DE2751589B2

DE2751589B2 - Verfahren zur Bestimmung eines Liganden oder der Liganden-Bindungskapazität in einem flüssigen Medium

Info

Publication number: DE2751589B2
Application number: DE2751589A
Authority: DE
Inventors: Zvi Gross; Daniel Wagner
Original assignee: Ames Yissum Ltd
Current assignee: Biodex Biotechnological and Diagnostic Systems Ltd
Priority date: 1976-11-19
Filing date: 1977-11-18
Publication date: 1980-01-31
Also published as: AU3074177A; GB1564580A; DE2751589C3; DE2751589A1; CA1108986A; US4166103A; AU510307B2; US4166104A; GB1564579A; JPS5366419A; CA1107195A; IL51224A; FR2371687A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren gemäß μ dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Bei einem derartigen Verfahren werden die freien (nicht gebundenen) Antigene an Adsorbentien gebunden, die durch Zentrifugation ausgefällt werden können. Pulverisiertes Talkum (Magnesiumsilicat), Kaolin (Aluminiumsilicat), Mikrokörner von Siliciumdioxid, CeIIuIosepulver usw. sind einige einfache Adsorbentien, die angewandt werden können. Viele Trennungen werden durchgeführt unter Anwendung von adsorbierender Aktivkohle, die mit Dextran überzogen ist Das Dextran verhält sich eher wie ein Sieb, das es den kleineren Molekülen des freien Antigens erlaubt, hindurchzugehen, die dann an die Aktivkohle gebunden werden, wobei das gebundene Antigen in Lösung bleibt, nachdem die Aktivkohle durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt worden ist, vgl. Principles of Competitive Protein-binding Assays, Herausgeber: W. D. Odell und W. H. Danghaday, Philadelphia und

Toronto 1972, Seite 303 und 310 bis 312.

Es ist femer bekannt, Ionenaustauscher und andere Harze anzuwenden, um freie Antigene durch elektrostatische Kräfte zu binden, und dieses Verfahren wurde bisher hauptsächlich angewandt zur Bestimmung kleiner Moleküle, wie Thyroidhormonen (T-3 und T-4). Beispiele für derartige Verfahren sind in den US-PS 36 59 104,37 10 117 und 39 61 894 angegeben.

Bei den erwähnten Verfahren zur Trennung des Antigen-Antikörper-Komplexes von freiem Antigen wird eine Säule, die mit einem Material gefüllt ist das vorzugsweise entweder das freie Antigen oder den Antigen-Antikörper-Komplex adsorbiert, angewandt Das inkubierte wäßrige Reaktionsgemisch wird von oben auf eine solche Säule aufgebracht und die Säule dann eluiert Die Radioaktivität entweder der Säule oder des Eluats wird dann bestimmt und der Gehalt an Antigen in der Ausgangslösung aus dieser Zählung berechnet

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, für ein spezifisches Bindungsverfahren der beschriebenen Art einen Feststoff als Adsorptionsmittel zu finden, der billiger und leichter zugänglich ist als die bisher bekannten und auf eine größere Anzahl unterschiedlicher Bestimmungsverfahren anwendbar ist

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß man als Feststoff einen nicl'.t-ionenaustauschenden vernetzten Polyvinylalkohol verwendet

Das neue Adsorbens ist vorzugsweise Polyvinylalkohol, der mit Glutaraldehyd vernetzt ist und findet hauptsächlich Anwendung zum Nachweis bzw. zur Bestimmung eines nicht proteinhaltigen Haptens, wie Thyroxin, Trijodthyronin, östriol. Vitamin B12 und Digoxin.

Bei den betliegenden Zeichnungen ist F i g. 1 eine Standardkurve, wie sie angewandt wird zur Bestimmung von Thyroxin nach einem radioimmunologicchen Konkurrenzbindungsverfahren,

F i g. 2 eine Standardkurve zur Anwendung bei der Bestimmung von östriol nach einem radioimmunologischen Konkurrenzbindungsverfahren, und

F i g. 3 eine Standardkurve zur Anwendung bei der Bestimmung von Thyroxin nach einem radioimmunologischen lConkurrenzbindungsverfahren.

Im Rahmen dieser Beschreibung haben die folgenden Ausdrücke die angegebene Bedeutung: »Ligand« ist die Substanz oder Gruppe von Substanzen, deren Vorhandensein oder Menge in einem flüssigen Medium bestimmt werden soll; »bindendes Mittel für den Liganden« ist irgendeine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die eine spezifische Bindungsaffinität für den Liganden unter Ausschluß anderer Substanzen besitzt, und »Bindungs-Analoges des Liganden« ist irgendeine Substanz oder Gruppe von Substanzen, die sich in bezug auf die Bindungsaffinität zu dem bindenden Mittel für den Liganden im wesentlichen wie der Ligand selbst verhält

Das neue Adsorbens kann zur Trennung bei verschiedenen Arten von heterogenen spezifischen Bindungsbestimmungen angewandt werden, wie bei KonkuffenzbindUngiVerfähren, oder den aufeinanderfolgenden Slttigungsverfahren, bei denen die ligandenhaltige Probe mit einem Oberschuß an Bindemittel zusammengebracht wird und die auftretenden, ungesättigten freien Stellen des Bindemittels mit einem markierten Liganden oder einem Analogen davon Bindungen eingehen, indem die Probe anschließend einem Überschuß der markierten Komponente ausge-

setzt wird. Die verbleibende Menge an freier markierter Komponente wird abgetrennt und steht direkt in Beziehung zu der Menge an unbekanntem Liganden in der Probe.

Nach Beendigung der Bindungsreaktion wird das Reaktionsgemisch mit dem neuen Adsorbens zusammengebracht, wobei die freie Form der markierten Komponente selektiv daran adsorbiert wird und das Adsorbens, ar., dem diese Form adsorbiert ist, wird physikalisch von dem Reaktionsgemisch abgetrennt ι ο Anschließend wird die Markierung in dem verbleibenden Reaktionsgemisch oder an dem Adsorbens gemessen. Das Zusammenbringen des Adsorbens mit dem Reaktionsgemisch und die anschließende Trennung kann auf verschiedene Arten durchgeführt werden.

Bei einer Ausfühmngsform kann das Adsorbens in feinteiliger Form, wie in Form von Pulver, Perlen, Körnern, Kristallen, Fäden usw, vorliegen. Das teilchenförmige Adsorbens kann einfach als solches zu dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden, und die Trennung kann durchgeführt werden durch Zentrifugieren, Filtrieren u. ä. Wahlweise kann das teilcl-cnförmige Adsorbens in einer Säule enthalten sein und das Zusammenbringen und die Trennung können durchgeführt werden, indem das Reaktionsgemisch durch die Säule geleitet wird. Ein solches »Durchleiten« kann z. B. ein Perkulieren und/oder Durchspülen von oben durch Schwerkraft des Reaktionsgemisches durch die Säule oder Einziehen des Reaktionsgemisches in die Säule sein. jo

Bei einer anderen Ausführungsform kann das Adsorbens in Form eines festen zusammengesetzten Körpers vorliegen, z. B. als fester Träger, der gegenüber dem Reaktionsgemisch inert ist und mit dem Adsorbens imprägniert oder überzogen ist Bei der Anwendung js wird die Vorrichtung aus Adsorbens und Träger in das Reaktionsgemisch getaucht und nach einer festgesetzten Zeit einfach daraus entnommen, wodurch die notwendige Trennung erreicht wird. Diese Ausführungsform Li besonders günstig zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, da sie in jedem beliebigen Laborgefäß, wie einem Reagens^las, durchgeführt werden kann. Bei dieser speziellen Ausführungsform kann der zusammengesetzte Körper mit dem Adsorbens mit einem Handgriff versehen sein, der damit fest oder abnehmbar verbunden seit. kann. Der Körper kann jede gewünschte Form besitzen. Wenn er innerhalb von Säulen verwendet werden soll, Itegt er vorzugsweise in Form einer Scheibe oder eines Zylinders vor. Bei diese Ausführungsform hängt die Zahl der einzelnen Körper, die in eine Säule gepackt sind, ab ven der Adsorptionskapazität des Körpers und der Konzentration des Liganden in dem Reaktionsgemisch. Der Körper kann durch übliche Imprägnier- u.->d Beschichtungsverfahren hergestellt werden. Vorzugweise wird der Träger zunächst mit dem Adsorbens imprägniert oder überzogen, z. B. durch Eintauchen in ein Bad einer geeigneten Losung und anschließendes Zusammenbringen des so imprägnierten oder überzogenen Trägers mit einer Lösung, enthaltend ein t>o Vernetzungsmittel, wiederum am besten durch Eintauchen.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform gemäß der Erfindung wird die Trennung erreicht durch Anwendung von Adsorptionssäulen, die mit einer teilchenförmigen Form des Adsorbens gefüllt bzw. gepackt sind. Zur Herstellung derartiger Säulen ist es z. B. möglich, Zylinder von Kunststoffspritzen zu verwenden. Jeder Zylinder wird vorher mit einem Mittel zum Verschließen des Bodens, z.B. einer abnehmbaren Kapp·*, versehen, und eine Rückhaltescheibe aus einem gesinterten porösen Äthylenpolymer (Homopolymer oder Copolymer), das mit Detergens behandelt worden ist, wird koaxial auf den Boden des Plastikzylinders gepreßt Nach Einbringen des gekörnten Adsorbens in den Spritzenzylinder wird es, wenn nötig, mit einem Puffer gewaschen und kann sich dann so setzen, daß es frei ist von Luftblasen, woraufhin eine andere poröse Scheibe aus mit Detsrgens behandeltem gesintertem Äthylenpolymer (Homopolymer oder Copolymer) ähnlich der ersten in den Spritzenzylinder eingeführt und koaxial in festen Kontakt mit dem körnigen Adsorbens gebracht wird. Die Menge an Adsorbens in der Säule hängt ab von der Art des Adsorbens und der Art des Tests, für den die Säule hergestellt wird. Die so hergestellte Säule wird dann mit einem entsprechenden Puffer gewaschen. Zur Durchführung einer Messung mit dieser Säule wird das Reaktionsgen?* >ch hergestellt und inkubiert im oberen Teil der Säule. Die Abdichtung am unteren Ende der Säule wird dann entfernt so daß die wäßrige Phase durchfließen kann, und die Säule wird mit Puffer gewaschen, um restliche Mengen der nicht adsorbierten gebundenen Form des Reagens auszuwaschen.

Aus der Gesamtradioaktivität (»Anfangs-«zählung) und der Radioaktivität des abgetrennten Adsorbens nach Beendigung der Bestimmung (»End-«zählung) wird die prozentuale Rückhaltung (Retention) nach der folgenden Gleichung berechnet:

Prozentuale Rückhaltung =

Endzählung
Anfangszählung

χ 100.

Zur Bestimmung der unbekannten Menge z. B. eines Haptens ist es zunächst nötig, eine Reib=; von Bestimmungen mit unterschiedlichen bekannten Mengen an Hapten durchzuführen und dadurch eine Kurve zu ^: ilden, bei der die prozentuale Standardrückhaltung gegen die Konzentration aufgetragen ist Diese Kurve wird dann angewandt zur Bestimmung einer unbekannten Konzentration aus der prozentualen Rückhaltung, die aus den Radioaktivitätszählungen berechnet worden ist

Im Prinzip wird die Gesamtradioaktivität bestimmt durch die Menge des radioaktiv markierten Haptens oder Analogen, die angewandt wird zur Herstellung des Reaktionsgemisches. Um jedoch Ungenauigkeiten zu vermeiden, die durch ein ungenaues Aufbringen bzw. Zugeben der markierten Komponente auftreten können, kann es günstiger sein, die Gesamtradioaktivität experimentell zu bestimmen. Das kann erfolgen entweder vor oder nach der selektiven Bestimmung der Radioaktivität des abgetrennten Adsorbens. Die Gesamtradioaktivität kann bestimmt werden nach Inkubation und vor der tatsächlichen Trennung der Adsorbenssäule von dem restlichen Reaktionsgemisch.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch geeignet zur Bestimmung der Liganden-Bindungskapa^ität in einem flüssigen Medium. Bei einer solcher Bestimmung wird von dem flüssigen Medium angenommen, daß es ein Bindungsmittel für den Liganden enthält. Zum Beispiel kann das enindungsgemäße Verfahren modifiziert werden zur Durchführung des sogenannten »T-3-Aufnahmetests«. Bei diesem Test wird das Thyroidhormon im Serum indirekt bestimmt durch

Bestimmung der verfügbaren Bindungsstellen von Thyroid-bindendem Globulin (TBG), das in dem Serum vorhanden ist. Bei diesem Versuch wird angenommen, daß die Menge an TBG in normalen Sera verhältnismäßig konstant ist und daß es den größten Teil des verfügbaren Thyroidhormons bindet Wenn markiertes T-3 (Trijodthyronin) zu einer Serumprobe zugesetzt wird, wird es von dem TBG gebunden im Verhältnis zu den restlichen verfügbaren Bindungsstellen. Wenn eine große Menge an markiertem T-3 von dem Serum gebunden wird, zeigt das eine große Zahl verfügbarer Bindungsstellen und damit einen geringen Gehalt an Thyroidhormon an und umgekehrt Die Messung des ungebundenen markierten T-3 kann damit in Zusammenhang gebracht werden mit der Schilddrüsenfunktion. Bei der klinischen Anwendung des T-3 Aufnahmetests reicht es in vielen Fällen, das Verhältnis der T-3 ■ IT ^i η ^% ^^n ^m I ^^^ »# BPIvI ei*"« ■ *■ *w ni π ^s wrw T9r *r*■* *m tmmn ^ta ■ ■■ r*w w ■■ m I lUIIIUIIIIIV. Uli t VIgIVIVII llllt ^VIIIVI" HWI IIIUIVII U^UIIUUI \Λ serum zu bestimmen. Dieses Verhältnis kann erhalten werden durch Teilung der Anfangszählung (wie oben definiert), die von der unbekannten Probe erhalten worden ist, durch die Anfangszählung einer Standardserumprobe, die einem parallelen identischen Bestimmungsverfahren unterworfen worden ist.

Eine Analyseneinheit zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren umfaßt erstens den Liganden oder ein Bindungs-Analoges davon, der (bzw. das) mit einer Markierung, wie einem radioaktiven Atom, versehen ist, zweitens ein Bindungsmittel für den Liganden, wie einen Antikörper, und drittens einen festen nicht ionenaustauschenden vernetzten Polyvinylalkohol. Zur Bestimmung der Liganden-Bindungskapazität eines flüssigen Mediums, enthält eine Analyseneinheit erstens den Liganden oder ein Bindungs-Analoges davon, der (das) mit einer Markierung, wie einem radioaktiven Atom, versehen ist, und zweitens einen festen nicht ionenaustauschenden vernetzten Polyvinylalkohol. Die Analyseneinheiten enthalten den Polyvinylalkohol, vorzugsweise in Teilchenform und in einer Säule oder in einer Trägermatrix, wie oben beschrieben.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Herstellung des vernetzten Polyvinylalkohols

5 ml konz. Salzsäure wurden unter Rühren zu einer Lösung von 10 g in kaltem Wasser löslichem kristallinen Polyvinylalkohol (PVA) Typ II (Katalog Nr. P 8136 der Sigma Chemical Co, St Louis, Missouri, USA) in 600 ml Wasser gegeben. Die entstehende viskose Lösung wurde mit einem Rührer mit hoher Kraft gerührt und auf 65⁰C erwärmt Dann wurden 10 ml einer 25%igen wäßrigen Lösung von Glutaraldehyd zugegeben und das Reaktionsgemisch 20 Minuten bei 65° C gerflhrt Der entstehende unlösliche vernetzte PVA wurde abfiltriert und mit destilliertem Wasser gewaschen, bis die Waschflüssigkeit neutral war. Der nasse Filterkuchen wurde mit Äthanol oder Aceton gewaschen und an der Luft getrocknet Die Ausbeute an körnigem weißen Polymer betrug 11,0 g. Beim Erhitzen auf 260⁰C wurde kein Schmelzen, Erweichen oder Zersetzung beobachtet Das Produkt erwies sich als in Wasser und organischen Lösungsmitteln, einschließlich unter Rückfluß siedendem Dimethylformamid (DMF), unlöslich.

Herstellung der Säulen

Es wurden Säulen hergestellt, indem 100 mg des wie oben hergestellten körnigen vernetzten Polyvinylalkohols (PVA) in Zylinder von 5 ml Plastikspritzen gegeben wurden, die vorher mit einer abnehmbaren Bodenkappe und einer Scheibe aus mit Detergens behandeltem gesintertem porösem Copolymer aus Äthylen und Vinylacetat versehen worden war. 2 ml Barbitalpuffer (2,33 g Natriumbarbital und 0,724 g Äthylendinitriltetraacetat in 150 ml Wasser, pH 8,6) wurden zugegeben und anschließend eine zweite mit Detergens behandelte gesinterte poröse Scheibe, wie oben, parallel zu der

in ersten mit einem Stopfen aufgedrückt. Die Bodenkappe wurde entfernt und die PVA-Säulen mit 3 ml Barbitalpuffer gewaschen und anschließend die Kappe wieder aufgesetzt.

Ii B e i s ρ i e I 1 Radioimmunologische Bestimmung von Tyroxin (T-4)

durchzuführen, wurden die folgenden Reagentien zu den mit Barbitalpuffer gewaschenen PVA-Säulen gegeben (alle Reagentien wurden in Barbitalpuffer gelöst):

1. 100μΐ ANS-Lösung (8-Anilin-l-naphthalin-sulfon-

säure-ammoniumsalz,4,0 g/l) ^r> 2. 100 μΙ ^l2SJ-T-4 (ungefähr 40 000 cpm)

3. 100 μΙ T-4 Standard (im Konzentrationsbereich von o — 36 μg/l) oder eine 1:5 verdünnte klinische Serumprobe

4. 100 ulAnti-T-4-Antikörper

Die Säulen wurden leicht geschüttelt, um ein gründliches Vermischen der Reagentien sicherzustellen und nach 5 Minuten langer Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Bodenkappe entfernt und das Reaktionsgemisch konnte in das PVA-Bett eindringen. Die Radioaktivität in jeder Säule wurde bestimmt (Anfangszählung). Jede Säule wurde dann mit 3,0 ml Puffer gewaschen und eine zweite Bestimmung der Radioaktivität der Säule vorgenommen (Endzählung).

Die »prozentuale Rückhaltung« jeder Säule wurde nach der folgenden Gleichung bestimmt:

Prozentuale Rückhaltung = Endzählung Anfangszählung

- χ 100.

Eine Standardkurve wurde erhalten durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung gegen die entsprechende so Konzentration an Thyroxin des T-4 Standards 'F i g. 1).

Die mit bekannten Vergleichssera erhaltenen Ergebnisse waren:

Bekannte Konzentrationen an Konzentrationen an T-4, T 4 in Vergleichssera wie sie entsprechend dem

Beispiel erhalten wurden

ml)

^gZlOO ml)

Lederle I 8-12')
Lederle Π 16-24")
NMS Π 16-19")

8,9; 8.6

16,0; 16,7; 16.0; 16.0 19,0; 20,6; 18,7

*) Lederie Diagnostics, American Cyanamid Company, Feari

River, N.Y., U.S.A.

^b) Nuclear Medical Systems, Inc., 515 Superior, Newport Beach, Ca^ U.S.A.

Klinisch!.' Proben mil unlit
suchten 1-4-(JeIIiIIlLiI

Kiin/cntniliiincn <m 1-4.
«ie sie entsprechend ileni
Heispiel erhallen »linien

</g/l(K) ml)

B. Bestimmungsverfahren

2.3

.18; 3.7
5.5; 4.8
(>.'»: 7.5: X.O
15.4: 14.5

2. 3.

Prozentuale Ruckhaltung =

IS.O: IS.2

I! c i s ρ i e I 2
Radioimmunoiogische Bestimmirig von östriol

Der bei diesem Versuch angewandte Puffer wurde hergestellt durch Losen von 1,57 g Natriumbiphosphat und 0,78 g Natriumäthylendiamintetraessigsäure in 120 ml destilliertem Wasser (pH 7,4). Die Säulen mit vernetztem PVA wurden wie oben hergestellt und mit dem Puffer (6 ml) gewaschen.

Der Versuch wurde durchgeführt durch Aufbringen der folgenden Lösungen auf das obere F.nde der Säule mit vernetztem PVA:

1. 0,5 ml '»J-Östriol(ungefähr lOOOOcpm)

2. 0,25 ml AntiöstriolAntikörper(1 : 150)

3. 0,5 ml östriol Standard (in Konzentrationen von 2.0, 5,0 und 20 ng/ml) oder der unbekannten zu untersuchenden Probe

Das Reaktionsgemisch wurde 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend konnte es in die Säule eindringen. Die Radioaktivität jeder Säule wurde gemessen (Anfangszählung), I ml Puffer wurde durch jede Säule gegeben und die Radioaktivität erneut gemessen (Endzählung). Die F.ichkurve wurde erhalten durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung (wie in Beispiel 1 berechnet) gegen die Konzentration an östriol(Fig. 2).

Unbekannte Mengen an östriol, z. B. Serum, können auf ähnliche Weise mit Hilfe der Kurve der Fig. 2 bestimmt werden. waren:

Beispiel 3

Radioimmunoiogische Bestimmung von Thyroxin (T-4) Bekannte Konzentralion T-4 A. Herstellung von mit vernetztem PVA ⁱⁿ Vergleichssera

überzogenen Scheiben
Ungefähr 6000 Scheiben mit einem Gesamtgewicht (:*g/100 ml)

von 500 g, jeweils mit einem Durchmesser von 10 mm

und einer Dicke von 2 mm, aus Folien eines Copolymers aus Äthylen und Vinylacetat (EVA) (Porvair Ltd, King's Lynn, Norfolk, England) wurden in eine Lösung von 240 g PVA in 2400 ml Wasser bei 65° C gegeben und die Lösung 45 Minuten stehengelassen. Die Scheiben wurden dann von der wäßrigen Lösung abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Die gewaschenen Scheiben wurden in eine Lösung von 96 ml Glutaraldehyd und 8 ml konz. Salzsäure in 2400 ml Wasser bei 65° C gegeben und 15 Minuten in der Lösung gelassen. Die Scheiben wurden von der Lösung abfiltriert, von etwaiger anhaftender Lösung freigewaschen und getrocknet

Zwei mit PVA überzogene Scheiben, die wie oben hergestellt worden waren, wurden in dem Zylinder einer Kunstsloffspritze mit entfernbarer Kappe am Boden aufeinander gelegt. Die Bodenkappe wurde entfernt und die Säule mit 0,1m Tris-maleat-Puffer, pH 7,4 (hergestellt durch Lösen von 285 g Tris-hydroxymethylaminomethan, 1,2 g Maleinsäure und 0,43 g Äthylendiamintetraessigsäure in 290 ml destilliertem Wasser), gewaschen. Der Boden der Säule wurde dann mit der Kappe dicht verschlossen und die Säule bis zu einer Höhe oberhalb der oberen Oberfläche der oberen Scheibe mit dem gleichen Pulver gefüllt.

Um eine radioimmunologische Bestimmung für T-4 durchzuführen, wurden Hie folgenden Reagentien von oben auf die Pufferlösung in der Säule gegeben (alle Reaeentien waren in dem 0.1m Tris-maleat-Puffer. pH 7,4, gelöst).

1. 100 μΙ ANS-Lösung (8-Anilin-l-naphthalin-sulfonsäure-ammonitimsalz,4,0 g/l)

100 μΙ '«J-T-4 (ungefähr 40 000 cpm)

100 μΙ T-4 Standard (im Konzentrationsbereich von 6 — 36 μg/l) oder eine 1 :5 verdünnte klinische

Serumprobe
4. IOX^IAnti-T-4-Antikörper

Man ließ das Reaktionsgemisch 30 Minuten am oberen Ende der Säule inkubieren, und die erste Zählung der Radioaktivität (Anfangszählung) wurde durchgeführt. Die Säulen konnten ablaufen und wurden dann mit 1 ml 0,1m Tris-maleat, pH 7,4, gewaschen und eine zweite Zählung der Radioaktivität vorgenommen (Endzählung).

Die »prozentuale Rückhaltung» jeder Säule wurde berechnet nach der Gleichung:

F.ndzahlung
Anfanes7ahlun{!

χ KH)

Eine Standardkurve wurde erhalten durch Auftragen der prozentualen Rückhaltung gegen die entsprechende Konzentration der T-4 Standards (Fig. 3).

Die mit bekannten Vergleichsseren erhaltenen Werte

Kon/entral ionen an T4,
wie sie entsprechend dem
Beispiel erhallen wurden

ml)

Lederle f 8-12^a) 11.0

Lederle Il 16-24^a) 19,2

NMS II 16-19") 20,8

^a) Lederle Diagnostics, American Cyanamid Company, Pearl

River, N.Y., U.S.A.
^h) Nuclear Medical Systems Inc.. 515 Superior. Newport Beach,

CA., U.S.A.

Unbekannte Mengen an T-4 (z. B. in Serum) können auf die oben angegebene Weise mit Hilfe der Standardkurve der F i g. 3 bestimmt werden.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

909 585/423

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung eines Liganden oder der Liganden-Bindungskapazität in einem flüssigen Medium durch spezifische Bindung, wobei das flüssige Medium mit dem Bestimmungsreagens, umfassend eine bindende Komponente, die mit einer Markierung versehen ist, unter Bildung eines Reaktionssystems, bei dem die gebundene und die ι ο freie Form der markierten Komponente vorhanden ist, zusammengebracht wird, die gebundene Form von der freien Form durch selektive Adsorption der freien Form der markierten Komponente an einen Feststoff getrennt wird und die Markierung in der is gebundenen oder freien Form der markierten Komponente gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man als Feststoff einen nicht-ionenaustauschenden vernetzten Polyvinylalkohol verelendet

2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man einen mit Glutaraldehyd vernetzten Polyvinylalkohol verwendet

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein nicht proteinhaltiges Hapten bestimmt

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Polyvinylalkohol in Teilchenform vorliegt

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn- jo zeichnet, da P man die Trennung durchführt, indem man den teilchenförmigen Polyvinylalkohol zu dem Reaktionsgemisch zugibt und anschließend durch Zentrifugieren oder Filtrieren abtrennt

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den teilchenförmigen Polyvinylalkohol in einer Säule verwendet und die Trennung durchführt indem man das Reaktionsgemisch durch die Säule leitet

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß man den Polyvinylalkohol zusammen mit einer Trägermatrix verwendet und die Trennung durchführt indem man die Trägermatrix mit dem Reaktionssystem zusammenbringt und anschließend daraus entfernt