DE2612948A1

DE2612948A1 - Immunadsorbentien und immunadsorptionsverfahren

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Publication number: DE2612948A1
Application number: DE19762612948
Authority: DE
Inventors: Lavell Rolfson Johnson
Original assignee: Summa Corp
Current assignee: Summa Corp
Priority date: 1973-03-19
Filing date: 1976-03-26
Publication date: 1976-10-21
Also published as: FR2307268A1; FR2307268B1; NL7403215A; FR2222654B1; NL176307B; US4059685A; DE2612948C2; NL7603439A; NL176307C; GB1460631A; FR2222654A1; US3896217A; DE2412833A1

Description

Immunadsorbentien und Inimunadsorptionsverfahren

Die Erfindung bezieht sich auf Immunadsorbentien und insbesondere auf ein verbessertes Immunadsorbens zur Anwendung in Immunitäts-Untersuchungen, beispielsweise Radioimmunitäts-Untersuchungen, bei denen das Immunadsorbens für mehrfache Versuche verwendet werden kann.

Radioimmunitätsuntersuchungen stellen eine Analysentechnik dar, die auf der Affinität eines Antigens für Antigenbindungsplätze an Antikörper-Molekülen beruht. Bei der praktischen Anwendung werden Standardkurven aus Werten abgeleitet, die aus einer Anzahl Proben gewonnen wurden, die jeweils (a) die gleiche Konzentration an markiertem Antigen und (b) unterschiedliche bekannte Konzentrationen an unmarkiertem Antigen aufweisen. Die Antigene werden mit einem

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radioaktiven Isotop als Indikator (Tracer) markiert. Das Gemisch wird unter Kontakt mit einem Antikörper bebrütet, das freie Antigen wird von dem Antikörper und dem daran gebundenen Antigen getrennt, und dann wird mittels eines geeigneten Detektors, etwa eines Gamma- oder Betastrahlen-Detektors, der Prozentgehalt von gebundenem oder freiem markierten Antigen oder von beidem bestimmt. Dieser Vorgang wird für eine Anzahl Proben mit verschiedenen bekannten Konzentrationen an unmarkierten Antigenen wiederholt, und die Ergebnisse werden aufgezeichnet. Normalerweise nimmt die relative Menge des an den Antikörper gebundenen Tracer-Antigens mit zunehmender Konzentration des Gesamtantigens ab. Nachdem die Standardkurven aufgestellt sind, werden sie zur Bestimmung der Konzentration von Antigen in den zu analysierenden Proben verwendet.

Bei der eigentlichen Analyse wird die Probe, in der die Antigenkonzentration bestimmt werden soll, mit einer bekannten Menge Tracer-Antigen vermischt. Das Tracerantigen ist das gleiche Antigen, dessen Vorkommen in der Probe bekannt ist,das aber durch ein geeignetes radioaktives Isotop markiert worden ist. Die Probe mit dem Tracer wird dann in Kontakt mit dem Antikörper bebrütet. Danach kann die Probe in einem geeigneten Detektor gezählt werden, der das in der Probe verbliebene freie Antigen zählt. Das an den Antikörper oder das Immunadsorbens gebundene Antigen kann in entsprechender Weise gezählt werden. Dann wird aus der Standardkurve die Konzentration von Antigen in der Originalprobe bestimmt. Anschliessend wird die Antikörper- oder Immunadsorbens-Masse vernichtet.

Um den Prozentanteil von an den Antikörper gebundenem Antigen (gebundenes Antigen) und/oder den Prozentanteil des frei oder ungebunden verbleibenden Antigens bestimmen

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zu können, muß zunächst die Probe unterteilt werden in einen Anteil, der gebundenes Antigen enthält, und einen weiteren Anteil, der nur freies Antigen enthält. Eine übliche Methode hierfür ist die Zugabe von dextranbeschichteter Holzkohle in die Mischung. Das Dextran läßt nicht gebundenes Antigen mit gegenüber dem gebundenen Antigen niedrigerem Molekulargewicht passieren, und die Holzkohle adsorbiert das freie Antigen. Die Holzkohle mit dem adsorbierten freien Antigen wird dann durch Zentrifugieren von dem Antikörper (und dem gebundenen Antigen) abgetrennt.

Nach einer anderen bekannten Methode wird dem Gemisch ein weiterer Antikörper zugefügt, der den ersten Antikörper (mit dem gebundenen Antigen) selektiv ausfällt, so daß in der Lösung nur das freie Antigen verbleibt. Die Trennung in die entsprechenden freien und gebundenen Fraktionen erfolgt dann durch Abtrennen des Überstandes von dem Niederschlag durch Zentrifugieren oder auf andere geeignete Weise. Einige Autoren sind dazu übergegangen, den Antikörper an die Innenwände eines Kunststoffgefäßes zu binden, dann das Gefäß mit der antigenhaltigen Probe zu füllen, es während einer üblicherweise zwischen 4 und 72 Stunden langen Bebrütungszeit stehen zu lassen und anschliessend das freie von dem gebundenen Antigen durch Ablassen und Spülen des Gefäßes zu trennen, wobei in dem Gefäß nur der Antikörper und das gebindene Antigen verbleiben. Nach einer neueren Technik wird das Immunadsorbens durch Binden des Antikörpers an ein unlösliches, vernetztes Dextran dargestellt. Das Immunadsorbens und die antigenhaltige Probe werden bebrütet, und dann wird das Dextran mit dem gebundenen Antigen auf geeignete Weise von der Lösung getrennt.

Bei allen diesen Verfahren wird der Prozentanteil an markiertem Antigen, und zwar des gebundenen und des freien Anteils oder beider bestimmt und die Antigenkonzentration an-

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hand der Standardkurve ermittelt. Danach wird das Immunadsorbens verworfen.

Wenn sich auch die genannten Radioimmununtersuchungsmethoden als wertvolle Hilfsmittel erwiesen und weite Verbreitung gefunden haben, ist viel an ihnen auszusetzen, weil der Antikörper (Immunadsorbens) mit jeder Analyse verbraucht wird und daher verworfen werden muß. Darüber hinaus arbeiten die bekannten Verfahren diskontinuierlich, und die verschiedenen Reagentien werden dem Antikörper in Teströhren zugefügt, in denen die verschiedenen Verfahrensphasen, etwa Bebrütung, Spülen u. dgl. vorgenommen werden, so daß die Arbeitsweise zeitraubend und kostspielig ist.

Die Patentanmeldung Ser.No. 342 153 vom 19. März 1973 beschreibt eine wesentliche Verbesserung der Immununtersuchungsmethoden insofern, als das gleiche Immunadsorbens wiederholt für eine große Zahl von Untersuchungen verwendet werden kann, indem von dem Immunadsorbens das Antigen freigegeben wird, das an die Antikörpermasse gebunden ist, welch letztere auf dem Substrat festgehalten wird, d.h. daß nach dem Abschluß der Untersuchung, das gesamte Antigen auf dem Immunadsorbens selektiv und stöchiometrisch freigegeben wird. Die vorliegende Erfindung ist auf ein wiederverwendbares Immunadsorbens gerichtet.

Aus dem Schrifttum ist es bekannt, daß Antikörper durch Verwendung von immunoligischen Adsorbentien isoliert werden können; diese Technik ist wertvoll für die Isolierung und Reinigung von Antikörpern, nicht jedoch für deren quantitative Bestimmung (vgl. Campbell et al. Proceedings Nt. Acad. Sei. U.S.A., 37 (1951) 575).

Die Anwendung eines an ein unlösliches Polymer gekoppelten Antikörpers zum Extrahieren eines speziellen Antigens, um

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dieses isolieren und reinigen zu können, ist beschrieben bei Weetall et al. Biochem. Biophys. Acta, 107 (1965) 150-152.

Als Substrat zum Festhalten von Enzymen ist poröses Glas beschrieben (vgl. Weetall, Biochem. Biophys. Acta, 212 (1970) 1-7. Dort wurde Glas mit Gamma-aminopropyltriäthoxysilan behandelt, und das Isothiozyanat-Derivat wurde durch Behandlung mit Thiophosgen dargestellt. Das Enzym wurde an das Isothiozyanat-Derivat gekoppelt. Ferner wurde die Darstellung eines Arylamin-Derivats durch Reaktion zwischen Alkylamin-Glas mit p-Nitrobenzoylchlorid und danach Anwendung von Natriumdithionat zur Reduzierung der Nitrogruppen beschrieben. Danach wurde das Arylamin-Glas diazotisiert und das Enzym mit ihm gekoppelt.

Weetall beschreibt ausserdem in Biochem. J. 117 (1970) - 261 die Anwendung von Antikörpern, die an poröses Glas durch ein Silan als Kopplungsagens gebunden sind. Die mitgeteilten Werte lassen jedoch erkennen, daß die wiederverwendete Säule, in der das Antigen aus dem festgehaltenen Antikörper-Immunadsorbens eluiert wurde, ein unberechenbares Ergebnis erbrachte, weil die Rückgewinnung von freigegebenem Antigen zwischen 74 % und 100 % schwankte (vgl. auch USA-Patentschrift 3 652 761 vom 28. März 1972). Das beschriebene System ist zwar brauchbar als Trennsystem, hat aber erhebliche Nachteile, wenn man es als Werkzeug für die quantitative Analyse betrachtet, für die eine praktisch stöchiometrische Freigabe des Antigens erfolgen muß.

Die USA-Patentschrift 3 555 143 vom 12. Januar 1971 bezieht sich auf radioimmunologische Untersuchungen, bei denen das festgehaltene Immunadsorbens nur ein einziges Mal verwendet und dann verworfen wurde. Bei dem Immunoadsorbens handelt es sich um ein Dextran (Sephadix G 25, superfein),

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vernetzt mit Glyzerin-Äther-Brücken und substituiert mit p-Nitrophenoxy-hydroxypropyl-Äther-Gruppen. Die Nitrogruppen werden mit Natriumdithionit zu Amin-Gruppen reduziert. Das mit p-Amino-phenoxy-hydroxy-propyl-Gruppen substituierte Sephadex wurde dann mit Thiophosgen behandelt, so daß Sephadex substituiert mit p-Isothiocyanat-phyenoxy-Hydroxypropyl-Gruppen entsteht, wobei der Antikörper an das letztgenannte Substituionsprodukt gekoppelt ist.

Eine weit verbreitete Reaktion zum Unlöslichmachen eines Proteins sieht eine kovalente Bindung des Proteins an eine mit Zyanbromid aktivierte Zellulosematrix vor. Die Reaktionsmechanik dieser Aktivierung ist von Bartling et al in Biotechnology and Bioengineering, VoI XIV (1972) 1039-1044 beschrieben.

Bedeutung haben ferner die USA-Patente 3 502 888 vom

13. Juli 1971, 3 639 559 vom 1. Februar 1972 und 3 720 760 vom 13. März 1972.

Wenn ein immobilisiertes Immunadsorbens nur einmal benutzt und dann verworfen werden soll, haben die Langzeiteigenschaften des Substrats keine wesentliche Bedeutung. Sephadex (Dextran) oder Sepharose (geperltes Agarose-Produkt) lassen sich daher in befriedigender Weise als Substrate für an sie gebundene Antikörper verwenden, wie in der obengenannten USA-Patentschrift 3 555 143 beschrieben. Soll dagegen das Immunadsorbens mehrfach verwendet werden, wie in der oben angeführten Patentanmeldung Ser. No. 342 513 beschrieben, so ergeben sich gewisse Schwierigkeiten.

Eine Schwierigkeit entsteht durch die Neigung der Sephadex- und Sepharose-Präparate trocken zu werden, d.h. das Gel fällt zusammen und wird in solchem Maße verdichtet, daß das Durch-

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strömen der Masse wesentlich beeinträchtigt und die Möglichkeit des Antikörpers, Antigen zu binden, verändert wird? dadurch wird die Reproduzierbarkeit der Wirkung des Immunadsorbens und seine Stabilität für mehrfache Verwendung beeinflußt.

Glas und andere feste anorganische Substanzen bieten eine erwünschte Ausweichmöglichkeit, weil sie in Perlenform gebracht werden können und bessere Durchströmung gewährleisten und sich ausserdem leichter in Form einer Säule anordnen lassen. Substanzen dieser Art fallen nicht zusammen und trocknen bei häufiger Verwendung, nicht aus. Glas-Erzeugnisse bieten somit eine wünschenswerte Alternative, sie haben aber auch Nachteile. Beispielsweise ist es schwierig, eine ausreichende Bindung des Antikörpers an das Substrat zu erzielen. Entweder ist die Bindung nicht stark genug, als daß die bei einem Analysenhilfsmittel erforderliche Aktivität erzielt v/erden könnte, oder die Aktivität ändert sich während der Betriebslebensdauer infolge unerwünschter Ablösung von Antikörpern.

Wenn das Glas, wie bei den genannten Literaturstellen von Weetall angegeben, sehr porös ist, gibt es so viel aktive Glasoberfläche, daß eine ausgedehnte Bindung von Antikörpern stattfindet, aber nichtspezifische Bindung von Antigen tritt ebenfalls auf. Daher wird das an das Glas gebundene Antigen nicht vollständig freigegeben. Das bedeutet, daß keine stöchiometrische Freigabe bei jeder Benutzung stattfindet, wie es für die quantitative Analyse erforderlich ist, denn die Freigabeeigenschaften ändern sich und sind nicht vorhersehbar. Das ergibt sich aus den Daten bei Weetall. Da dieses Glas üblicherweise zu 96 % aus Luft oder unbesetztem Raum besteht, findet sich eine beträchtliche aktive Glasoberfläche, die nicht von Antikörper eingenommen ist und als Antigenbindungszone wirkt.

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Eine weitere Schwierigkeit bei sehr porösem Glas sind die zahlreichen Risse in den Poren, was zu Einschlüssen in den Rissen und zu einer langsamen Freigabe wegen der geringen Diffusion in den Rissen führt. Wenn ein schnelles Ansprechen erforderlich ist, wie beispielsweise bei automatisch arbeitenden Geräten, stellt die Diffusion der Reaktionspartner einen Faktor dar, der die Geschwindigkeit begrenzt, und bekanntlich kann eine Diffusion relativ langsam ablaufen. Wenn das Antigen auch nicht an das Substrat gebunden ist, so verläuft doch die Diffusion des Antigens verhältnismässig langsam, und daher erscheint das Antigen in Verbindung mit einem schnellen automatisierten Analysegerät tatsächlich gebunden und wird nicht schnell und stöchiometrisch freigegeben.

Zur Verwendung in der Chromatographie ist oberflächenporöses Trägermaterial bekannt, vgl. beispielsweise die USA-Patentschrift 3 505 785 vom 14. April 1970; diese Patentschrift beschreibt ein im Handel unter dem Namen "Zipax" bekanntes Präparat der E.I. DuPont de Nemours & Co. Diese als Packung für eine chromatographische Säule verwendeten Trägerperlen umfassen eine Vielzahl einzelner Mikropartikel mit undurchlässigen Kernen; mit den Perlen irreversibel verbunden ist eine Beschichtung aus einer Folge von nach Art eines Adsorbens aufeinanderfolgenden einlagigen Schichten von gleichen kolloidalen Mikroteilchen. Auf diese Weise tragen kugelförmige Mikroperlen von etwa 30 ,u Durchmesser aus Glas eine poröse Oberflächenhaut, die ungefähr 1 ,u. stark ist. Wird ein solches Material als Substrat verwendet, so ergibt sich eine beträchtliche Oberflächengröße für die gewünschte Aktivität, aber das Substrat muß sorgfältig hergestellt werden, wenn das richtige schnelle Ansprechen und die stöchiometrische Freigabe gewährleistet sein soll.

Es wäre also sehr wünschenswert, über ein mehrfach verwend-

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bares Immunadsorbens verfügen zu können, das das Antigen für jeden Versuch stöchiometrisch freigibt. Wenn dieses Immunadsorbens ausserdem nicht austrocknet und sich so packen läßt, daß die Strömungsverhältnisse durch die Masse während der Nutzungsdauer des Iiranunadsorbens den Anforderungen entspricht, so ist ein erheblich verbessertes, mehrfach verwendbares, immobilisiertes Immunadsorbens gefunden.

Mit der Erfindung wird ein verbessertes immobilisertes Immunadsorbens angegeben, das für wiederholte Benutzung bei Radioimmununtersuchungen verwendbar ist. Das Substrat oder die Grundmatrix ist stabil gegenüber Austrocknung und Verdichten und hat die Form einer Masse fester Teilchen, deren Aussenseite jeweils eine große Oberfläche aufweist. Ein typisches Substrat dieser Art besteht aus hochtemperaturbeständigen, oberflächlich porösen Teilchen, die jeweils einen undurchlässigen Kern aufweisen, auf den eine genügend große Zahl von Schichten aus Mikropartikeln aufgebracht sind, so daß sich eine äussere poröse Beschichtung auf dem Kern mit grosser Oberflächenentfaltung ergibt.

Mit dem Substrat ist ein wasserunlösliches Polymermaterial verbunden. Das Polymer kann gebunden werden, indem das Substrat so behandelt wird, daß sich ein Aminoalkylsilan-Derivat bildet, darauf erfolgt eine Behandlung zur Bildung eines Isothiozyanalkylsilan-Derivats, an das das Polymer gebunden wird. Zu den geeigneten Polymermaterialien gehört Dextran.

Das Dextran wirkt wie eine Schranke, die die aktiven Bereiche auf dem Substrat, an die Antigen gebunden werden kann, so bedeckt, daß es für die nachfolgenden Versuche störend ist. Wenn das Immunadsorbens nach der Erfindung mehrfach benutzt wird, indem ein Eluierungsmedium verwendet

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wird, das das Antigen von den gebundenen Antikörpern trennt, führt die Ablösung von Antigen, das an das Substrat gebunden sein kann, zu Fehlern in den nachfolgenden Untersuchungen. Der Fehler entsteht wegen der unvorhersehbaren und unbekannten Menge, die zurückgehalten oder freigegeben wird.

Das Polymer wird dann zum Binden von Antikörper durch eine kovalente Bindung durch eine Behandlung mit Zyanbromid aktiviert; die Reaktionsmechanik ist in der obengenannten Literaturstelle Bartling et al beschrieben.

Das sich ergebende immobilisierte Immunadsorbens wird dann in einen Kammerhalter speziellen Aufbaus gegeben, der in einer automatischen Anlage nach der obengenannten Patentanmeldung Ser.No. 342 513 verwendet wird.

Fig. 1 stellt unter Fortlassung einiger Teile eine perspektivische Ansicht, teilweise im Schnitt, des im Rahmen der Erfindung verwendbaren Substrats schematisch dar;

Fig. 2 ist ein Schnittbild eines erfindungsgemäßen Kammerhalters.

Das verbesserte immobilisierte Immunadsorbens gemäß der Erfindung soll insbesondere bei Radioimmununtersuchungsverfahren verwendet werden.

Kit dem erfindungsgemäßen System lassen sich beispielsweise die folgenden Substanzen untersuchen: östriol, Digoxin, Digitoxin, Testosteron, östradiol, Aldosteron, Progesteron, Cortison, 11-Desoxy-Cortisteron, 11-Desoxycortison, Thyroid-Hormone, beispielsweise Thyroxin (T₄)trijodothyronin (T₃), Polypeptide, z.B. Angiotensin, TSH (Thyroid-stimulierendes

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Hormon, ACTH, GH (Größen-Hormon), HP (Placento-Luteotropin, Parathormon, Calcitonin, Insulin,Glucagen, Polypeptid-Proteine, z.B. CEA (Carcino-Embryo-Antigen), Alpha-Feto-Protein, Interferon, Viren wie z.B. Australisches Antigen), Vitamine, wie D und B₁₂, Folsäure und Medikamente wie z.B. Dilantin und Barbiturate; natürlich sind das nur einige wenige Beispiele.

Die Antiseren für die genannten Antigene sind bekannt, ebenso die markierten Antigene, die in Form eines radioaktiven markierten Materials, im allgemeinen in Form des Iso-

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tops J oder des Isotops H erhältlich sind.

Das erfindungsgemäße immobilisierte Immunadsorbens enthält ein Substrat, mit dem die Antikörper ziemlich dauerhaft verbunden sind. Im praktischen Versuch wird eine Probe von nicht-markiertem Antigen mit bekannter Konzentration von markiertem Antigen in Kontakt gebracht mit dem in einem Kammerhalter angeordneten immobilisierten Immunadsorbens. Beim Kontaktieren wird ein Teil des Gemischs aus markiertem Antigen und nicht-markiertem Antigen an den speziellen Antikörper gebunden, der an das Substrat gebunden ist. Anschliessend wird das ungebundene Antigen oder das gebundene Antigen oder beides gezählt und die Konzentration des nicht markierten Antigens nach den Standard-Werten bestimmt.

Anschliessend wird das immobilisierte Immunadsorbens mit einer geeigneten wäßrigen Lösung,die Lösungsmittel wie Methylalkohol, Isopropylalkohol oder Äthylalkohol enthält, sowie Dimethylformamid, gespült, um eine stöchiometrische Lösung des gebundenen markierten und unmarkierten Antigens von dem immobilisierten Immunadsorbens herbeizuführen. Durch das Spülen und Eluieren wird das Immunadsorbens zur Wiederverwendung wirkungsvoll regeneriert, und anschliessend kann

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das gleiche Immunadsorbens mehrfach von neuem benutzt werden für Untersuchungen, für die der immobilisierte Antikörper spezifisch ist, wobei zwischen die verschiedenen Anwendungen jeweils ein Waschvorgang in der angegebenen Art eingeschaltet wird.

Da das Antigenmaterial in eine Kammer geschwemmt wird, in der sich das wieder zu verwendende Immunadsorbens befindet, sollten die Strömungseigenschaften des Substrats geeignet sein, einen Kontakt zwischen den festgehaltenen Antikörpern und dem Antigengemisch herzustellen. Darüber hinaus muß das Substrat so beschaffen sein, daß keine Störung bei der Ablösung des gebundenen Antigens eintritt, während der gebundene Antikörper festgehalten wird. Reproduzierbarkeit, Stabilität und Geschwindigkeit sind einige der Vorteile der verbesserten Methode, und daher muß das Substrat so bescha_fen sein, daß -?ine ausreichende Aktivität im Hinblick auf gebundene Antikörper mit verfügbaren Antigenbindungsplätzen gegeben ist. Das Substrat ist daher vorzugsweise partikelförmig und kugelförmig, d.h. es besteht aus einer Masse einzelner Teilchen, weil dadurch der erwünschte Durchströmungscharakter nicht nur des Probengemisches von markiertem und nichtmarkiertem Antigen, sondern auch des Wasch- und des Eluierungsmediums verbessert wird.

Partikelförmiges Material mit der erforderlichen Antikörperaktivität ist bekannt, z.B. Sephadex, Sepharose, poröses Glas u. dgl.; Sephades und Sepharose und ähnliches Material liegt in Gelform vor, und bei vielfacher Benutzung haben diese Stoffe eine Tendenz zum Austrocknen, wodurch sie zum Zusammenfallen und Verdichten neigen, was zur Behinderung des Durchströmens führt. Poröses Glas und ähnliche Stoffe sind derart aktiv, daß das Antigen an das Glas gebunden und nicht wieder freigegeben wird.

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Ein wesentliches Ziel der Erfindung ist daher die Bildung einer absperrenden Beschichtung über einem partikelartigen Substrat, wobei die Sperre oder Schranke wie eine Maske wirkt, die die potentiell aktiven Plätze aus dem Substrat daran hindert, die Antigene irreversibel zu binden. Die Schranke wirkt ausserdem als immobilisierte Komponente des Substrats, an der die Antikörper angebracht werden können. Da die Untersuchungen in wäßrigen und wasserfreien Lösungsmitteln vorgenommen werden, ist die absperrende Beschichtung vorzugsweise unlöslich und wird von den Lösungsmitteln und Lösungen, die bei den Untersuchungen verwendet werden, nicht angegriffen. Wasserunlösliches Polymermaterial, beispielsweise Dextran, ist im Rahmen der Erfindung zu bevorzugen.

Das Substrat selbst stellt vorzugsweise ein partikelförmiges Material dar, das der Austrocknung und Verdichtung widersteht. Schnelle Massenübertragungen und verhältnismässig hoher Durchsatz hängen von der Substratgeometrie und dem Packungscharakter in dem Kammerhalter ab. Das bevorzugte Substrat ist ein Material mit regelmässiger Oberflächenporosität, mit oberflächlich porösen hochtemperaturbeständigen Teilchen aus einzelnen Makropartikeln mit undurchlässigem, nicht-porösen Kern, und darauf eine Beschichtung aus einer Folge adsorbierter Einfachschichten von gleichartigen anorganischen Mikropartikeln.

Zur Erläuterung der Erfindung wird auf Fig. 1 verwiesen; danach besitzt das oberflächlich poröse, hochtemperaturbeständige Teilchen 10, das das Substrat für das immobilisierte Immunadsorbens bildet, einen Kern 12 in Gestalt eines Makropartikels, das einen undurchlässigen, nicht-porösen Kern darstellt. Der Kern 12 ist kugelförmig gezeichnet, weil diese Form aus Packungsgründen zu bevorzugen ist.

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Der kugelförmige Kern hat einen Durchmesser zwischen 5 und 500 ,u und besteht aus Glas, kann
Keramikmaterial u. dgl. bestehen.

500 ,u und besteht aus Glas, kann aber auch aus Banden,

Die Kerne haben vorzugsweise übereinstimmende Abmessungen, d.h. liegen alle innerhalb eines Bereichs von ungefähr 50 % um den mittleren Durchmesser. Um den Kern 12 ist eine Anzahl Schichten aus Mikropartikeln 14 angeordnet, die eine äussere poröse Beschichtung bilden. Die Größe der Mikropartikel kann zwischen 5 m.u und 1 ,u liegen, die Anzahl der Schichten kann zwischen 2 und 30 betragen. Die Mikropartikel können aus amorphem Siliziumoxid, Aluminiumoxid, Thoriumoxid u. dgl. bestehen.

Ein auf diese Weise aufgebautes Substrat hat natürlich eine verhältnismässig große Flächenentfaltung wegen der porösen Beschichtung 15, ist aber verhältnismässig porenfrei im Kernmaterial. Bei Perlen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 30 .u und einer porösen Randbeschichtung von 1 /U

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ergibt sich eine Oberfläche von 0_f8 bis 1,0 m /g bei einer

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Packungsdichte von 1,5 g/cm . Die gleichmässige geometrische Form, die Beständigkeit gegenüber Austrocknung und Verdichtung und die Packungsverhältnissa lassen das oben beschriebene I-Iaterial als ganz ausserordentlich gut geeignet erscheinen .

Jedoch ist auch dieses Material bestrebt, wenn es in der angegebenen Form als Substrat für das Antikörpermaterial benutzt wird, aktive Plätze aufzuweisen, die das Antigengemisoh oder einen Teil des Gemische nichtlösbar aufnehmen. Dieses Problem erhält dann Gemeiit, wenn das immobilisierte IiHRunaäsorbens mehrfach bsmitz-t wird_? und dieser Gedankt ist ein ^c.>S3S!viliches Merkmal der Erfindung Da die Uiite; ;Uckuiigs^'S-.,:.a,uicjk3±i: und -geschwindigkeit ~£. !weiss mit

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der Fähigkeit des Antikörpers verknüpft ist, das Antigen zu binden und beim Waschen stöchiometrisch freizugeben, beeinträchtigt alles nicht freigegebene Antigen die Genauigkeit der nachfolgenden Untersuchung. Man könnte eine Untergrundzählung vornehmen, jedoch ist dieses Vorgehen nicht voll befriedigend, weil die Bindungs- und Freigabeerscheinung ungleichmässig und unvorhersehbar ablaufen kann.

Im Rahmen der Erfindung wird diese Tendenz ausgeschaltet, indem eine Sperrbeschichtung verwendet wird, die an dem Substrat durch Vermittlung eines Silans als Kopplungsagens haftet, d.h. das Polymer ist unmittelbar an die Oberflächenabschnitte des Substrats durch Silanbindungen gebunden. Dann wird das Polymer durch eine Behandlung mit Zyanbromid aktiviert, wodurch das Protein (Antikörper) kovalent an das partikelförmige Substrat mit aktiviertem Polymer gebunden wird. Die Polymerschicht dient nicht nur als Schranke, um Plätze mit latenter Aktivität auf dem eigentlichen Substrat abzudecken, sondern bietet eine aktive Fläche, an der der Antikörper kovalent gebunden werden kann, d.h. mit einer als verhältnismässig stark zu erachtenden Bindung.-

Bei einem typischen. Vorgehen gemäß der Erfindung wurden 12 g teilchenförmigen Substratmaterials (oberflächlich poröse hochtemperaturbeständige Partikel von 30 ,u Durchmesser der oben beschriebenen Art) in einen 500 ml-Kolben gegeben und 20 ml (18,84 g) 3-Aminopropyltriäthoxysllan und 100 ml Toluol zugefügt. Das Gemisch wurde 22 Std. umgewälzt, um das Aminoalkylsilan-Derivat des Glassubstrats herzustellen. Das Derivat wurde abgefiltert, auf dem Filterträger mit 200 ml Toluol gewaschen und in Luft getrocknet, darauf zum zweiten Male gewaschen (100 ml Chloroform) und anschliessend in Luft getrocknet.

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Das Isothiozyanoalkylsilan-Derivat wurde hergestellt, indem das gewonnene AminoalkyIsilan-Glas-Derivat mit 16,6 ml (25 g) Thiophosgen und 150 ml Chloroform behandelt wurde.Das Reaktionsgefäß wurde vor Licht geschützt, und es wurde 18 Std. lang durchmischt, um das angegebene Derivat zu erhalten, das anschliessend gefiltert, in Chloroform gewaschen und in Luft getrocknet wurde.

Das Ergebnis dieser Schritte war die Gewinnung eines "aktivierten" Substrats, an das das wasserunlösliche Polymer gebunden werdenkann.

Gemäß der Erfindung wird die Verwendung von Dextran mit einem Molekulargewicht von 70 000 bevorzugt, jedoch können auch andere Substanzen verwendet werden.

Demnach wurden 200 ml einer 1 %igen Lösung von Dextran in 0,1 m Natriumbikarbonat (ph 9,0) zu dem "aktivierten" Substrat gegeben. Das Gemisch wurde drei Stunden lang gerührt, gefiltert, mit 300 ml Wasser gewaschen, dann mit 100 ml Azeton gewaschen und in Luft getrocknet; es entstanden 11,6 g polymerbeschichtetes partikelförmiges Substrat.

Zu den restlichen Herstellungsschritten gehört die Aktivierung des polamerbeschichteten Substrats und wahlweise die Reinigung des Antikörpers und die Bindung des Antikörpers an das beschichtete Substrat, was manchmal auch als Konjugation des Antikörpers an präpariertes Substrat bezeichnet wird.

Zur Aktivierung des Dextrans wurden 20 g Zyanbromid in 200 ml Wasser gelöst; Zyanbromid ist sehr giftig, weshalb die einschlägigen Vorsichtsmaßnahmen beachtet werden müssen. Das dextranbeschichtete Substrat (11,6 g) wurde hinzugefügt und

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das Gemisch gerührt. Der pH wurde von 3,6 durch Zufügen von 23 ml 6n Natriumhydroxid auf pH 10-11 erhöht. Der pH wurde auf Werten zwischen 10 und 11 gehalten, indem 2 Min. lang 6n Natriumhydroxid zugegeben wurden. Dann wurde das aktivierte dextranbeschichtete Substrat mit 400 ml Wasser, 400 ml Mischung von Wasser und Azeton zu gleichen Volumenteilen, 400 ml Mischung aus 25 Volumenprozent Wasser und 75 Volumenprozent Azeton und abschliessend 400 ml Azeton gewaschen. Danach wurde in Luft getrocknet.

Die Behandlung des polymerbeschichteten Substrats mit Zyanbromid führt zu einer Umsetzung mit benachbarten Hydroxylgruppen auf dem Polymer und zur Bildung eines Imidokarbonats, das sich mit den nukleophilen Gruppen (Amino-) auf dem Antikörper verbindet und bei Hydrolyse Kohlensäureester bildet. Schnelle Hydrolyse des Imidokarbonats in saurer Umgebung führt zur Bildung eines Zyklokarbonats, das nicht die gleiche Bindewirkung hat wie das Imidokarbonat. Es ist also darauf zu achten, daß Bedingungen vermieden werden, die zur Bildung eines Zyklokarbonats führen.

Eine einfache Reinigung des Antikörpers vor der Konjugation läßt sich etwa folgendermaßen vornehmen: 1 ml 18 %iges Natriumsulfat wird in 0,1 ml des Antiserums gegeben. Die Lösung wurde stark durchwirbelt und eine Stunde lang bebrütet, um Gammaglobuline auszufällen. Dann wurde das entstandene Gemisch 5 Min. lang bei Zimmertemperatur mit 1000.g zentrifugiert, anschliessend dekantiert und der überstand verworfen. Die Tablette wurde in 10 ml 18 %igem Natriumsulfat unter Zugabe von 0,10 ml Wasser aufgenommen. Das entstandene Gemisch wurde stark gerührt und wiederum zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und die Tablette in 0,8 ml 0,1 m Natriumbikarbonatlösung gelöst.

Vorzugsweise wurde gemäß der Erfindung der Antikörper dem

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Substrat konjugiert, während dieses mit dem Antigen, auf das es anspricht, gesättigt ist. Der Grund dafür ist, daß man eine erhöhte Aktivität erzielen will, indem die aktiven Plätze auf dem Antikörper während des Konjugationsvorgangs geschützt werden, wodurch nämlich erreicht wird, daß der Antikörper eine Verbindung mit dem Substrat eingeht, wodurch die Verfügbarkeit von aktiven Plätzen gewährleistet ist. In gewissem Sinne ermöglicht die Bindung der aktiven Plätze an Antigen eine Orientierung des Antikörpers, die die Abdeckung der Plätze durch den Konjugationsvorgang reduziert.

Eine Menge von 0,5 ml einer für den Antikörper spezifischen Lösung von 0,1 mg/ml eines für den Antikörper spezifischen Antigens wurde in einerüthanol-Wasser-Lösung (2 Teile Äthanol, 1 Teil Wasser) gelöst und in einem Testrohr mit Stickstoffgas getrocknet. Das gereinigte Antiserura, gelöst in 0,8 ml 0,1 m Natriumbikarbonat oder 0,1 ml Antisera in 0,8 ml 0,1 m Natriumbikarbonat, wurde in das Rohr mit getrocknetem Antigen gegeben und anschliessend eine Stunde lang in einem bedeckten Kulturrohr bebrütet. Danach wurden 300 mg des zyanaktivierten, polymerbeschichteten Substrats in das die Antikörperlösung enthaltende Rohr gegeben und dann unter Mischen einen bis drei Tage lang bsi 4 C bebrütet. Während des Bebrütens erfolgt die Konjugation, wobei die Antigenbindungsplätze des Antikörpers durch gebundenes Antigen geschützt sind.

Nach dem Bebrüten wurde die Suspension 5 Min. lang mit 1000.g zentrifugiert und das überstehende dekantiert und verworfen. Die Tablette wurde zweimal in 10 ml 0,5 m Natriumbikarbonatlösung gewaschen. Nach jedem Waschvorgang wurde die Suspension zentrifugiert und der überstand verworfen. Das antikörperbeschichtete Substrat wurde dann zweimal mit 10 ml 0,1 m Acetatpuffer, pH 4, gewaschen. Dann

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wurde das antikörperbeschichtete Substrat gewaschen mit 10 ml 0,05 m Phosphatpuffer, pH 7,5, in dem 0,05 m Natriumchlorid und 0,5 % Rinderserumalbumin und 0,02 % Natriumazid als Konservierungsmittel enthalten waren . Das entstandene Produkt wurde dann in 10 ml der letzten Waschlösung wieder aufgenommen und bei 4° C aufbewahrt.

Vor der Verwendung zu üntersuchungszwecken wird das resultierende Produkt mit einer der beschriebenen Lösungen gewaschen, um das an den immobilisierten Antikörper gebundene Antigen zu entfernen. Beim Aufbewahren ist es jedoch zweckmässiger, das Antigen an den Antikörper gebunden zu belassen.

Es ist erfindungsgemäß möglich, den Antikörper in freiem Zustand mit dem Substrat zu konjugieren. Dazu muß der Antikörper mit dem zyanaktivierten polymerbeschichteten Substrat vermischt und anschliessend bebrütet und nachbehandelt werden, wie bereits oben beschrieben.

Nach einem Merkmal der Erfindung ist ein Kammerhalter für das immobilisierte Immunadsorbens vorgesehen. Gemäß Fig. 2 weist der Kammerhalter 25 einen Tragkörper 27 auf, der der einfacheren Herstellung wegen Zylinderform hat. In dem Tragkörper 27 ist eine Kammer 30 vorgesehen, die das immobilisierte Immunadsorbermaterial 32 enthält, das als partikelförmiges Material gezeichnet ist. Das Immunadsorbens wird in der Kammer von einem porösen Stopfen 34 gehalten, dessen Poren kleiner sind als die das Immunadsorbens bildenden Partikel. Ein Auslaß 36 ist vorgesehen, durch den ein durch die Kammer strömendes, durch einen Einlaß 38 eintretendes Material wieder austreten kann. Der Stopfen 34 sitzt fest in dem Tragkörper, der aus ßiypropylen oder "DELRIN" oder einem anderen Kunststoff bestehen kann. Die Kammer kann beispielsweise 3 mm (1/8 ") Durchmesser und 6 mm (1/4 ") Län-

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ge haben, während der Stopfen 3 mm und 3 mm (1/8 " und 1/8 ") mißt und eine Porenweite von 10 ,u hat.

In der Einlaßbahn befinden sich Filterelemente 41 und 43 in Form eines 400 mesh Nylonsiebes, das an einer Filterscheibe 43 anliegt, die vorzugsweise aus Polytetrafluoräthylen besteht und die Form eines Filzes mit höchstens 10 ,u Porengröße hat.

Wie sich aus der Zeichnung ergibt, läuft die Kammer 30 nach beiden Seiten in erweiterte Endabschnitte 46 bzw. 47 aus, die die Form von Sackbohrungen haben, die jeweils einen eingepreßten Stopfen 48 bzs. 49 aufnehmen. In jedem Stopfen befindet sich eine Sackbohrung 51 bzw. 53 und, wie der Zeichnung zu entnehmen ist, ein Durchlaß. An den der Kammer 30 zugewandten Enden sind an dem Stopfen konisch sich erweiternde Ausnehmungen 56 bzw. 57 sowie eine Ringschulter vorgesehen, in die eine O-Ring-Dichtung eingelegt ist; die O-Ringe bilden eine Dichtung an den jeweils zugeordneten Enden der Sackbohrungen in dem Tragkörper 27.

Der Stopfen 49 hält die Filter 41 und 43 an ihrem Platz gegen die Unterlage, wobei das Netz das Eindringen des Filzes in die konische Ausnehmung 57 verhindert.

Die Halterung des Kammerhalters erfolgt mittels der Abschlußstopfen 48, 49 und deren Bohrungen 51, 53. Der Kammerhalter wird daher als einheitliches Bauteil abgenommen und durch einen Kammerhalter für ein Immunadsorbens eines Antikörpers ersetzt, der für das in dem speziellen Versuch benutzte Antigen spezifisch ist. Ausser Gebrauch kann der in geeigneter Weise gekennzeichnete Kammerhalter bei 4° C aufbewahrt werden.

Kammerhalter der angegebenen Art für die Aufnahme von immo-

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bilisierten lmmunadsorbentien sind bei Untersuchungen der verschiedenen identifizierten Antigene verwendet worden. Die Immunadsorbentien gemäß der Erfindung sind für mehr als 5OO Untersuchungen bei jedem Immunadsorbens benutzt worden und arbeiten noch jetzt mit Ergebnissen, die gegenüber den klassischen Verfahren als günstig angesehen werden müssen, d.h. mit Standardabweichungen zwischen 5 % und 6 %.

Der Kammerhalter weist am Einlaßende für die Kammer einen sich öffnenden Konus 57 auf, der dazu dient, die Strömung über das Bett des partikelförmigen Immunadsorbens in der Kammer 30 aufzufächern. Die kegelförmige öffnung 56 wirkt wie ein Kollektor für das heraustretende Material, während der Stopfen 46 den porösen Stopfen 34 in der Kammer hält.

Als brauchbares Polymer ist Dextran angegeben worden, jedoch beschränkt sich die Erfindung nicht auf diese spezielle Substanz. Man kann auch andere wasserunlösliche Polymermaterialien mit freien Hydroxy-Gruppen zur Zyanbromid-Aktivierung verwenden, z.B. Zellulose u. dgl.. Dextran wird jedoch deswegen bevorzugt, weil dieses Material bereits früher in erheblichem Umfang bei Radioimmununtersuchungen angewendet worden ist, z.B. als dextranbeschichtete Holzkohle, und sein Verhalten in der Umgebung beeinträchtigt den Vorgang nicht.

Dem Fachmann sind gewisse Abwandlungen der Brfindungsmerkmale selbstverständlich« Sum Beispiel kann die Sperrbeschichtung angewendet werden, um andere Substrate abzudecken, bei denen die Aktivität des Substrats ein wichtiges Problem ist.

Patentansprüche;

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Claims

Patentansprüche ;

l.\ Kainmerhalter für ein immobilisiertes Immunadsorbens, gekennzeichnet durch
eine Tragkonstruktion (27} ,

eine Kammer (30) , in der genannten Tragkonstruktion, ein immobilisiertes Immunadsorbens (32) in der genannten Kammer,

wobei das genannte Immunadsorbens ein gegenüber Austrocknen und Verdichten stabiles Substrat umfaßt und dem Substrat Antikörper zum Binden eines speziellen Antigens beigegeben sind,

und· durch eine der Kammer (30) zugeordnete Einrichtung, die das genannte immobilisierte Immunadsorbens (32) in der genannten Kammer (30) trägt.

2« Kammerhalter nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Einlaß (3S) und einen Auslaß (36) für den Durchtritt von Fluid durch die genannte Kammer (3O)♦

3. Kammerhalter nach Anspruch 2_r dadurch gekennzeichnet, daß eine Filteranordnung (41_r 43) in dem genannten Einlaß derart vorgesehen ist, daß das Fluid zunächst die Filteranordnung und dann das genannte Immunadsorbens berührt«

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4. Kammer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat partikelförmig ist und aus Perlen besteht, die einen mittleren Durchmesser im Bereich zwischen Io und 500 .xx besitzen.

5. Kammerhalter nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger als poröser Stopfen (34) ausgebildet ist.

6. Kammer nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Poren in dem genannten Stopfen (34) kleiner sind als der Durchmesser der genannten Perlen.

7. Kammer nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Perlen eine poröse Oberfläche und einen darunter liegenden festen Kern (12) aufweisen, und daß die genannten Antikörper an der porösen Oberfläche angeordnet sind.

8. Kammer nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein wasserunlösliches Polymer mit der Aussenfläche der Perlen verbunden ist und daß die genannten Antikörper mit dem genannten Polymer verbunden sind.

9. Kammer nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Perlen eine Sperrbeschichtung aufweisen, an die die genannten Antikörper gebunden sind.

10. Kammer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das

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genannte Substrat eine Masse aus festen Teilchen umfaßt, die jeweils eine Oberfläche von großer Flächenentfaltung im Vergleich zu dem genannten Kern aufweisen, und daß die Aussenflache der genannten Partikel mit einer Sperrbeschichtung versehen ist, und daß die genannten Antikörper an die genannte Sperrbeschichtung gebunden s ind.

11. Kammer nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Sperrbeschichtung aus einem wasserunlöslichen Polymer besteht.

12. Kammer nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymer Dextran gewählt ist.

13. Kammer nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Poren in dem genannten Stopfen höchstens 10 ,u weit sind.

14. Kammer nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Einlaß eine Einrichtung (57) aufweist, mit der der Fluidstrom aufgefächert werden kann, wenn das Fluid in die genannte Kammer eintritt.

15. Immobilisiertes Immunadsorbens, gekennzeichnet durch ein gegenüber Austrocknen und Verdichten stabiles Substrat,

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an das ein wasserunlösliches Polymer gebunden ist_r wobei an das Polymer Antikörper gebunden sind, die ein spezielles Antigen binden sollen.

16. Immobilisiertes Immunadsorbens zum Binden eines speziellen Antigens, gekennzeichnet durch eine Masse aus festen Partikeln, deren Aussenflache jeweils eine große Flächenentfaltung aufweist, ein wasserunlösliches Polymermaterial, das chemisch an die genannte Aussenfläche der genannten festen Partikel gebunden ist,

wobei an das genannte Polymer durch covalente Bindung Antikörper gebunden sind, die das genannte spezifische Antigen binden sollen.

17. Immobilisiertes Immunadsorbens, gekennzeichnet durch eine Masse aus oberflächlich porösen, hochtemperaturbeständigen Partikeln, die jeweils einen undurchlässigen Kern (12) aufweisen, an den sich eine so große Zahl von Schichten aus Mikropartikeln (14) anschließt, daß eine äussere poröse Schicht auf dem genannten Kern entsteht, durch ein an die genannten Partikel gebundenes wasserunlösliches Polymermaterial, an das durch covalente Bindungen Antikörper gebunden sind, um ein spezielles Antigen zu binden.

18. Immobilisiertes Immunadsorbens nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Substrat um ein partikelförmiges Material handelt, das eine Aussenfläche mit grofier Oberflächenentfaltung aufweist, wobei das genannte

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wasserunlösliche Polymer Hydroxylgruppen aufweist und
die genannten Antikörper an das genannte Polymer durch
Imidokarbonat-Bindungen gebunden sind.

19. Immobilisiertes Immunadsorbens nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymer Dextran gewählt ist.

20. Immobilisiertes Immunadsorbens nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte partikelförmige Material sich aus undurchlässigen Glaskugeln zusammensetzt, die
von einer ausseren porösen umhüllung von Mikropartikeln
umgeben ist.

21. Immobilisiertes Immunadsorbens nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Kugeln einen Durchmesser zwischen 5 und 500 u und die genannten Mikrokugeln
einen Durchmesser zwischen 5 »u und 1 ,u aufweisen.

22. Immobilisiertes Immunadsorbens nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische Oberfläche des ge-

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nannten Substrats zwischen 0,8 und 1,0 m /g beträgt.

23. Immobilisiertes Immunadsorbens nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Polymer mit den genannten Partikeln durch eine Silanbindung verbunden ist, und daß die genannten Antikörper mit dem genannten Polymer durch Imidokarbonatbindungen verbunden sind.

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24. Immobilisiertes Immunadsorbens nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten Antikörper mit lösbar an sie gebundenen, für die genannten Antikörper spezifischen Antigenen versehen sind.

25. Verfahren zum Herstellen eines immobilisierten Immunadsorbens, gekennzeichnet durch folgende Schritte: Behandeln eines partikeIförmigen Substrats zum Aktivieren des Substratmaterials zum Binden eines Polymermaterials an das Substratmaterial, Binden eines Polymermaterials an das genannte aktivierte Substrat,

Aktivieren des genannten Polymers, um Antikörper an das Polymermaterial zu binden, und Konjugieren einer Masse von Antikörpern an das aktivierte Polymersubstrat, an welche Antikörper Antigene gebunden sind, die für die genannten Antikörper spezifisch sind.

26. Radioimmununtersuchungsverfahren, bei dem eine bekannte Menge eines markierten Antigens und ein unbekanntes und nicht markiertes Antigen mit einem immobilisierten Immunadsorbens in Berührung gebracht werden, an das Antikörper gebunden sind, die für das genannte Antigen spezifisch sind, um einen Teil des markierten und unbekannten Antigens zu binden, wodurch ein gebundener Teil und ein nicht gebundener Teil entsteht, bei dem ferner die Konzentration des unbekannten Antigens in Abhängigkeit von dem gebundenen oder dem nicht gebundenen Teil oder von beiden bestimmt wird, und bei dem schließlich der gebun-

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dene Teil von dem Immunadsorbens abgetrennt wird, indem das letztere mit einem Eluierungsmittel gespült wird,

gekennzeichnet durch die Verbesserung, daß ein Gemisch einer bekannten Menge von markiertem Antigen und eines unbekannten und nicht markierten Antigens in Berührung mit einem Antikörper gebracht wird, der für dieses Antigen spezifisch ist, und daß der genannte Antikörper kovalent an ein wasserunlösliches Polymer gekoppelt wird, das an ein partikelförmiges Substrat gebunden ist.

27. Radioimmununtersuchungsverfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte wasserunlösliche Polymer funktioneile Hydroxylgruppen enthält.

28. Radioimmununtersuchungsverfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymer Dextran gewählt ist.

29. Radioimmununtersuchungsverfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat aus einem oberflächlich porösen, hochtemperaturbeständigen Material besteht.

30. Radioimmununtersuchungsverfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Polymer durch Silanbindungen an das genannte Material gebunden ist

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und daß die genannten Antikörper durch Imidokarbonatbindungen an das genannte Polymer gebunden sind.

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