EP1656556A2 - Substrat als träger von ligaten - Google Patents

Substrat als träger von ligaten

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EP1656556A2
EP1656556A2 EP04731631A EP04731631A EP1656556A2 EP 1656556 A2 EP1656556 A2 EP 1656556A2 EP 04731631 A EP04731631 A EP 04731631A EP 04731631 A EP04731631 A EP 04731631A EP 1656556 A2 EP1656556 A2 EP 1656556A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
substrate
ligates
ligands
test sites
substrate according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04731631A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gerhard Hartwich
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH
Original Assignee
Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH filed Critical Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH
Publication of EP1656556A2 publication Critical patent/EP1656556A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof

Definitions

  • Substrate as a carrier for ligates
  • the invention relates to a substrate for use as a carrier for ligates.
  • dynamic ranks of a sensor means the area in which the sensor reproducibly and specifically reacts to changes in the concentration of a particular analyte.
  • the “dynamic ranks” of a sensor is generally about a factor of 10 to 100 in Analyte concentration and is limited to small concentrations by the sensitivity of the detection method. For high concentrations, the sensor becomes saturated from a certain range, so that a further increase in the analyte concentration does not cause a signal change.
  • the object of the invention is to provide a sensor which makes it possible to detect the concentration fluctuations of constituents of an analyte liquid in parallel, which constituents can be present in the test substance in concentrations that differ by orders of magnitude.
  • characteristic parameters of the active areas of the sensor surface such as occupancy parameters e.g. the geometric area of the test sites or their coverage with ligates.
  • the characteristic occupancy parameter defines the number of the respective ligates on the sensor surface and thus also the number of association events for a given analyte concentration via the association constant.
  • Fluorophore chemical compound that is able to emit a longer-wave (red-shifted) fluorescent light when excited with light.
  • Fluorophores fluorescent dyes
  • UV ultraviolet
  • VIS visible
  • IR infrared
  • the absorption and emission maxima are typically shifted from each other by 15 to 40 nm (Stokes shift).
  • Ligand Term for molecules that are specifically bound by the ligate examples are substrates, cofactors or coenzymes of a protein (enzyme), antibodies (as ligand an antigen), antigens (as ligand of an antibody), receptors (as ligand of a hormone), hormones (as ligand of a receptor) or nucleic acid oligomers (as ligand of the complementary nucleic acid oligomers).
  • Ligate Term for (macro) molecule with specific recognition and binding sites for the formation of a complex with a ligand examples include substrates, cofactors or coenzymes of a protein (enzyme), antibodies (as ligate of an antigen), antigens (as ligate of an antibody), receptors (as ligate of a hormone), hormones (as ligate of a receptor) ) or nucleic acid oligomers (as a ligate of the complementary nucleic acid oligomers).
  • Probe Biomolecules applied to the sensor surface that can specifically bind one or more molecules from the test substance (targets).
  • the chains are alkyl, alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl or heteroalkynyl.
  • Preferred spacers are those of chain length 1-20, in particular chain length 1-14, the chain length being the shortest continuous connection between the structures to be connected.
  • the test site each carry one or more types of probe molecules, each of which can specifically bind one or more molecules of a test substance.
  • the size of these areas and their surface coverage with probes can be optimized to the order of magnitude of the target concentration.
  • Target molecules in the test substance that can bind specifically to one or more biomolecules on the sensor surface (probes).
  • These spacers can in turn be bound to various reactive groups which are naturally present on the nucleic acid oligomer or are attached to it by modification.
  • "N" is any integer, in particular a number between 1 and 20.
  • the spacer for connecting the disulfide function to the nucleic acid oligomer can each have a different chain length (shortest continuous connection between disulfide function and nucleic acid oligomer), in particular any chain length between 1 and 14. These spacers can in turn be connected to different ones naturally existing on the nucleic acid oligomer or attached to it by modification attached reactive groups.
  • the placeholder "n” is any integer, in particular a number between 1 and 20.
  • oligo-spacer-SS- Two identical or different nucleic acid oligomers, spacer oligo, which are connected to one another via a disulfide bridge, the disulfide bridge being connected to the nucleic acid oligomers via any two spacers and the two spacers having a different chain length (shortest continuous connection between disulfide bridge and the respective nucleic acid oligomer), in particular any chain length between 1 and 14.
  • These spacers can in turn be bound to various reactive groups that are naturally present on the nucleic acid oligomer or are attached to them by modification.
  • PNA Peptide nucleic acid synthetic DNA or RNA in which the sugar-phosphate unit is replaced by an amino acid.
  • synthetic DNA or RNA synthetic DNA or RNA in which the sugar-phosphate unit is replaced by an amino acid.
  • the sugar-phosphate unit is replaced by the -NH- (CH 2 ) 2 -N (COCH 2 base) -CH 2 CO unit hybridizes PNA with DNA).
  • Nucleic acid At least two covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine (e.g. cytosine, thymine or uracil) or purine bases (e.g. adenine or guanine).
  • the term nucleic acid refers to any "backbone" of the covalently linked pyrimidine or purine bases, such as e.g. on the sugar-phosphate backbone of the DNA, cDNA or RNA, on a peptide backbone of the PNA or on analogous structures (e.g. phosphoramide, thio-phosphate or dithio-phosphate backbone).
  • An essential feature of a nucleic acid in the sense of the present invention is the sequence-specific binding of naturally occurring cDNA or RNA.
  • Nucleic acid - nucleic acid of unspecified base length e.g. oligomeric nucleic acid octamer: a nucleic acid with any backbone in which 8 pyrimidine or purine bases are covalently bound to one another.
  • Oligomer equivalent to nucleic acid oligomer Oligomer equivalent to nucleic acid oligomer.
  • Oligonucleotide equivalent to oligomer or nucleic acid oligomer e.g. a DNA, PNA or RNA fragment of unspecified base length.
  • Oligo Abbreviation for oligonucleotide Oligo Abbreviation for oligonucleotide.
  • the present invention relates to a substrate for use as a carrier for ligates in a method for the detection of ligate-ligand association events.
  • Test sites which have ligates bound to the surface are arranged on the substrate. At least two types of test sites are provided, the individual test sites being occupied with different types of ligates. These different types of ligates each detect complementary types of ligands which are present in an analyte solution in different concentration ranges.
  • the test sites have a characteristic occupancy parameter, so that the ligands can be detected in the concentration range in which the respective ligand is present in the analyte solution.
  • a sensor with a given number of specific coupling points reaches a saturation value from a certain analyte concentration in the test substance, so that a further increase in the concentration can no longer be detected.
  • This can theoretically be described with first-order binding kinetics for the binding of a probe S on the sensor surface and a target T in the test substance to form a surface complex ST with an association constant K:
  • the present invention provides a sensor with a "dynamic ranks" optimized with regard to the analysis of analyte liquids which contain analytes in very different concentrations.
  • the present invention is based on the idea that by optimizing the "dynamic range" of a sensor, changes in the concentrations of constituents of a liquid test substance can also be detected in parallel if the initial concentrations of these constituents vary by many orders of magnitude.
  • the substrate of the invention is preferably used as a carrier of biomolecules in a method for the electrochemical or fluorescence spectroscopic detection of components of an electrolyte solution.
  • the substrate according to the invention can also be used in an electrochemical or fluorescence spectroscopic method for the detection of biomolecules.
  • the present invention describes a sensor with spatially limited areas of different probe molecules (spots), each of which can specifically bind one or more target molecules from a test substance.
  • the size and / or surface coverage of the probes (characteristic coverage parameters of the substrate) of the spots of the invention are optimized for the concentration ranges of the corresponding targets to be detected in such a way that the proportion of binding events of all spots for, for example, the non-pathogenic state is independent of the actual concentration of the spots Targets is roughly the same. This leaves the specific "dynamic ranks" of a sensor normalize to this "initial state".
  • the advantage of this method lies in the adjusted sensitivity of all spots with regard to the changes in concentration of the corresponding targets to be detected, regardless of their initial concentration.
  • the sensor is thus optimized for the “tolerable” concentration range between the “permitted”, non-pathogenic value and the “critical”, pathogenic value of each analyte.
  • the composition of the analyte pool of a healthy organism is generally the rule sufficiently known that the present method can be used to provide evidence of a disease (exceeding the "critical" concentration value of an analyte) on the basis of changes in individual analytes.
  • ligands are preferably detected which are present in the analyte solution in concentration ranges whose mean values differ by at least a factor of 10.
  • the mean values of the concentration ranges in which they are present in the analyte solution differ by at least a factor of 100, particularly preferably by at least a factor of 1000, very particularly preferably by at least a factor of 10,000.
  • the present invention also includes the use of the substrates in methods for the detection of ligate-ligand association events.
  • the substrates can be used in particular in fluorescence spectroscopic and electrochemical detection methods.
  • Chronoamperometry (CA), chronocoulometry (CC), linear sweep voltammetry (LSV), cyclic voltammetry (CSV),retemating current voltammetry (ACV), voltammetry techniques with different pulse shapes, in particular square wave voltammetry (SWV), differential pulse voltammetry are used as electrochemical detection methods (DPV) or Normal Pulse Voltammetry (NPV), AC Impedance Spectroscopy, Chronopotentiometry and Cyclic Chronopotentiometry in question.
  • CA Chronoamperometry
  • CC chronocoulometry
  • LSV linear sweep voltammetry
  • CSV cyclic voltammetry
  • ACCV alternating current voltammetry
  • SWV square wave voltammetry
  • DUV electrochemical detection methods
  • NPV Normal Pulse Voltammetry
  • AC Impedance Spectroscopy
  • the characteristic occupancy parameter of the substrate is the size of the area of the individual test sites.
  • the area of the test sites preferably differs by at least a factor of 10, particularly preferably by at least a factor of 100, particularly preferably by at least a factor of 1000 and very particularly preferably by at least a factor of 10000.
  • substrates which have test site areas between 1 ⁇ m 2 and 1 mm 2 Preference is given to substrates which have test site areas between 1 ⁇ m 2 and 1 mm 2 . Substrates which have test site areas between 10 ⁇ m 2 and 100000 ⁇ m 2 are particularly preferred.
  • solid bodies with a freely accessible surface that can be functionalized with biomolecules and wetted with a liquid test substance are suitable as sensor substrates.
  • Solid substrates include plastics as well as metals, semiconductors, glasses, composites or porous materials.
  • the term surface is independent of the spatial dimensions of the surface. The surface of the sensor must be divisible into separate areas. This can be achieved by structuring the solid-state substrate into active and inactive areas or by partially functionalizing its homogeneous surface.
  • the structuring of the solid state substrates into active and inactive areas can be e.g. by lithography, vacuum deposition, electrochemical deposition, doping or laser treatment.
  • the structuring on homogeneous substrates can be achieved by applying and structuring passivation layers.
  • any material that forms a closed layer on a surface and thus separates the substrate surface from the environment is suitable as a passivation layer. At a later time the material can e.g. can be removed in its entire thickness without residue by laser ablation at the desired locations.
  • micro-contact printing ⁇ CP mico-contact printing
  • Whitesides 1994 A. Kumar, G.M. Whitesides, Science, 1994, 263, 60
  • a microstructured stamp is wetted with a liquid, then brought into direct contact with the substrate to be processed, and a lateral chemical structure is thus imprinted on the surface.
  • electrically conductive materials such as platinum, palladium, gold, cadmium, mercury, nickel, zinc, carbon, silver, copper, iron, lead, aluminum, manganese, any doped or undoped semiconductors and binary or ternary connections are used as surfaces of the sensor substrates.
  • electrically conductive materials such as platinum, palladium, gold, cadmium, mercury, nickel, zinc, carbon, silver, copper, iron, lead, aluminum, manganese, any doped or undoped semiconductors and binary or ternary connections are used as surfaces of the sensor substrates.
  • homogeneous electrically conductive surfaces can be structured or conductive materials can be applied to spatially separated areas of a non-conductive substrate, such as glass or plastic, in any thickness.
  • insulating carrier plates are used as sensor substrates, which are expediently rigid carrier plates on one side, rigid carrier plates on both sides or rigid multilayer carrier plates.
  • the insulating carrier plate can be a one-sided or double-sided flexible carrier plate, in particular made of a polyimide film, or a rigid-flexible carrier plate. It advantageously consists of a base material that is selected from the group BT (bismaleimide triazine resin with quartz glass), CE (cyanate ester with quartz glass), CEM1 (hard paper core with FR4 outer layers), CEM3 (glass fleece core with FR4 outer layers), FR2 ( Phenolic resin paper), FR3 (hard paper), FR4 (epoxy glass hard fabric), FR5 (epoxy glass hard fabric with cross-linked resin system), PD (polyimide resin with aramid reinforcement), PTFE (polytetrafluoroethylene with glass or ceramic), CHn (highly cross-linked hydrocarbons with ceramic) and glass ,
  • BT bismaleimide triazine resin with quartz glass
  • CE cyanate ester with quartz glass
  • CEM1 hard paper core with FR4 outer layers
  • CEM3
  • carrier plates have a certain number of conductor tracks with a gold surface, which are coated with a solder resist layer as a passivation.
  • laser gold ablation is used to burn free gold spots into the lacquer for later functionalization.
  • spots of any size and geometry can be written in the lacquer, whereby only the width of the conductor tracks represents a limit.
  • laser ablation not only removes the lacquer layer at desired points, but also ensures that the surface of the gold is temporarily melted and the pores are reduced by melting it briefly. By melting the substrates, a few gold layers are additionally ablated from the surface, thus removing impurities.
  • the conductor track substrates just described are suitable both for electrochemical measurement methods and for fluorescence spectroscopy. Functionalization of the active areas with ligates
  • the active areas of the sensor are functionalized with ligates, which act as probes for the ligands present in the test substance.
  • ligates which act as probes for the ligands present in the test substance.
  • all types of ligates are suitable for examining analyte liquids for the presence of their specific ligands. Molecules that specifically interact with a ligand to form a complex are referred to as ligates.
  • ligates in the sense of the present document are substrates, cofactors or coenzymes as complex binding partners of a protein (enzyme), antibodies (as complex binding partners of an antigen), antigens (as complex binding partners of an antibody), receptors (as complex binding partners of a hormone), hormones (as complex binding partners of a receptor), nucleic acid oligomers (as complex binding partner of the complementary nucleic acid oligomer) or metal complexes.
  • the number of probes on the sensor surface scales linearly with the surface, for example the application of probe monolayers under conditions which enable an occupancy of less than the densest packing.
  • volume methods for immobilizing the probes, for example via functionalized polymers, are also conceivable as long as the number of probes continues to scale with the area.
  • the free substrate sites are preferably wetted with modified nucleic acid oligomers in aqueous solution.
  • the nucleic acid oligomer which is to be applied to the free surface is modified via a covalently attached spacer of any composition and chain length with one or more reactive groups, these reactive groups preferably being located near one end of the nucleic acid oligomer.
  • the reactive groups are preferably groups that can react directly with the unmodified surface.
  • nucleic acid oligomers of the general formula (nx HS spacer) oligo, (nx RSS spacer) oligo or oligo spacer SS -Spacer-oligo, which react with a gold surface to form gold-sulfur bonds, (ii) nucleic acid oligomers with amines that attach to platinum or silicon surfaces by chemical or physical sorption and (iii) nucleic acid oligomers with silanes that form a covalent bond with oxidic surfaces. With these types of attachment of nucleic acid oligomers, deposits of less than the densest packing are generally realized, so that there is sufficient space on the surface for later hybridization.
  • HS spacer thiol
  • SS disulfide
  • the molecule can also be modified with an electrochemical label if necessary via a further spacer of any composition and chain length, if the functionalization of the free substrate sites and the subsequent hybridization using electrochemical
  • Oligonucleotides with a redox label can be used electrochemical methods to investigate the hybridization events, if the
  • Target molecules are provided with a redox label.
  • Another electrochemical detection variant is a displacement assay, in which short-chain signal oligomers are also bound to the unlabeled probe oligomers
  • Redox labels of unlabeled target oligomers of the complementary sequence are displaced.
  • Transition metal complexes in particular those of copper, iron, ruthenium, osmium or titanium with ligands such as pyridine, 4,7-dimethylphenanthroline, 9,10-phenanthrenequinone diimine, can be used as redox labels of the ligates or ligands, Porphyrins and substituted porphyrin derivatives can be used.
  • riboflavin of quinones such as pyrrolloquinoline quinone, ubiquinone, anthraquinone, naphthoquinone or menaquinone or derivatives thereof, of metallocenes and metallocene derivatives such as ferrocenes and ferrocene derivatives, cobaltocenes and cobaltocene derivatives, of porphyrins, methylene blue, hydroquinone derivatives, daaminomycin derivatives Derivatives (para or ortho dihydroxy benzene derivatives, para or ortho dihydroxy anthraquinone derivatives, para or ortho dihydroxy naphthoquinone derivatives) and similar compounds are possible.
  • quinones such as pyrrolloquinoline quinone, ubiquinone, anthraquinone, naphthoquinone or menaquinone or derivatives thereof
  • metallocenes and metallocene derivatives such as ferrocenes and ferrocene derivative
  • ligates or ligands can be given a fluorophore as a second functionalization via a further spacer of any composition and chain length if the functionalization of the free substrate sites and the subsequent hybridization are to be examined with the aid of optical methods.
  • fluorescence spectroscopy can also be performed with a fluorophore on the target molecules and unlabeled probes.
  • fluorescent dyes such as e.g. Texas Red®, rhodamine dyes, Cy3 TM, Cy5 TM, fluorescein etc. (cf. Fluka, Amersham and Molecular Probes catalog) can be used.
  • Two techniques are particularly suitable for the functionalization of the exposed substrate sites.
  • small volumes are selectively applied to the spots of the substrate using a commercially available spotter, each spot being able to be functionalized with different molecules.
  • all exposed spots can be functionalized with the same probe molecules, for example by immersing the substrate in the probe liquid or by wetting the entire substrate. Varying the surface concentration of the ligates
  • the number of probes on the sensor surface can also be set without varying the active spot size. This means that different amounts of probe molecules can be realized on spots of the same size with just one sensor design.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention is therefore substrates whose characteristic occupancy parameter is the occupancy density of the test sites with ligates.
  • the occupancy densities of the test sites with ligates particularly preferably differ by at least a factor of 10, particularly preferably by at least a factor of 100 and very particularly preferably by at least a factor of 1000.
  • the assignment can e.g. the incubation time, the number of coupling groups per molecule, the molarity of the loading buffer or the concentration of the molecules in the incubation solution.
  • the surface coverage is set using a coadsorbate.
  • a suitable coadsorbate is added to the incubation solution of the probe molecules in a certain concentration and brought into contact with the sensor surface, or the coadsorbate is applied in a second coating step after the functionalization with the probes.
  • the coadsorbate preferably has the same coupling group as the probe molecule, thus occupies part of the active surface and ensures a reduced surface coverage of the probe.
  • the surface coverage can be adjusted via the concentration of the coadsorbate in the respective incubation solution.
  • short-chain thiols of the general structure SH- (CH 2 ) n -X are particularly preferred, where X can be any head group.
  • Fig. 1 Theoretical curves of the relative proportion of binding events ([TS] / S 0 ) for different target concentrations.
  • concentration of the probes on the sensor surface is normalized to the association constant of the binding.
  • Fig. 2 Schematic image of a section of the sensor substrates based on circuit board technology, a) top view of the conductor track substrate with free substrate locations of different active area and geometry, b) cross section through a substrate with 3 identical electrode spots.
  • the gold sites of the substrate exposed by laser ablation are functionalized with double-modified nucleic acid oligomers, which have a thioi group at one end for binding to the gold surface and at the other end have an electrochemical label (e.g. osmium complexes).
  • the desired number of probes on the sensor surface is set either via the electrode size or by using a short-chain thiol of a certain concentration as a coadsorbate.
  • the nucleic acid oligomers of the test liquid also have an electrochemical label (eg ferrocene derivatives), so that both the assignment with the nucleic acid oligomers and the hybridization efficiency can be determined using electrochemical methods.
  • a preferred measurement method for analyzing occupancy and hybridization efficiency is AC (alternating current) voltammetry. From the ACV current at the redox potential of the label, according to O'Connor et al. (J. Electroanal. Chem., 466, 1999, 197-202) calculate the number of labels involved. The experiments can thus be evaluated quantitatively.
  • Example 1 PCB substrates.
  • FIG. 2a shows a section of this conductor track picture. The detail shows 4 of the 48 working electrodes (20A to 20D) and part of the counter electrode 28.
  • the entire conductor pattern is covered with a 15 ⁇ m to 20 ⁇ m thick passivation layer 22 (FIG. 2 b) made of structurable, optically curable lacquer (2-component solder resist, Elpemer GL 2467 SM-DG, from Peters).
  • Recesses 24, 24A to 24D are made in the passivation layer by high-energy pulses from an excimer laser and are used to hold the biomolecules 26.
  • a passivation layer with a thickness of 15 ⁇ m to 20 ⁇ m, you need to remove the lacquer and melt it for a short time
  • the melting of the surface leads to the closure of surface pores of the gold layer, to a reduction in the surface roughness and, by ablation, fewer gold layers to the removal of surface impurities.
  • the laser irradiation of the substrate can take place directly or via an optic or mask and enables recesses of any size and geometry.
  • FIG. 2b shows a section through a conductor track substrate with 3 identical spots.
  • Each of the conductor tracks 20 consists of a copper core 14 which is continuously covered by a nickel barrier layer 16 and a gold layer 18.
  • the copper core has a thickness of approximately 28 ⁇ m. It represents an inexpensive and highly conductive basic component of the conductor tracks.
  • the base copper core is coated with a 6 ⁇ m thick, continuous nickel layer as a diffusion barrier. A 2 ⁇ m thick gold layer is applied to this nickel layer.
  • the conductor tracks of the exemplary embodiment are approximately 150 ⁇ m wide and are arranged on the carrier plate at a distance of approximately 200 ⁇ m (center-center).
  • the working electrodes, the counter electrode and a reference electrode, if provided, are each connected to connection contact surfaces (not shown) of the electrical substrate for contacting.
  • the conductor tracks have circular recesses with diameters of 10 ⁇ m, 30 ⁇ m, 100 ⁇ m and rectangular recesses with the dimensions 100 ⁇ m ⁇ 700 ⁇ m (cf. 24A to 24D in FIG. 2a). These recesses thus have areas of 78.5 ⁇ m 2 , 706.5 ⁇ m 2 , 7850 ⁇ m 2 or 70000 ⁇ m 2 , so that the active area of the electrodes is varied by a factor of 1000.
  • Example 2 Functionalization of the spots of the substrate with nucleic acid oligomers.
  • the free substrate sites of various sizes described in Example 1 are e.g. functionalized with the nucleic acid oligomers via a spotting method.
  • the oligonucleotides are synthesized in an automatic oligonucleotide synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA / RNA synthesizer) in accordance with the synthesis protocols recommended by the manufacturer for a 1.0 ⁇ mol synthesis.
  • the oxidation steps are carried out with a 0.02 mol / l iodine solution in order to avoid oxidative cleavage of the disulfide bridge.
  • Modifications to the 5'-position of the oligonucleotides are carried out with a coupling step which is extended to 5 min.
  • the amino modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) is incorporated into the sequences according to the respective standard protocol.
  • the coupling efficiencies are determined online during the synthesis via the DMT cation concentration photometrically or conductometrically.
  • the oligonucleotides are deprotected with concentrated ammonia (30%) at 37 ° C for 16 h.
  • the oligonucleotides are purified using RP-HPL chromatography according to standard protocols (eluent: 0.1 mol / l triethylammonium acetate buffer, acetonitrile), and the characterization is carried out using MALDI-TOF MS.
  • the amine-modified oligonucleotides are coupled to the activated redox labels (e.g. osmium complexes) in accordance with the conditions known to the person skilled in the art. The coupling can take place both before and after the oligonucleotides have been bound to the surface.
  • the substrates from Example 1 are, for example, modified with double-modified 20 bp single-strand oligonucleotide of the sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification one: the phosphate group of the 3' end is with (HO- (CH 2 ) 2 -S) 2 esterified to P- O- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH
  • Modification two: at the amino-modified 5 'end is the osmium complex [Os (bipy) 2 Cl imidazole acrylic acid] according to the respective standard protocol) as a 5x10 "5 molar solution in buffer (Phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7 with 0.05 vol% SDS) applied using a spotter (Carthesian) and incubated for 2 - 24 h.
  • the disulfide spacer PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH of the oligonucleotide is cleaved homolytically.
  • the spacer forms a covalent Au-S bond with the Au atoms on the surface, which leads to a 1: 1 coadsorption of the ss-oligonucleotide and the split off 2-hydroxy-mercaptoethanol.
  • the single-strand can also be hybridized with its complementary strand.
  • Split-pin needles (Arraylt chipmarker pins from TeleChem) are used for the assignment with the spotter from Cartesian Technologies (MicroSys PA), which have a loading volume of 0.2 to 0.6 ⁇ l and deliver volumes of about 1 nl per wetting process.
  • the contact area of these needles has a diameter of approximately 130 ⁇ m and is therefore significantly larger than the areas of the substrate exposed during laser ablation.
  • the needle is positioned over the substrate with an accuracy of 10 ⁇ m at a humidity of around 70 - 80%. The drop is released when the tip comes into contact with the passivation layer and there is no direct contact with the substrate (“pseudo-contact printing”).
  • Example 3 Variation of the surface coverage by coadsorbates.
  • the occupancy density of a spot with nucleic acid oligomers can be reduced in a controlled manner by coadsorption with thiols, in order to increase the relative proportion of binding events with the target concentration and electrode size remaining the same.
  • the incubation solution consists of the nucleic acid oligomers (analogous to Example 2) with an additional between about 10 "5 to 10 '1 molar propanethiol.
  • This free propanethiol which is present at the same time, is co-adsorbed by forming an Au-S bond and thus takes up space on the sensor surface
  • the propanethiol (10 "5 to 10 " 1 molar in 500 mmol / l phosphate buffer) is applied in a second incubation step (30 min to 12 h) after the functionalization of the sensor surface with nucleic acid oligomers.
  • propanethiol as a coadsorbate can reduce the surface coverage density of the nucleic acid oligomers in both variants by up to a factor of 10.
  • Example 4 Varying the surface occupancy using occupancy parameters.
  • the surface coverage density of the sensor spots can also be adjusted by varying selected occupancy parameters when functionalizing with nucleic acid oligomers.
  • the occupancy density increases by a factor of 5.
  • concentration of the incubation buffer is increased from 10 mmol / l to 500 mmol / l at a probe concentration of 30 ⁇ mol / l.
  • Example 5 Hybridization with complementary nucleic acid oligomers.
  • a substrate with 48 working electrodes is produced as described in Example 1 with active areas of different sizes.
  • groups of 12 electrodes each, circular holes with a diameter of 10 ⁇ m (spot group 1), 30 ⁇ m (spot group 2) or 100 ⁇ m (spot group 3) and a rectangular profile with 100 ⁇ m x 700 ⁇ m ( Spot group 4) burned.
  • the individual spot groups therefore have areas of 78.5 ⁇ m 2 , 706.5 ⁇ m 2 , 7850 ⁇ m 2 or 70000 ⁇ m 2 , so that the area is varied by a factor of around 1000.
  • the working electrodes of a spot group are each functionalized with double-modified nucleic acid oligomers (probes) of a certain sequence (S1 to S4) analogously to Example 2.
  • the surface coverage density with nucleic acid oligomers can be calculated from the redox current at the potential of the osmium complex. In the present case, the result is 5 x 10 "1 mol / cm 2 .
  • the working electrodes are brought into contact with complementary, ferrocene-modified nucleic acid oligomers in a post-loading step for 30 minutes with a 1 mmol / l solution of propanethiol before hybridization.
  • the spaces between the nucleic acid oligomers are rendered hydrophobic. This shifts the redox potential of ferrocene to more positive values, resulting in better separation from the osmium potential.
  • the four different target nucleic acid oligomers are synthesized analogously to Example 2 but without a thiol modification at the 3 'end.
  • the target nucleic acid oligomers have a sequence (T1 to T4) which is complementary to a probe nucleic acid oligomer.
  • T1 to T4 the amino-modified nucleic acid oligomers are coupled at the 5 'end with ferrocene acetic acid (FcAc) in accordance with the respective standard protocol.
  • FcAc ferrocene acetic acid
  • the measurement data show a second redox peak, the ratio of the peak currents of the osmium label and the ferrocene label corresponding to the hybridization efficiency of the experiment.
  • the measurement data of the hybridization from FIG. 3 show an electrode close to saturation with a hybridization efficiency of over 90%.
  • the working electrodes with the sizes adapted to the concentrations of the respective targets all show the same hybridization efficiencies of approximately 30-40%.
  • Example 6 Diagnostic chip.
  • vaginal smear which is examined for HPV, E-Coli and lactobacilli, among others.
  • a sample is taken with the aid of standardized swabs, which is then treated using standardized methods in order to obtain the RNA of the bacteria present and the double-stranded DNA of the viruses.
  • bacteria or particle numbers up to a certain limit are classified as harmless: for HPV this is 100 particles, for E-coli 100 germs and for lactobacilli 10000 germs of all relevant lactobacilli.
  • a sensor chip according to the invention for the above application has three different spot sizes, which are functionalized with probe polynucleotides specific for the respective disease targets.
  • Spots with an area of 1 ⁇ m 2 are used to detect the HPV-DNA in the range of 10 2 to 10 4 molecules in the test substance, while for the E-Coli RNA in the range of 10 6 to 10 8 molecules (corresponding to 10 2 up to 10 4 germs) areas of 10 4 ⁇ m 2 and for the lactobacillus RNA in the range of 10 8 to 10 10 molecules (corresponding to 10 4 to 10 6 germs) areas of 10 6 ⁇ m 2 are used.
  • the choice of the electrode sizes ensures that the sensor for the respective area allows quantitative measurements from the critical target concentrations of the different pathogens and thus a parallel diagnosis of all diseases can be made.

Abstract

Beschrieben wird ein Substrat zum Einsatz als Träger von Ligaten bei einem Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen, mit auf dem Substrat angeordneten Teststellen (24) und mit an die Oberfläche der Teststellen (24) gebundenen Ligaten (26), wobei wenigstens zwei Arten von Teststellen (24) vorgesehen sind, wobei die verschiedenen Arten von Teststellen jeweils mit verschiedenen Arten von Ligaten (26) belegt sind, wobei durch die verschiedenen Arten von Ligaten (26) jeweils komplementäre Arten von Liganden detektiert werden, wobei die Liganden in einer Analytlösung in jeweils unterschiedlichen Konzentrationsbereichen vorliegen, und wobei die Teststellen (24) einen charakteristischen Belegungsparameter aufweisen, der eine Detektion der Liganden in deren jeweiligen Konzentrationsbereich erlaubt.

Description

Substrat als Träger von Ligaten
Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein Substrat zum Einsatz als Träger von Ligaten.
Stand der Technik
Im Bereich der Biowissenschaften, der Medizintechnik und der Sensorik wurden speziell in den letzten Jahren viele Sensoren und Verfahren für die Forschungsgebiete „Genomics" und „Proteomics" entwickelt. Für das Verständnis von Organismen ist die Analyse ihrer Gene bzw. ihres Proteinsatzes unerlässlich. Der Mensch besitzt z.B. in etwa 30000 - 50000 Gene und etwa 500000 verschiedene Proteine. Um diesen enormen Informationsgehalt detektieren zu können, bedarf es Sensoren mit einem hohen Grad an Parallelisierung und intelligente Auswertealgorithmen. Eine entscheidende Limitierung in Bezug auf die Qualität eines Sensors stellt der so genannte „dynamic ränge" des Sensors dar.
Unter dem Begriff „dynamic ränge" eines Sensors versteht man den Bereich, in dem der Sensor auf Änderungen in der Konzentration eines bestimmten Analyten reproduzierbar und spezifisch reagiert. Der „dynamic ränge" eines Sensors beträgt in der Regel etwa einen Faktor 10 bis 100 in der Analytkonzentration und ist zu kleinen Konzentrationen hin durch die Sensitivität der Nachweismethode begrenzt. Für hohe Konzentrationen tritt der Sensor ab einem gewissen Bereich in Sättigung, so dass eine weitere Erhöhung der Analytkonzentration keine Signaländerung hervorruft.
Im Bereich der Genexpressionsanalyse von Organismen oder der Identifizierung von Fremdkeimen wie z.B. Viren oder Bakterien in Organismen, wie sie beispielsweise bei einer medizinischen Untersuchung durchgeführt wird, ergibt sich oft die Problemstellung, viele verschiedene Analyten nebeneinander quantitativ analysieren zu müssen. Die Konzentrationen dieser Analyten können aber um viele Größenordnungen schwanken. Bereits im nicht-pathogenen Zustand liegen die Analyten in sehr unterschiedlichen Konzentrationen vor. Die Ausbildung einer pathogenen Wirkung setzt in der Regel erst bei Überschreitung eines Analyt- abhängigen Grenzwertes ein, der ein Vielfaches der tolerablen Grundanalytkonzentration darstellen kann. Solche extrem streuenden Änderungen in den Analytkonzentrationen können von den aus dem Stand der Technik bekannten Sensoren nicht parallel detektiert werden. Vielmehr werden mehrere Sensoren verwendet, die jeweils nur Änderungen der Konzentration einer Gruppe von Analyt-Molekülen detektieren, welche in einer ähnlichen Anfangskonzentration vorliegen.
Darstellung der Erfindung
Hier setzt die Erfindung an. Der Erfindung, wie sie in den Ansprüchen gekennzeichnet ist, liegt die Aufgabe zugrunde, einen Sensor bereitzustellen, der es ermöglicht, die Konzentrationsschwankungen von Bestandteilen einer Analytflüssigkeit parallelisiert zu detektieren, wobei diese Bestandteile in um Größenordnungen verschiedenen Konzentrationen in der Testsubstanz vorliegen können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Substrat nach Anspruch 1 und die Verwendung des Substrats nach Anspruch 24 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Figuren und den Beispielen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt: ACV Altemating current voitammetry
dynamic ränge Bereich eines Sensors, in dem er auf Änderungen in der Konzentration eines bestimmten Analyten reproduzierbar und spezifisch reagiert.
charakteristischer Parameter der aktiven Bereiche der Sensoroberfläche, wie Belegungsparameter z.B. die geometrische Fläche der Test-Sites oder ihre Belegungsdichte mit Ligaten. Der charakteristische Belegungsparameter definiert die Anzahl der jeweiligen Ligaten auf der Sensoroberfläche und somit über die Assoziationskonstante auch die Anzahl der Assoziationsereignisse bei gegebener Analytkonzentration.
FcAc Ferrocen Acetic acid (Ferrocen Essigsäure)
Fluorophor chemische Verbindung (chemische Substanz), die in der Lage ist, bei Anregung mit Licht ein längerwelliges (rotverschobenes) Fluoreszenzlicht abzugeben. Fluorophore (Fluoreszenzfarb-stoffe) können Licht in einem Wellenlängenbereich vom ultravioletten (UV) über den sichtbaren (VIS) bis hin zum infraroten (IR) Bereich absorbieren. Die Absorptions- und Emissionsmaxima sind typischerweise um 15 bis 40 nm gegeneinander verschoben (Stokes-Shift).
Laser-Ablation Partielles oder vollständiges Entfernen von organischen oder anorganischen Passivierungsschichten, aber auch das Entfernen von Verunreinigungen auf einem Substrat durch Einstrahlung von Laserlicht.
Ligand Bezeichnung für Moleküle, die vom Ligaten spezifisch gebunden werden; Beispiele von Liganden im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme eines Proteins (Enzyms), Antikörper (als Ligand eines Antigens), Antigene (als Ligand eines Antikörpers), Rezeptoren (als Ligand eines Hormons), Hormone (als Ligand eines Rezeptors) oder Nukleinsäure-Oligomere (als Ligand der komplementären Nukleinsäure-Oligomere).
Ligat Bezeichnung für (Makro-) Molekül, an dem sich spezifische Erkennungs- und Bindungsstellen für die Ausbildung eines Komplexes mit einem Liganden befinden. Beispiele von Ligaten im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme eines Proteins (Enzyms), Antikörper (als Ligat eines Antigens), Antigene (als Ligat eines Antikörpers), Rezeptoren (als Ligat eines Hormons), Hormone (als Ligat eines Rezeptors) oder Nukleinsäure- Oligomere (als Ligat der komplementären Nukleinsäure- Oligomere).
μCP Micro-Contact-Printing.
Osmium-Komplex [Os(bipy)2 Cl imidazolacrylsäure]
SDS Sodiumdodecylsulfat
Sonde Auf die Sensoroberfläche aufgebrachte Biomoleküle, die spezifisch ein oder mehrere Moleküle aus der Testsubstanz (Targets) binden können.
Spacer Beliebige molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom,
Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül. In der Regel handelt es sich um Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder Heteroalkinyl-Ketten. Bevorzugte Spacer sind solche der Kettenlänge 1 - 20, insbesondere der Kettenlänge 1 - 14, wobei die Kettenlänge die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen darstellt.
Spot bzw. Räumlich begrenzte Gebiete auf der Sensoroberfläche, die Test-Site je einen oder mehrere Typen von Sonden-Moleküle tragen, die spezifisch je ein oder mehrere Moleküle einer Testsubstanz binden können. Die Größe dieser Bereiche bzw. ihre Oberflächenbelegung mit Sonden lässt sich auf die Größenordnung der Target-Konzentration optimieren.
Target Moleküle in der Testsubstanz, die spezifisch an ein oder mehrere Biomoleküle an der Sensoroberfläche (Sonden) binden können.
(n x HS-Spacer)- Nukleinsäure-Oligomer, an das n Thiolfunktionen über oligo jeweils einen Spacer angebunden sind, wobei die Spacer jeweils eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Thiolfunktion und Nukleinsäure-Oligomer) aufweisen können, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14. Diese Spacer können wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer vorhandene oder an diesem durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein. Dabei ist „n" eine beliebige ganze Zahl, insbesondere eine Zahl zwischen 1 und 20.
(n x R-S-S-Spacer)- Nukleinsäure-Oligomer, an das n Disulfidfunktionen über oligo jeweils einen Spacer angebunden sind, wobei ein beliebiger Rest R die Disulfidfunktion absättigt. Der Spacer zur Anbindung der Disulfidfunktion an das Nukleinsäure- Oligomer kann jeweils eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Disulfidfunktion und Nukleinsäure-Oligomer) aufweisen, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14. Diese Spacer können wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer vorhandene oder an diesem durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein. Der Platzhalter „n" ist eine beliebige ganze Zahl, insbesondere eine Zahl zwischen 1 und 20.
oligo-Spacer-S-S- Zwei gleiche oder verschiedene Nukleinsäure-Oligomere, Spacer-oligo die über eine Disulfid-Brücke miteinander verbunden sind, wobei die Disulfidbrücke über zwei beliebige Spacer an die Nukleinsäure-Oligomere angebunden ist und die beiden Spacer eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Disulfidbrücke und dem jeweiligen Nukleinsäure-Oligomer) aufweisen können, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14. Diese Spacer können wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer vorhandene oder an diese durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein.
DNA Desoxyribonukleinsäure
RNA Ribonukleinsäure
PNA Peptidnukleinsäure (synthetische DNA oder RNA, bei der die Zucker-Phosphat-Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei Ersatz der Zucker-Phosphat-Einheit durch die -NH- (CH2)2-N(COCH2-Base)-CH2CO-Einheit hybridisiert PNA mit DNA).
A Adenin
G Guanin
Cytosin Thymin
Base A, G, T oder C
Bp Basenpaar
Nukleinsäure Wenigstens zwei kovalent verbundene Nukieotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z.B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z.B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z.B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid- Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z.B. Phosphoramid-, Thio-Phosphat- oder Dithio-Phosphat- Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die sequenzspezifische Bindung natürlich vorkommender cDNA oder RNA.
Nukleinsäure- Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z.B. Oligomer Nukleinsäure-Oktamer: eine Nukleinsäure mit beliebigem Rückgrat, bei dem 8 Pyrimidin- oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind).
Oligomer Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer.
Oligonukleotid Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z.B. ein DNA-, PNA- oder RNA-Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge.
Oligo Abkürzung für Oligonukleotid.
ss Single Strand (Einzelstrang) K Assoziationskonstante
[S] Tatsächliche Belegungsdichte der Sondenmoleküle an der Oberfläche nach Bindung der Liganden an die Ligaten.
[ST] Belegungsdichte der Komplexe aus Target und Sondenmolekül an der Oberfläche.
So Gesamtbelegungsdichte der Sondenmoleküle an der Oberfläche.
[TJ Targetkonzentration
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Substrat zum Einsatz als Träger von Ligaten bei einem Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen. Auf dem Substrat sind Teststellen angeordnet, die an die Oberfläche gebundene Ligaten aufweisen. Es sind wenigstens zwei Arten von Teststellen vorgesehen, wobei die einzelnen Teststelien mit verschiedenen Arten von Ligaten belegt sind. Durch diese verschiedenen Arten von Ligaten werden jeweils komplementäre Arten von Liganden detektiert, welche in einer Analytlösung in unterschiedlichen Konzentrationsbereichen vorliegen. Die Teststellen weisen einen charakteristischen Belegungsparameter auf, so dass eine Detektion der Liganden in dem Konzentrationsbereich ermöglicht wird, in dem der jeweilige Ligand in der Analytlösung vorliegt.
Ein Sensor mit einer gegebenen Anzahl von spezifischen Kopplungsstellen erreicht ab einer gewissen Analyt-Konzentration in der Testsubstanz einen Sättigungswert, so dass eine weitere Erhöhung der Konzentration nicht mehr detektiert werden kann. Dies lässt sich theoretisch mit einer Bindungskinetik erster Ordnung für die Bindung einer Sonde S auf der Sensoroberfläche und einem Target T in der Testsubstanz zu einem Oberflächenkomplex ST mit einer Assoziationskonstante K beschreiben:
Für die Oberflächenbelegungsdichten gilt: [S] = S0 - [ST], wobei S0 die Gesamtbelegungsdichte der Sonden und [S] die Belegungsdichte freier Sonden im thermodynamischen Gleichgewicht darstellt. Formt man obige Gleichung um, erhält man einen Ausdruck [ST] / S0 für den relativen Anteil der Oberflächenkomplexe:
[ST] / S0 = K-[T] / (1 + K-[T]) = 1 - [S] / So (2)
Dieser Ausdruck als Funktion der auf die Assoziationskonstante K normierten Oberflächenbelegungsdichte S0 ist in der Figur 1 für vier verschiedene Target- Konzentrationen [T] dargestellt und entspricht den bekannten Langmuir- Bindungsisothermen. Im Falle von Bindungsereignissen, die nicht mehr voneinander unabhängig sind und deren Bindungsenergien einer Verteilung unterliegen, ist das angmu/r-Modell jedoch nicht mehr gültig. Es entstehen heterogene Adsorptionsisothermen, die z.B. durch das S/ s-Modell beschrieben werden:
[ST] / S0 = (K.[T]) / (1 + (K.r ]) ) (3)
wobei a ein Parameter (a ≤ 1) ist, der eine Pseudo-Gauß-Verteilung von Bindungsenergien darstellt. Für a = 1 geht obige Formel wieder in die Langmuir- Isotherme über.
An der Darstellung des Langπw/r-Modells (Figur 1) ist ersichtlich, dass sich für eine gegebene Analyt-Konzentration der Anteil der Bindungsereignisse ab einer Sondenzahl kleiner einer gewissen Grenze nicht mehr erhöht. In diesem Bereich spricht man von „ambient analyte conditions" (US 5,807,755). Die Anzahl der Sonden auf dem Sensor führt zu keiner merklichen Verarmung (weniger als 10 %) der Targets in der Testsubstanz. Unter „ambient analyte conditions" führt eine Erhöhung der Analyt-Konzentration nur zu einer parallelen Verschiebung des Plateaus zu höheren Anteilen von Bindungsereignissen. Nach einer Erhöhung um 2 bis 3 Größenordnungen wird die Sättigung des Sensors erreicht. Liegt also bei gegebener Assoziationskonstante und Sondenzahl des Sensors eine Analyt-Konzentration vor, die zu einer relativen Belegung (vgl. [TS]/S0 in Figur 1) nahe 1 führt, so sind weitere Konzentrationserhöhungen dieser Spezies in der Testsubstanz nicht mehr zu detektieren. Erhöht man jedoch die Sondenzahl des Sensors für einen in zu hoher Konzentration vorliegenden Target-Typ der Testsubstanz bzw. bringt man diese Sonden bei gleicher Belegungsdichte auf größere Elektroden auf, so lässt sich die relative Belegung dieser Reaktion senken und so die Sensitivität optimieren.
Durch die vorliegende Erfindung wird ein Sensor mit einem im Hinblick auf die Untersuchung von Analytflüssigkeiten, die Analyten in sehr unterschiedlichen Konzentrationen enthalten, optimierten „dynamic ränge" bereitgestellt.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Idee zu Grunde, dass durch Optimierung des „dynamic ränge" eines Sensors Änderungen in den Konzentrationen von Bestandteilen einer flüssigen Testsubstanz auch dann parallel detektiert werden können, wenn die Ausgangskonzentrationen dieser Bestandteile um viele Größenordnungen streuen.
Bevorzugt kommt das Substrat der Erfindung als Träger von Biomolekülen bei einem Verfahren zur elektrochemischen bzw. fluoreszenzspektroskopischen Detektion von Bestandteilen einer Elektrolytlösung zum Einsatz. Das erfindungsgemäße Substrat kann auch in einem elektrochemischen bzw. fluoreszenzspektroskopischen Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt einen Sensor mit räumlich begrenzten Gebieten verschiedener Sonden-Moleküle (Spots), die spezifisch je ein oder mehrere Target-Moleküle aus einer Testsubstanz binden können. Die Spots der Erfindung sind in Größe und/oder Oberflächenbelegung der Sonden (charakteristische Belegungsparameter des Substrats) so auf die zu detektierenden Konzentrationsbereiche der entsprechenden Targets optimiert, dass der Anteil an Bindungsereignissen aller Spots für z.B. den nicht-pathogenen Zustand unabhängig von der eigentlichen Konzentration ihrer Targets in etwa gleich ist. Dadurch lässt sich der spezifische „dynamic ränge" eines Sensors auf diesen „Anfangszustand" normieren. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt in der angeglichenen Sensitivität aller Spots hinsichtlich der zu detektierenden Konzentrationsänderungen der entsprechenden Targets unabhängig von deren Anfangskonzentration. Der Sensor ist somit auf den „tolerierbaren" Konzentrationsbereich zwischen dem „erlaubten", nicht-pathogenen Wert und dem „kritischen", pathogenen Wert jedes Analyten optimiert.
Für die Optimierung des Sensors sollten also die „erlaubten", nicht-pathogenen Konzentrationen der Analyten der Testflüssigkeiten zu Beginn einer Experimentserie bekannt sein. Speziell im Bereich der Genexpressionsanalyse oder der Identifikation von Keimen ist die Zusammensetzung des Analyt-Pools eines gesunden Organismus in der Regel hinreichend bekannt, so dass mit dem vorliegenden Verfahren anhand der Änderungen von einzelnen Analyten Indizien für eine Erkrankung (Überschreitung des „kritischen" Konzentrationswertes eines Analyten) geliefert werden können.
Für das quantitative Auslesen der verschiedenen Spots des Sensors in Bezug auf mögliche Bindungsereignisse kommen im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle geeigneten Messmethoden in Abhängigkeit von den verwendeten Substraten und den jeweiligen Biomolekülen in Frage.
Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Substrate werden bevorzugt verschiedene Arten von Liganden detektiert, die in der Analyt-Lösung in Konzentrationsbereichen vorliegen, deren Mittelwerte sich um wenigstens einen Faktor 10 unterscheiden. Unter dem Mittelwert cm eines Konzentrationsbereichs wird der Wert cm = ((cmax - cmjn) / 2) + cmin verstanden, wobei cmaχ die maximale Konzentration und cmin die minimale Konzentration bedeutet. Bevorzugt können verschiedene Arten von Liganden detektiert werden, wobei sich die Mittelwerte der Konzentrationsbereiche, in denen sie in der Analyt-Lösung vorliegen, um wenigstens einen Faktor 100, insbesondere bevorzugt um wenigstens einen Faktor 1000, ganz besonders bevorzugt um wenigstens einen Faktor 10000 unterscheiden. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung der Substrate in Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen.
Die Substrate können insbesondere in fluoreszenzspektroskopischen und elektrochemischen Nachweisverfahren verwendet werden. Als elektrochemische Nachweisverfahren kommen Chronoamperometrie (CA), Chronocoulometrie (CC), Linear Sweep Voltammetrie (LSV), zyklische Voltammetrie (CSV), Altemating current voltammetry (ACV), Voltammetrietechniken mit verschiedenen Pulsformen, insbesondere Square Wave Voltammetrie (SWV), Differential Pulse Voltammetrie (DPV) oder Normal Pulse Voltammetrie (NPV), AC Impedanzspektroskopie, Chronopotentiometrie und zyklische Chronopotentiometrie in Frage.
Sensor-Substrate mit aktiven Flächen verschiedener Größen
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem charakteristischen Belegungsparameter des Substrats um die Größe der Fläche der einzelnen Teststellen. Bevorzugt unterscheidet sich die Fläche der Teststellen um mindestens den Faktor 10, besonders bevorzugt um mindestens den Faktor 100, insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 1000 und ganz besonders bevorzugt um mindestens den Faktor 10000.
Bevorzugt werden Substrate, die Teststellen-Flächen zwischen 1 μm2 und 1 mm2 aufweisen. Besonders bevorzugt werden Substrate, die Teststellen-Flächen zwischen 10 μm2 und 100000 μm2 aufweisen.
Als Sensor-Substrate eignen sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle Festkörper mit frei zugänglicher Oberfläche, die mit Biomolekülen funktionalisiert und mit einer flüssigen Testsubstanz benetzt werden können. Als Festkörpersubstrate kommen sowohl Kunststoffe als auch Metalle, Halbleiter, Gläser, Verbundstoffe oder poröse Materialien in Frage. Die Bezeichnung Oberfläche ist unabhängig von den räumlichen Dimensionen der Oberfläche. Die Oberfläche des Sensors muss in räumlich getrennte Bereiche unterteilbar sein. Dies lässt sich durch Strukturierung des Festkörpersubstrats in aktive und inaktive Bereiche oder durch partielle Funktionalisierung seiner homogenen Oberfläche realisieren.
Die Strukturierung der Festkörpersubstrate in aktive und inaktive Bereiche lässt sich z.B. durch Lithographie, Vakuumabscheidung, elektrochemische Abscheidung, Dotieren oder Laserbehandlung erreichen. Auf homogenen Substraten kann man die Strukturierung durch Aufbringen und Strukturierung von Passivierungsschichten realisieren. Erfindungsgemäß eignet sich als Passivierungsschicht jedes beliebige Material, das an einer Oberfläche eine geschlossene Schicht bildet und somit die Substratoberfläche von der Umgebung trennt. Zu einem späteren Zeitpunkt kann das Material z.B. durch Laser-Ablation an den gewünschten Stellen in seiner gesamten Dicke rückstandsfrei entfernt werden.
Auch ohne Strukturierung der Substrate können räumlich getrennte Bereiche unterschiedlicher Funktionalisierung hergestellt werden. Hier sei exemplarisch auf das Mikrokontakt-Drucken μCP (mico-contact-printing), das erstmals von Whitesides 1994 (A. Kumar, G.M. Whitesides, Science, 1994, 263, 60) vorgestellt wurde, hingewiesen. Bei diesem Verfahren wird ein mikrostrukturierter Stempel mit einer Flüssigkeit benetzt, anschließend in direktem Kontakt mit dem zu bearbeitenden Substrat gebracht und so der Oberfläche eine laterale chemische Struktur aufgeprägt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden elektrisch leitfähige Materialien wie Platin, Palladium, Gold, Cadmium, Quecksilber, Nickel, Zink, Kohlenstoff, Silber, Kupfer, Eisen, Blei, Aluminium, Mangan, beliebige dotierte oder nicht-dotierte Halbleiter und binäre oder ternäre Verbindungen als Oberflächen der Sensorsubstrate verwendet. Zur Realisierung von räumlich getrennten aktiven Test-Sites bzw. Spots auf dem Sensor können homogene elektrisch leitfähige Oberflächen strukturiert werden oder aber leitfähige Materialien auf räumlich getrennte Bereiche eines nicht-leitfähigen Substrats, wie z.B. Glas oder Kunststoff in beliebiger Dicke aufgebracht werden. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden als Sensorsubstrate isolierende Trägerplatten verwendet, die zweckmäßig einseitig starre Trägerplatten, doppelseitig starre Trägerplatten oder starre Mehrlagenträgerplatten sind. Alternativ kann die isolierende Trägerplatte eine einseitige oder doppelseitige flexible Trägerplatte, insbesondere aus einer Polyimidfolie oder eine starr-flexible Trägerplatte sein. Sie besteht mit Vorteil aus einem Basismaterial, das ausgewählt ist aus der Gruppe BT (Bismaleinimid- Triazinharz mit Quarzglas), CE (Cyanatester mit Quarzglas), CEM1 (Hartpapierkern mit FR4-Außenlagen), CEM3 (Glasvlieskern mit FR4-Außenlagen), FR2 (Phenolharzpapier), FR3 (Hartpapier), FR4 (Epoxid-Glashartgewebe), FR5 (Epoxid- Glashartgewebe mit vernetztem Harzsystem), PD (Polyimidharz mit Aramidverstärkung), PTFE (Polytetrafiuorethylen mit Glas oder Keramik), CHn (hochvernetzte Kohlenwasserstoffe mit Keramik) und Glas.
Diese Trägerplatten weisen eine gewisse Anzahl von Leiterbahnen mit einer Goldoberfläche auf, die mit einer Lötstopplackschicht als Passivierung überzogen sind. An einem Ende der Leiterbahnen befinden sich Kontakte für elektrochemische Untersuchungen, am anderen Ende werden mit einer Laser-Ablation freie Goldstellen für die spätere Funktionalisierung in den Lack gebrannt. Mit Hilfe der Laser-Ablation lassen sich Spots beliebiger Größe und Geometrie in den Lack schreiben, wobei nur die Breite der Leiterbahnen eine Grenze darstellt. Die Laser- Ablation entfernt erfindungsgemäß nicht nur die Lackschicht an gewünschten Stellen, sondern sorgt durch das kurzzeitige Aufschmelzen der Goldoberfläche auch für die Reduktion der Oberflächenrauigkeit und das Verschließen von Poren. Durch das Aufschmelzen der Substrate werden zusätzlich wenige Goldlagen von der Oberfläche ablatiert und somit Verunreinigungen entfernt.
Die gerade beschriebenen Leiterbahn-Substrate eignen sich sowohl für elektrochemische Messmethoden als auch für die Fluoreszenz-Spektroskopie. Funktionalisierung der aktiven Flächen mit Ligaten
Die aktiven Bereiche des Sensors sind mit Ligaten funktionalisiert, die als Sonden für die in der Testsubstanz vorhandenen Liganden fungieren. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung eignen sich alle Arten von Ligaten, um Analytflüssigkeiten auf das Vorhandensein ihrer spezifischen Liganden zu untersuchen. Als Ligaten werden Moleküle bezeichnet, die spezifisch mit einem Liganden unter Ausbildung eines Komplexes wechselwirken. Beispiele von Ligaten im Sinne der vorliegenden Schrift sind Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme als Komplexbindungspartner eines Proteins (Enzyms), Antikörper (als Komplexbindungspartner eines Antigens), Antigene (als Komplexbindungspartner eines Antikörpers), Rezeptoren (als Komplexbindungspartner eines Hormons), Hormone (als Komplexbindungspartner eines Rezeptors), Nukleinsäure-Oligomere (als Komplexbindungspartner des komplementären Nukleinsäure-Oligomers) oder Metallkomplexe.
Für die Kopplung der Biomoleküle mit der Sensoroberfläche stehen aus dem Stand der Technik eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Verfügung. Beispiele hierfür sind: (i) Thiol- (HS-) oder Disulfid- (S-S-) Gruppen, die an Oberfläche aus Au, Ag, Cd, Hg und Cu koppeln, (ii) Amine, die sich durch Chemi- oder Physisorption an Platin-, Silizium- oder Kohlenstoff-Oberflächen anlagern, (iii) Silane, die mit oxidischen Oberflächen eine kovalente Bindung eingehen und (iv) Epoxy-Zement, der an alle leitfähigen Oberflächen bindet (Heller et al., Sensors and Actuators, 1993, 180, 13- 14; Pishko et al., Anal. Chem., 1991, 63, 2268; Gregg and Heller, J. Phys. Chem., 1991 , 95, 5970-5975).
Zur Immobilisierung der Sonden werden Methoden bevorzugt, bei der die Anzahl der Sonden auf der Sensoroberfläche linear mit der Fläche skaliert, also z.B. das Aufbringen von Sonden-Monolagen unter Bedingungen, die eine Belegung kleiner der dichtesten Packung ermöglichen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind aber auch „Volumenverfahren" zur Immobilisierung der Sonden z.B. über funktionalisierte Polymere denkbar, solange die Sondenanzahl weiter mit der Fläche skaliert. Bevorzugt werden die freien Substratstellen mit modifizierten Nukleinsäure- Oligomeren in wässriger Lösung benetzt. Das Nukleinsäure-Oligomer, das auf die freie Oberfläche aufgebracht werden soll, ist über einen kovalent angebundenen Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge mit einer oder mehreren reaktiven Gruppen modifiziert, wobei sich diese reaktiven Gruppen bevorzugt in der Nähe eines Endes des Nukleinsäure-Oligomers befinden. Bei den reaktiven Gruppen handelt es sich bevorzugt um Gruppen, die direkt mit der unmodifizierten Oberfläche reagieren können. Beispiele hierfür sind: (i) Thiol- (HS-) oder Disulfid- (S-S-) derivatisierte Nukleinsäure-Oligomere der allgemeinen Formel (n x HS- Spacer)-oligo, (n x R-S-S-Spacer)-oligo oder oligo-Spacer-S-S-Spacer-oligo, die mit einer Goldoberfläche unter Ausbildung von Gold-Schwefelbindungen reagieren, (ii) Nukleinsäure-Oligomere mit Aminen, die sich durch Chemi- oder Physisorption an Platin- oder Silizium-Oberflächen anlagern und (iii) Nukleinsäure-Oligomere mit Silanen, die mit oxidischen Oberflächen eine kovalente Bindung eingehen. Bei diesen Arten der Anbindung von Nukleinsäure-OIigomeren werden in der Regel Belegungen kleiner der dichtesten Packung realisiert, so dass für eine spätere Hybridisierung ausreichend Platz auf der Oberfläche zur Verfügung steht.
Am anderen Ende des Nukleinsäure-Oligomers kann das Molekül bei Bedarf über einen weiteren Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge zusätzlich mit einem elektrochemischen Label modifiziert werden, wenn die Funktionalisierung der freien Substratstellen und die spätere Hybridisierung mit Hilfe elektrochemischer
Methoden untersucht werden sollen. Auch ohne die Modifikation der Sonden-
Oligonukleotide mit einem Redox-Label können elektrochemische Methoden zur Untersuchung der Hybridisierungsereignisse verwendet werden, wenn alternativ die
Targetmoleküle mit einem Redox-Label versehen sind. Eine weitere elektrochemische Detektionsvariante stellt ein Verdrängungsassay dar, bei dem an die ungelabelten Sonden-Oligomere gebundene, kurzkettige Signal-Oligomere mit
Redox-Label von ungelabelten Target-Oligomeren der Komplementärsequenz verdrängt werden.
Als Redox-Label der Ligaten oder Liganden können Übergangsmetallkomplexe, insbesondere solche des Kupfers, Eisens, Rutheniums, Osmiums oder Titans mit Liganden wie Pyridin, 4,7-Dimethylphenanthrolin, 9,10-Phenanthrenchinondiimin, Porphyrine und substituierte Porphyrin-Derivate verwendet werden. Daneben ist der Einsatz von Riboflavin, von Chinonen wie Pyrrollochinolinochinon, Ubichinon, Anthrachinon, Naphtochinon oder Menachinon bzw. Derivaten davon, von Metallocenen und Metallocenderivaten wie Ferrocenen und Ferrocenderivaten, Cobaltocenen und Cobaltocenderivaten, von Porphyrinen, Methylenblau, Daunomycin, Dopamin-Derivaten, Hydrochinon-Derivaten (para- oder ortho- dihydroxy-Benzol-Derivaten, para- oder ortho-dihydroxy-Anthrachinon-Derivaten, para- oder ortho-dihydroxy-Naphtochinon-Derivaten) und ähnlichen Verbindungen möglich.
Alternativ zum Redox-Label können Ligaten oder Liganden als zweite Funktionalisierung über einen weiteren Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge ein Fluorophor erhalten, wenn die Funktionalisierung der freien Substratstellen und die spätere Hybridisierung mit Hilfe von optischen Methoden untersucht werden sollen. Analog zur elektrochemischen Analyse kann die Fluoreszenz-Spektroskopie auch mit einem Fluorophor an den Target-Molekülen und ungelabelten Sonden durchgeführt werden.
Als Fluorophore können hierfür kommerziell erhältliche Fluoreszenzfarbstoffe wie z.B. Texas Red®, Rhodamin-Farbstoffe, Cy3™, Cy5™, Fluorescein etc. (vgl. Fluka, Amersham und Molecular Probes Katalog) verwendet werden.
Für die Funktionalisierung der freigelegten Substratstellen eignen sich vor allem zwei Techniken. Beim Spotting-Verfahren werden mit einem kommerziell erhältlichen Spotter kleine Volumina gezielt auf die Spots des Substrats aufgebracht, wobei jeder Spot mit verschiedenen Molekülen funktionalisiert werden kann. Alternativ können alle freigelegten Spots mit den gleichen Sonden-Molekülen funktionalisiert werden, indem das Substrat z.B. in die Sonden-Flüssigkeit getaucht wird oder aber das gesamte Substrat benetzt wird. Variation der Oberflächenkonzentration der Ligaten
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Anzahl der Sonden auf der Sensoroberfläche auch ohne die Variation der aktiven Spotgröße eingestellt werden. Somit können verschiedene Mengen an Sonden-Molekülen auch mit nur einem Sensor-Design auf Spots gleicher Größe realisiert werden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellen also Substrate dar, deren charakteristischer Belegungsparameter die Belegungsdichte der Teststellen mit Ligaten ist.
Besonders bevorzugt unterscheiden sich die Belegungsdichten der Teststellen mit Ligaten um mindestens den Faktor 10, insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 100 und ganz besonders bevorzugt um mindestens den Faktor 1000.
Für die Kontrolle der Oberflächenbelegung eignen sich verschiedene Varianten. Die Belegung kann z.B. über die Inkubationszeit, die Anzahl an Kopplungsgruppen pro Molekül, die Molarität des Belegungspuffers oder über die Konzentration der Moleküle in der Inkubationslösung eingestellt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Oberflächenbelegung über ein Koadsorbat eingestellt. Hierzu wird entweder ein geeignetes Koadsorbat in einer bestimmten Konzentration zur Inkubationslösung der Sonden-Moleküle zugegeben und mit der Sensoroberfläche in Kontakt gebracht oder aber das Koadsorbat wird in einem zweiten Belegungsschritt nach der Funktionalisierung mit den Sonden aufgebracht. Das Koadsorbat weist bevorzugt dieselbe Kopplungsgruppe auf wie das Sonden-Molekül, belegt somit einen Teil der aktiven Oberfläche und sorgt für eine reduzierte Oberflächenbelegung der Sonde. Die Oberflächenbelegung lässt sich über die Konzentration des Koadsorbats in der jeweiligen Inkubationslösung einstellen.
Für die weiter oben beschriebenen Nukleinsäure-Oligomere mit Thiol- Kopplungsgruppe eignen sich besonders bevorzugt kurzkettige Thiole der aligemeinen Struktur SH-(CH2)n-X, wobei X eine beliebige Kopfgruppe sein kann. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung soll nachfolgend anhand der Ausführungsbeispiele im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigen
Fig. 1 Theoretische Kurven des relativen Anteils an Bindungsereignissen ([TS]/S0) für verschiedene Target-Konzentrationen. Die Konzentration der Sonden an der Sensoroberfläche ist auf die Assoziationskonstante der Bindung normiert.
Fig. 2 Schematisches Bild eines Ausschnitts der auf Leiterplatten-Technologie basierenden Sensor-Substrate, a) Aufsicht auf das Leiterbahnen-Substrat mit freien Substratstellen verschiedener aktiver Fläche und Geometrie, b) Querschnitt durch ein Substrat mit 3 gleichen Elektrodenspots.
Fig. 3 a) Schematisches Bild eines Hybridisierungs-Experiments mit 2 Redox- Labeln. b) ACV-Kurven (Uao = 10 mV, f = 5 Hz) eines typischen Experiments auf einer Arbeitselektrode mit d = 10 μm vor und nach der Hybridisierung. Der linke Peak bei etwa U = 220 mV zeigt das Osmium der Sonde, der rechte Peak bei etwa U = 360 mV zeigt das Ferrocen des Targets. Die Potentiale sind gegen eine Ag/AgCI Referenz-Elektrode angegeben.
Wege zur Ausführung der Erfindung
Eine exemplarische Prozessführung zur Analyse einer Testflüssigkeit mit Nukleinsäure-Oligomeren mit Hilfe eines auf der Leiterplatten-Technologie basierenden Sensors ist in den folgenden Beispielen geschildert.
Die durch Laser-Ablation freigelegten Goldstellen des Substrats werden mit doppelt modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert, die an dem einen Ende eine Thioi-Gruppe zur Bindung an die Goldoberfläche und an dem anderen Ende ein elektrochemisches Label (z.B. Osmium-Komplexe) besitzen. Die gewünschte Anzahl an Sonden auf der Sensoroberfläche wird entweder über die Elektrodengröße oder durch Verwendung eines kurzkettigen Thiols bestimmter Konzentration als Koadsorbat eingestellt. Die Nukleinsäure-Oligomere der Testflüssigkeit besitzen ebenfalls ein elektrochemisches Label (z.B. Ferrocenderivate), so dass sowohl die Belegung mit den Nukleinsäure-Oligomeren als auch die Hybridisierungs-Effizienz mit elektrochemischen Methoden bestimmt werden können.
Eine bevorzugte Messmethode zur Analyse der Belegung und der Hybridisierungs- Effizienz ist die AC (alternating current) Voltammetrie. Aus dem ACV-Strom am Redox-Potential des Labels lässt sich nach O'Connor et al. (J. Electroanal. Chem., 466, 1999, 197-202) die Anzahl der beteiligten Label berechnen. Die Experimente sind somit quantitativ auswertbar.
Die in den folgenden Beispielen geschilderten Verfahren sind für den Fachmann ohne weiteres auf die Beschichtung anderer Sensoroberflächen mit anderen Biomolekülen und auf andere Detektionsmethoden übertragbar.
Beispiel 1: Leiterplatten-Substrate.
Auf einer Trägerplatte aus Epoxid-Glashartgewebe FR4 wird ein Leiterbild aus fünfzig parallelen Leiterbahnen aufgebracht. Figur 2a zeigt einen Ausschnitt dieses Leiterbahnenbildes. Der Ausschnitt zeigt 4 der 48 Arbeitselektroden (20A bis 20D) und einen Teil der Gegenelektrode 28.
Das gesamte Leiterbild ist mit einer 15 μm bis 20 μm dicken Passivierungsschicht 22 (Fig. 2b) aus strukturierbaren, optisch aushärtbaren Lack (2-Komponenten Lötstopplack, Elpemer GL 2467 SM-DG, Fa. Peters) überzogen. In die Passivierungsschicht werden durch hochenergetische Pulse eines Excimer-Lasers Ausnehmungen 24, 24A bis 24D in den Lack eingebracht, die zur Aufnahme der Biomoleküle 26 dienen. Bei einer Passivierungsschicht mit 15 μm bis 20 μm Dicke benötigt man zum Entfernen des Lacks und zum kurzfristigen Aufschmelzen der Oberfläche etwa 130 Pulse a 20 ns eines Excimer-Lasers (Lambda Physics) mit einer Flächenleistung von 600 - 1200 mJ/cm2. Das Aufschmelzen der Oberfläche führt zum Verschluss von Oberflächenporen der Goldschicht, zu einer Reduktion der Oberflächenrauigkeit und durch Ablation weniger Goldlagen zum Entfernen von Oberflächenverunreinigungen. Die Laser-Bestrahlung des Substrats kann direkt oder über eine Optik bzw. Maske erfolgen und ermöglicht Ausnehmungen beliebiger Größe und Geometrie.
Figur 2b zeigt einen Schnitt durch ein Leiterbahnsubstrat mit 3 gleichen Spots. Jede der Leiterbahnen 20 besteht aus einem Kupferkern 14, der durchgehend von einer Nickel-Sperrschicht 16 und einer Goldschicht 18 überzogen ist. Im Ausführungsbeispiel hat der Kupferkern eine Dicke von etwa 28 μm. Er stellt einen preiswerten und gut leitfähigen Grundbestandteil der Leiterbahnen dar. Um sehr genaue Messungen bei der elektrochemischen Detektion im wässrigen Medium zu ermöglichen, ist der unedle Kupferkern mit einer 6 μm dicken, durchgehenden Nickelschicht als Diffusionssperre überzogen. Auf dieser Nickel-Schicht wird eine 2 μm dicke Goldschicht aufgebracht.
Die Leiterbahnen des Ausführungsbeispiels sind etwa 150 μm breit und mit einem Abstand von etwa 200 μm (Mitte-Mitte) auf der Trägerplatte angeordnet. Die Arbeitselektroden, die Gegenelektrode und eine gegebenenfalls vorgesehene Referenzelektrode sind zur Kontaktierung jeweils mit nicht dargestellten Anschlusskontaktflächen des elektrischen Substrats verbunden.
In den Ausführungsbeispielen haben die Leiterbahnen kreisrunde Ausnehmungen mit Durchmessern von 10 μm, 30 μm, 100 μm und rechteckige Ausnehmungen der Dimension 100 μm x 700 μm (vgl. 24A bis 24D in Figur 2a). Diese Ausnehmungen weisen also Flächen von 78,5 μm2, 706,5 μm2, 7850 μm2 bzw. 70000 μm2 auf, so dass die aktive Fläche der Elektroden um etwa einen Faktor 1000 variiert wird. Beispiel 2: Funktionalisierung der Spots des Substrats mit Nukleinsäure- Oligomeren.
Die im Beispiel 1 beschriebenen freien Substratstellen verschiedener Größe werden z.B. über ein Spotting-Verfahren mit den Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert.
Die Synthese der Oligonukleotide erfolgt in einem automatischen Oligonukleotid- Synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA/RNA-Synthesizer) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Syntheseprotokolle für eine 1.0 μmol Synthese. Bei den Synthesen mit dem 1-O-Dimethoxytrityl-propyl-disulfid-CPG-Träger (Glen Research 20-2933) werden die Oxidationsschritte mit einer 0.02 mol/l lodlösung durchgeführt, um eine oxidative Spaltung der Disulfidbrücke zu vermeiden. Modifikationen an der 5'-Position der Oligonukleotide erfolgen mit einem auf 5 min verlängerten Kopplungsschritt. Der Amino-Modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) wird in die Sequenzen nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut. Die Kopplungseffizienzen werden während der Synthese online über die DMT-Kationen- Konzentration photometrisch bzw. konduktometrisch bestimmt.
Die Oligonukleotide werden mit konzentriertem Ammoniak (30%) bei 37°C 16 h entschützt. Die Reinigung der Oligonukleotide erfolgt mittels RP-HPL Chromatographie nach Standardprotokollen (Laufmittel: 0.1 mol/l Triethylammoniumacetat-Puffer, Acetonitril), die Charakterisierung mittels MALDI- TOF MS. Die aminmodifizierten Oligonukleotide werden an die aktivierten Redox- Label (z.B. Osmium-Komplexe) entsprechend den dem Fachmann bekannten Bedingungen gekoppelt. Die Kopplung kann sowohl vor als auch nach der Anbindung der Oligonukleotide an die Oberfläche erfolgen.
Die Substrate aus dem Beispiel 1 werden z.B. mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation eins: die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P- O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert. Modifikation zwei: an das amino-modifizierte 5' Ende ist der Osmium-Komplex [Os(bipy)2 Cl imidazolacrylsäure] nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) als 5x10"5 molare Lösung in Puffer (Phosphatpuffer, 0.5 molar in Wasser, pH 7 mit 0.05 vol% SDS) mit Hilfe eines Spotters (Carthesian) aufgebracht und für 2 - 24 h inkubiert.
Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 :1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy- mercaptoethanols kommt. Statt des Einzelstrang-Oligonukleotids kann der Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.
Für die Belegung mit dem Spotter der Firma Cartesian Technologies (MicroSys PA) werden Split-Pin Nadeln (Arraylt Chipmarker Pins der Firma TeleChem) verwendet, die ein Ladevolumen von 0.2 bis 0.6 μl haben und Volumina von etwa 1 nl pro Benetzungsvorgang abgeben. Die Kontaktfläche dieser Nadeln hat einen Durchmesser von etwa 130 μm und ist damit deutlich größer als die bei der Laser- Ablation freigelegten Bereiche des Substrates. Die Positionierung der Nadel über dem Substrat erfolgt mit einer Genauigkeit von 10 μm bei einer Luftfeuchtigkeit von etwa 70 - 80%. Der Tropfen wird beim Kontakt der Spitze mit der Passivierungsschicht abgegeben und es kommt zu keiner direkten Berührung mit dem Substrat („Pseudo-Kontakt-Drucken").
Beispiel 3: Variation der Oberflächenbelegung durch Koadsorbate.
Die Belegungsdichte eines Spots mit Nukleinsäure-Oligomeren lässt sich durch die Koadsorption mit Thiolen kontrolliert reduzieren, um somit den relativen Anteil von Bindungsereignissen bei gleich bleibender Target-Konzentration und Elektrodengröße zu erhöhen.
Für die Koadsorption von Thiolen stehen zwei Verfahren zur Wahl. In einem Verfahren besteht die Inkubationslösung aus den Nukleinsäure-Oligomeren (analog Beispiel 2) mit zusätzlich zwischen ca. 10"5 bis 10'1 molarem Propanthiol. Dieses gleichzeitig anwesende, freie Propanthiol wird durch Ausbildung einer Au-S Bindung koadsorbiert und beansprucht somit Platz auf der Sensoroberfläche. Bei einem alternativen Verfahren wird das Propanthiol (10"5 bis 10"1 molar in 500 mmol/l Phosphat-Puffer) in einem zweiten Inkubationsschritt (30 min bis 12 h) nach der Funktionalisierung der Sensoroberfläche mit Nukleinsäure-Oligomeren aufgebracht.
Durch die Verwendung von Propanthiol als Koadsorbat kann die Oberflächenbelegungsdichte der Nukleinsäure-Oligomere in beiden Varianten um bis zu einem Faktor 10 reduziert werden.
Beispiel 4: Variation der Oberflächenbelegung durch Belegungsparameter.
Auch durch die Variation ausgewählter Belegungsparameter bei der Funktionalisierung mit Nukleinsäure-Oligomeren lässt sich die Oberflächenbelegungsdichte der Spots des Sensors einstellen.
Erhöht man z.B. die Konzentration der Nukleinsäure-Oligomere in der Inkubationslösung (500 mmol/l Puffer) von 1 μmol/l auf 30 μmol/l, so steigt' die Belegungsdichte um einen Faktor 5. Eine ähnliche Erhöhung der Oberflächenbelegung erhält man, wenn die Konzentration des Inkubationspuffers von 10 mmol/l auf 500 mmol/l bei einer Sonden-Konzentration von 30 μmol/l erhöht wird.
Beispiel 5: Hybridisierung mit komplementären Nukleinsäure-Oligomeren.
Ein Substrat mit 48 Arbeitselektroden wird wie in Beispiel 1 beschrieben mit aktiven Bereichen verschiedener Größen hergestellt. In Gruppen von je 12 Elektroden werden mit dem Excimer-Laser kreisrunde Löcher mit einem Durchmesser von 10 μm (Spotgruppe 1), 30 μm (Spotgruppe 2) bzw. 100 μm (Spotgruppe 3) und ein rechteckiges Profil mit 100 μm x 700 μm (Spotgruppe 4) gebrannt. Die einzelnen Spotgruppen weisen also Flächen von 78,5 μm2, 706,5 μm2, 7850 μm2 bzw. 70000 μm2 auf, so dass die Fläche um einen Faktor von rund 1000 variiert wird. Die Arbeitselektroden einer Spotgruppe werden jeweils mit doppelt modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren (Sonden) einer bestimmten Sequenz (S1 bis S4) analog dem Beispiel 2 funktionalisiert. Die Arbeitselektroden weisen annähernd die gleichen Oberflächenbelegungsdichten auf. Figur 3 zeigt exemplarisch eine ACV- Messung (Uac = 10 mV, f = 5 Hz) einer Arbeitselektrode (Symbole □ in Figur 3), die mit Osmium-modifizierten Oligomeren funktionalisiert ist. Aus dem Redox-Strom am Potential des Osmium-Komplexes lässt sich die Oberflächenbelegungsdichte mit Nukleinsäure-Oligomeren berechnen. Im vorliegenden Fall ergibt sich ein Wert von 5 x 10"1 mol/cm2.
Nach der Funktionalisierung werden die Arbeitselektroden noch vor der Hybridisierung mit komplementären, Ferrocen-modifizierten Nukleinsäure- Oligomeren in einem Nachbelegungsschritt für 30 Minuten mit einer 1 mmol/l Lösung Propanthiol in Kontakt gebracht. Hierbei werden die Räume zwischen den Nukleinsäure-Oligomeren hydrophobisiert. Dadurch verschiebt sich das Redoxpotential des Ferrocens zu positiveren Werten, wodurch eine bessere Separation vom Osmium-Potential erreicht wird.
Die vier unterschiedlichen Target-Nukleinsäure-Oligomere werden analog Beispiel 2 aber ohne Thiol-Modifikation am 3' Ende synthetisiert. Die Target-Nukleinsäure- Oligomere weisen eine zu jeweils einem Sonden-Nukleinsäure-Oligomer komplementäre Sequenz (T1 bis T4) auf. Für die Modifikation mit dem Redox-Label Ferrocen werden die amino-modifizierten Nukleinsäure-Oligomere am 5' Ende mit Ferrocenessigsäure (FcAc) gemäß dem jeweiligen Standardprotokoll gekoppelt.
Die 4 verschiedenen Ferrocen-modifizierten Nukleinsäure-Oligomere werden der Target-Lösung in unterschiedlichen Konzentrationen (T1 = 0.1 μmol/I, T2 = 1 μmol/l, T3 = 10 μmol/l, T4 = 100 μmol/l in 500 mmol/l Phosphat-Puffer, pH 7, mit 1 mol/l NaCI und 0.05 vol% SDS) zugegeben und auf alle Spots des Sensors aufgebracht. Nach einer gewissen Inkubationszeit unter hybridisierenden Bedingungen wird das Substrat gespült und erneut eine elektrochemische ACV-Messung (Uac = 10 mV, f = 5 Hz) durchgeführt (Symbole ■ in Figur 3). Die Messdaten zeigen einen zweiten Redox-Peak, wobei das Verhältnis der Peak-Ströme des Osmium-Labels und des Ferrocen-Labels der Hybridisierungs-Effizienz des Experiments entspricht. Die Messdaten der Hybridisierung aus Figur 3 zeigen eine Elektrode nahe der Sättigung mit einer Hybridisierungseffizienz von über 90 %. Die Arbeitselektroden mit den auf die Konzentrationen der jeweiligen Targets angepassten Größen zeigen hingegen alle die gleichen Hybridisierungs-Effizienzen von etwa 30 - 40 %.
Beispiel 6: Diagnostik-Chip.
In der medizinischen Diagnostik ist es wünschenswert, mehrere diagnostisch relevante Parameter gleichzeitig bei einer Untersuchung zu erfassen. Ein wichtiges Beispiel aus dem Bereich der Routineuntersuchungen ist ein Vaginalabstrich, der unter anderem auf HPV, E-Coli und Laktobazillen untersucht wird. Bei einem solchen Abstrich wird mit Hilfe von standardisierten Tupfern eine Probe entnommen, die dann mit genormten Verfahren behandelt wird, um die RNA der vorhandenen Bakterien und die doppelsträngige DNA der Viren zu erhalten. Bei einer Untersuchung werden Keim- bzw. Partikelzahlen bis zu einer gewissen Grenze als unbedenklich eingestuft: Bei HPV sind dies 100 Partikel, bei E-coli 100 Keime und bei Laktobazillen 10000 Keime aller relevanten Laktobazillen. Da in Bakterienzellen die charakteristischen RNAs jeweils etwa 104-fach vorkommen, muss ein parallelisierter Chip-Test sehr unterschiedliche Konzentrationen erfassen können, um alle Parameter gleichzeitig bei einer Untersuchung zu erhalten. Ein erfindungsgemäßer Sensor-Chip für obige Anwendung hat drei verschiedene Spotgrößen, die mit für die jeweiligen Krankheits-Targets spezifischen Sonden- Polynukleotiden funktionalisiert sind. Zum Nachweis der HPV-DNA im Bereich von 102 bis 104 Molekülen in der Testsubstanz werden Spots mit einer Fläche von 1 μm2 verwendet, während für die E-Coli-RNA im Bereich von 106 bis 108 Molekülen (entsprechend 102 bis 104 Keimen) Flächen von 104 μm2 und für die Laktobazillen- RNA im Bereich von 108 bis 1010 Molekülen (entsprechend 104 bis 106 Keimen) Flächen von 106 μm2 benutzt werden. Durch die Wahl der Elektrodengrößen wird gewährleistet, dass der Sensor für den jeweiligen Bereich ab den kritischen Target- Konzentrationen der verschiedenen Erreger quantitative Messungen zulässt und somit eine parallele Diagnose aller Krankheiten getroffen werden kann.

Claims

Patentansprüche
1. Substrat zum Einsatz als Träger von Ligaten bei einem Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen, mit auf dem Substrat angeordneten
Teststellen (24) und mit an die Oberfläche der Teststellen (24) gebundenen Ligaten (26), wobei wenigstens zwei Arten von Teststellen (24) vorgesehen sind, wobei die verschiedenen Arten von Teststellen jeweils mit verschiedenen Arten von Ligaten (26) belegt sind, wobei durch die verschiedenen Arten von Ligaten (26) jeweils komplementäre Arten von Liganden detektiert werden, wobei die Liganden in einer Analytlösung in jeweils unterschiedlichen Konzentrationsbereichen vorliegen, und wobei die Teststellen (24) einen charakteristischen Belegungsparameter aufweisen, der eine Detektion der Liganden in deren jeweiligen Konzentrationsbereich erlaubt.
2. Substrat nach Anspruch 1 , wobei der charakteristische Belegungsparameter die Fläche der Teststellen ist.
3. Substrat nach Anspruch 2, wobei sich die Fläche der Teststellen (24) um mindestens den Faktor 10 unterscheidet.
4. Substrat nach Anspruch 2, wobei sich die Fläche der Teststellen (24) um mindestens den Faktor 100 unterscheidet.
5. Substrat nach Anspruch 2, wobei sich die Fläche der Teststellen (24) um mindestens den Faktor 1000 unterscheidet.
6. Substrat nach Anspruch 2, wobei sich die Fläche der Teststellen (24) um mindestens den Faktor 10000 unterscheidet.
7. Substrat nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei die Fläche der Teststellen (24) zwischen 1 μm2 und 10 mm2 beträgt.
8. Substrat nach Anspruch 7, wobei die Fläche der Teststellen (24) zwischen 10 μm2 und 100000 μm2 beträgt.
9. Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der charakteristische Belegungsparameter die Belegungsdichte der Teststellen mit
Ligaten ist.
10. Substrat nach Anspruch 9, wobei sich die Belegungsdichte der Teststellen (24) mit Ligaten um mindestens den Faktor 10 unterscheidet.
11. Substrat nach Anspruch 9, wobei sich die Belegungsdichte der Teststellen (24) mit Ligaten um mindestens den Faktor 100 unterscheidet.
12. Substrat nach Anspruch 9, wobei sich die Belegungsdichte der Teststellen (24) mit Ligaten um mindestens den Faktor 500 unterscheidet.
13. Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich die jeweiligen Mittelwerte der Konzentrationsbereiche, in denen die verschiedenen Arten von Liganden vorliegen, um wenigstens einen Faktor 10 unterscheiden.
14. Substrat nach Anspruch 13, wobei sich die jeweiligen Mittelwerte der Konzentrationsbereiche, in denen die verschiedenen Arten von Liganden vorliegen, um wenigstens einen Faktor 100 unterscheiden.
15. Substrat nach Anspruch 13, wobei sich die jeweiligen Mittelwerte der Konzentrationsbereiche, in denen die verschiedenen Arten von Liganden vorliegen, um wenigstens einen Faktor 1000 unterscheiden.
16. Substrat nach Anspruch 13, wobei sich die jeweiligen Mittelwerte der Konzentrationsbereiche, in denen die verschiedenen Arten von Liganden vorliegen, um wenigstens einen Faktor 10000 unterscheiden.
17. Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Liganden Cofaktoren oder Coenzyme und als Ligaten Proteine oder Enzyme verwendet werden.
18. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei als Liganden Antikörper und als Ligaten Antigene verwendet werden.
19. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei als Liganden Antigene und als Ligaten Antikörper verwendet werden.
20. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei als Liganden Rezeptoren und als Ligaten Hormone verwendet werden.
21. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei als Liganden Hormone und als Ligaten Rezeptoren verwendet werden.
22. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei als Liganden Nukleinsäure- Oligomere und als Ligaten dazu komplementäre Nukleinsäure-Oligomere verwendet werden.
23. Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Substrat mit einer Passivierungsschicht belegt ist, die an den Teststellen (24) Aussparungen aufweist.
24. Verwendung eines Substrats nach einem der vorhergehenden Ansprüche in einem Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen.
25. Verwendung nach Anspruch 24, wobei es sich um ein elektrochemisches Nachweisverfahren handelt ausgewählt aus der Gruppe Chronoamperometrie (CA), Chronocoulometrie (CC), Linear Sweep Voltammetrie (LSV), zyklische
Voltammetrie (CSV), Alternating current voltammetry (ACV), Voltammetrietechniken mit verschiedenen Pulsformen, insbesondere Square Wave Voltammetrie (SWV), Differential Pulse Voltammetrie (DPV) oder Normal Pulse Voltammetrie (NPV), AC oder DC Impedanzspektroskopie, Chronopotentiometrie und zyklische Chronopotentiometrie.
26. Verwendung nach Anspruch 24, wobei es sich um ein fluoreszenzspektroskopisches Nachweisverfahren handelt.
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