factor binding protein-1 in the diagnosis of ruptured fetal membranes | |
| Anai et al. | Vaginal fluid hCG levels for detecting premature rupture of membranes | |
| CN101509917A (zh) | 预测早产风险的方法和试剂盒 | |
| AU674327B2 (en) | Diagnostic method for determining the susceptibility to delivery and reagent kit for use therefor | |
| CN107121541B (zh) | 检测cxcl12的试剂在制备预测诊断map试剂盒中的用途及试剂盒、装置、筛选方法 | |
| CN101858917B (zh) | Axl单克隆抗体的应用及以Axl为检测指标的胎膜早破检测试剂盒和制备方法 | |
| CN114609391A (zh) | 人胎盘生长因子测定试剂盒及其制备方法 | |
| CN102053157A (zh) | 一种胎膜早破快速检测试纸条 | |
| CN103267851B (zh) | 一种检测胎膜早破的试剂盒及其制备方法 | |
| CN103134935B (zh) | 一种检测胎膜早破免疫层析试纸的制备方法 | |
| CN103163305A (zh) | 一种快速判断女性妊娠情况的方法 | |
| CN204832205U (zh) | 一种快速定量检测sFlt-1和Endoglin试纸 | |
| CN102426243B (zh) | 以补体因子d为检测指标的子痫前期检测试剂盒的制备方法 | |
| CN109212195A (zh) | 一种利用磁微粒化学发光法快速检测人amh的试剂盒 | |
| CN103235134B (zh) | 一种检测胎膜早破的免疫层析试纸及其制备方法 | |
| CN103293310B (zh) | 一种检测胎膜早破的试剂盒 | |
| CN112034180B (zh) | 角蛋白1在异位妊娠中的应用和产品 | |
| CN114487444B (zh) | 一种测定血清中抗穆勒氏管激素含量的检测试剂盒 | |
| WO2010150804A1 (ja) | 破水および羊水塞栓症の検査方法 | |
| CN103149362B (zh) | 一种检测胎膜早破免疫层析试纸的制备方法 | |
| CN112305220B (zh) | 组织蛋白酶z在子痫前期的早期预警、诊断中的应用和产品 | |
| CN103175959A (zh) | 一种检测胎膜早破免疫层析试纸的制备方法 | |
| KHOWAILED et al. | Endothelial-Platelet Dysfunction as an Indicator of Pre-Eclampsia and its Severity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |