DE2841782C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein teilchenförmiges Reagenz
zur Verwendung bei Immunanalysen.
Bekanntlich kann man Antigene und Antikörper (sowie
andere bindende Proteine) mit Hilfe einer kompetitiven
Bindungsreaktion unter Verwendung eines markierten Reagen
zes bestimmen, wobei die Bestimmung durch Messung der Menge
an entweder zu einem Komplex gebundener oder ungebunden in
Lösung verbleibender Markierungssubstanz durchgeführt wird.
Ein Beispiel für ein derartiges Verfahren ist die bekannte
Radioimmunassay-Technik, bei der eine radioaktive Markie
rung verwendet wird. Analoge Techniken unter Verwendung
anderer Markierungssubstanzen, wie beispielsweise von En
zymen und Fluorophoren, sind ebenfalls bekannt.
Bei diesen Verfahren ist es entweder erforderlich,
die gebildeten Komplexe oder den freien, ungebundenen,
markierten Reaktionsteilnehmer von dem Rest des Umsetzungs
gemisches abzutrennen, um die Menge an markierter Substanz
in einem der Anteile zu messen. Dieser Abtrennungsschritt
läßt sich selten leicht durchführen und stellt in derarti
gen Bestimmungen eine Irrtumsquelle dar.
Um diese Schwierigkeit zu vermeiden oder
zumindest zu verringern, wurde in der älteren Patent
anmeldung DE-OS 27 10 438 die Verwendung von magnetisch
anziehbaren Teilchen bei Immunoanalysen vorgeschlagen, die
an ihrer peripheren Oberfläche einen an sie kovalent gebun
denen Reaktionsteilnehmer aufweisen. Die Teilchen können
(zusammen mit dem Umsetzungsprodukt zwischen dem Reak
tionsteilnehmer und einer markierten Verbindung des Um
setzungsgemisches) klar und einfach von dem Rest des
Umsetzungsgemisches abgetrennt und die markierte Substanz
in diesem Rest oder auf den Teilchen anschließend bestimmt
werden.
Aus der Literaturstelle Clinica Chimica Acta 63 (1975)
69 bis 72 ist auch schon die Herstellung anziehbarer Teil
chen für Immunanalysen bekannt, indem man Magnetitteilchen
mit einem Aminogruppen enthaltenden Silan überzieht, an
das durch Diazokupplung Antidigoxin-Serum gebunden wird.
Aus der älteren Patentanmeldung DE-OS 26 44 249 ist
schließlich die Verwendung magnetisch anziehbarer Teilchen
in einer wasserunlöslichen polymeren Matrix aus Polystyrol
bei Immunanalysen bekannt, wobei das biologisch aktive
Material an das Polystyrol adsorbiert ist.
Eine Beschränkung dieser Verfahren besteht darin, daß
Voraussetzung für die Reagenzien, die an die magnetischen
Teilchen gekuppelt werden sollen, ist, daß sie an die Poly
merisatmatrix der Teilchen kovalent gebunden oder adsor
biert werden können. Es ist daher nicht möglich gewesen,
Reagenzien zu verwenden, die nicht auf diese Weise an die
magnetischen Teilchen gebunden sind. Unter den Reagenzien,
die auf diese Weise nicht verwendet werden konnten, befin
den sich gegenüber der Matrix inerte, feste Adsorbentien,
wie beispielsweise Aktivkohle und dgl.; diese Materialien
sind jedoch für Immunanalysen äußerst nützlich, da sie zur
Adsorption freier, ungebundener markierter Substanz aus dem
Umsetzungsgemisch verwendet und in Form von Feststoffen aus
dem Umsetzungsgemisch anschließend abgetrennt werden können.
Es wurde nun gefunden, daß man die Verwendung von
magnetisch anziehbaren Teilchen (mit den ihnen innewohnen
den Vorteilen bei der Abtrennung) mit der Verwendung von
Adsorbentien, wie Aktivkohle und dgl. (mit den ihnen inne
wohnenden Vorteil bei der selektiven Adsorption von Reak
tionsteilnehmern) kombinieren kann. Im einzelnen wurde ge
funden, daß diese Adsorbentien in Form von diskreten, festen
Teilchen in eine Polymerisatmatrix eingebettet werden können,
die ebenfalls magnetisch anziehbare Teilchen enthält, so daß
ein magnetisch anziehbares, teilchenförmiges Reagenz zur
Verwendung bei Immunanalysen gebildet wird. Im folgenden
werden die magnetisch anziehbaren teilchenförmigen Mate
rialien gemäß der Erfindung, die aus diskreten, magnetisch
anziehbaren Teilchen sowie diskreten Teilchen aus Adsorp
tionsmittel, die in einer Polymerisatmatrix verteilt sind,
bestehen, einfach als "Teilchen gemäß der Erfindung" be
zeichnet.
Gegenstand der Erfindung ist ein teilchenförmiges
Reagenz zur Verwendung für eine Immunanalyse einer flüssigen
Probe zur selektiven Adsorption einer oder mehrerer in der
Flüssigkeit enthaltener Komponenten, das dadurch gekenn
zeichnet ist, daß jedes Teilchen aus einer kontinuierlichen
Phase aus einer wasserunlöslichen polymeren Matrix besteht,
in die ein magnetisch anziehbares Material und diskrete,
feste, gegenüber der Matrix inerte Teilchen aus einem adsor
bierenden Material eingebettet sind, wobei die adsorbierenden
Teilchen aus Aktivkohle, Talkum, Ionenaustauscherharzen,
Bleicherde, Siliciumdioxid, Oxiden von Zirkon oder Aluminium
oder Titan, porösem Glas, Zeolithen, natürlichen oder syn
thetischen Polymerisaten, unspezifischen polymerisierten
ersten oder zweiten Antikörpern oder Enzymen, unspezifischen
Zelloberflächenantigenen oder -rezeptoren, subzellularen
Teilchen, Viren oder Bakterienzellen bestehen.
In den Teilchen gemäß der Erfindung ist das Adsorp
tionsmittel im Gegensatz zu den bekannten Reagenzien, in
denen ein Material an eine polymere Matrix kovalent gebunden
oder adsorbiert ist, in die polymere Matrix eingebettet.
Das Teilchen gemäß der Erfindung bestehen aus einer
kontinuierlichen Phase aus einer wasserunlöslichen polyme
ren Matrix, die die magnetisch anziehbaren sowie die Ad
sorptionsmittelteilchen eingebettet enthält. Die Matrix
kann aus einer großen Anzahl unterschiedlicher Materialien
bestehen, wie beispielsweise natürliche und synthetische
Polymerisate, wie Polyacrylamid, Cellulose, Celluloseester,
Polyamid, Polycarbonat, Polyvinylharze, Methylmethacrylate,
Polystyrol, Polystyrl-Acrynitril, Epoxidharze, Melamin-
Formaldehyd, Phenol-Formaldehyd, Harnstoff-Formaldehyd,
Polyester, Polyacrylnitril, Polyacrolein, Polyacetal,
vernetzte Proteine und dgl.
Die Matrix dient dazu, die magnetischen und ab
sorbierenden Teilchen in gleichmäßiger Teilchenform zu
halten, ohne daß eine der Komponenten chemisch an die
Matrix gebunden wird. Da einige, wenn nicht die meisten
der adsorbierenden Teilchen völlig innerhalb der Matrix
eingeschlossen und nicht an der Matrixoberfläche teil
weise exponiert sind, ist die Matrix vorzugsweise in einem
solchen Ausmaß porös, das ausreicht, um das Eintreten des
Umsetzungsgemisches zu ermöglichen. Die Porosität der
Matrix kann vorteilhafterweise gesteuert werden, um nur
ausgewählte gelöste Bestandteile eintreten zu lassen, bei
spielsweise kleine Antigene, jedoch nicht große Antikörper;
dieser sog. Gelfiltrationseffekt ist selbst bekannt. Poly
acrylamid ist ein besonders geeignetes Polymerisat zur
Herstellung von Matrices mit ausgewählter Porengröße.
Geeignete magnetisch anziehbare Materialien sind sol
che, die in der obenerwähnten DE-OS 27 10 438 beschrieben
sind.
Die Art des Adsorptionsmittels kann je nach dem
Endzweck der Teilchen gemäß der Erfindung in weiten Grenzen
variieren. Aktivkohle wird am meisten bevorzugt, jedoch
können auch andere Materialien, wie beispielsweise Talkum,
Ionenaustauscherharze, Bleicherde, Siliciumdioxid, Dioxide
von Zirkon, Aluminium und Titan, poröses Glas, Zeolithe,
feinverteilte natürliche und synthetische Polymerisate, un
spezifische polymerisierte erste oder zweite Antikörper oder
Enzyme, unspezifische Zelloberflächenantigene und -rezeptoren,
subzellulare Teilchen, Viren und Bakterienzellen verwendet
werden.
Die Wirkungsweise des Adsorptionsmittels besteht
darin, einen Teil des für die Immunanalyse verwendeten
Umsetzungsgemisches zu adsorbieren oder sich an ihn che
misch zu binden, so daß dieser Teil des Gemisches mit den
Teilchen der Erfindung entfernt wird. Beispielsweise wird
bei der Analyse eines bestimmten Antigens ein Umsetzungs
gemisch gebildet, das die Probe, eine Menge an markiertem
Antigen und einen Antikörper enthält. In dem Gemisch wer
den Komplexe zwischen dem Antikörper und dem Antigen sowie
zwischen dem Antikörper und dem markierten Antigen gebil
det. Dem Gemisch werden dann Teilchen gemäß der Erfindung
zugesetzt, und diese können beispielsweise das freie,
nicht gebundene Antigen (sowohl markiert als auch unmar
kiert) selektiv adsorbieren. Abtrennung der Teilchen durch
eine magnetische Falle bewirkt, daß lediglich die Komplexe
in Lösung zurückbleiben, wonach entweder die Lösung oder
die abgetrennten Teilchen auf ihren Gehalt an markiertem
Antigen hin untersucht werden können.
Es ist ein beträchtlicher Vorteil der vorliegenden
Erfindung, daß die Teilchen gemäß der Erfindung unspezifisch
und nicht immunospezifisch sind und daher einen weiten An
wendungsbereich besitzen. Beispielsweise adsorbiert ein
Teilchen gemäß der Erfindung, das Aktivkohle als Adsorp
tionsmittel enthält, viele unterschiedliche kleine Antigene.
Auf diese Weise können die Teilchen gemäß der Erfindung für
Immunanalysen vieler unterschiedlicher Antigene verwendet
werden. Dies ist von großem Vorteil, da durch die Not
wendigkeit vermieden wird, für jede unterschiedliche Immun
analyse ein anderes Reagenz auf den magnetischen Teilchen
vorzusehen, wie es bisher erforderlich war. Der Anwendungs
bereich der Teilchen gemäß der Erfindung variiert natürlich
mit dem verwendeten Adsorptionsmittel, jedoch bei Materia
lien, wie Aktivkohle und anderen ähnlichen festen Adsor
bentien, kann er hochsignifikant sein.
Die Teilchen gemäß der Erfindung eignen sich ins
besondere für Radioimmunoassays. Das für eine bestimmte
Immunanalyse oder andere Analyse geeignete teilchenförmige
Adsorptionsmittel ist dem Fachmann entweder bekannt oder
kann durch routinemäßige Versuche bestimmt werden. Einige
Beispiele für bestimmte Verwendungen sind die folgenden:
Aktivkohle für die Analyse von Steroiden, Thyroidhormonen
T4 und T3, ACTH, Agiotensin-II, Insulin und Glucagon,
menschlichem Wachstumshormon, Vitamin B12, Folat und
anderen; Talkum oder Siliciumdioxid in Analysen von ACTH,
Wachstumshormon, Parathroidhormon, Insulin und Calcitonin
sowie Vitamin B12; Anionaustauscherharze bei der Analyse
von Insulin und Wachstumshormon, Dogoxin, cyclischem AMP,
cyclischem GMP, Insulin, Angiotensin-I und Thyroxin(T4);
unspezifische polymerisierte erste oder zweite Antikörper
zur Adsorption von Antigenen bzw. ersten Antikörpern oder
zur Herstellung von von Thyroxin und Cortisol usw. freien
Sera; unspezifischen Zelloberflächenantigene und -rezeptoren
sowie subzellulare Teilchen zu Abtrennungszwecken und Bak
terienzellen sowie Viren zum Ermitteln von antibakteriellen
und antiviralen Antikörpern in einer Probe.
Die Teilchen gemäß der Erfindung können zu einzelnen
(manuellen) Analysen oder in automatisierten Systemen nach
dem kontinuierlichen Durchflußprinzip verwendet werden, wie
sie beispielsweise in der obenerwähnten DE-OS 27 10 438 be
schrieben sind. Insbesondere bei den Systemen des konti
nuierlichen Durchflußprinzips muß das spezifische Gewicht der
Teilchen gemäß der Erfindung demjenigen des Umsetzungsgemischs
verhältnismäßig nahekommen, so daß kein unzulässiges Auf
schwimmen oder Absetzen erfolgt und die Teilchen in dem Um
setzungsgemisch in Suspension gehalten werden können. Im all
gemeinen sind spezifische Gewichte von etwa 1,4 bis 3,2
zufriedenstellend.
Die Teilchen gemäß der Erfindung können hergestellt
werden, indem man das teilchenförmige Adsorptionsmittel
und das teilchenförmige, magnetisch anziehbare Material
in einem Polymerisat oder in einem Gemisch, das ein Poly
merisat bildet, dispergiert. Im Falle einer Polyacrylamid-
Matrix können die beiden teilchenförmigen Materialien bei
spielsweise mit einem oder mehreren flüssigen Acrylamid-
Monomeren und einer ausgewählten Menge eines Vernetzungs
mittels, wie beispielsweise von Methylen-bis-(acrylamid),
vermischt werden. Die Polymerisation wird unter Verwendung
von Ammoniumpersulfat initiiert und die erhaltene feste
Masse getrocknet, vermahlen und zu der gewünschten Teilchen
größe gesiebt. Diese kann in weiten Grenzen variieren, je
doch ist für die meisten Immunanalysen eine Teilchengröße
im Bereich von 1-20 µm im allgemeinen zufriedenstellen.
Das Gewichtsverhältnis des teilchenförmigen Materials
in der Matrix kann in weiten Grenzen wie gewünscht variieren.
Es wurde eine Stammsuspension aus 5 g Aktivkohle in
200 ml eines Analysenverdünnungsmittels (0,05 m Phosphat
puffer vom pH 7,4) hergestellt. 152 ml der Stammsuspen
sion wurden mit 3,8 g Acrylamid, 0,2 g N,N-methylenbis
acrylamid, 3,8 g Eisen(II, III)-oxid (Fe3O4) und 1 ml
N,N,N′,N′-Tetramethyldiamin versetzt.
1,2 g Ammoniumpersulphat wurden daraufhin in 2 ml des
Analysenverdünnungsmittels unter heftigem Rühren zugesetzt.
Es folgt eine exotherme Umsetzung, die zur Bildung von
13,2 g eines homogenen Gels (Trockenausbeute) führte.
Das Geld wurde in schmale Stücke von etwa 0,25 cm3
zerschnitten und 24 h in einem Vakuumexikator getrocknet,
wonach die erhaltenen harten, trockenen Granula in einer
Kaffeemühle zerkleinert und zu je 2,0 g in 30 ml
Wasser dispergiert wurden. Danach wurde die Suspension
20 min in einer Feinstmahleinrichtung von McCrone ver
mahlen und das Gel nach viermaligem Waschen mit Analysen
verdünnungsmittel erneut zu je 2 g in 30 ml suspendiert.
0,4 ml dieser Suspension je Proberöhrchen wurden für die
Abtrennungsstufe verwendet.
Es wurde eine Verdünnungsreihe von Antiserum unter
Verdopplung der jeweils vorhergehenden Verdünnung herge
stellt, und aliquote Teile von 50 µl wurden mit Verdünnun
gen von 1 : 400 bis 1 25 600 in Doppelversuchen in Röhrchen
gegeben. Eine Lösung von mit 125I-markiertem Digoxin wurde
durch Verdünnung einer Stammlösung in Analysenverdünnungs
mittel im Verhältnis 1 : 8 hergestellt. In jedes Röhrchen
wurden 100 µl des mit 125I-markierten Digoxins eingebracht.
Danach wurden 200 µl digoxinfreies Plasma in jedes Röhrchen
eingebracht, wonach die Röhrchen über Nacht bebrütet werden.
Danach wurden 400 µl der gemäß Beispiel 1 hergestell
ten Teilchensuspension jedem Röhrchen zugesetzt. Nach
zehnminütigem Bebrüten wurden 2 ml Analysenverdünnungsmit
tel zugegeben und die Teilchen rasch absetzen gelassen, in
dem man die Röhrchen auf einen multipolaren Ferritplatten
magneten setzte. Die überstehen
de Flüssigkeit wurde abgesaugt und die Teilchen einmal mit
2 ml Analysenverdünnungsmittel gewaschen und danach die
125I Aktivität in einem Gammazähler gemessen. Die erhaltene
Verdünnungskurve ist zusammen mit derjenigen, die unter An
wendung des herkömmlichen Verfahrens mit freier Aktivkohle
erhalten worden war, in Fig. 1 dargestellt. Daraus geht her
vor, daß das neue Material gemäß der Erfindung ähnliche
Adsorptionseigenschaften besitzt wie freie Aktivkohle.
Antiserum wurde mit Analysenverdünnungsmittel
(1 : 6400) verdünnt. Standards von Digoxin (0,5, 1,0, 2,0,
3,0, 4,0 und 6,0 ng/ml "gepoolten" Serums) wurden zu je
200 µl in Versuchsröhrchen eingebracht, wonach in jedes
Röhrchen 100 µl mit 125I-markiertes Digoxin zugegeben wur
den. Das Ganze wurde mit 50 µl Antiserumlösung versetzt.
Die Röhrchen wurden 30 min bei Raumtemperatur bebrütet,
wonach 400 µl der gemäß Beispiel 1 hergestellten Teilchen
suspension zugesetzt wurden. Nach 10 min wurde das teilchen
förmige Material in einem Magnetfeld, wie in Beispiel 2 be
schrieben, abgetrennt. Die erhaltene Standardkurve ist zu
sammen mit derjenigen, die unter Anwendung der herkömmlichen
Abtrennungstechnik mit freier Aktivkohle erhalten worden war,
in Fig. 2 dargestellt, und es ergibt sich, daß das neue Ma
terial analoge Adsorptionseigenschaften wie das alte be
sitzt.
Die Nützlichkeit des teilchenförmigen Materials ge
mäß der Erfindung wurde durch den folgenden Versuch be
stätigt.
Sera von 25 Patienten wurden doppelt sowohl nach der
herkömmlichen Methode als auch nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren analysiert. Eine annehmbare Korrelation wurde
zwischen beiden Methoden erzielt (r = 0,959, Fig. 3). Sta
tistisch war die Neigung der Linie nicht signifikant von
1,0 und der Achsenabschnitt nicht signifikant
von 0,0 verschieden.
Claims (6)
1. Teilchenförmiges Reagenz zur Verwendung für eine
Immunanalyse einer flüssigen Probe zur selektiven
Adsorption einer oder mehrerer in der Flüssigkeit ent
haltener Komponenten,
dadurch gekennzeichnet,
daß jedes Teilchen aus einer kontinuierlichen Phase aus
einer wasserunlöslichen polymeren Matrix besteht, in die
ein magnetisch anziehbares Material und diskrete, feste,
gegenüber der Matrix inerte Teilchen aus einem adsorbie
renden Material eingebettet sind, wobei die adsorbierenden
Teilchen aus Aktivkohle, Talkum, Ionenaustauscherharzen,
Bleicherde, Siliciumdioxid, Oxiden von Zircon, Aluminium
oder Titan, porösem Glas, Zeolithen, natürlichen oder
synthetischen Polymerisaten, unspezifischen polymerisierten
ersten oder zweiten Antikörpern oder Enzymen, unspezifi
schen Zelloberflächenantigenen oder -rezeptoren, sub
zellularen Teilchen, Viren oder Bakterienzellen bestehen.
2. Teilchenförmiges Reagenz gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die polymere Matrix aus einem Acrylpolymerisat be
steht.
3. Teilchenförmiges Reagenz gemäß Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß es ein spezifisches Gewicht von 1,4 bis 3,2 besitzt.
4. Teilchenförmiges Reagenz gemäß einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß die Teilchen eine Größe von 1 bis 20 µ besitzen.
5. Wäßrige Suspension eines teilchenförmigen Reagenzes
gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche.
6. Verwendung eines Reagenzes gemäß einem der Ansprüche
1 bis 4 oder einer Suspension gemäß Anspruch 5 zur
Bestimmung eines Bestandteiles einer flüssigen Probe,
insbesondere in Immunanalysen.
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