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Ii:ununanalysen sowie teilchenförmiges
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Reagenz zur Verwendung bei Immunanalysen Die Erfindung betrifft Immunanalysen
sowie ein neues Reagenz zur Verwindung bei derartigen Immunanalysen.
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Bekanntlich kann man Antigene und Antikörper (sowie andere bindende
Proteine) mit Hilfe einer kompetitiven Bindungsreaktion unter Verwendung eines markierten
Reagenzes bestimmen, wobei die Bestimmung durch Messung der Menge an entweder zu
einem Komplex gebundener oder ungebunden in Lösung verbleibender Markierungssubstanz
durchgeführt wird.
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Ein Beispiel für ein derartiges Verfahren ist die bekannte Radioimmunoassay-Technik,
bei der eine radioaktive Markierung verwendet wird. Analoge Techniken unter Verwendung
anderer Markierungssubstanzen, wie beispielsweise von Enzymen und Fluorophoren,
sind ebenfalls bekannt.
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Bei diesen Verfahren ist es entweder erforderlich, die gebildeten
Komplexe oder den freien, ungebundenen, markierten Reaktionsteilnehmer von dem Rest
des Umsetzungsgemisches abzutrennen, um die Menge an markierter Substanz in einem
der Anteile zu messen. Dieser Abtrennungsschritt läßt sich selten leicht durchführen
und stellt in derartigen Bestimmungen eine Irrtumsquelle dar.
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Um diese Schwierigkeit zu vermeiden oder zumindestens zu verringern,
wurde in dem älteren Patent .......
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(Patentanmeldung P 27 10 438.7) die Verwendung von magnetisch anziehbaren
Teilchen bei Immunoanalysen vorgeschlagen, die an ihrer peripheren Oberfläche einen
an sie kovalent gebundenen Reaktionsteilnehmer aufweisen. Die Teilchen können
(zusammen
mit dem Umsetzungsprodukt zwischen dem Reaktionsteilnehmer und einer markierten
Verbindung des Umsetzungsgemisches) klar und einfach von dem Rest des Umsetzungsgemisches
abgetrennt und die markierte Substanz in diesem Rest oder auf den Teilchen anschließend
bestimmt werden.
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Eine Beschränkung dieses Verfahrens besteht darin, daß die einzigen
Reagenzien, die an die magnetischen Teilchen gekuppelt werden können, bisher lediglich
solche Substanzen sind, die an die Polymerisatmatrix der Teilchen kovalent gebunden
werden können. Somit bestehen die Teilchen bisher aus magnetisch anziehbarem Material,
das in eine Matrix aus einem Polymerisat, wie beispielsweise Cellulose, eingebettet
ist, wobei das Reagenz kovalent an die Cellulose gebunden ist. Es ist bisher nicht
möglich gewesen, Reagenzien zu verwenden, die nicht auf diese Weise an die magnetischen
Teilchen gebunden sind. Unter den Reagenzien, die auf diese Weise nicht verwendet
werden konnten, befinden sich inerte, feste Adsorbentien, wie beispielsweise Aktivkohle
und dgl.; diese Materialien sind jedoch für Immunanalysen äußerst nützlich, da sie
zur Adsorption freier, ungebundener markierter Substanz aus dem Umsetzungsgemisch
verwendet und in Form von Feststoffen aus dem Umsetzungsgemisch anschließend abgetrennt
werden können.
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Es wurde nun gefunden, daß man die Verwendung von magnetisch anziehbaren
Teilchen (mit den ihnen innewohnenden Vorteilen bei der Abtrennung) mit der Verwendung
von Adsorbentien, wie Aktivkohle und dgl. (mit den ihnen innewohnenden Vorteilen
bei der selektiven Adsorption von Reaktionsteilnehmern) kombinieren kann. Im einzelnen
wurde gefunden, daß diese Adsorbentien in Form von disl;reten, festen Teilchen in
eine Polymerisatmatrix eingebettet werden können, die ebenfalls magnetisch anziehbare
Teilchen enthält, so daß
ein magnetisch anziehbares, teilchenförmiges
Reagenz zur Verwendung bei Immunanalysen gebildet wird. Im folgenden werden die
magnetisch anziehbaren teilchenförmigen Materialien gemäß der Erfindung, die aus
diskreten, magnetisch anziehbaren Teilchen sowie diskreten Teilchen aus Adsorptionsmittel,
die in einer Polymerisatmatrix verteilt sind, bestehen, einfach als "Teilchen gemäß
der Erfindung'1 bezeichnet.
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Gegenstand der Erfindung ist ein teilchenförmiges Reagenz zur Verwendung
bei einer Immunoanalyse einer flüssigen Probe, um aus der Flüssigkeit eine oder
mehrere darin enthaltene Komponenten selektiv zu adsorbieren, wobei jedes Teilchen
aus einer kontinuierlichen Phase einer.
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wasserunlöslichen polymeren Matrix besteht, die ein magnetisch anziehbares
Material sowie diskrete, feste Teilchen eines adsorbierenden Materials enthält,
die aus Aktivkohle, Talicurn, lonenaustauscherharzen, Bleicherde, Siliciumdioxid,
Oxiden von Zirkon oder Aluminium oder Titan, porösem Glas, Zeolithen, natürlichen
oder synthetischen Polymerisaten, polymerisierten ersten oder zweiten Antikörpern
oder Enzymen, Zelloberflächenantigenen oder -rezeptoren, subzellularen Teilchen,
Viren oder Bakterienzellen bestehen.
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Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Durchführung
einer Immunanalyse zur Bestimmung eines Bestandteiles in einer flüssigen Probe,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Umsetzungsgemisch aus der Probe mit
einer Substanz bildet, die mit dem zu bestimmenden Bestandteil in der Probe reagiert,
ein teilchenförmiges Reagenz gemäß der Erfindung zusetzt, um eine Komponente des
Umsetzungsgemisches selektiv zu adsorbieren, das teilchenförmige Reagenz aus dem
Umsetzungsgemisch magnetisch abtrennt und den zu bestimmenden Bestandteil durch
Analyse des abgetrennten teilchenförmigen Reagenzes oder des abgetrennten
Umsetzungsgemisches
bestimmt.
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Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein Verfahren zur Durchführung
der Immunanalyse von zwei oder mehreren flüssigen Proben zur Bestimmung verschiedener
Bestandteile in ihnen unter Anwendung der kontinuierlichen Durchflußmethode, das
dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Umsetzungsgemisch aus jeder der flüssigen
Proben mit einer Substanz bildet, die mit den zu bestimmenden Bestandteilen der
Proben reagiert, die Umsetzungsgemische jeder der flüssigen Proben nacheinander
und unterteilt voneinander längs einer Leitung strömen läßt, in jedes der Umsetzungsgemische
während des Strömens längs der Leitung ein teilchenförmiges Reagenz gemäß der Erfindung
einführt, indem das Adsorptionsmittel in der Lage ist, die gebundene oder die freie
Fraktion in jedem der Umsetzungsgemische zu lösen, das Reagenz aus jedem der Umsetzungsgemische
magnetisch abtrennt und das abgetrennte Reagenz oder das Umsetzungsgemisch zur Bestimmung
des zu analysierenden Bestandteils in jeder der flüssigen Proben analysiert.
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In den Teilchen gemäß der Erfindung ist das Adsorptionsmittel im
Gegensatz zu den bekannten Reagenzien, in denen ein Material an eine polymere Matrix
kovalent gebunden ist, in die polymere Matrix eingebettet.
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Die Teilchen gemäß der Erfindung bestehen aus einer kontinuierlichen
Phase aus einer wasserunlöslichen polymeren Matrix, die die magnetisch anziehbaren
sowie die Adsorptionsmittelteilchen eingebettet enthält. Die Matrix kann aus einer
großen Anzahl unterschiedlicher Materialien bestehen, wie beispielsweise natürliche
und synthetische Polymerisate, wie Polyacrylamid, Cellulose, Celluloseester, Polyamid,
Polycarbonat, Polyvinylharze, Methylmethacrylate, Polystyrol, Polystyrol-Acrylnitril,
Epoxidharze, Melamin-Formaldehyd, Phenol-Formaldehyd, Harnstoff-Formaldehyd,
Polyester,
Polyacrylnitril, Polyacrolein, Polyacetal, vernetzte Proteine und dgl.
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Die Matrix dient dazu, die magnetischen und absorbierenden Teilchen
in gleichmäßiger Teilchenform zu halten, ohne daß eine der Komponenten chemisch
an die Matrix gebunden wird. Da einige, wenn nicht die meisten der adsorbierenden
Teilchen völlig innerhalb der Matrix eingeschlossen und nicht an der Matrixoberfläche
teilweise exponiert sind, ist die Matrix vorzugsweise in einem solchen Ausmaß porös,
das ausreicht, um das Eintreten des Umset7unOGsgemisones zu ermöglichen. Die Porosität
der Matrix kann vorteilhaftenreise gesteuert werden, um nur ausgewählte gelöste
Bestandteile eintreten zu lassen, beispielsweise kleine Antigene, jedoch nicht große
Antikörper; dieser sog. Gelfiltrationseffekt ist selbst bekannt. Polyacrylamid ist
ein besonders geeignetes Polymerisat zur Herstellung von matrizes mit ausgewählter
Porengröße.
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Geeignete magnetisch anziehbare Materialien sind solche, die in der
oben erwähnten Patentschrift .......
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(Patentanmeldung p 27 10 438.7) beschrieben sind.
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Die Art des Adsorptionsmittels kann je nach dem Endzweck der Teilchen
gemäß der Erfindung in weiten Grenzen variieren. Aktivkohle wird am meisten bevorzugt,
jedoch können auch andere Materialien, wie beispielsweise Talkum, Ionenaustauscherharze,
Bleicherde, Siliciumdioxit, Dioxide von Zirkon, Aluminium und Titan, poröses Glas,
Zeolithe, feinverteilte natürliche und synthetische Polymerisate, polymerisierte
erste oder zweite Antikörper oder Enzyme, Zelloberflächenantigene und -rezeptoren,
subcellulare Teilchen, Viren und Bakterienzellen.
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Die Wirkungsweise des Adsorptionsmittels besteht darin, einen Teil
des für die Immunanalyse verwendeten Umsetzungsgemisches zu adsorbieren oder sich
an ihn chemisch zu binden, so daß dieser Teil des Gemisches mit den Teilchen der
Erfindung entfernt wird. Beispielsweise wird bei der Analyse eines bestimmten Antigens
ein Umsetzungsgemisch gebildet, das die Probe, eine Menge an markiertem Antigen
und einen Antikörper enthält. In dem Gemisch werden Komplexe zwischen dem Antikörper
und dem Antigen sowie zwischen dem Antikörper und dem markierten Antigen gebildet.
Dera Gemisch werden dann Teilchen gemäß der Erfindung zugesetzt, und diese können
beispielsweise das freie, nicht gebundene Antigen (sowohl markiert als auch unmarkiert)
selektiv adsorbieren. Abtrennung der Teilchen durch eine magnetische Falle bewirkt,
daß lediglich die Komplexe in Lösung zurückbleiben, wonach entweder die Lösung oder
die abgetrennten Teilchen auf ihren Gehalt an markiertem Antigen hin untersucht
werden können.
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Es ist ein beträchtlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung, daß
die Teilchen gemäß der Erfindung unspezifisch und nicht immunospezifisch sind und
daher einen weiten Anwendungsbereich besitzen. Beispielsweise adsorbiert ein Teilchen
gemäß der Erfindung, das Aktivkohle als Adsorptionsmittel enthält, viele unterschiedliche
kleine Antigene.
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Auf diese Weise können die Teilchen gemäß der Erfindung für Immunanalysen
vieler unterschiedlicher Antigene verwendet werden. Dies ist von großem Vorteil,
da dadurch die Notwendigkeit vermieden wird, für jede unterschiedliche Immunanalyse
ein anderes Reagenz auf den magnetischen Teilchen vorzusehen, wie. es bisher erforderlich
war. Der Anwendungsbereich der Teilchen gemäß der Erfindung variiert natürlich mit
dem verwendeten Adsorptionsmittel, jedoch bei Materialien, wie Aktivkohle und anderen
ähnlichen festen Adsorbentien, kann er hochsignifikant sein.
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Die Teilchen gemäß der Erfindung eignen sich insbesondere für Radioimmunoassays.
Das für eine bestimmte Immunanalyse oder andere Analyse geeignete teilchenförmige
Adsorptionsmittel ist dem Fachmann entweder bekannt oder kann durch routinemäßige
Versuche bestimmt werden. Einige Beispiele für bestimmte Verwendungen sind die folgenden:
Aktivkohle für die Analyse von Steroiden, Thyroidhormonen T4 und T3, ACTH, Angiotensin-Il,
Insulin und Glucagon, menschlichem lZachstumshormon, Vitamin B12, Folat und anderen;
Talkum oder Siliciumdioxid in Analysen von ACTH, Wachstunshormon, Parathroidhormon,
Insulin und Calcitonin sowie Vitamin B12; Anionaustauscherharze bei der Analyse
von Insulin und Wachstumshormon, Dioxin, cyclischer AMP, cyclischem GMP, Insulin,
Angiotensin-I und Thyroxin(T4); polymerisierte erste oder zweite Antikörper zur
Adsorption von Antigenen bzw. ersten Antikörpern oder zur Herstellung von von Thyroxin
und Cortisol usw. freien Sera; Zelloberflächenantigene und -rezeptoren sowie subcellulare
Teilchen zu Abtrennungszwecken und Bakterienzellen sowie Viren zum Ermitteln von
antibakteriellen und antiviralen Antikörpern in einer Probe.
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Die Teilchen gemäß der Erfindung können zu einzelnen (manuellen)
Analysen oder in automatisierten Systemen nach dem kontinuierlichen Durchflußprinzip
verwendet werden, wie sie beispielsweise in der oben erwähnten Patentschrift .,.,,..
(Patentanmeldung P 27 10 438 .? ) beschrieben sind. Insbesondere bei den Systemen
des kontinuierlichen Durchflußprinzips muß das spezifische Gewicht der Teilchen
gemäß der Erfindung demjenigen des Umsetzungsgemisches verhältnismäßig nahekommen,
so daß kein unzulässiges Aufschwimmen oder Absetzen erfolgt und die Teilchen in
dem Umsetzungsgemisch in Suspension gehalten werden können. Im allgemeinen sind
spezifische Gewichte von etwa 1,4 bis 3,2 zufriedenstellend. Die vorliegende Erfindung
betrifft, wie bereits erwähnt, auch ein Verfahren zur Immunanalyse, wie es in der
oben erwähnten Patentschrift beschrieben ist, bei
der Teilchen
gemäß der Erfindung verwendet werden. Dies ist somit ein Verfahren zur Analyse einer
Flüssigkeit hinsichtlich eines zu bestimmenden Bestandteils, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man (a) ein Gemisch aus der Flüssigkeitsprobe und einem Reagenz bildet,
das mit dem zu bestimmenden Bestandteil in der Flüssigkeit reagiert; (b) das Gemisch
längs einer Leitung strömen läßt; (c) in das Gemisch Teilchen gemäß der Erfindung
einführt, die als teilchenförmiges Adsorptionsmittel ein Material enthalten, das
einen Bestandteil des Umsetzungsgemisches selektiv adsorbiert; (d) die Teilchen
gemäß der Erfindung in der Leitung magnetisch einfängt, um sie gegen die Strömung
Sestzuhalten und sie dadurch aus dem Umsetzungsgemisch abzutrennen; und (e) den
zu bestimmenden Bestandteil durch Analyse der abgetrennten Teilchen und bzw. oder
des abgetrennten Umsetzungsgemisches bestimmt.
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In einer bevorzugten Durchführungsform dieses Verfahrens ist das
Reagenz eine vorherbestimmte Menge einer Substanz, die mit dem zu bestimmenden Bestandteil
unter Ausbildung eines Komplexes reagiert, wobei die Teilchen gemäß der Erfindung
sich mit dem überschüssigen Reagenz in dem Gemisch binden und entweder die abgetrennte
Flüssigkeit oder die abgetrennten Teilchen zur Bestimmung des interessierenden Bestandteils
der Probe analysiert werden.
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Die Teilchen gemäß der Erfindung können hergestellt werden, indem
man das teilchenförmige Adsorptionsmittel und das teilchenförmige, magnetisch anziehbare
Material in einem Polymerisat oder in einem Gemisch, das ein Polymerisat bildet,
dispergiert. Im Falle einer Polyacrylamid-Matrix können die beiden teilchenförmigen
Materialien beispielsweise mit einem oder mehreren flüssigen Acrylamid-
Monomeren
und einer ausgewählten Menge eines Vernetzungsmittels, wie beispielsweise von Methylen-bis-
(acrylamid) vermischt werden. Die Polymerisation wird unter Verwendung von Ammoniumpersulphat
initiiert und die erhaltene feste Masse getrocknet, vermahlen und zu der gewünschten
Teilchengröße gesiebt. Diese kann in weiten Grenzen variieren, jedoch ist für die
meisten Immunanalysen eine Teilchengröße im Bereich von 1 bis 20/u im allgemeinen
zufriedenstellend.
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Das Gewichtsverhältnis des teilchenförmigen Materials in der Matrix
kann in weiten Grenzen wie gewünscht variieren.
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Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Beispielen näher erläutert.
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Beispiel 1 Herstellung von Teilchen gemäß der Erfindung, die Aktivkohle
enthalten Es wurde eine Stammsuspension aus 5 g Aktivkohle der Bezeichnung NORIT
OL (BDH) in 200 ml eines Analysenverdünnungsmittels (O,05m Phosphatpuffer vom pH
7,4) hergestellt. 152 ml der Stammsuspension wurden mit 3,8 g Acrylamid, 0,2 g N,N-methylenbisacrylamid,
3,8 g Eisen-(III) Oxid (Fe304, Fisons und 1 ml N,N,N',N'-Tetramethyldiamin versetzt.
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1,2 g Ammoniumpersulphat wurden daraufhin in 2 ml des Analysenverdünnungsmittels
unter heftigem Rühren zugesetzt.
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Es folgt eine exotherme Umsetzung, die zur Bildung von 13,2 g eines
homogenen Gels (Trockenausbeute) führte.
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Das Gel wurde in schmale Stücke von etwa 0,25 cm³ zerschnitten und
24 h in einem Vakuumexikator getrocknet, wonach die erhaltenen harten, trockenen
Granula in einer Kaffeemuhle (Braun) zerkleinert und zu je 2,0 g in 30 ml Wasser
dispergiert wurden. Danach wurde die Suspension
20 min in einer
Feinstmahleinrichtung von McCrone vermahlen und das Gel nach viermaligem Waschen
mit Analysenverdünnungsmittel erneut zu je 2 g in 30 ml suspendiert.
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0,4 ml dieser Suspension je Proberöhrchen wurden für die Abtrennungs
stufe verwendet.
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Beispiel 2 Antlkörper-Verdünnungskurven (Fig. 1) Es wurde eine Verdünnungsreihe
von Antiserum unter Verdopplung der jeweils vorhergehenden Verdünnung hergestellt,
und aliquote Teile von 50/ul wurden mit Verdünnungen von 1 : 400 bis 1 : 25600 in
Doppelversuchen in Röhrchen gegeben. Eine Lösung von mit 125I-markiertem Digoxin
wurde durch Verdwnnung einer Stammlösung in Analysenverdünnungsmittel im Verhältnis
1 : 8 hergestellt. In jedes Röhrchen wurden 100/ul des mit 1251 markierten Digoxins
eingebracht.
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Danach wurden 200/ul digoxinfreies Plasma in jedes Röhrchen eingebracht,
wonach die Röhrchen über Nacht bebrütet wurden.
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Danach wurden 400 um der gemäß Beispiel 1 hergestellten Teilchensuspension
jedem Röhrchen zugesetzt. Nach zehnminütigem Bebrüten wurden 2 ml Analysenverdünnungsmit
tel zugegeben und die Teilchen rasch absetzen gelassen, indem man die Röhrchen auf
einen multipolaren Ferritplattenmagneten (Magnet Applications Ltd.) setzte. Die
überstehende Flüssigkeit wurde abgesaugt und die Teilchen einmal mit 2 ml Analysenverdünnungsmittel
gewaschen und danach die 125I Aktivität in einem Gammazähler gemessen. Die erhaltene
Verdünnungskurve ist zusammen mit derjenigen, die unter Anwendung dns herkömumlichen
Verfahrens mit freier Aktivkohle erhalten worden war, in Fig. 1 dargestellt. Daraus
geht hervor, daß das neue Material gemäß der Erfindung ähnliche Adsorptionseigenschaften
besitzt wie freie Aktivkohle.
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Beispiel 3 Standardkurven Antiserum wurde mit Analysenverdünnungsmittel
(1 : 6400) verdünnt. Standards von Digoxin (0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 und 6,0 ng/ml
"gepooltentl Serums) wurden zu je 200/ul in Versuchsröhrchen eingebracht, wonach
in jedes Röhrchen 100/ul mit 1251 markiertes Digoxin zugegeben wurden. Das Ganze
wurde mit 50/ul Antiserumlösung versetzt.
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Die Röhrchen wurden 30 min bei Raumtemperatur bebrütet, wonach 400
um der gemäß Beispiel 1 hergestellten Teilchensuspension zugesetzt wurden. Nach
10 min wurde das teilchenförmige Material in einem Magnetfeld, wie in Beispiel 2
beschrieben, abgetrennt. Die erhaltene Standardkurve ist zusammen mit derjenigen,
die unter Anwendung der herkömmlichen Abtrennungstechnik mit freier Aktivkohle erhalten
worden war, in Fig. 2 dargestellt, und es ergibt sich, daß das neue Material analoge
Adsorptionseigenschaften wie das alte besitzt.
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Beispiel 4 Die Nützlichkeit des teilchenförmigen Materials gemäß
der Erfindung wurde durch den folgenden Versuch bestätigt.
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Sera von 25 Patienten wurden doppelt sowohl nach der herkömmlichen
Methode als auch nach dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert. Eine annehmbare
Korrelation wurde zwischen beiden Methoden erzielt (r = 0,959, Fig. 3). Statistisch
war die Neigung der Linie nicht signifikant von 1,0 und der Achsenabschnitt (intercept)
nicht signifikant von 0,0 verschieden.
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In einer Abwandlung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das adsorbierende
Material der Teilchen selbst als Matrix für die magnetischen Teilchen verwendet
werden, so daß
keine besondere polymere Matrix erforderlich ist.
Dies kann beispielsweise unter Verwendung von Anionenaustauscherharzen als Adsorptionsmittel
bewirkt werden.