WO2006063604A1 - Substrat zur kontrollierten durchführung von spezifischen ligat/ligand-bindungsreaktionen und ein verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Substrat zur kontrollierten durchführung von spezifischen ligat/ligand-bindungsreaktionen und ein verfahren zu seiner herstellung Download PDF

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WO2006063604A1 PCT/EP2004/014243 EP2004014243W WO2006063604A1 WO 2006063604 A1 WO2006063604 A1 WO 2006063604A1 EP 2004014243 W EP2004014243 W EP 2004014243W WO 2006063604 A1 WO2006063604 A1 WO 2006063604A1
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substrate
protective layer
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PCT/EP2004/014243
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Gerhard Hartwich
Heiko Hillebrandt
Sabine Kiermaier
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Friz Biochem Gesellschaft Für Bioanalytik Mbh
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
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    • G01N27/3276—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a hybridisation with immobilised receptors

Definitions

  • the invention relates to a substrate for the controlled performance of specific ligand / ligand binding reactions.
  • the invention further relates to a manufacturing method for such a substrate, and a method for the controlled performance of specific ligate / ligand binding reactions with such a substrate.
  • the reaction of two components can be studied by mixing two liquid phases containing the components in one reaction vessel. Through this reaction, properties of the liquids in the reaction vessel change in a detectable manner.
  • the analysis in the volume phase on the one hand has the advantage that especially proteins retain their specific functions, on the other hand, the often required large volume lumina are disadvantageous. Thus, it is necessary to provide substrates that provide extremely small reaction vessels.
  • surfaces which have different coupling groups and can specifically bind specific analytes in order to study unknown liquids for the presence of these analytes.
  • the sensor surface must first be functionalized with the coupling groups, then brought into contact with the unknown liquid and then the binding of the analyte can be detected.
  • a variety of methods such as fluorescence spectroscopy, radiometry, electrochemistry and a variety of surface-sensitive methods such as AFM, SPR or quartz crystals are available in the prior art.
  • the unknown analyte fluids mostly consist of a large number of different substances in very small quantities, making a potential sensor for the analysis of these fluids with regard to the important factors for industrial applications how cost or time have a high degree of parallelization, how to manage with very small amounts of material and how to be very sensitive.
  • the parallelization of such an analysis can be achieved either by a lateral structuring of the sensor surface in areas of different functionalities or in the case of a volume approach by a large number of reaction vessels.
  • microcontact printing ⁇ CP microcontact-printing
  • ⁇ CP microcontact-printing
  • a microstructured stamp is wetted with a liquid, then brought into direct contact with the substrate to be processed and thus the surface of a lateral chemical structure impressed.
  • a major difficulty of this technique is the realization of a uniform contact between the punch and the substrate, which is crucial for the success or quality.
  • sensors typically require analyte concentrations above a critical level to analyze liquid sample substances. Thus, it can be For example, sensors may need to increase the concentrations of a biological sample prior to analysis by additional preparation steps prior to analysis.
  • the invention has for its object to provide a substrate and a method for its production, which avoid the disadvantages of the prior art mentioned above.
  • the substrate should allow the analysis of analyte liquids lowest concentration and thus in particular allow an analysis of biological samples without additional preparation steps.
  • Analyte fluid A fluid that potentially contains an analyte to be detected by a sensor.
  • Liquid not only pure liquid substances but also liquids with tergens, any kind of dissolved organic or inorganic substances, as well as emulsions, suspensions and colloidal solutions.
  • ligate molecules to the test sites of a substrate. These molecules may be physisorbed on the substrate, chemisorbed or covalently bound by coordination or by complex formation.
  • HTS High throughput screening Laser ablation Partial or complete removal of organic or inorganic protective layers, but also the removal of impurities on a substrate by irradiation of laser light.
  • Protective layer applied to the substrate to be processed before the actual wetting layer can consist of organic as well as inorganic materials, be physisorbed, chemisorbed or covalently bound by coordination or complex formation, depending on the substrate type and application requirements, and applied by any desired techniques.
  • Spot or spatially limited areas on the sensor surface that each carry one or more types of probe molecules that can each specifically bind one or more molecules of a test substance.
  • these are areas at points of reduced lacquer layer thickness at which the protective layer has been removed completely and in any desired geometry and the substrate is thus accessible.
  • Substrate Solid with a freely accessible surface, which can thus be wetted with a liquid.
  • Suitable solid-state substrates include both plastics and metals, semiconductors, glasses, composites or porous materials.
  • the term surface is independent of the spatial dimensions of the surface.
  • PNA peptide nucleic acid synthetic DNA or RNA, in which the
  • N (COCH 2 -BaSe) -CH 2 CO unit hybridizes PNA with DNA).
  • Nucleic acid at least two covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine (eg cytosine, thymine or uracil) or purine bases (eg adenine or guanine).
  • the term nucleic acid refers to any "backbone" of the covalently linked pyrimidine or purine bases, such as e.g. On the sugar-phosphate backbone of the DNA, cDNA or RNA, on a peptide backbone of the PNA or on analogous structures (e.g.
  • Phosphoramide, thio-phosphate or dithio-phosphate backbone Phosphoramide, thio-phosphate or dithio-phosphate backbone.
  • An essential feature of a nucleic acid according to the present invention is that it can bind naturally occurring cDNA or RNA sequence-specific.
  • Nucleic acid nucleic acid of unspecified base length eg, Nuk oligomer, linoleic acid octamer: a nucleic acid of any backbone in which 8 pyrimidine or purine bases are covalently bound together.
  • Oligomer equivalent to nucleic acid oligomer Oligonucleotide equivalent to oligomer or nucleic acid oligomer, so z. As a DNA, PNA or RNA fragment unspecified base length.
  • Oligo Abbreviation for oligonucleotide ss Single Strand (single strand)
  • Fluorophore chemical compound capable of emitting a longer wavelength (red-shifted) fluorescent light upon excitation with light.
  • Fluorophores fluorescent dyes
  • UV ultraviolet
  • VIS visible
  • IR infrared
  • ligands for the purposes of the present specification are substrates, cofactors or coenzymes of a protein; (Enzyme), antibodies (as a ligand of an antigen), antigens (as a ligand of an antibody), receptors (as a ligand of a hormone), hormones (as a ligand of a receptor) or nucleic acid oligomers (as a ligand of the complementary nucleic acid oligomer.
  • Ligat Name for (macro-) molecule where specific recognition and binding sites for the formation of a complex with a ligand are located (template).
  • Redox label or chemical compound the other by recording or delivery of Elektelektrochemisches from another chemical compound these other
  • Spacer is any molecular connection between two molecules or between a surface atom, surface molecule or a surface molecule group and another molecule, usually alkyl, - alkenyl, alkynyl, heteroalkyl, heteroalkenyl, heteroalkynyl chains.
  • Preferred spacers are those of the chain length 1-20, in particular the chain length 1-14, wherein the chain length represents the shortest continuous connection between the structures to be joined.
  • Target molecules in the test substance that can specifically bind to one or more biomolecules on the sensor surface (probes).
  • Oligo-Spacer-SS- two identical or different nucleic acid oligomers which are connected to one another via a disulfide bridge, wherein the disulfide bridge is attached to the nucleic acid oligomers via any two spacers and the two spacers have a different chain length (Shortest continuous connection between disulfide bridge and the respective nucleic acid oligomer) may have, in each case any chain length between 1 and 14 and these spacers may in turn be bound to various naturally present on the nucleic acid oligomer or attached to this by modification reactive groups.
  • These spacers may in turn be attached to various natural groups present on the nucleic acid oligomer or attached thereto by modification reactive groups and "n” is any integer, in particular a number between 1 and 20.
  • the spacer for binding the disulfide function to the nucleic acid oligomer can each have a different chain length (shortest continuous connection between disulfide function and nucleic acid oligomer), in particular any desired chain length between 1 and 14. These spacers can in turn be attached to various naturally occurring nucleic acids Oligomer present or attached thereto by modification reactive groups.
  • the placeholder "n” is any integer, in particular a number between 1 and 20.
  • a substrate for the controlled performance of specific ligate / ligand binding reactions comprises a support with at least one recess for receiving an analyte liquid containing potentially to be detected ligand molecules, and a plurality of arranged in the sink test sites for receiving ligate molecules.
  • the test sites are surrounded by microwells which allow a fluid connection between the test sites above a predetermined liquid level of the analyte liquid and interrupt the flow connection between the test sites when the predetermined liquid level is undershot.
  • a solid with a freely accessible surface is referred to, which can thus be wetted with a liquid.
  • suitable solid-state substrates include both plastics and metals, semiconductors, glasses, composites or porous materials.
  • liquids are understood to mean not only pure liquid substances, but also liquids with detergent, any type of dissolved organic or inorganic substances, as well as emulsions, suspensions and colloidal solutions.
  • the substrate according to the invention enables a controlled increase in the analyte concentration of the test liquids in order to increase the proportion of specific binding events.
  • the binding reaction between a ligand and a ligate always obeys a binding kinetics that is described by an association constant (eg Langmuir isotherm).
  • the thermodynamic equilibrium of the reaction can be adjusted via the concentrations of the reactants involved. If, accordingly, the target concentration in the analyte liquid is increased by reducing the volume while the amount of analyte remains constant, the proportion of specific binding events on the sensor surface is also increased.
  • the controlled drying of the analyte liquid on the substrate according to the invention has the advantage that any samples, regardless of the concentrations of the analytes contained immediately, can be examined without additional external preparation ons suitse.
  • the sometimes very expensive concentration of e.g. biological samples to a required concentration value is no longer necessary with the present invention. Without concentrating, the samples are in relatively large volumes, so that expensive spotter devices or pipetting robots can be dispensed with here.
  • the invention is based on a controlled increase in the concentrations in the analyte liquid to a well-defined final state.
  • the controlled drying of the invention is realized in that the test sites are surrounded within the filled with analyte liquid depressions of micro sources, at the edges of the liquid film breaks at the end of the drying process and thus the flow connection between the individual test sites is interrupted. By the time the liquid film breaks, each of the test sites is still wetted with a defined final volume, which is given by the volume of the area enclosed by the microwells and which contains only a small fraction of the total target amount.
  • the carrier has a carrier plate, on the surface of the test sites are arranged.
  • the support plate is advantageously provided with a flat protective layer which separates the surface from the environment.
  • the flat protective layer expediently has a thickness of between 10 ⁇ m and 500 ⁇ m, preferably between 100 ⁇ m and 400 ⁇ m.
  • the depression of the carrier can be formed in particular by a region of reduced thickness of the protective layer.
  • the thickness of the protective layer in the depression is advantageously reduced by 50% to 99.5%, preferably by 90% to 99%.
  • the protective layer in the depression may have a thickness of 5 ⁇ m to 50 ⁇ m, preferably of about 10 ⁇ m.
  • the test sites are defined by extending to the surface of the support plate vertical recesses in the protective layer. They may, for example, have a characteristic extent of from about 5 ⁇ m to about 200 ⁇ m, preferably from about 10 ⁇ m to about 100 ⁇ m.
  • the vertical recesses advantageously have a substantially rectangular, elliptical or circular cross section. According to the invention, it is preferred if the protective layer between the test sites has recessed regions whose edges adjacent to the test sites form the microwells.
  • the protective layer applied to the carrier plate preferably consists of a material which sorbs, chemisorbs or covalently binds to the surface of the carrier plate to be wetted, or binds by complex formation.
  • the protective layer can be formed by a positive or negative photoresist, a solder resist, an organic polymer, in particular cellulose, dextran or collagen.
  • test sites arranged in the depression are preferably arranged in the form of an n ⁇ m matrix with n rows and m columns, where n and m are greater than or equal to 1.
  • the carrier plate may be formed by a one-sided rigid carrier plate, a double-sided rigid carrier plate, a rigid multi-layer carrier plate, a one-sided or double-sided flexible carrier plate, in particular a polyimide foil, or by a rigidly flexible carrier plate.
  • the carrier plate has a main body of plastic, metal, semiconductor, glass, composite, a porous material or a combination of these materials.
  • the carrier plate may have a base body of a base material which is selected from the group bismaleimide-triazine resin with quartz glass (BT), cyanate ester with quartz glass (CE), hard paper core with FR4 outer layers (CEM1), glass fleece core with FR4
  • CEM3 phenolic resin paper
  • FR3 kraft paper
  • epoxy glass frit FR4
  • FR5 epoxy glass frit
  • PD aramid reinforced polyimide resin
  • PTFE ceramic polytetrafluoroethylene
  • CHn highly cross-linked hydrocarbons with ceramic (CHn) and glass.
  • the main body of the carrier plate is expediently provided with a conductive layer, in particular of silicon, platinum or gold, which forms the surface of the carrier plate.
  • the base body of the carrier plate is provided with a homogeneous conductive layer which has substantially the same thickness at each point of the carrier plate.
  • the thickness of the homogeneous conductive layer is preferably about 20 nm to about 5 ⁇ m, and more preferably between about 100 nm and about 500 nm.
  • the main body of the carrier plate is provided with a conductor pattern with spaced interconnects and terminal contact surfaces.
  • the test sites are arranged on the tracks.
  • the interconnects advantageously have a metal core made of a highly conductive base metal and a gold layer surrounding the metal core.
  • the conductor tracks are preferably provided throughout with a diffusion barrier layer, which prevents direct contact of the analyte liquid with the metal core.
  • the metal core may in particular comprise copper, tungsten and / or aluminum.
  • the diffusion barrier layer advantageously comprises an intermediate layer of nickel, titanium and / or platinum arranged between the metal core and the outer gold layer, which preferably has a thickness of from about 2 ⁇ m to about 10 ⁇ m, more preferably from about 3 ⁇ m to about 8 ⁇ m, and completely more preferably from about 4 microns to about 6 microns.
  • the base metal core typically copper
  • the base metal core can greatly influence the measurement signal during electrochemical detection. For example, copper oxidation results in a signal peak at a potential of 250 mV relative to an Ag / AgCl reference electrode. In this potential range, many of the elec- Rochemical detection method performed.
  • a diffusion barrier layer in particular with an abovementioned intermediate layer, effectively prevents the diffusion of atoms
  • the base metal core in the surrounding electrolyte solution and thus allows highly sensitive electrochemical detection methods.
  • the said gold layer advantageously has a thickness of about 0.15 ⁇ m to about 10 ⁇ m, preferably from about 1 ⁇ m to about 5 ⁇ m, more preferably from about 2 ⁇ m to about 3 ⁇ m.
  • the conductor tracks are expediently designed with a width of 50 ⁇ m to 250 ⁇ m, in particular from 80 ⁇ m to 200 ⁇ m.
  • the distance between the tracks determines the available dead volume of the well areas.
  • Distances between the edges of the conductor tracks of about 10 ⁇ m to about 400 ⁇ m have proven to be suitable.
  • widths of the printed conductors for example about 150 ⁇ m, distances of about 200 ⁇ m to about 300 ⁇ m between the edges have yielded good results.
  • the test sites are functionalized with specific ligate molecules.
  • ligate molecules are physisorbed at the test sites on the surface of the support plate, chemisorbed or covalently, coordinatively or bound by complex formation.
  • the test sites are functionalized with nucleic acid oligomers modified with one or more reactive groups.
  • the test sites can be arranged in the region of a GoId layer and be functionalized with thiol (HS) or disulfide (SS) derivatized nucleic acid oligomers.
  • HS thiol
  • SS disulfide
  • the nucleic acid oligomers are advantageously modified with a fluorophore and / or a redox label.
  • a method for producing a substrate for the controlled performance of specific ligate / ligand binding reactions comprises the method steps: a) providing a carrier plate, b) applying a conductor pattern with spaced conductor tracks and terminal contact surfaces to the carrier plate, c) applying a flat protective layer on the printed circuit board provided with the conductive pattern, which results in recessed regions between the spaced interconnects, d) structuring the protective layer to produce at least one depression with reduced protective layer thickness, and e) creating vertical recesses in the depression which extend to the interconnects of the conductive pattern and define test sites on the support plate such that the edges of the recessed regions form microwells for the test sites.
  • Carrying out specific ligate / ligand-binding reactions comprises the method steps: a) providing a carrier plate with a homogeneous conductive surface, b) applying a flat protective layer to the carrier plate, c) structuring the protective layer to produce at least one depression reduced protective layer thickness, d) creating vertical recesses in the recess extending to a surface of the support plate defining test sites on the support plate; and e) creating recessed regions between the test sites so that the edges of the recessed regions are microbalances for the test sites form.
  • the recesses, the depressions and, in the case of the latter method, the recessed regions are preferably produced by laser ablation, in particular by irradiation of partial regions of the protective layer with continuous or pulsed laser radiation of a predetermined wavelength, preferably in the ultraviolet spectral range.
  • the laser radiation can be directed to the ablated protective layer directly or via an optical system or a mask.
  • the order in which the recesses and the recessed areas are generated is not essential to the invention.
  • a surface region of the carrier plate is preferably melted in the region of the test sites.
  • the melting of the surface results in a reduced surface roughness and improved homogeneity of the surface of the carrier plate.
  • the reflow also ablates a few gold layers from the surface, thus freeing the substrate of surface contamination.
  • the thus exposed sites of the substrate can then be functionalized with suitable molecules.
  • test sites can be functionalized in a step f) with specific ligate molecules.
  • the test sites can be functionalized with a spotting method or alternatively by filling the depression with a solution with nucleic acid oligomers.
  • the invention further includes methods for the controlled performance of specific ligate / ligand binding reactions with a substrate of the type described above.
  • the methods differ according to whether a according to the substrate with unused test sites or with already functionalized test sites.
  • the method according to the invention comprises the steps: a) functionalizing the test sites with specific ligate molecules, b) filling the well with an analyte liquid containing potentially to be detected ligand molecules, c) partially or completely drying the analyte to increase the analyte concentration in the test sites, and d) to detect ligate-ligand binding reactions in the test sites.
  • test sites can be functionalized in step a), for example, by a spotting method or by filling the well with a solution of nucleic acid oligomers.
  • the depression is preferably filled as completely as possible with the analysis liquid in order to provide the largest possible number of ligand molecules.
  • the invention also includes variants in which the depression is only partially filled, for example because the standard volume of a pipette or another delivery device is filled.
  • the drying of the analyte liquid in step c) is preferably accelerated controlled by a gas stream, such as an air, argon, nitrogen or other inert gas stream or by tempering.
  • a gas stream such as an air, argon, nitrogen or other inert gas stream or by tempering.
  • T m melting temperature
  • this melting temperature is in the range of 60 0 C, and the temperature can be increased during drying without complication to about 40 - 50 0 C.
  • the process according to the invention comprises the steps: a) filling the depression with an analyte liquid containing potentially to be detected ligand molecules, b) partially or completely drying the analyte liquid to increase the analyte concentration in the test sites, and c ) Detection of ligate-ligand binding reactions in the test sites.
  • the depression is preferably filled as completely as possible with the analysis liquid and the drying of the analyte liquid in step b) by a gas stream, in particular an air, argon, nitrogen or another inert gas stream, or by increasing the temperature (under Consideration of the condition T ⁇ T m ) controls accelerated.
  • the detection of the ligate-ligand binding reactions in step c) is preferably carried out by an electrochemical or fluorescence spectroscopic method.
  • the increase according to the invention of the concentration of the analyte liquid during drying is determined by the ratio of initial and final volumes and can be adjusted via various geometrical parameters of the substrate design, such as the protective layer thickness or the thickness of the protective layer in the recesses.
  • the fraction of target molecules per test site after rupture of the film is determined by the ratio of the size of the actual sensor area and the total wetting area. With recesses with a diameter of 10 - 40 microns and a paint layer thickness of the walls of 10 - 20 microns, for example, you have a controlled final volume on the electrodes of only 0.8 - 25 pL. On the other hand, commercially available spotters give off volumes of about 1 nL or more per wetting process.
  • the substrate has been described that allows the controlled reaction of small amounts of specific binding partners on its structured surface.
  • the controlled drying of the analyte liquid is particularly suitable for the analysis of biological samples, since these are used in the Usually contain several analytes in arbitrary concentrations.
  • the samples can be used without elaborate additional preparation steps.
  • the substrate according to the invention also permits a parallelized examination of all constituents for liquids which contain a plurality of analytes in various concentrations. For this parallel analysis, neither expensive pipetting robots nor large amounts of analyte are necessary according to the invention.
  • the substrates for the detection of specific ligate / ligand binding reactions of the invention are also referred to below as sensor substrates or sensors for short.
  • Suitable carrier plates for such sensor substrates in the context of this invention are all solids with a freely accessible surface which can be functionalized with biomolecules and wetted with a liquid test substance.
  • Suitable solid-state substrates include both plastics and metals, semiconductors, glasses, composites or porous materials.
  • the term surface is independent of the spatial dimensions of the surface.
  • the surface of the sensor substrates can be subdivided into spatially separated areas. This can be realized by structuring the solid substrate in active and inactive areas and / or by the partial functionalization of the homogeneous surfaces. On homogeneous substrates, structuring can be achieved by applying and modifying passivation layers or protective layers as described below.
  • electrically conductive materials such as platinum, palladium, gold, cadmium, mercury, nickel, zinc, carbon, Silver, copper, iron, lead, aluminum, manganese, any doped or undoped semiconductor and binary or ternary compounds used as a sensor surface.
  • electrically conductive materials such as platinum, palladium, gold, cadmium, mercury, nickel, zinc, carbon, Silver, copper, iron, lead, aluminum, manganese, any doped or undoped semiconductor and binary or ternary compounds used as a sensor surface.
  • electrically conductive materials such as platinum, palladium, gold, cadmium, mercury, nickel, zinc, carbon, Silver, copper, iron, lead, aluminum, manganese, any doped or undoped semiconductor and binary or ternary compounds used as a sensor surface.
  • a protective layer see Figure 3
  • conductive materials on spatially separated areas of a non-conductive substrate, such as glass or plastic in any Thickness are applied (see Figure 1 and 2).
  • insulating support plates are used as sensor substrates, which are expediently one-sided rigid support plates, double-sidedly rigid support plates or rigid multi-layer support plates.
  • the insulating support plate may be a single-sided or double-sided flexible support plate, in particular made of a polyimide film, or a rigid-flexible support plate.
  • a base material selected from the group BT (bismaleimide triazine resin with quartz glass), CE (cyanate ester with quartz glass), CEM1 (hard paper core with FR4 outer layers), CEM3 (glass fiber core with FR4 outer layers), FR2 ( Phenolic resin paper), FR3 (hard paper), FR4 (epoxy glass hard tissue), FR5 (epoxy glass resin mesh with crosslinked resin system), PD (aramid reinforced polyimide resin), PTFE (glass or ceramic polytetrafluoroethylene), CHn (highly crosslinked hydrocarbons with ceramics) and glass ,
  • BT bismaleimide triazine resin with quartz glass
  • CE cyanate ester with quartz glass
  • CEM1 hard paper core with FR4 outer layers
  • CEM3 glass fiber core with FR4 outer layers
  • FR2 Phenolic resin paper
  • FR3 hard paper
  • FR4 epoxy glass hard tissue
  • FR5 epoxy glass resin mesh with crosslinked resin system
  • carrier plates have a certain number of conductor tracks made of a non-precious metal core (eg copper and nickel, cf. FIG. 1) with a gold surface, which can be coated, for example, with a solder resist layer as a passivation.
  • a non-precious metal core eg copper and nickel, cf. FIG. 1
  • gold surface which can be coated, for example, with a solder resist layer as a passivation.
  • the electrical measuring apparatus on the other hand, with the help of laser ablation, free gold sites can be burned into the resist for later functionalization.
  • the printed conductor substrates just described are suitable both for electrochemical measurement methods and for fluorescence spectroscopy.
  • a protective layer (also called passivation layer in the context of this application) is applied to the substrate.
  • This protective layer can bridge the critical period between the production of the substrates and their further processing, since the protective layer prevents the adsorption of impurities.
  • any material can be used for this purpose which forms a closed layer on one surface, thus separating the substrate surface from the environment and at a later time e.g. can be removed without residue by laser ablation at desired locations either in its entire thickness or reduced to fractions of the original thickness.
  • organic polymers such as cellulose, dextran or collagen are also suitable. It is also conceivable to create paints whose special constituents form advantageous functionalizations for special applications when the material is being dried on the surface.
  • the protective layer can be applied to the substrate, for example, by spraying in the case of photoresists, by spin coating or physisorption in the case of the organic polymers or by screen printing or curtain coating in the case of solder resists.
  • protective layers of solder resist plating known from printed circuit board technology are applied to the substrates. There are 2-component or 1-component solder resists,. which can be applied by curtain coating, screen printing or spray methods and then cured in air or by UV irradiation. Alternatively, a film lamination process in which plastic films are placed on the substrate and melt by increasing the temperature with the substrate is also suitable.
  • An advantage of the curtain coating method and the film lamination method is that the thickness of the protective layer can be arbitrarily set in a wide range by the speed of the substrates under the paint curtain and the thickness of the film, respectively.
  • Another aspect of these methods is that the surface morphology of the substrate in coating is approximately maintained (see Figures 2 and 5) and consequently the protective layer at each point of the substrate is comparable to, e.g. the speed under the paint curtain has certain thickness.
  • the edges of the printed conductors are subject to the coating of the paint and thus to an increased layer thickness between the webs. In the case of lamination, there is no bleeding of the layer and the morphology is exactly preserved.
  • laser ablation refers not only to the partial or complete removal of organic or inorganic protective layers, but also the removal of impurities on a substrate by irradiation of laser light.
  • laser ablation is used to remove or pattern the applied protective layer at desired locations on the substrate in any geometry.
  • various, well-defined free substrate surfaces, depressions or depressions in the protective layer in variable size and depth on one and demo- to realize the same substrate design only by changing the laser exposure.
  • a thickness of the protective layer determined by the penetration depth of the radiation is removed. If, therefore, a region of the substrate is irradiated with the same number of pulses of a certain intensity, the morphology predetermined by the substrate and the protective layer is retained in the reduction of the layer thickness (compare FIGS. 2 and 3).
  • Another aspect of laser ablation is the melting of the substrate surface with complete removal of the protective layer, which can be achieved by adjusting the laser intensity or the irradiation time to the conditions of the substrate and the protective layer.
  • This short-term, near-surface melting of the substrate in addition to the reduction of the surface roughness, also includes existing pores in the material and thus contributes to the homogeneity of the free substrate surfaces (see FIG. 4).
  • a few gold layers are also ablated from the surface, thus freeing the substrate of surface contamination.
  • the laser ablation can be done by direct irradiation of light or by irradiation of the light via an optical system or a mask.
  • the size or the shape of the individual substrate positions to be exposed or structured and their lateral spacing are arbitrary and only dependent on the respective application.
  • the wavelength of the laser light used, as well as the duration and duration of the pulses depend on the combination of protective layer and substrate material and can be optimized for each pair.
  • structures comprising depressions, free substrate sites and possibly depressions between the test sites are formed by means of an excimer laser over a plurality of masks in a plurality of process steps. len written in a Lötstopplack that allow the filling with liquids for the purpose of functionalizing the exposed sites with ligands or the addition of Analytflüssstechniken.
  • FIGS. 2 and 3 Two non-limiting examples of a structure of depressions with exposed substrate sites are shown in the schematic Figures 2 and 3, which include a structured printed circuit board substrate (see also Figure 1) or a substrate with a homogeneous conductive surface and a process control according to the invention for production demonstrate.
  • FIGS. 2 and 3 by way of example only one line each is shown at test sites, which may be part of a test site matrix with n rows and m columns.
  • the test sites can be functionalized as active regions of the sensor (ie the actual sensor surfaces with an exposed substrate within the depressions) with biomolecules which act as probes for targets present in the test substance.
  • all types of ligates are suitable for investigating analyte fluids for the presence of their specific ligands.
  • Ligates are molecules that interact specifically with a ligand to form a complex.
  • ligates in the context of the present specification are substrates, cofactors or coenzymes as complex binding partner of a protein (enzyme), antibodies (as complex binding partner) ner of an antigen), antigens (as a complex binding partner of an antibody), receptors (as a complex binding partner of a hormone), hormones (as a complex binding partner of a receptor), nucleic acid oligomers (as a complex binding partner of the complementary nucleic acid oligomer) or metal complexes.
  • thiol (HS) or disulfide (SS) groups coupling to the surface of Au, Ag, Cd, Hg, Cu and GaAs
  • amines characterized by either chemical or Attaching physisorption to platinum, silicon or carbon surfaces
  • silanes that covalently bond with oxidic surfaces
  • epoxy cement that binds to all conductive surfaces
  • the free substrate sites are wetted with modified nucleic acid oligomers in aqueous solution.
  • the nucleic acid oligomer to be applied to the free surface is modified via a covalently attached spacer of any composition and chain length with one or more reactive groups, these reactive groups preferably being in the vicinity of one end of the nucleic acid oligomer ,
  • the reactive groups are preferably groups which can react directly with the unmodified surface.
  • nucleic acid oligomers examples include: (i) thiol (HS) or disulfide (SS) derivatized nucleic acid oligomers of the general formula (nx HS spacer) oligo, (nx RS-S spacer) oligo or oligo spacer -SS spacer oligo that react with a gold surface to form gold-sulfur bonds, (ii) nucleic acid oligomers with amines that attach to pi-tin or silicon surfaces through chemisorption or physisorption, and (iii) nucleic acid Oligomers with silanes that form a covalent bond with oxidic surfaces.
  • HS thiol
  • SS disulfide
  • the molecule can be further modified with an electrochemical label (eg ferrocene derivatives or osmium complexes) or a fluorophore (eg fluorescein) via a further spacer of any composition and chain length such that the functionalization of the free substrate sites and / or the subsequent hybridization should be investigated by means of electrochemical or spectroscopic methods.
  • an electrochemical label eg ferrocene derivatives or osmium complexes
  • a fluorophore eg fluorescein
  • a special electrochemical detection variant is a displacement ascription, in which short-chain signal oligomers bound to the unlabeled probe oligomers with redox label are displaced from unlabeled target oligomers of the complementary sequence.
  • each test site of the substrate can be functionalized with different molecules.
  • all exposed test sites, each in one of the depressions can be functionalized by filling with a liquid containing the probe molecules. Execution of specific binding reactions
  • liquids can be examined for the presence of analytes that specifically bind to the probes of the sensor. There are several options for this.
  • the functionalized spots are selectively wetted with small volumes of the test liquid by using a spotter. After a certain incubation period, the substrate can be rinsed and the sensor is read for possible binding events.
  • the entire depression of the substrate containing the exposed test sites can be filled with the test liquid at the desired level.
  • the substrate can be rinsed after a certain incubation time and the sensor is read out for possible binding events.
  • this method requires a larger volume of the test liquid, the spotter can be dispensed with.
  • the depression contained in the test sites is filled up to the upper edge of the lacquer (compare FIGS. 2f and 3g) with analytical fluid, so that a volume (V 0 ) determined only by the geometry of the structured lacquer layer is injected becomes.
  • the evaporation is forcibly controlled, for example, by an inert gas stream or by increasing the temperature (with T ⁇ T m ) in order to increase the concentration of the analytes in the test liquid (FIGS. 2g and 3h, respectively).
  • the substrate can be rinsed immediately if necessary since the specific binding events have already taken place during the reduction of the solvent.
  • the substrate After rinsing, the substrate can again be visualized for the specific binding events, depending on the modification of the ligates, e.g. be read by electrochemical or fluorescence spectroscopic techniques.
  • Fig. 1 shows a schematic representation of a printed circuit board technology based sensor substrate according to an embodiment of the invention.
  • the sections in a) show a plan view of a strip substrate with 3 supply lines for working electrodes and a counter electrode, b) a cross section through a substrate with 3 leads, and c) a substrate with lacquer layers of two thicknesses (dark gray: original thickness, light gray : Depression) and exposed test sites (white) on the working electrodes;
  • FIGS. 2 in a) to h) are schematic representations to illustrate the manufacturing method according to the invention of a substrate with a Eins- kung and aligned with the tracks of the substrate exposed spots (test sites) for functionalization with ligate molecules.
  • the concentration of the targets is increased during the specific reaction of the binding partner by evaporation of the solvent;
  • FIG. 3 shows in a) to i) a schematic representation to illustrate the production method according to the invention of a substrate having a sinking region, depressions and spots (test sites) reaching the conductive, homogeneous surface for functionalization with ligate molecules;
  • FIG. 6 shows a visualization of the functionalization of the test sites with fluorescence-labeled oligomers. a) shows a section of 4 test sites, b) the distribution of fluorescence intensity over 48 test sites; and
  • FIG. 7 shows in a) a schematic picture of a hybridization experiment with FIG.
  • An exemplary process for producing a substrate with areas of reduced thickness (depressions) and exposed spots (test sites) with adjacent microwaves is divided into the following stages: i) providing the carrier plate and optionally applying a conductive pattern, ii) applying a protective layer, iii) structuring the Protective layer by laser ablation to form the depressions and, where appropriate, the recessed regions, and iv) laser ablation to produce exposed substrate sites (test sites) within the depressions.
  • functionalization can be accomplished with ligate molecules, and the substrate can be used as a sensor for ligand molecules present in one or more fluids. Finally, the substrate is read for possible binding events.
  • the entire substrate surface or the surface of the tracks is gold and the protective layer is a solder resist film.
  • the gold sites of the substrate exposed by laser ablation are exemplarily coated with doubly modified nucleic acid oligomers having at one end a thiol group for attachment to the gold surface and at the other end a fluorophore (eg, fluorescein isothiocyanate). or a redox label (eg, an osmium complex).
  • a fluorophore eg, fluorescein isothiocyanate
  • a redox label eg, an osmium complex
  • the functionalized substrate sites are contacted with an analyte fluid (e.g., a solution containing potentially complementary nucleic acid oligomers) and the sensor is subsequently read for possible binding reactions using a fluorescence scanner or electrochemical technique.
  • analyte fluid e.g., a solution containing potentially complementary nucleic acid oligomers
  • the hybridization events can be detected via an altered fluorescence intensity.
  • the surface-bound, single-stranded oligonucleotide is in a more compressed conformation, characterized by a small distance of the fluorophore from the conductive surface, thus resulting in a low fluorescence intensity by fluorescence quenching.
  • the hybridization of the bound oligonucleotides with a complementary oligomer strand increases the distance between the fluorescent dye molecule and the surface acting as a quencher so that a higher fluorescence intensity can be observed by hybridization.
  • electrochemical measurement methods for reading the sensor.
  • a preferred method of measuring occupancy and hybridization efficiency is AC (alternating current) voltammetry. From the ACV current at the redox potential of the label can be according to O'Connor et al. (J. Electroanal Chem., 466, 1999, 197-202) calculate the number of labels involved and thus the experiments are quantitatively evaluable.
  • This electrochemical detection variant represents a displacement assay in which the short-chain signal oligomers bound to the unlabeled probe oligomers are displaced with the redox label of unlabeled target oligomers of the complementary sequence, thus changing the communication between the redox label and the electrode.
  • Example 1 Substrates with Homogeneous Conductive Surface
  • Step 1 Production of the substrates with structured solder mask layer.
  • a glass base is coated with a vapor deposited 5 nm thick CrNi contact layer and a gold layer deposited thereon to a thickness of about 200 nm to form a substrate support plate 12 (Figure 3a).
  • the carrier plate 12 is coated with a passivation layer 22 of structurable, optically curable lacquer (2-component solder resist, Elpemer GL 2467 SM-DG, Peters company) having a thickness of 350 .mu.m, which is coated in a curtain casting method known from printed circuit board technology. Method is applied to the support plate 12, Figure 3b.
  • the protective layer 22 is patterned with an excimer laser from Lambda-Physics.
  • the laser can be imaged in reduced size on the substrate via different masks, the area intensity of the irradiation being adjusted via the imaging device. Depending on the mask, different geometries of the ablated regions can be realized (see FIGS. 4a and 4b).
  • the protective layer 22 is first written by high-energy pulses of the excimer laser a recess 23 A with a reduced protective layer thickness in the paint, Figure 3c.
  • a recess 23 A with a reduced protective layer thickness in the paint, Figure 3c.
  • the lacquer is then further thinned to 10 ⁇ m at selected points 23B within the recess 23A via a second mask by additional laser exposure, FIG. 3d.
  • recessed regions 23B are created which, together with the subsequently introduced recesses 24, form the microwells according to the invention.
  • a third Structuring step generates the recesses 24 for the actual test sites and so exposed the substrate for the functionalization and melted, Figure 3e.
  • These exposed sites typically have diameters of about 10-100 microns and serve to later accommodate ligates 26. Melting of the surface results in occlusion of surface pores of the gold layer, reduction in surface roughness, and removal of surface contaminants.
  • Step 2 Functionalization of the exposed test sites of the substrate with fluorescence-labeled nucleic acid oligomers 26
  • the exposed test sites described in step 1 are used e.g. about one
  • the synthesis of the oligonucleotides is carried out in an automatic oligonucleotide synthesizer (Expedite 8909, ABI 384 DNA / RNA synthesizer) according to the manufacturer's recommended synthesis protocols for a 1.0 ⁇ mol synthesis.
  • the oxidation steps are carried out with a 0.02 M iodine solution in order to avoid oxidative cleavage of the disulfide bridge.
  • Modifications to the 5 ' position of the oligonucleotides are made with a 5-minute extended coupling step.
  • the amino modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) is incorporated into the sequences with the respective standard protocols.
  • the coupling efficiencies are determined photometrically or conductometrically online during the synthesis via the DMT cation concentration.
  • the oligonucleotides are deprotected with concentrated ammonia (30%) at 37 ° C. for 16 h.
  • the purification of the oligonucleotides is carried out by means of RP-HPL chromatography according to standard protocols (eluent: 0.1 M triethylammonium acetate buffer, acetonitrile), the characterization by means of MALDI-TOF MS.
  • the Amine-modified oligonucleotides are coupled to the corresponding activated fluorophores (eg, fluorescein isothiocyanate) according to conditions known to those skilled in the art. The coupling can take place both before and after the attachment of the oligonucleotides to the surface.
  • the substrates from step 1 are incubated with double-modified 20 bp single-stranded oligonucleotide of the sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification one: the phosphate group of the 3' end is labeled with (HO- (CHk) T S) 2 is esterified to P-O- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) rOH, modification two: to the 5 'end is the fluoresceine-fluorescein-phosphoramidite flourescein (Proglio Biochemie GmbH) according to the respective standard protocol incorporated) as 5x10 '5 molar solution in buffer (phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7 with 0.05 vol% SDS) with the addition of about 10 ' 5 to 10 "1 molar propanethiol (or other thiols or disulfides suitable chain length) was applied with the aid of a spotter (Carthesian) and incubated for 2 min
  • the spacer with Au atoms of the surface forms an Au-S bond, resulting in a 1: 1 coadsorption of the ss oligonucleo tids and cleaved 2-hydroxy-mercaptoethanol comes.
  • the free propanethiol present simultaneously in the incubation solution is also coadsorbed by formation of an Au-S bond.
  • this single strand can also be hybridized with its complementary strand.
  • split-pin needles (Arraylt chip marker pins from the company TeIe-Chem) are used, which have a loading volume of 0.2 to 0.6 ⁇ L and volumes of about 1 nL per wetting process submit.
  • the contact surface of these needles has a diameter of about 130 microns and is thus significantly larger than the exposed during laser ablation areas of the substrate.
  • the positioning of the needle over the substrate is done with an accuracy of 10 ⁇ m with an air humidity of about 70-80%.
  • the drop is on contact
  • a fluorescence scanner from Lavision Biotech
  • a substrate is prepared as described in step 1. Subsequently, the region of the depression 23A is filled with a solution of the above-described nucleic acid oligomers, the substrate is rinsed after an incubation time of 2 minutes-24 hours and the functionalization of the free sites with nucleic acid oligomers 26 by means of a fluorescence scanner from Lavision Biotech visualized.
  • Example 2 Printed Circuit Board Substrates.
  • Step 1 Production of printed circuit board substrates with structured solder stop coating.
  • FIG. 1a shows only a section of this conductor track image.
  • the section shows 3 of the 48 working electrodes (20A to 20C) and a part of the counter electrode 28.
  • FIG. 1b shows a section through a strip conductor substrate with three identical strip conductors.
  • Each of the conductor tracks 20 consists of a copper core 14 which is continuously covered by a nickel barrier layer 16 and a gold layer 18.
  • the copper core has a thickness of about 28 microns. It represents a low-cost and highly conductive basic component of the conductor tracks.
  • the base copper core is coated with a 6 ⁇ m thick, continuous nickel layer as a diffusion barrier. On This nickel layer is applied as a surface of a 2 micron thick gold layer.
  • the conductor tracks of the embodiment are about 150 microns wide and arranged at a distance of about 200 microns (center-center) on the support plate.
  • the working electrodes, the counter electrode and optionally also provided reference electrode are connected for contacting in each case with not shown terminal contact surfaces of the electrical substrate.
  • Example 2 With reference to Figure 2, the entire circuit pattern as in Example 1 with a 350 micron thick protective layer 22 of structurable, optically curable varnish (2-component solder mask, Elpemer GL 2467 SM-DG, Fa. Peters) is coated in one of the PCB technology known Curtain casting method has been applied to the substrates.
  • a 350 micron thick protective layer 22 of structurable, optically curable varnish (2-component solder mask, Elpemer GL 2467 SM-DG, Fa. Peters) is coated in one of the PCB technology known Curtain casting method has been applied to the substrates.
  • a region of reduced thickness 23 is written in the resist in the resist 22 by high-energy pulses of the excimer laser.
  • the thickness of the protective layer 22 in selected regions, for example by 340 .mu.m, it takes about 2500 pulses 20 ns of the laser with a surface power of 600 - 1200 mJ / cm 2 .
  • the remaining resist is then removed by means of a second mask at selected locations 24 (24A-C, FIG. 1c) within the region of the first structuring step by additional laser exposure, thus exposing and locally melting the surface of the conductor tracks 20A-20C , These exposed sites typically have diameters of about 10-100 ⁇ m. The melting of the surface leads to the occlusion of surface pores of the gold layer, to a reduction of the surface roughness and to the removal of surface contamination.
  • the conductor tracks have circular recesses with diameters of 10 ⁇ m (FIG. 1c).
  • Step 2 Functionalization of the exposed sites of the substrate with redox-labeled nucleic acid oligomers.
  • the functionalization in this application example can be carried out analogously to the two alternatives from Example 1, that is to say via a spotting process or the filling of the depression 23.
  • the synthesis of the nucleic acid oligomers is likewise carried out analogously to Example 1, but the fluorescence label is replaced by a redox label.
  • the nucleic acid oligomers are modified at the amino-modified 5 1 end with the osmium complex [Os (bipy) 2 Cl imidazoleacrylic acid] according to the respective standard protocol.
  • Step 3 Analysis of a sample liquid with nucleic acid oligomers.
  • the working electrodes may be contacted with a 1 mM solution of propanethiol for 30 minutes prior to hybridization with the complementary, ferrocene-modified nucleic acid oligomers in a post-loading step.
  • the spaces between the nucleic acid oligomers are hydrophobized and shift the redox potential of the ferrocene to more positive values in order to achieve a better separation from the osmium potential.
  • the complementary nucleic acid oligomers for hybridization are synthesized analogously to Example 1, but without the thiol modification at the 3 'end.
  • Targets are synthesized analogously to Example 1, but without the thiol modification at the 3 'end.
  • the measured data show a second redox peak and the ratio of the peak currents of the osmium label and the ferrocene label correspond to the hybridization efficiency of the experiment.
  • the working electrodes in this process alternative show hybridization efficiencies of about 40-50%.
  • the hybridization with complementary nucleic acid oligomers is carried out with reduction of the solvent.
  • the area of reduced protective layer thickness with a length of about 1.7 cm and a width of about 500 ⁇ m includes all 48 working electrodes of the printed circuit board substrate.
  • the applied lacquer layer has a thickness of 350 .mu.m, which was reduced in the sinking region 23 to 10 microns.
  • the depression region of this method example has a capacity of about 2.5 .mu.l.
  • the liquid can be filled in this process alternative with a commercial pipette in the depression area and then dried in air. After about 1 hour, the final state at which the liquid film breaks off at the elevations of the wetting points is reached and the substrate can be rinsed if necessary and read out for potential binding events.
  • the wetting sites with diameters of 10 ⁇ m were functionalized as in alternative 1 with Os-modified nucleic acid oligomers and the analyte liquid again contains FcAc-modified nucleic acid oligomers with a concentration of 0.01 ⁇ M in this example.
  • the initial concentration is increased in the embodiment to about 3 uM, thereby increasing the hybridization efficiency already over 90% (see Figure 7c).
  • the communication of the spatially separated wetting sites is no longer possible, so that only a very small fraction of the available target molecules are available to each spot, and thus virtually no binding events even on further drying more can take place.
  • the wetting sites each have 4.8 * 10 6 probes.
  • 1.5 * 10 10 target molecules were applied to the entire sensor, so that each of the spatially isolated spots is then only in contact with 1.4 * 10 5 molecules which, according to the present assignment, could only effect a maximum of about 3% hybridization .
  • the final state of the hybridization, at which the liquid film breaks, is therefore subject to a maximum error of only 3% in this application example and thus very accurately determined in comparison to a conventional drying process.

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Abstract

Ein Substrat zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand­Bindungsreaktionen weist einen Träger mit zumindest einer Einsenkung zur Aufnahme einer Analytflüssigkeit, die potentiell nachzuweisende Ligandmole­küle enthält, und eine Mehrzahl von in der Einsenkung angeordneten Teststel­len zur Aufnahme von Ligatmolekülen auf. Die Teststellen sind dabei von Mik­rowällen umgeben, die oberhalb eines vorbestimmten Flüssigkeitspegels der Analytflüssigkeit eine Fliessverbindung zwischen den Teststellen erlauben und bei Unterschreiten des vorbestimmten Flüssigkeitspegels die Fliessverbindung zwischen den Teststellen unterbrechen.

Description

Substrat zur kontrollierten Durchführung von spezifischen Ligat/Ligand- Bindungsreaktionen und ein Verfahren zu seiner Herstellung
Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft Substrat zur kontrollierten Durchführung spezifischer Li- gat/Ligand-Bindungsreaktionen. Die Erfindung betrifft ferner ein Herstellungsverfahren für ein solches Substrat, sowie ein Verfahren zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen mit einem derartigen Substrat.
Stand der Technik
Im Bereich der Biowissenschaften, der Medizintechnik und der Sensorik wurde in den letzten Jahren die Herstellung von mikrostrukturierten Substraten für die Analytik von Flüssigkeiten vorangetrieben, um Lab-on-a-chip Produkte zu erhalten. Diese Produkte sollen es im so genannten High-throughput-screening (HTS) ermöglichen, in paralleler Weise eine Vielzahl von möglichen spezifischen Reaktionen in kurzer Zeit automatisiert zu untersuchen. Für diese Analytik von Flüssigkeiten werden typischerweise 2 verschiedene Ansätze einge- setzt.
Die Reaktion zweier Komponenten kann durch das Mischen zweier flüssiger, die Komponenten enthaltenden Phasen in einem Reaktionsgefäß untersucht werden. Durch diese Reaktion ändern sich Eigenschaften der Flüssigkeiten im Reaktionsgefäß in detektierbarer Weise. Die Analytik in der Volumenphase hat auf der einen Seite den Vorteil, dass speziell Proteine ihre spezifischen Funktionen beibehalten, wobei auf der anderen Seite die oft benötigten großen Vo- lumina von Nachteil sind. Somit ist es nötig, Substrate zu schaffen, die extrem kleine Reaktionsgefäße zur Verfügung stellen.
Im zweiten Ansatz benutzt man Oberflächen, die mit verschiedenen Kopp- lungsgruppen versehen sind und spezifisch bestimmte Analyten binden können, um unbekannte Flüssigkeiten auf das Vorhandensein dieser Analyten zu untersuchen. Hierzu muss die Sensoroberfläche zunächst mit den Kopplungsgruppen funktionalisiert, dann mit der unbekannten Flüssigkeit in Kontakt gebracht und anschließend das Anbinden des Analyten detektiert werden. Für die Detektion solcher Bindungsereignisse an Oberflächen steht im Stand der Technik eine Vielzahl von Verfahren wie Fluoreszenzspektroskopie, Radiometrie, Elektrochemie und eine Vielzahl Oberflächen-sensitiver Methoden wie AFM, SPR oder Schwingquarze zur Verfügung.
Speziell im Bereich der DNA-Analytik oder der Proteom-Forschung bestehen die unbekannten Analyt-Flüssigkeiten meistens aus einer großen Anzahl verschiedener Substanzen in zum Teil sehr kleinen Mengen, so dass ein potentieller Sensor zur Analyse dieser Flüssigkeiten mit Hinblick auf die für industrielle Anwendungen wichtigen Faktoren wie Kosten oder Zeit einen hohen Grad an Parallelisierung aufweisen, mit sehr kleinen Materialmengen auskommen und sehr sensitiv sein muss. Die Parallelisierung einer solchen Analyse kann entweder durch eine laterale Strukturierung der Sensoroberfläche in Bereiche verschiedener Funktionalitäten bzw. im Falle eines Volumenansatzes durch eine große Anzahl an Reaktionsgefäßen erreicht werden.
Für die Parallelisierung von Analysen in der Volumenphase stehen kommerziell erhältliche Mikrotitter-Platten zur Verfügung, die mit Volumina von nur etwa 10 μl pro Reaktionsgefäß betrieben werden können. Um aber das parallele Befüllen der Platten mit solchen kleinen Volumina in kurzer Zeit zu erreichen, sind meist teure Pipetier-Roboter nötig. Für die Analyse einer unbekannten Flüssigkeit mit Hilfe der oben beschriebenen Sensoroberflächen mit lateral begrenzten Bereichen unterschiedlicher Funktionalitäten stehen im Weiteren zwei Möglichkeiten zur Verfügung: das Benetzen des gesamten Substrats oder aber das gezielte Benetzen nur der funktionalisierten Bereiche des Substrats mit der Analyt-Flüssigkeit. Beide gerade erwähnten Varianten der Analyse einer unbekannten Flüssigkeit mit einer Sensoroberfläche weisen jedoch entscheidende Nachteile auf.
Das Benetzen der gesamten Sensoroberfläche führt zu großen Todvolumen, so dass dieses Verfahren sehr große Analytmengen benötigt. Durch die gezielte Benetzung nur der funktionalisierten Bereiche der Substratoberfläche wird zwar die zu verwendende Flüssigkeitsmenge drastisch reduziert, auf der anderen Seite werden aber spezielle Geräte benötigt, die dieses gezielte Aufbringen kleiner Volumina ermöglichen. Aus dem Stand der Technik sind für das gezielte Aufbringen kleiner Volumina kommerziell erhältliche Spotter (z.B. der Firma Cartesian Technologies) bekannt, die aber mit erheblichen Anschaffungskosten verbunden sind und geschultes Personal erfordern.
Ein weiteres Verfahren zur partiellen Benetzung eines Substrates mit einer Flüssigkeit ist das Mikrokontakt-Drucken μCP (mico-contact-printing), das erstmals von Whitesides 1994 (A. Kumar, G. M. Whitesides, Science, 1994, 263, 60; US-A-6 048 623) vorgestellt wurde. Bei diesem Verfahren wird ein mikrostrukturierter Stempel mit einer Flüssigkeit benetzt, anschließend in direktem Kontakt mit dem zu bearbeitenden Substrat gebracht und so der Ober- fläche eine laterale chemische Struktur aufgeprägt. Eine große Schwierigkeit dieser Technik ist die Realisierung eines gleichförmigen Kontakts zwischen Stempel und Substrat, der für das Gelingen bzw. die Qualität von entscheidender Bedeutung ist.
Alle Arten der oben beschriebenen Sensoren mit funktionalisierten Oberflächen benötigen zur Analyse von flüssigen Probensubstanzen in der Regel A- nalytkonzentrationen oberhalb eines kritischen Wertes. Somit kann es bei be- stimmten Sensoren z.B. nötig werden, die Konzentrationen einer biologischen Probe vor der Untersuchung durch zusätzliche Präparationsschritte vor der Analyse zu erhöhen.
Darstellung der Erfindung
Hier setzt die Erfindung an. Der Erfindung, wie sie in den Ansprüchen gekennzeichnet ist, liegt die Aufgabe zugrunde, ein Substrat und ein Verfahren zu seiner Herstellung anzugeben, das die eingangs genannten Nachteile des Stands der Technik vermeiden. Insbesondere soll das Substrat die Analyse von Analytflüssigkeiten geringster Konzentration erlauben und so insbesondere eine Analyse biologischer Proben ohne zusätzliche Präparationsschritte ermöglichen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Substrat nach Anspruch 1 , das Herstellungsverfahren nach Anspruch 31 oder 32 und das Verfahren zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen nach Anspruch 39 oder 44 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Figuren und den Beispielen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt:
Allgemeines
ACV alternating current voltammetry
AFM atomic force microscope.
Analytflüssigkeit Flüssigkeit, die potentiell einen Analyten enthält, der über einen Sensor nachgewiesen werden soll.
Flüssigkeit nicht nur reine flüssige Stoffe, sondern auch Flüssigkeiten mit De- tergenz, jede Art von gelösten organischen oder anorganischen Stoffen, sowie Emulsionen, Suspensionen und kolloidalen Lösungen.
Funktionalisierung Aufbringen von Ligat-Molekülen auf die Teststellen eines Substrats. Diese Moleküle können hierbei auf dem Substrat physisor- biert, chemisorbiert oder kovalent, koordinativ bzw. über Komplexbildung gebunden sein.
HTS High throughput Screening Laser-Ablation partielles oder vollständiges Entfernen von organischen oder anorganischen Schutzschichten, aber auch das Entfernen von Verunreinigungen auf einem Substrat durch Einstrahlung von Laserlicht.
Lötstopplack aus der Leiterplattentechnologie bekannter Lack, der auf Platinen aufgebracht wird, um beim automatisierten Löten das Entstehen von Lötzinnbrücken zu verhindern. μCP Micro contact printing.
Pseudo-Kontakt- Aufbringen einer Flüssigkeit mit Hilfe einer Nadel, Kapillare, PinDrucken zette, eines Ringes oder Stempels bzw. einer Anordnung von Nadeln, Kapillaren, Pinzetten, Ringen oder Stempeln auf ein strukturiertes Substrat, wobei hier wegen der vorhandenen Schutzschicht und der lateralen Ausdehnung der Spitzen der Be- netzungsvorrichtung, die bevorzugt größer als die freien zu benetzenden Flächen ist kein direkter Kontakt zwischen der Vorrichtung und dem Substrat zustande kommt.
Schutzschicht auf das zu bearbeitende Substrat vor der eigentlichen Benetzung aufgebrachte Schicht. Hierfür ist jedes beliebige Material verwendbar, das an einer Oberfläche eine geschlossene Schicht bildet, somit die Substratoberfläche von der Umgebung trennt und zu einem späteren Zeitpunkt durch Laser-Ablation an ausgewählten Stellen teilweise oder vollständig entfernt werden kann. Diese Schutzschicht kann aus organischen als auch anorganischen Materialien bestehen, je nach Substrattyp und Anwendungsvoraussetzungen physisorbiert, chemisorbiert oder kovalent, koordinativ bzw. über Komplexbildung gebunden sein und mit beliebigen Techniken aufgebracht werden.
SEM Scanning electron microscopy
Spot bzw. räumlich begrenzte Gebiete auf der Sensoroberfläche, die je eiTest-Site nen oder mehrere Typen von Sonden-Moleküle tragen, die spezifisch je ein oder mehrere Moleküle einer Testsubstanz binden können. In einer bevorzugten Art der Erfindung sind dies Bereiche an Stellen reduzierter Lackschichtdicke, an denen die Schutzschicht vollständig und in beliebiger Geometrie entfernt wurde und das Substrat somit zugänglich ist.
Substrat Festkörper mit einer frei zugänglichen Oberfläche, der somit mit einer Flüssigkeit benetzt werden kann. Als Festkörpersubstrate kommen sowohl Kunststoffe, als auch Metalle, Halbleiter, Gläser, Verbundstoffe oder poröse Materialien in Frage. Die Bezeichnung Oberfläche ist unabhängig von den räumlichen Dimensionen der Oberfläche.
UV Ultraviolettes Licht
Genetik
DNA Desoxyribonukleinsäure
RNA Ribonukleinsäure
PNA Peptidnukleinsäure (synthetische DNA oder RNA, bei der die
Zucker-Phosphat Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei
Ersatz der Zucker-Phosphat Einheit durch die -NH-(CH2)2-
N(COCH2-BaSe)-CH2CO- Einheit hybridisiert PNA mit DNA).
A Adenin G Guanin C Cytosin
T Thymin
Base A, G, T, oder C
Bp Basenpaar
Nukleinsäure wenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z.
B. Phosphoramid-, Thio-Phosphat- oder Dithio-Phosphat- Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist, dass sie natürlich vorkommende cDNA oder RNA sequenzspezifisch binden kann.
Nukleinsäure- Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z. B. Nuk- Oligomer leinsäure-Oktamer: eine Nukleinsäure mit beliebigem Rückgrat, bei dem 8 Pyrimidin- oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind).
Oligomer Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer. Oligonukleotid Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z. B. ein DNA, PNA oder RNA Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge.
Oligo Abkürzung für Oligonukleotid. ss Single Strand (Einzelstrang)
Chemikalien FcAc bzw. Ferro- Ferrocen Acetic acid (Ferrocen Essigsäure) cen
Fluorophor chemische Verbindung (chemische Substanz), die in der Lage ist, bei Anregung mit Licht ein längerwelliges (rotverschobenes) Fluoreszenzlicht abzugeben. Fluorophore (Fluoreszenzfarbstoffe) können Licht in einem Wellenlängenbereich vom ultravioletten (UV) über den sichtbaren (VIS) bis hin zum infraroten (IR) Bereich absorbieren. Die Absorptions- und Emissionsmaxima sind um 15 bis 40 nm verschoben (Stokes-Shift).
Fluorescein Resorcinphtalein Ligand Bezeichnung für Moleküle, die vom Ligaten spezifisch gebunden werden; Beispiele von Liganden im Sinne der vorliegenden Schrift sind Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme eines Protein; (Enzyms), Antikörper (als Ligand eines Antigens), Antigene (als Ligand eines Antikörpers), Rezeptoren (als Ligand eines Hormons), Hormone (als Ligand eines Rezeptors) oder Nukleinsäu- re-Oligomere (als Ligand des komplementären Nukleinsäure- Oligomers.
Ligat Bezeichnung für (Makro-) Molekül, an dem sich spezifische Er- kennungs- und Bindungsstellen für die Ausbildung eines Komplexes mit einem Liganden befinden (Template).
Osmium-Komplex [Os(bipy)2 Cl imidazolacrylsäure]
Redox-Label bzw. chemische Verbindung, die durch Aufnahme bzw. Abgabe von Elektelektrochemisches ronen aus einer anderen chemischen Verbindung diese andere
Label chemische Verbindung oxidiert bzw. reduziert.
SDS Sodiumdodecylsulfat Sonde auf der Sensoroberfläche aufgebrachte Biomoleküle, die spezifisch ein oder mehrere Moleküle aus der Testsubstanz (Targets) binden können. Spacer beliebige molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül, in der Regel Alkyl,- Alkenyl, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl-, Heteroalkinyl-Ketten. Bevorzugte Spacer sind solche der Kettenlänge 1 - 20, insbesondere der Kettenlänge 1 - 14, wobei die Kettenlänge die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen darstellt.
Target Moleküle in der Testsubstanz, die spezifisch an ein oder mehrere Biomoleküle an der Sensoroberfläche (Sonden) binden können.
Oligo-Spacer-S-S- zwei gleiche oder verschiedene Nukleinsäure-Oligomere, die ü- Spacer-Oligo ber eine Disulfid-Brücke miteinander verbunden sind, wobei die Disulfidbrücke über zwei beliebige Spacer an die Nukleinsäure- Oligomere angebunden ist und die beiden Spacer eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Disulfidbrücke und dem jeweiligen Nukleinsäure- Oligomer) aufweisen können, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14 und diese Spacer wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer vorhandene oder an diese durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein können.
(n x HS-Spacer)- Nukleinsäure-Oligomer, an das n Thiolfunktionen über jeweils oligo einen Spacer angebunden sind, wobei die Spacer jeweils eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Thiolfunktion und Nukleinsäure-Oligomer) aufweisen können, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14. Diese Spacer können wiederum an verschie dene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer vorhandene oder an diesem durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein und "n" ist eine beliebige ganze Zahl, insbesondere eine Zahl zwischen 1 und 20. (n x R-S-S- Nukleinsäure-Oligomer, an das n Disulfidfunktionen über jeweils Spacer)-oligo einen Spacer angebunden sind, wobei ein beliebiger Rest R die Disulfidfunktion absättigt. Der Spacer zur Anbindung der Disulfid- funktion an das Nukleinsäure-Oligomer kann jeweils eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Disulfidfunktion und Nukleinsäure-Oligomer) aufweisen, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14. Diese Spacer können wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer vorhandene oder an diesem durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein. Der Platzhalter "n" ist eine beliebige ganze Zahl, insbesondere eine Zahl zwischen 1 und 20.
Erfindungsgemäß umfasst ein Substrat zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen einen Träger mit zumindest einer Einsenkung zur Aufnahme einer Analytflüssigkeit, die potentiell nachzuweisende Ligandmoleküle enthält, und eine Mehrzahl von in der Einsenkung angeordneten Teststellen zur Aufnahme von Ligatmolekülen. Die Teststellen sind dabei von Mikrowällen umgeben, die oberhalb eines vorbestimmten Flüssigkeitspegels der Analytflüssigkeit eine Fließverbindung zwischen den Teststellen erlauben und bei Unterschreiten des vorbestimmten Flüssigkeitspegels die Fließverbindung zwischen den Teststellen unterbrechen.
Als Substrat wird im Rahmen dieser Erfindung ein Festkörper mit einer frei zugänglichen Oberfläche bezeichnet, der somit mit einer Flüssigkeit benetzt werden kann. Als Festkörpersubstrate kommen sowohl Kunststoffe, als auch Metalle, Halbleiter, Gläser, Verbundstoffe oder poröse Materialien in Frage. Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter Flüssigkeiten nicht nur reine flüssige Stoffe, sondern auch Flüssigkeiten mit Detergenz, jede Art von gelösten organischen oder anorganischen Stoffen, sowie Emulsionen, Suspensionen und kolloidalen Lösungen. Das erfindungsgemäße Substrat ermöglicht eine kontrollierte Erhöhung der Analytkonzentration der Testflüssigkeiten, um den Anteil an spezifischen Bindungsereignissen zu steigern. Die Bindungsreaktion zwischen einem Liganden und einem Ligaten gehorcht stets einer Bindungskinetik, die über eine Assozia- tionskonstante beschrieben wird (z.B. Langmuir-Isotherme). Das thermodyna- mische Gleichgewicht der Reaktion kann über die Konzentrationen der beteiligten Reaktionspartner eingestellt werden. Erhöht man dementsprechend die Target-Konzentration in der Analytflüssigkeit durch Reduktion des Volumens bei gleichbleibender Analytmenge, so erhöht man auch den Anteil der spezifischen Bindungsereignisse an der Sensoroberfläche.
Das kontrollierte Eintrocknen der Analytflüssigkeit auf dem erfindungsgemäßen Substrat hat den Vorteil, dass beliebige Proben, unabhängig von den Konzentrationen der enthaltenen Analyten sofort, ohne zusätzliche externe Präparati- onsschritte untersucht werden können. Das teilweise sehr aufwendige Aufkonzentrieren von z.B. biologischen Proben auf einen benötigten Konzentrationswert ist mit der vorliegenden Erfindung nicht mehr nötig. Ohne das Aufkonzentrieren liegen die Proben in relativ großen Volumina vor, so dass hier auf teure Spotter-Geräte oder Pipetier-Roboter verzichtet werden kann.
Die Erhöhung der spezifischen Bindungsereignisse durch die wachsende Analytkonzentration während des Eintrocknens des Lösungsmittels analog einer Bindungskinetik findet nur bis zu einem bestimmten Grenzwert statt, da bei zu hohen Konzentrationen unspezifische Adsorption durch das Ausfallen der Sub- stanzen zunimmt. Ohne gezielte Maßnahmen ist dieser Endpunkt des Eintrocknens sehr unbestimmt, so dass ein Verfahren, bei dem Einzeltropfen auf räumlich voneinander getrennten Benetzungsgebieten platziert werden, beim Eintrocknen zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen führt. Somit beruht die Erfindung auf einer kontrollierten Erhöhung der Konzentrationen in der Analytflüssig- keit bis zu einem genau definierten Endzustand. Das kontrollierte Eintrocknen der Erfindung wird dadurch realisiert, dass die Teststellen innerhalb der mit Analytflüssigkeit gefüllten Einsenkungen von Mik- rowällen umgeben sind, an deren Rändern der Flüssigkeitsfilm gegen Ende des Eintrockenvorgangs reißt und somit die Fließverbindung zwischen den einzel- nen Teststellen unterbrochen wird. Zu dem Zeitpunkt, an dem der Flüssigkeitsfilm reißt, ist jede der Teststellen noch mit einem definierten Endvolumen benetzt, das durch das Volumen des von den Mikrowällen eingeschlossenen Bereichs gegeben ist und das nur einen kleinen Bruchteil der gesamten Target- Menge enthält.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung weist der Träger eine Trägerplatte auf, auf deren Oberfläche die Teststellen angeordnet sind. Die Trägerplatte ist dabei vorteilhaft mit einer flächigen Schutzschicht versehen, die die Oberfläche von der Umgebung trennt. Zweckmäßig weist die flächige Schutzschicht eine Dicke zwischen 10 μm und 500 μm, bevorzugt zwischen 100 μm und 400 μm auf.
Die Einsenkung des Trägers kann insbesondere durch einen Bereich reduzierter Dicke der Schutzschicht gebildet sein. Dabei ist die Dicke der Schutz- Schicht in der Einsenkung vorteilhaft um 50% bis 99,5%, bevorzugt um 90% bis 99% reduziert. Beispielsweise kann die Schutzschicht in der Einsenkung eine Dicke von 5 μm bis 50 μm, bevorzugt von etwa 10 μm aufweisen.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung sind die Teststellen durch sich zur Oberfläche der Trägerplatte erstreckende vertikale Aussparungen in der Schutzschicht definiert. Sie können beispielsweise eine charakteristische Ausdehnung von etwa 5 μm bis etwa 200 μm, bevorzugt von etwa 10 μm bis etwa 100 μm aufweisen. Die vertikalen Aussparungen weisen vorteilhaft einen im Wesentlichen rechteckigen, elliptischen oder kreisförmigen Querschnitt auf. Gemäß der Erfindung ist es bevorzugt, wenn die Schutzschicht zwischen den Teststellen Vertiefungsgebiete aufweist, deren an die Teststellen grenzende Ränder die Mikrowälle bilden.
Die auf die Trägerplatte aufgebrachte Schutzschicht besteht vorzugsweise aus einem Material, das an die zu benetzende Oberfläche der Trägerplatte physi- sorbiert, chemisorbiert oder kovalent, koordinativ bzw. über Komplexbildung bindet. Insbesondere kann die Schutzschicht durch einen positiven oder negativen Photolack, einen Lötstopplack, ein organisches Polymer, insbesondere Cellulose, Dextran oder Collagen gebildet sein.
Die in der Einsenkung angeordneten Teststellen sind vorzugsweise in Form einer n x m Matrix mit n Zeilen und m Spalten angeordnet sind, wobei n und m größer oder gleich 1 sind.
Die Trägerplatte kann durch eine einseitige starre Trägerplatte, eine doppelseitige starre Trägerplatte, eine starre Mehrlagenträgerplatte, eine einseitige oder doppelseitige flexible Trägerplatte, insbesondere aus einer Polyimidfolie, oder durch eine starrflexible Trägerplatte gebildet sein. In vorteilhaften Ausgestal- tungen weist die Trägerplatte einen Grundkörper aus Kunststoff, Metall, Halbleiter, Glas, Verbundstoff, einem porösen Material oder einer Kombination dieser Materialien auf. Insbesondere kann die Trägerplatte einen Grundkörper aus einem Basismaterial aufweisen, das ausgewählt ist aus der Gruppe Bis- maleinimid-Triazinharz mit Quarzglas (BT), Cyanatester mit Quarzglas (CE), Hartpapierkern mit FR4-Außenlagen (CEM1 ), Glasvlieskern mit FR4-
Außenlagen (CEM3), Phenolharzpapier (FR2), Hartpapier (FR3), Epoxid- Glashartgewebe (FR4), Epoxid-Glashartgewebe mit vernetztem Harzsystem (FR5), Polyimidharz mit Aramidverstärkung (PD), Polytetrafluoräthylen mit Glas oder Keramik (PTFE), hochvernetzte Kohlenwasserstoffe mit Keramik (CHn) und Glas. Der Grundkörper der Trägerplatte ist zweckmäßig mit einer leitfähigen Schicht, insbesondere aus Silizium, Platin oder Gold versehen, die die Oberfläche der Trägerplatte bildet.
Dabei ist in einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung der Grundkörper der Trägerplatte mit einer homogenen leitfähigen Schicht versehen, die an jedem Punkt der Trägerplatte im Wesentlichen dieselbe Dicke aufweist. Die Dicke der homogenen leitfähigen Schicht beträgt bevorzugt etwa 20 nm bis etwa 5 μm, und liegt besonders bevorzugt zwischen etwa 100 nm und etwa 500 nm.
In einer anderen, ebenfalls vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist der Grundkörper der Trägerplatte mit einem Leiterbild mit beabstandeten Leiterbahnen und Anschlusskontaktflächen versehen. Die Teststellen sind dabei auf den Leiterbahnen angeordnet.
In diesem Zusammenhang weisen die Leiterbahnen vorteilhaft einen Metallkern aus einem gut leitenden Unedelmetall und eine den Metallkern umgebende Goldschicht auf. Die Leiterbahnen sind bevorzugt durchgehend mit einer Diffusionssperrschicht versehen, die einen direkten Kontakt der Analytflüssig- keit mit dem Metallkern verhindert. Der Metallkern kann dabei insbesondere Kupfer, Wolfram und/oder Aluminium umfassen.
Die Diffusionssperrschicht umfasst mit Vorteil eine zwischen dem Metallkern und der äußeren Goldschicht angeordnete Zwischenschicht aus Nickel, Titan und/oder Platin, die bevorzugt eine Dicke von etwa 2 μm bis etwa 10 μm, besonders bevorzugt von etwa 3 μm bis etwa 8 μm, und ganz besonders bevorzugt von etwa 4 μm bis etwa 6 μm aufweist. Ohne eine Diffusionssperrschicht kann der auf den Substraten vorgesehene Unedelmetallkern, typischerweise Kupfer, das Messsignal bei der elektrochemischen Detektion stark beeinflus- sen. So führt beispielsweise die Kupferoxidation zu einem Signalpeak bei einem Potential von 250 mV relativ zu einer Ag/AgCI Referenzelektrode. In diesem Potentialbereich werden auch viele der als bevorzugt angegebenen elekt- rochemischen Nachweisverfahren durchgeführt. Insbesondere wenn sehr kleine Mengen einer Testsubstanz in einer Analyflüssigkeit nachgewiesen werden sollen, kann schon eine vergleichsweise kleine Anzahl an Kupferatomen zu einer Verfälschung oder unerwünschten Beeinflussung des Messsignals füh- ren. Eine Diffusionssperrschicht, insbesondere mit einer oben genannten Zwischenschicht verhindert wirkungsvoll die Diffusion von Atomen aus dem Unedelmetallkern in die umgebende Elektrolytlösung und ermöglicht damit höchstempfindliche elektrochemische Nachweisverfahren.
Die genannte Goldschicht weist vorteilhaft eine Dicke von etwa 0,15 μm bis etwa 10 μm, bevorzugt von etwa 1 μm bis etwa 5 μm, besonders bevorzugt von etwa 2 μm bis etwa 3 μm auf.
Die Leiterbahnen sind zweckmäßig mit einer Breite von 50 μm bis 250 μm, insbesondere von 80 μm bis 200 μm ausgebildet. Der Abstand zwischen den Leiterbahnen bestimmt das zur Verfügung stehende Todvolumen der Vertiefungsgebiete. Als geeignet haben sich Abstände zwischen den Rändern der Leiterbahnen von etwa 10 μm bis etwa 400 μm herausgestellt. Bei üblichen Breiten der Leiterbahnen, beispielsweise etwa 150 μm, haben Abstände von etwa 200 μm bis etwa 300 μm zwischen den Rändern gute Ergebnisse erbracht.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung sind die Teststellen mit spezifischen Ligatmolekülen funktionalisiert. Insbesondere sind Ligatmoleküle an den Teststellen an die Oberfläche der Trägerplatte physisorbiert, chemisor- biert oder kovalent, koordinativ oder über Komplexbildung gebunden. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung sind die Teststellen mit Nukleinsäure- Oligomeren funktionalisiert, die mit einer oder mehreren reaktiven Gruppen modifiziert sind. Insbesondere können die Teststellen im Bereich einer GoId- Schicht angeordnet sein und mit Thiol- (HS-) oder Disulfid- (S-S-) derivatisier- ten Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert sein. Zum Nachweis von Bin- dungsreaktionen sind die Nukleinsäure-Oligomere mit Vorteil mit einem Fluo- rophor und/oder einem Redoxlabel modifiziert.
Ein Verfahren zum Herstellen eines Substrats zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen, insbesondere der oben beschriebenen Art, umfasst die Verfahrensschritte: a) Bereitstellen einer Trägerplatte, b) Aufbringen eines Leiterbilds mit beabstandeten Leiterbahnen und Anschlusskontaktflächen auf die Trägerplatte, c) Aufbringen einer flächigen Schutzschicht auf die mit dem Leiterbild versehene Trägerplatte, wodurch zwischen den beabstandeten Leiterbahnen Vertiefungsgebiete entstehen, d) Strukturieren der Schutzschicht zur Erzeugung zumindest einer Einsenkung mit reduzierter Schutzschichtdicke, und e) Erzeugen vertikaler Aussparungen in der Einsenkung, die sich zu den Leiterbahnen des Leiterbilds erstrecken und Teststellen auf der Trägerplatte definieren, so dass die Ränder der Vertiefungsgebiete Mikrowälle für die Teststellen bilden.
Ein anderes Verfahren zum Herstellen eines Substrats zur kontrollierten
Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen, insbesondere der oben beschriebenen Art, umfasst die Verfahrensschritte: a) Bereitstellen einer Trägerplatte mit einer homogenen leitfähigen Oberfläche, b) Aufbringen einer flächigen Schutzschicht auf die Trägerplatte, c) Strukturieren der Schutzschicht zur Erzeugung zumindest einer Einsenkung mit reduzierter Schutzschichtdicke, d) Erzeugen von vertikalen Aussparungen in der Einsenkung, die sich zu einer Oberfläche der Trägerplatte erstrecken und Teststellen auf der Träger- platte definieren, und e) Erzeugen von Vertiefungsgebieten zwischen den Teststellen, so dass die Ränder der Vertiefungsgebiete Mikrowälle für die Teststellen bilden. In beiden Verfahrensvarianten wird vorteilhaft als Schutzschicht ein Lötstopplack mit einem Vorhanggießverfahren aufgebracht.
Die Aussparungen, die Einsenkungen und im Fall des letztgenannten Verfahrens die Vertiefungsgebiete werden bevorzugt mittels Laserablation, insbesondere durch Bestrahlung von Teilbereichen der Schutzschicht mit kontinuierlicher oder gepulster Laserstrahlung einer vorbestimmten Wellenlänge, bevorzugt im ultravioletten Spektralbereich erzeugt. Die Laserstrahlung kann dabei direkt oder über eine Optik bzw. eine Maske auf die abzutragende Schutzschicht gerichtet werden. Die Reihenfolge, in der die Aussparungen und die Vertiefungsgebiete erzeugt werden, ist dabei für die Erfindung nicht wesentlich.
Beim Erzeugen der Aussparungen wird bevorzugt eine Oberflächenregion der Trägerplatte im Bereich der Teststellen aufgeschmolzen. Durch das Aufschmelzen der Oberfläche ergeben sich eine reduzierte Oberflächenrauigkeit und eine verbesserte Homogenität der Oberfläche der Trägerplatte. Durch das Aufschmelzen werden außerdem wenige Goldschichten von der Oberfläche ablatiert, und somit das Substrat von Oberflächenverunreinigungen befreit. Die so freigelegten Stellen des Substrats lassen sich anschließend mit geeigneten Molekülen funktionalisieren.
Die Teststellen können in beiden Verfahrensvarianten in einem Schritt f) mit spezifischen Ligatmolekülen funktionalisiert werden. Dabei können die Teststellen mit einem Spotting-Verfahren oder alternativ durch Befüllen der Einsenkung mit einer Lösung mit Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert werden.
Die Erfindung umfasst ferner Verfahren zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen mit einem Substrat der oben beschriebenen Art. Die Verfahren unterscheiden sich danach, ob ein erfindungs- gemäßes Substrat mit unbelegten Teststellen oder mit bereits funktionalisier- ten Teststellen eingesetzt wird.
Wird ein Substrat mit unbelegten Teststellen verwendet, so umfasst das Ver- fahren erfindungsgemäß die Schritte: a) Funktionalisieren der Teststellen mit spezifischen Ligatmolekülen, b) Befüllen der Einsenkung mit einer Analytflüssigkeit, die potentiell nachzuweisende Ligandmoleküle enthält, c) Teilweises oder vollständiges Eintrocknen der Analytflüssigkeit zur Erhö- hung der Analytkonzentration in den Teststellen, und d) Nachweis von Ligat-Ligand-Bindungsreaktionen in den Teststellen.
Die Teststellen können in Schritt a) beispielsweiseτnit einem Spotting- Verfahren oder durch Befüllen der Einsenkung mit einer Lösung mit Nuklein- säure-Oligomeren funktionalisiert werden. Die Einsenkung wird bevorzugt möglichst vollständig mit der Analyflüssigkeit befüllt, um eine größtmögliche Anzahl an Ligandmolekülen bereitzustellen. Die Erfindung umfasst jedoch auch Varianten, in denen die Einsenkung nur teilweise befüllt wird, etwa weil das Standardvolumen einer Pipette oder einer anderen Zuführvorrichtung ein- gefüllt wird.
Das Eintrocknen der Analytflüssigkeit in Schritt c) wird vorzugsweise durch einen Gasstrom, wie etwa einen Luft-, Argon-, Stickstoff- oder einen anderen Inertgasstrom bzw. durch Temperieren kontrolliert beschleunigt. Beim be- schleunigtem Eintrocknen durch Temperaturerhöhung muss beachtet werden, dass die Temperatur nicht über der Schmelztemperatur Tm der spezifischen Hybride liegt. Im Falle von z.B. 20mer Oligomeren liegt diese Schmelztemperatur im Bereich von 60 0C, und die Temperatur kann beim Eintrocknen ohne Komplikation auf etwa 40 - 50 0C erhöht werden. Zum Nachweis der Ligat- Ligand-Bindungsreaktionen in Schritt d) wird mit Vorteil auf ein elektrochemisches oder ein fluoreszenzspektroskopisches Verfahren zurückgegriffen. Bei Verwendung eines Substrats mit bereits funktionalisierten Teststellen um- fasst das Verfahren erfindungsgemäß die Schritte: a) Befüllen der Einsenkung mit einer Analytflüssigkeit, die potentiell nachzuweisende Ligandmoleküle enthält, b) Teilweises oder vollständiges Eintrocknen der Analytflüssigkeit zur Erhöhung der Analytkonzentration in den Teststellen, und c) Nachweis von Ligat-Ligand-Bindungsreaktionen in den Teststellen.
Auch in diesem Fall wird die Einsenkung bevorzugt möglichst vollständig mit der Analyflüssigkeit befüllt und das Eintrocknen der Analytflüssigkeit in Schritt b) durch einen Gasstrom, insbesondere einen Luft-, Argon-, Stickstoff- oder einen anderen Inertgasstrom, bzw. durch Erhöhung der Temperatur (unter Beachtung der Bedingung T < Tm) kontrolliert beschleunigt. Auch der Nachweis der Ligat-Ligand-Bindungsreaktionen in Schritt c) erfolgt bevorzugt mit einem elektrochemischen oder fluoreszenzspektroskopischen Verfahren.
Die erfindungsgemäße Erhöhung der Konzentration der Analytflüssigkeit beim Eintrocknen ist durch das Verhältnis von Anfangs- und Endvolumen bestimmt und kann über verschiedene geometrische Parameter des Substratdesigns wie der Schutzschichtdicke oder der Dicke der Schutzschicht in den Vertiefungen eingestellt werden. Der Bruchteil der Target-Moleküle pro Teststelle nach dem Reißen des Films ist durch das Verhältnis der Größe der eigentlichen Sensorfläche und der gesamten Benetzungsfläche bestimmt. Bei Aussparungen mit einem Durchmesser von 10 - 40 μm und einer Lackschichtdicke der Wälle von 10 - 20 μm hat man beispielsweise ein kontrolliertes Endvolumen auf den Elektroden von nur 0.8 - 25 pL. Kommerziell erhältliche Spotter geben hingegen pro Benetzungsvorgang Volumina von etwa 1 nL oder mehr ab.
Insgesamt wurde ein Substrat beschrieben, das die kontrollierte Reaktion von kleinen Probenmengen spezifischer Bindungspartnern auf seiner strukturierten Oberfläche ermöglicht. Das kontrollierte Eintrocknen der Analytflüssigkeit ist besonders für die Analyse von biologischen Proben geeignet, da diese in der Regel mehrere Analyten in beliebigen Konzentrationen enthalten. Die Proben können zum einen ohne aufwendige zusätzliche Präparationsschritte verwendet werden., zum anderen erlaubt das erfindungsgemäße Substrat auch für Flüssigkeiten, die mehrere Analyten in verschiedenen Konzentrationen enthal- ten, eine parallelisierte Untersuchung aller Bestandteile. Für diese parallele Analyse sind nach der Erfindung weder teure Pipetier-Roboter noch große A- nalytmengen nötig.
Weitere Ausgestaltungen und Vorteile der Erfindung werden nachfolgend im Detail beschrieben:
Sensor-Substrate
Die Substrate für den Nachweis spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen der Erfindung werden nachfolgend auch als Sensor-Substrate oder kurz Sensoren bezeichnet. Als Trägerplatten für derartige Sensor-Substrate eignen sich im Rahmen dieser Erfindung alle Festkörper mit einer frei zugänglichen Oberfläche, die mit Biomolekülen funktionalisiert und mit einer flüssigen Testsubstanz benetzt werden können. Als Festkörpersubstrate kommen sowohl Kunststoffe, als auch Metalle, Halbleiter, Gläser, Verbundstoffe oder poröse Materialien in Frage. Die Bezeichnung Oberfläche ist unabhängig von den räumlichen Dimensionen der Oberfläche.
Die Oberfläche der Sensorsubstrate lässt sich in räumlich getrennte Bereiche unterteilen. Dies lässt sich durch Strukturierung des Festkörpersubstrats in aktive und inaktive Bereiche und / oder durch die partielle Funktionalisierung der homogenen Oberflächen realisieren. Auf homogenen Substraten kann man die Strukturierung durch das weiter unten beschriebene Aufbringen und Modifizieren von Passivierungsschichten bzw. Schutzschichten realisieren.
In einer bevorzugten Art der Erfindung werden elektrisch leitfähige Materialien wie Platin, Palladium, Gold, Cadmium, Quecksilber, Nickel, Zink, Kohlenstoff, Silber, Kupfer, Eisen, Blei, Aluminium, Mangan, beliebige dotierte oder nichtdotierte Halbleiter und binäre oder ternäre Verbindungen als Sensoroberfläche verwendet. Zur Realisierung von räumlich getrennten aktiven Teststellen bzw. Spots auf dem Sensor können homogene elektrisch leitfähige Oberflächen z.B. über eine Schutzschicht strukturiert werden (siehe Figur 3) oder aber leitfähige Materialien auf räumlich getrennte Bereiche eines nicht-leitfähigen Substrats, wie z.B. Glas oder Kunststoff in beliebiger Dicke aufgebracht werden (siehe Figur 1 und 2).
In einer besonders bevorzugten Art der Erfindung werden als Sensorsubstrate isolierende Trägerplatten verwendet, die zweckmäßig einseitig starre Trägerplatten, doppelseitig starre Trägerplatten oder starre Mehrlagenträgerplatten sind. Alternativ kann die isolierende Trägerplatte eine einseitig oder doppelseitig flexible Trägerplatte, insbesondere aus einer Polyimidfolie, oder eine starr- flexible Trägerplatte sein. Sie besteht mit Vorteil aus einem Basismaterial, das ausgewählt ist aus der Gruppe BT (Bismaleinimid-Triazinharz mit Quarzglas), CE (Cyanatester mit Quarzglas), CEM1 (Hartpapierkern mit FR4-Außenlagen), CEM3 (Glasvlieskern mit FR4-Außenlagen), FR2 (Phenolharzpapier), FR3 (Hartpapier), FR4 (Epoxid-Glashartgewebe), FR5 (Epoxid-Glashartgewebe mit vernetztem Harzsystem), PD (Polyimidharz mit Aramidverstärkung), PTFE (Polytetrafluoräthylen mit Glas oder Keramik), CHn (Hochvernetzte Kohlenwasserstoffe mit Keramik) und Glas.
Diese Trägerplatten haben eine gewisse Anzahl von Leiterbahnen aus einem unedlen Metallkern (z.B. Kupfer und Nickel, vergleiche Figur 1 ) mit einer Goldoberfläche, die z.B. mit einer Lötstopplackschicht als Passivierung überzogen werden können. An einem Ende der Leiterbahnen befinden sich Kontakte zur elektrischen Messapparatur, auf der anderen Seite können mit Hilfe der Laser- Ablation freie Goldstellen für die spätere Funktionalisierung in den Lack ge- brannt werden. Die gerade beschriebenen Leiterbahn-Substrate eignen sich sowohl für elektrochemische Messmethoden als auch für die Fluoreszenz-Spektroskopie.
Aufbringen einer Schutzschicht auf das Substrat
Nach bevorzugten Ausgestaltungen wird eine Schutzschicht (im Rahmen dieser Anmeldung auch Passivierungsschicht genannt) auf das Substrat aufgebracht. Diese Schutzschicht kann den kritischen Zeitraum zwischen der Pro- duktion der Substrate und ihrer Weiterverarbeitung überbrücken, da die Schutzschicht das Adsorbieren von Verunreinigungen verhindert.
Erfindungsgemäß kann hierfür jedes beliebige Material verwendet werden, das an einer Oberfläche eine geschlossene Schicht bildet, somit die Substratober- fläche von der Umgebung trennt und zu einem späteren Zeitpunkt z.B. durch Laser-Ablation an gewünschten Stellen entweder in seiner gesamten Dicke rückstandsfrei entfernt oder aber auf Bruchteile der ursprünglichen Dicke reduziert werden kann. Hierbei ist es möglich für ein gewünschtes Substrat eine ideale Schutzschicht auszuwählen, die in Bezug auf die Haftung zwischen Substrat und Schutzschicht optimiert ist. Ebenfalls lässt sich der Schutzfilm hinsichtlich der zu verwendenden Flüssigkeiten optimieren.
Neben üblichen bekannten Lacken aus der Lithographie (positive und negative Photolacke) und der Leiterplatten-Technologie (Lötstopplacke) eignen sich auch organische Polymere wie Cellulose, Dextran oder Collagen. Auch ist es denkbar, Lacke zu kreieren, deren spezielle Bestandteile beim Trocknen des Materials an der Oberfläche vorteilhafte Funktionalisierungen für besondere Anwendungen ausbilden. Die Schutzschicht kann z.B. durch Sprühen im Falle der Photolacke, durch Spincoating oder Physisorption im Falle der organi- sehen Polymere oder durch Siebdruck bzw. Vorhanggießen im Falle der Lötstopplacke auf das Substrat aufgebracht werden. In einer bevorzugten Art der Erfindung werden auf die Substrate Schutzschichten aus von der Leiterplattentechnologie bekannten Lötstopplacken aufgebracht. Es eignen sich 2-Komponenten oder 1 -Komponenten Lötstopplacke, . die über Vorhanggießverfahren, Siebdruck oder Sprayverfahren aufgebracht werden und anschließend an der Luft oder durch UV-Bestrahlung aushärten können. Alternativ eignet sich auch ein Folien-Laminierverfahren, bei dem Kunststofffolien auf das Substrat gelegt werden und durch Erhöhung der Temperatur mit dem Substrat verschmelzen.
Ein Vorteil beim Vorhanggießverfahren und dem Folien-Laminierverfahren besteht darin, dass die Dicke der Schutzschicht durch die Geschwindigkeit der Substrate unter dem Lackvorhang bzw. durch die Dicke der Folie beliebig in einem großen Bereich eingestellt werden kann. Ein weiterer Aspekt dieser Verfahren ist, dass die Oberflächenmorphologie des Substrats beim Beschichten in etwa erhalten bleibt (vergleiche Figur 2 und 5) und folglich die Schutzschicht an jeder Stelle des Substrats eine vergleichbare, über z.B. die Geschwindigkeit unter dem Lackvorhang bestimmte Dicke hat. Wie am Bild des Querschnitts der Leiterplatten (Figur 5) zu erkennen, kommt es an den Kanten der Leiterbahnen zum Verlaufen des Lacks und dadurch zu einer erhöhten Schichtdicke zwischen den Bahnen. Im Falle der Laminierung kommt es zu keinem Verlaufen der Schicht und die Morphologie ist genau erhalten.
Laser-Ablation der Schutzschicht in beliebiger Geometrie
Unter dem Begriff "Laser-Ablation" versteht man nicht nur das partielle oder vollständige Entfernen von organischen oder anorganischen Schutzschichten, sondern auch das Entfernen von Verunreinigungen auf einem Substrat durch Einstrahlung von Laserlicht. Erfindungsgemäß wird die Laser-Ablation zur Entfernung oder Strukturierung der aufgebrachten Schutzschicht an gewünschten Stellen des Substrats in beliebiger Geometrie verwendet. Somit ist es möglich, verschiedene, genau definierte freie Substratflächen, Vertiefungen oder Einsenkungen in der Schutzschicht in variabler Größe und Tiefe auf ein und dem- selben Substrat-Design nur durch Veränderung der Laser-Belichtung zu realisieren.
Durch die Laser-Ablation mit Licht einer gewissen Intensität und Bestrahlzeit wird eine durch die Eindringtiefe der Strahlung bestimmte Dicke der Schutzschicht entfernt. Wird also ein Bereich des Substrats mit der gleichen Anzahl an Pulsen einer gewissen Intensität bestrahlt, so bleibt die durch das Substrat und die Schutzschicht vorgegebene Morphologie bei der Reduktion der Schichtdicke erhalten (vergleiche Figur 2 und 3).
Ein weiterer Gesichtspunkt der Laser-Ablation ist das Aufschmelzen der Substratoberfläche bei vollständigem Entfernen der Schutzschicht, das durch Einstellung der Laserintensität oder der Bestrahlzeit auf die Gegebenheiten des Substrats und der Schutzschicht erreicht werden kann. Dieses kurzfristige, oberflächennahe Aufschmelzen des Substrats schließt, neben der Reduktion der Oberflächenrauigkeit, auch vorhandene Poren im Material und trägt somit zur Homogenität der freien Substratflächen bei (siehe Figur 4). Durch das Aufschmelzen werden außerdem wenige Goldschichten von der Oberfläche abla- tiert, und somit das Substrat von Oberflächenverunreinigungen befreit.
Für die vorliegende Erfindung kann die Laser-Ablation durch direkte Einstrahlung von Licht oder durch Einstrahlen des Lichts über eine Optik bzw. eine Maske erfolgen. Die Größe oder die Form der einzelnen freizulegenden oder strukturierten Substratstellen und ihr lateraler Abstand sind hierbei beliebig und nur von der jeweiligen Anwendung abhängig. Die Wellenlänge des verwendeten Laserlichts, sowie Einstrahldauer bzw. Anzahl und Dauer der Pulse hängen von der Kombination aus Schutzschicht und Substratmaterial ab und können für jedes Paar optimiert werden.
In einer bevorzugten Art der Erfindung werden mit einem Excimer-Laser über mehrere Masken in mehreren Prozessschritten Strukturen aus Einsenkungen, freien Substratstellen und gegebenenfalls Vertiefungen zwischen den Teststel- len in einen Lötstopplack geschrieben, die das Befüllen mit Flüssigkeiten zum Zwecke der Funktionalisierung der freigelegten Stellen mit Liganden bzw. der Zugabe von Analytflϋssigkeiten ermöglichen.
In Lötstopplackschichten von typischerweise 10 - 400 μm Dicke werden mit einer bestimmten Anzahl an Laser-Pulsen verschiedene Bereiche mit um 5 - 390 μm reduzierter Schichtdicke (Einsenkungen) geschnitten und dann innerhalb dieser Bereiche die eigentliche Sensorfläche (aktive Bereiche des Sensors aus z.B. Gold bei Platinen-Elektrodenarrays) an ein oder mehreren Stel- len mit Durchmessern von etwa d = 10 - 100 μm durch weitere Laser-Pulse > freigelegt, um die Teststellen zu bilden.
Zwei nicht einschränkende Beispiele für eine Struktur aus Vertiefungen mit freigelegten Substratstellen sind in den schematischen Figuren 2 und 3 darge- stellt, die ein strukturiertes Leiterplattensubstrat (vgl. auch Figur 1 ) bzw. ein Substrat mit homogener leitfähiger Oberfläche und je eine erfindungsgemäße Prozessführung zur Herstellung zeigen. In Figur 2 und 3 ist exemplarisch je nur eine Zeile an Teststellen gezeigt, die ein Teil einer Teststellen-Matrix mit n Zeilen und m Spalten sein kann.
Funktionalisierung der aktiven Flächen mit Biomolekülen
Erfindungsgemäß lassen sich die Teststellen als aktive Bereiche des Sensors (also die eigentlichen Sensorflächen mit freigelegtem Substrat innerhalb der Einsenkungen) mit Biomolekülen funktionalisieren, die als Sonden für in der Testsubstanz vorhandene Targets fungieren. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung eignen sich alle Arten von Ligaten, um Analytflüssigkeiten auf das Vorhandensein ihrer spezifischen Liganden zu untersuchen. Als Ligaten werden Moleküle bezeichnet, die spezifisch mit einem Liganden unter Ausbildung eines Komplexes wechselwirken. Beispiele von Ligaten im Sinne der vorliegenden Schrift sind Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme als Komplexbindungspartner eines Proteins (Enzyms), Antikörper (als Komplexbindungspart- ner eines Antigens), Antigene (als Komplexbindungspartner eines Antikörpers), Rezeptoren (als Komplexbindungspartner eines Hormons), Hormone (als Komplexbindungspartner eines Rezeptors), Nukleinsäure-Oligomere (als Komplexbindungspartner des komplementären Nukleinsäure-Oligomers) oder Metallkomplexe.
Für die Kopplung der Biomoleküle mit der Sensoroberfläche steht aus dem Stand der Technik eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Verfügung. Beispiele hierfür sind: (i) Thiol- (HS-) oder Disulfid- (S-S-) Gruppen, die an Oberfläche aus Au, Ag, Cd, Hg, Cu und GaAs koppeln, (ii) Amine, die sich durch Chemi- oder Physisorption an Platin-, Silizium- oder Kohlenstoff-Oberflächen anlagern, (iii) Silane, die mit oxidischen Oberflächen eine kovalente Bindung eingehen und (iv) Epoxy-Zement, der an alle leitfähigen Oberflächen bindet (Heller et. al., Sensors and Actuators, 1993, 180, 13-14; Pishko et al., Anal. Chem., 1991 , 63, 2268; Gregg and Heller, J. Phys. Chem., 1991 , 95, 5970-5975).
In einer bevorzugten Art der Erfindung werden die freien Substratstellen mit modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren in wässriger Lösung benetzt. Das Nuk- leinsäure-Oligomer, das auf die freie Oberfläche aufgebracht werden soll, ist über einen kovalent angebundenen Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge mit einer oder mehreren reaktiven Gruppen modifiziert, wobei sich diese reaktiven Gruppen bevorzugt in der Nähe eines Endes des Nukleinsäure-Oligomers befinden. Bei den reaktiven Gruppen handelt es sich bevorzugt um Gruppen, die direkt mit der unmodifizierten Oberfläche reagieren können. Beispiele hierfür sind: (i) Thiol- (HS-) oder Disulfid- (S-S-) derivatisierte Nukleinsäure-Oligomere der allgemeinen Formel (n x HS-Spacer)-oligo, (n x R-S- S-Spacer)-oligo oder oligo-Spacer-S-S-Spacer-oligo, die mit einer Goldoberfläche unter Ausbildung von Gold-Schwefelbindungen reagieren, (ii) Nukleinsäure-Oligomere mit Aminen, die sich durch Chemi- oder Physisorption an PIa- tin- oder Silizium-Oberflächen anlagern und (iii) Nukleinsäure-Oligomere mit Silanen, die mit oxidischen Oberflächen eine kovalente Bindung eingehen. Bei diesen Arten der Anbindung von Nukleinsäure-Oligomeren werden in der Re- gel Belegungen mit Sonden-DNA realisiert, die kleiner als die dichteste Packung sind, so dass für eine spätere Hybridisierung mit den Targets ausreichend Platz auf der Oberfläche zur Verfügung steht.
An der anderen Seite des Sonden-Nukleinsäure-Oligomers kann das Molekül bei Bedarf über einen weiteren Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge zusätzlich mit einem elektrochemischen Label (z.B. Ferrocen- Derivate oder Osmium-Komplexe) oder einem Fluorophor (z.B. Fluorescein) modifiziert werden, so dass die Funktionalisierung der freien Substratstellen und/oder die spätere Hybridisierung mit Hilfe elektrochemischer oder spektroskopischer Methoden untersucht werden soll.
Auch ohne die Modifikation der Sonden-Oligonukleotide mit einem Label können entsprechende Methoden zur Untersuchung der Hybridisierungsereignisse verwendet werden, wenn alternativ die Target-Moleküle mit einem Label versehen sind bzw. nach der Hybridisierung die vorhandenen freien Bindungsplätze mit gelabelten Signal-Oligomeren abgeprüft werden (sog. Rücktitration).
Eine spezielle elektrochemische Detektionsvariante stellt ein Verdrängungsas- say dar, bei dem an den ungelabelten Sonden-Oligomeren gebundene, kurz- kettige Signal-Oligomere mit Redox-Label von ungelabelten Target- Oligomeren der Komplementärsequenz verdrängt werden.
Für die Funktionalisierung der freigelegten Teststellen innerhalb einer Einsen- kung eignen sich vor allem zwei Techniken. Beim Spotting-Verfahren werden nur kleine Volumina benötigt und jede Teststelle des Substrats kann mit verschiedenen Molekülen funktionalisiert werden. Alternativ können alle freigelegten Teststellen, die jeweils in einer der Einsenkungen liegen, über das Befüllen mit einer die Sonden-Moleküle enthaltenen Flüssigkeit funktionalisiert werden. Ausführung der spezifischen Bindungsreaktionen
Mit Hilfe der funktionalisierten Substrate lassen sich Flüssigkeiten auf das Vorhandensein von Analyten untersuchen, die spezifisch an die Sonden des Sen- sors binden. Hierfür stehen mehrere Möglichkeiten zur Verfügung.
In einem Fall werden nur die funktionalisierten Spots gezielt mit kleinen Volumina der Testflüssigkeit durch Verwendung eines Spotters benetzt. Nach einer gewissen Inkubationszeit kann das Substrat gespült werden und der Sensor wird auf mögliche Bindungsereignisse ausgelesen.
Alternativ kann die gesamte Einsenkung des Substrats, das die freigelegten Teststellen enthält mit der Testflüssigkeit in gewünschter Höhe befüllt werden. Auch hier kann das Substrat nach einer gewissen Inkubationszeit gespült wer- den und der Sensor wird auf mögliche Bindungsereignisse ausgelesen. Bei diesem Verfahren benötigt man zwar ein größeres Volumen der Testflüssigkeit, jedoch kann auf den Spotter verzichtet werden.
In einer bevorzugten Variante zur Ausführung der spezifischen Bindungsreak- tionen wird die die Teststellen enthaltene Einsenkung z.B. bis zur Lackoberkante (vergleiche Figur 2f bzw. 3g) mit Analyflüssigkeit befüllt, so dass ein nur durch die Geometrie der strukturierten Lackschicht bestimmtes Volumen (V0) injiziert wird. Anschließend wird das Verdunsten z.B. durch einen Inertgasstrom oder durch Erhöhung der Temperatur (mit T < Tm) kontrolliert forciert, um die Konzentration der Analyten in der Testflüssigkeit zu erhöhen (Figur 2g bzw. 3h).
Die Fließverbindung zwischen den räumlich getrennten Benetzungsstellen wird automatisch unterbrochen, wenn der Flüssigkeitsfilm über den Lackerhö- hungen der Benetzungsstellen reißt (vgl. Figur 2h und 3i). Somit ergibt sich ein durch die Höhe der Wälle (hw) an den Sensoroberflächen und dem Durchmesser der Lackaussparungen (ds) genau definiertes Endvolumen pro räumlich getrennter Teststelle (Vs) mit gegenüber den Anfangswerten deutlich erhöhten Konzentration cE der Analyten (cE/co = V0Λ/E) und nur einem kleinen, durch das Verhältnis Sensorfläche zu gesamter Benetzungsfläche (As/AB) gegebenen Bruchteil der vorhandenen Analyt-Moleküle. Durch das gegenüber dem An- fangsvolumen (V0) deutlich reduziertem Endvolumen (VE) führt weiteres Eintrocknen der Flüssigkeit in den n räumlich getrennten Benetzungsstellen mit nur einem kleinen Bruchteil aller Analyt-Moleküle (Ns = No/n * AS/AB) nur noch in geringem Maße zu Veränderungen der Anzahl an Bindungsereignissen und es kann ein sehr genauer Endwert der Bindungseffizienz erreicht werden.
Ist der Endzustand des obigen Verdunstungsprozesses erreicht, so kann das Substrat bei Bedarf sofort gespült werden, da die spezifischen Bindungsereignisse bereits während der Reduktion des Lösungsmittels stattgefunden haben.
Nach dem Spülen kann das Substrat für die Visualisierung der spezifischen Bindungsereignisse wieder je nach Modifikation der Ligaten z.B. über elektrochemische oder fluoreszenzspektroskopische Techniken ausgelesen werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Nachfolgend soll die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Dabei sind nur die für das Verständnis der Erfindung wesentlichen Elemente dargestellt. Es zeigt
Fig. 1 schematische Darstellungen eines auf Leiterplatten-Technologie basierenden Sensor-Substrats nach einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. Dabei zeigen die Ausschnitte in a) eine Aufsicht auf ein Leiterbahnen-Substrat mit 3 Zuleitungen für Arbeitselektroden und einer Gegenelektrode, b) einen Querschnitt durch ein Substrat mit 3 Zuleitungen, und c) ein Substrat mit Lackschichten zweier Dicken (dunkelgrau: ursprüngliche Dicke, hellgrau: Einsenkung) und freigelegten Teststellen (weiß) auf den Arbeitselektroden;
Fig. 2 in a) bis h) schematische Darstellungen zur Illustration des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens eines Substrats mit einem Einsen- kungsbereich und mit auf die Leiterbahnen des Substrats ausgerichteten freigelegten Spots (Teststellen) zur Funktionalisierung mit Ligat- Molekülen. Die Konzentration der Targets wird während der spezifischen Reaktion der Bindungspartner durch Verdunsten des Lösungsmittels erhöht;
Fig. 3 in a) bis i) schematische Darstellung zur Illustration des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens eines Substrats mit einem Einsen- kungsbereich, Vertiefungen und bis zur leitfähigen, homogenen Oberfläche reichenden Spots (Teststellen) zur Funktionalisierung mit Ligat- Molekülen;
Fig. 4 in a) und b) SEM-Aufnahmen von durch Laser-Ablation freigelegten
Oberflächenbereichen einer Stopplack-Schutzschicht mit quadratischem bzw. rundem Profil, in c) ein AFM-BiId einer gelaserten und aufgeschmolzenen Gold- Oberfläche und in d) ein Querschnitts-Höhenprofil entlang der Linie A-A aus a); Fig. 5 SEM-Aufnahmen eines Schnitts durch die Leiterplattensubstrate mit einer dünnen Lackschicht, wobei a) einen Ausschnitt mit 3 Leiterbahnen und b) ein Detailbild einer Leiterbahn mit freigelegtem Bereich in der Lackschicht zeigt;
Fig. 6 eine Visualisierung der Funktionalisierung der Teststellen mit Fluoreszenz-markierten Oligomeren. a) zeigt einen Ausschnitt von 4 Teststellen, b) die Verteilung der Fluoreszenzintensität über 48 Teststellen; und
Fig. 7 in a) ein schematisches Bild eines Hybridisierungs-Experiments mit 2
Redox-Labeln, und in b) und c) ACV-Kurven (Uac = 10 mV, f = 5 Hz) eines typischen Experiments auf einer Arbeitselektrode mit d = 10 μm vor und nach der Hybridisierung. Der linke Peak bei etwa U = 220 mV zeigt das Osmium der Sonde, der rechte Peak bei etwa U = 360 mV zeigt das Ferrocen des Targets. Die Potentiale sind gegen eine Ag/AgCI Referenz-Elektrode angegeben. Figur 7b) zeigt ein Experiment mit konstanter Analytkonzentration, während Figur 7c) das analoge Experiment mit Eintrocknen des Lösungsmittels zeigt.
Wege zur Ausführung der Erfindung
Eine exemplarische Prozessführung zur Herstellung eines Substrats mit Bereichen reduzierter Dicke (Einsenkungen) und freigelegten Spots (Teststellen) mit angrenzenden Mikrowellen gliedert sich in folgende Stufen: i) Bereitstellen der Trägerplatte und gegebenenfalls Aufbringen eines Leiterbildes, ii) Aufbringen einer Schutzschicht, iii) Strukturierung der Schutzschicht durch Laser-Ablation zur Herstellung der Einsenkungen und gegebenenfalls der Vertiefungsgebiete, und iv) Laser-Ablation zur Herstellung von freigelegten Substratstellen (Teststellen) innerhalb der Einsenkungen. In den Bereichen, an denen die Substratoberfläche durch die Laser-Ablation freigelegt wurde, lässt sich eine Funktionalisierung mit Ligat-Molekülen durchführen und das Substrat kann als Sensor für in einer oder mehreren Flüssigkeiten vorhandene Ligand-Moleküle benutzt werden. Abschließend wird das Substrat hinsichtlich möglicher Bindungsereignisse ausgelesen.
In den folgenden Beispielen ist die gesamte Substratoberfläche oder aber die Oberfläche der Leiterbahnen aus Gold und als Schutzschicht wird ein Film aus Lötstopplack verwendet.
In den Beispielen werden die durch Laser-Ablation freigelegten Goldstellen des Substrats exemplarisch mit doppelt modifizierten Nukleinsäure- Oligomeren beschichtet, die an dem einen Ende eine Thiol-Gruppe zur Bindung an die Goldoberfläche und an dem anderen Ende ein Fluorophor (z. B. Fluoresceinisothiocyanat) oder ein Redox-Label (z.B. ein Osmium-Komplex) besitzen. Die Belegung der Substrate mit den Nukleinsäure-Oligomeren kann mittels Fluoreszenzspektroskopie oder elektrochemischer Methoden visuali- siert werden.
Die funktionalisierten Substratstellen werden mit einer Analytflüssigkeit (z.B. einer Lösung, die potentiell komplementäre Nukleinsäure-Oligomere enthält) in Kontakt gebracht und der Sensor anschließend auf mögliche Bindungsreaktionen mit Hilfe eines Fluoreszenz-Scanners oder einer elektrochemischen Technik ausgelesen.
Im Falle von auf einer leitfähigen Goldoberfläche immobilisierten Oligonukleo- tiden mit Fluoreszenz-Farbstoff kann man die Hybridisierungsereignisse über eine veränderte Fluoreszenzintensität detektieren. Bei hohem Salzgehalt der Flüssigkeit liegt das oberflächengebundene, einzelsträngige Oligonukleotid in einer eher komprimierten Konformation vor, die sich durch einen kleinen Abstand des Fluorophores von der leitfähigen Oberfläche auszeichnet und somit durch Fluoreszenzlöschen zu einer niedrigen Fluoreszenzintensität führt. Durch die Hybridisierung der gebundenen Oligonukleotide mit einem komplementären Oligomer-Strang vergrößert sich der Abstand zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Oberfläche, so dass durch die Hybridisierung eine höhere Fluoreszenzintensität zu beobach- ten ist.
Im Falle von immobilisierten Oligonukleotiden mit einem elektrochemischen Label (z.B. ein Osmium-Komplex), die mit komplementären Oligomeren hybridisieren, die ebenfalls mit einem Redox-Label modifiziert sind, gibt es eine Vielzahl elektrochemischer Messmethoden zum Auslesen des Sensors. Eine bevorzugte Messmethode zur Analyse der Belegung und der Hybridisierungs- Effizienz ist die AC (alternating current) Voltammetrie. Aus dem ACV-Strom am Redox-Potential des Labels lässt sich nach O'Connor et al. (J. Electroanal. Chem., 466, 1999, 197-202) die Anzahl der beteiligten Label berechnen und die Experimente sind somit quantitativ auswertbar.
Auch ohne die Modifikation der Sonden- und Target-Oligonukleotide mit einem Redox-Label können elektrochemische Methoden zur Untersuchung der Hybridisierungsereignisse verwendet werden. Diese elektrochemische Detek- tionsvariante stellt ein Verdrängungsassay dar, bei dem an die ungelabelten Sonden-Oligomere gebundene, kurzkettige Signal-Oligomere mit Redox-Label von ungelabelten Target-Oligomeren der Komplementärsequenz verdrängt werden und sich so die Kommunikation zwischen Redox-Label und Elektrode ändert.
Die in den folgenden Beispielen geschilderten Verfahren sind für den Fachmann ohne weiteres auf die Beschichtung anderer strukturierter Substrate mit anderen Materialien und verschiedenen Ligat / Ligand-Bindungsereignissen übertragbar. Beispiel 1 : Substrate mit homogener leitfähiger Oberfläche
Schritt 1 : Herstellung der Substrate mit strukturierter Lötstopplackschicht.
Mit Bezug auf Figur 3 wird ein Glasgrundkörper mit einer aufgedampften, 5 nm dicken CrNi-Kontaktschicht und einer darauf aufgedampften Goldschicht mit einer Dicke von etwa 200 nm beschichtet, um eine Trägerplatte 12 für das Substrat zu bilden (Figur 3a). Anschließend wird die Trägerplatte 12 mit einer 350 μm dicke Passivierungsschicht 22 aus strukturierbarem, optisch aushärt- baren Lack (2-Komponenten Lötstopplack, Elpemer GL 2467 SM-DG, Fa. Peters) überzogen, der in einem aus der Leiterplatten-Technologie bekanntem Vorhanggieß- Verfahren auf die Trägerplatte 12 aufgebracht wird, Figur 3b.
Nach dem Trocknen des Lackes wird die Schutzschicht 22 mit einem Excimer- Laser der Firma Lambda-Physics strukturiert. Der Laser kann über verschiedene Masken verkleinert auf dem Substrat abgebildet werden, wobei die Flächenintensität der Bestrahlung über die Abbildungsvorrichtung eingestellt wird. Je nach Maske lassen sich so verschiedene Geometrien der ablatierten Regionen realisieren (siehe Figur 4a und 4b).
In die Schutzschicht 22 wird durch hochenergetische Pulse des Excimer- Lasers zunächst eine Einsenkung 23A mit reduzierter Schutzschichtdicke in den Lack geschrieben, Figur 3c. Um die Dicke der Schutzschicht 22 in ausgewählten Bereichen z.B. um 300 μm zu reduzieren, benötigt man etwa 2200 Pulse ä 20 ns des Lasers mit einer Flächenleistung von 600 - 1200 mJ/cm2.
In einem zweiten Strukturierungsschritt wird dann der Lack an ausgewählten Stellen 23B innerhalb der Einsenkung 23A über eine zweite Maske durch zusätzliche Laser-Belichtung weiter auf 10 μm verdünnt, Figur 3d. Dadurch wer- den Vertiefungsgebiete 23B geschaffen, die zusammen mit den anschließend eingebrachten Aussparungen 24 die erfindungsgemäßen Mikrowälle bilden. Innerhalb der entstandenen Plateaus werden schließlich in einem dritten Strukturierungsschritt die Aussparungen 24 für die eigentlichen Teststellen erzeugt und so das Substrat für die Funktionalisierung freigelegt und aufgeschmolzen, Figur 3e. Diese freigelegten Stellen haben typischerweise Durchmesser von etwa 10 - 100 μm und dienen der späteren Aufnahme der Ligaten 26. Das Aufschmelzen der Oberfläche führt zum Verschluss von Oberflächenporen der Goldschicht, zu einer Reduktion der Oberflächenrauigkeit und zum Entfernen von Oberflächenverunreinigungen.
Schritt 2: Funktionalisierung der freigelegten Teststellen des Substrats mit FIu- oreszenz-markierten Nukleinsäure-Oligomeren 26
Alternative 1 : Spotting-Verfahren.
Die im Schritt 1 beschriebenen freigelegten Teststellen werden z.B. über ein
Spotting-Verfahren mit den Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert.
Die Synthese der Oligonukleotide erfolgt in einem automatischen Oligonukleo- tid-Synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA/RNA-Synthesizer) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Syntheseprotokolle für eine 1.0 μmol Synthese. Bei den Synthesen mit dem 1-O-Dimethoxytrityl-propyl-disulfid-CPG-Träger (Glen Research 20-2933) werden die Oxidationsschritte mit einer 0.02 M lod- lösung durchgeführt, um eine oxidative Spaltung der Disulfidbrücke zu vermeiden. Modifikationen an der 5'-Position der Oligonukleotide erfolgen mit einem auf 5 min verlängerten Kopplungsschritt. Der Amino-Modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) wird in die Sequenzen mit den jeweiligen Standardprotokollen eingebaut. Die Kopplungseffizienzen werden während der Synthese online über die DMT-Kationen-Konzentration photometrisch bzw. konduktometrisch bestimmt.
Die Oligonukleotide werden mit konzentriertem Ammoniak (30%) bei 37 0C 16 h entschützt. Die Reinigung der Oligonukleotide erfolgt mittels RP-HPL Chromatographie nach Standardprotokollen (Laufmittel: 0,1 M Triethylammoniuma- cetat-Puffer, Acetonitril), die Charakterisierung mittels MALDI-TOF MS. Die aminmodifizierten Oligonukleotide werden an die entsprechenden aktivierten Fluorophore (z. B. Fluoresceinisothiocyanat) entsprechend der dem Fachmann bekannten Bedingungen gekoppelt. Die Kopplung kann sowohl vor als auch nach der Anbindung der Oligonukleotide an die Oberfläche erfolgen.
Die Substrate aus dem Schritt 1 werden mit doppelt modifiziertem 20 bp Ein- zelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation eins: die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CHk)TS)2 zum P- O-(CH2)2-S-S-(CH2)rOH verestert ist, Modifikation zwei: an das 5' Ende ist der Flourescein-Modifier Fluorescein-Phosphoramidite (Proglio Biochemie GmbH) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) als 5x10'5 molare Lösung in Puffer (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7 mit 0.05 vol% SDS) mit Zusatz von ca. 10'5 bis 10"1 molarem Propanthiol (oder anderen Thiolen oder Di- sulfiden geeigneter Kettenlänge) mit Hilfe eines Spotters (Carthesian) aufge- bracht und für 2 min - 24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)rS-S-(CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 :1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy-mercaptoethanols kommt. Das in der Inku- bationslösung gleichzeitig anwesende, freie Propanthiol wird ebenfalls durch Ausbildung einer Au-S Bindung koadsorbiert . Statt des Einzelstrang- Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.
Für die Belegung mit dem Spotter der Firma Cartesian Technologies (Micro- Sys PA) werden Split-Pin Nadeln (Arraylt Chipmarker Pins der Firma TeIe- Chem) verwendet, die ein Ladevolumen von 0.2 bis 0.6 μL haben und Volumina von etwa 1 nL pro Benetzungsvorgang abgeben. Die Kontaktfläche dieser Nadeln hat einen Durchmesser von etwa 130 μm und ist damit deutlich größer als die bei der Laser-Ablation freigelegten Bereiche des Substrats. Die Positionierung der Nadel über dem Substrat erfolgt mit einer Genauigkeit von 10 μm bei einer Luftfeuchtigkeit von etwa 70-80 %. Der Tropfen wird beim Kontakt der Spitze mit der Schutzschicht abgegeben und es kommt zu keiner direkten Berührung mit dem Substrat („Pseudo-Kontakt-Drucken"). Mit Hilfe eines Fluoreszenz-Scanners der Firma Lavision Biotech kann die Belegung der freien Substratstellen mit fluoreszenz-modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren visuali- siert werden (Figur 6).
Alternative 2: Befüllen der Einsenkung
Ein Substrat wird wie in Schritt 1 beschrieben hergestellt. Anschließend wird der Bereich der Einsenkung 23A mit einer Lösung der oben beschriebenen Nukleinsäure-Oligomeren gefüllt, das Substrat nach einer Inkubationszeit von 2 min - 24 h gespült und die Funktionalisierung der freien Stellen mit Nukleinsäure-Oligomeren 26 mit Hilfe eines Fluoreszenz-Scanners der Firma Lavision Biotech visualisiert.
Beispiel 2: Leiterplatten-Substrate.
Schritt 1 : Herstellung der Leiterplatten-Substrate mit strukturierter Löt- stopplackschicht.
Auf einer Trägerplatte aus Epoxid-Glashartgewebe FR4 wird ein Leiterbild aus im Ausführungsbeispiel fünfzig parallelen Leiterbahnen aufgebracht. Figur 1a zeigt nur einen Ausschnitt dieses Leiterbahnenbildes. Der Ausschnitt zeigt 3 der 48 Arbeitselektroden (2OA bis 20C) und einen Teil der Gegenelektrode 28.
Figur 1 b zeigt einen Schnitt durch ein Leiterbahnensubstrat mit 3 gleichen Leiterbahnen. Jede der Leiterbahnen 20 besteht aus einem Kupferkern 14, der durchgehend von einer Nickel-Sperrschicht 16 und einer Goldschicht 18 überzogen ist. Im Ausführungsbeispiel hat der Kupferkern eine Dicke von etwa 28 μm. Er stellt einen preiswerten und gut leitfähigen Grundbestandteil der Leiter- bahnen dar. Um hochgenaue Messungen bei der elektrochemischen Detektion im wässrigen Medium zu ermöglichen, ist der unedle Kupferkern mit einer 6 μm dicken, durchgehenden Nickelschicht als Diffusionssperre überzogen. Auf dieser Nickel-Schicht wird als Oberfläche eine 2 μm dicke Goldschicht aufgebracht.
Die Leiterbahnen des Ausführungsbeispiels sind etwa 150 μm breit und mit einem Abstand von etwa 200 μm (Mitte-Mitte) auf der Trägerplatte angeordnet. Die Arbeitselektroden, die Gegenelektrode und eine gegebenenfalls ebenfalls vorgesehene Referenzelektrode sind zur Kontaktierung jeweils mit nicht dargestellten Anschlusskontaktflächen des elektrischen Substrats verbunden.
Mit Bezug auf Figur 2 wird das gesamte Leiterbild wie in Beispiel 1 mit einer 350 μm dicken Schutzschicht 22 aus strukturierbarem, optisch aushärtbaren Lack (2-Komponenten Lötstopplack, Elpemer GL 2467 SM-DG, Fa. Peters) überzogen, der in einem aus der Leiterplatten-Technologie bekanntem Vorhanggieß-Verfahren auf die Substrate aufgebracht wurde.
Nach dem Trocknen wird in die Schutzschicht 22 durch hochenergetische Pulse des Excimer-Lasers ein Bereich reduzierter Dicke 23 in den Lack geschrieben. Um die Dicke der Schutzschicht 22 in ausgewählten Bereichen z.B. um 340 μm zu reduzieren, benötigt man etwa 2500 Pulse ä 20 ns des Lasers mit einer Flächenleistung von 600 - 1200 mJ/cm2.
In einem zweiten Strukturierungsschritt wird dann über eine zweite Maske an ausgewählten Stellen 24 (24A-C, Figur 1c) innerhalb des Bereichs des ersten Strukturierungsschrittes der restliche Lack durch zusätzliche Laser-Belichtung entfernt und so die Oberfläche der Leiterbahnen 20A-20C freigelegt und lokal aufgeschmolzen. Diese freigelegten Stellen haben typischerweise Durchmesser von etwa 10 - 100 μm. Das Aufschmelzen der Oberfläche führt zum Verschluss von Oberflächenporen der Goldschicht, zu einer Reduktion der O- berflächenrauigkeit und zum Entfernen von Oberflächenverunreinigungen. In den folgenden Ausführungsbeispielen haben die Leiterbahnen kreisrunde Ausnehmungen mit Durchmessern von 10 μm (Figur 1c). Schritt 2: Funktionalisierung der freigelegten Stellen des Substrats mit Redox- markierten Nukleinsäure-Oligomeren.
Die Funktionalisierung in diesem Anwendungsbeispiel kann analog den beiden Alternativen aus dem Beispiel 1 , also über ein Spotting-Verfahren oder das Befüllen der Einsenkung 23 erfolgen. Die Synthese der Nukleinsäure- Oligomere wird ebenfalls analog zum Beispiel 1 durchgeführt, wobei aber das Fluoreszenz-Label durch ein Redox-Label ersetzt wird. In diesem Beispiel werden die Nukleinsäure-Oligomere an dem amino-modifizierten 51 Ende mit dem Osmium-Komplex [Os(bipy)2 Cl imidazolacrylsäure] nach dem jeweiligen Standardprotokoll modifiziert.
Schritt 3: Analyse einer Probenflüssigkeit mit Nukleinsäure-Oligomeren.
Alternative 1 : Befüllen der Einsenkungen
Figur 7 zeigt exemplarisch die ACV-Messung (Uac = 10 mV, f = 5 Hz) einer mit Osmium-modifizierten Oligomeren funktionalisierten Arbeitselektrode (Symbole ■ in Figur 7 b und c).
Nach der Funktionalisierung können die Arbeitselektroden bei Bedarf noch vor der Hybridisierung mit den komplementären, Ferrocen-modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren in einem Nachbelegungsschritt für 30 Minuten mit einer 1 mM Lösung Propanthiol in Kontakt gebracht werden. Hierbei werden die Räu- me zwischen den Nukleinsäure-Oligomeren hydrophobisiert und verschieben das Redox-Potential des Ferrocens zu positiveren Werten, um eine bessere Separation vom Osmium-Potential zu erreichen.
Die komplementären Nukleinsäure-Oligomere für die Hybridisierung (Targets) werden analog dem Beispiel 1 , aber ohne die Thiol-Modifikation am 3' Ende synthetisiert. Für die Modifikation mit dem Redox-Label Ferrocen werden die amino-modifizierten Nukleinsäure-Oligomere am 5' Ende mit Ferrocenessig- säure (FcAc) nach dem jeweiligen Standardprotokoll gekoppelt.
Die Ferrocen-modifizierten Nukleinsäure-Oligomere werden der Target-Lösung mit einer Konzentration von 1 μM in 500 mM Phosphat-Puffer (pH 7, mit 1 M NaCI und 0.05 vol% SDS) zugegeben und die Einsenkung des Sensors bis zu einer gewünschten Höhe mit dieser Target-Lösung befüllt. Nach einer gewissen Inkubationszeit unter hybridisierenden Bedingungen bei kontrollierter Luftfeuchtigkeit (70 - 80 %), die das Eintrocknen der Flüssigkeit verhindert, wird das Substrat gespült und erneut eine elektrochemische ACV-Messung (Uac = 10 mV, f = 5 Hz) durchgeführt (Symbole D in Figur 7b). Die Messdaten zeigen einen zweiten Redox-Peak und das Verhältnis der Peak-Ströme des Osmium- Labels und des Ferrocen-Labels entsprechen der Hybrid isierungs-Effizienz des Experiments. Die Arbeitselektroden in dieser Verfahrensalternative zeigen Hybridisierung- seffizienzen von etwa 40 - 50 %.
Alternative 2: Lösungsmittel-Reduktion.
In dieser Verfahrensalternative wird die Hybridisierung mit komplementären Nukleinsäure-Oligomeren unter Reduktion des Lösungsmittels durchgeführt. Der Bereich reduzierter Schutzschichtdicke mit einer Länge von etwa 1.7 cm und einer Breite von etwa 500 μm beinhaltet alle 48 Arbeitselektroden des Leiterplatten-Substrats. Die aufgetragene Lackschicht hat eine Dicke von 350 μm, die im Einsenkungsbereich 23 auf 10 μm reduziert wurde. Der Einsenkungsbe- reich dieses Verfahrensbeispiels hat ein Fassungsvermögen von etwa 2.5 μl. Die Flüssigkeit kann in dieser Verfahrensalternative mit einer kommerziellen Pipette in den Einsenkungsbereich eingefüllt und dann an Luft eingetrocknet werden. Nach etwa 1 Stunde ist der Endzustand, bei dem der Flüssigkeitsfilm an den Erhebungen der Benetzungsstellen abreißt erreicht und das Substrat kann bei Bedarf gespült und auf potentielle Bindungsereignisse ausgelesen werden. Die Benetzungsstellen mit Durchmessern von 10 μm wurden wie in Alternative 1 mit Os-modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert und die Ana- lytflüssigkeit enthält wieder FcAc-modifizierte Nukleinsäure-Oligomere mit in diesem Beispiel einer Konzentration von 0.01 μM. Durch die erfindungsgemäße Reduktion des Lösungsmittels auf etwa 8 nl am Zustand vor dem Reißen des Flüssigkeitsfilms wird die Anfangskonzentration im Ausführungsbeispiel auf etwa 3 μM erhöht und dadurch die Hybridisierungseffizienz bereits auf über 90 % gesteigert (siehe Figur 7c).
Ab dem Zeitpunkt, an dem der Flüssigkeitsfilm reißt, ist die Kommunikation der räumlich getrennten Benetzungsstellen nicht mehr möglich, so dass jedem Spot nur noch ein sehr kleiner Bruchteil der vorhandenen Target-Moleküle zur Verfügung steht und somit auch bei weiterem Eintrocknen quasi keine Bin- dungsereignisse mehr stattfinden können. In diesem Verfahrensbeispiel ist das Verhältnis aus eigentlicher Sensorfläche As = ττ*rs2 = 79 μm2 und der gesamten Benetzungsfläche A8 = 500 μm * 350 μm = 1.75*105 μm2 pro Spot AB/AS = 2215, d.h. jedem der 48 Spots steht ab dem Zeitpunkt des Reißens nur noch ein Bruchteil von 1/(48*2215) = 9.4*106 der ursprünglichen Stoffmenge zur Verfügung.
Bei einer typischen Belegung der Spots von etwa 1*10'13 Mol/cm2 besitzen die Benetzungsstellen jeweils 4.8*106 Sonden. Auf den gesamten Sensor wurden hier 1.5*1010 Target-Moleküle aufgebracht, so dass jeder der räumlich isolier- ten Spots dann nur noch mit 1.4*105 Molekülen in Kontakt steht, die entsprechend der vorliegenden Belegung maximal nur etwa 3 % Hybridisierung bewirken könnten. Der Endzustand der Hybridisierung, an dem der Flüssigkeitsfilm reißt ist also in diesem Anwendungsbeispiel mit einem maximalen Fehler von nur 3 % behaftet und somit im Vergleich zu einem herkömmlichen Eintrocken- prozess sehr genau bestimmt.

Claims

Patentansprüche
1. Substrat zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand- Bindungsreaktionen mit
- einem Träger mit zumindest einer Einsenkung zur Aufnahme einer A- nalytflüssigkeit, die potentiell nachzuweisende Ligandmoleküle enthält, und
- einer Mehrzahl von in der Einsenkung angeordneten Teststellen zur Aufnahme von Ligatmolekülen,
wobei die Teststellen von Mikrowällen umgeben sind, die oberhalb eines vorbestimmten Flüssigkeitspegels der Analytflüssigkeit eine Fließverbindung zwischen den Teststellen erlauben und bei Unterschreiten des vorbestimmten Flüssigkeitspegels die Fließverbindung zwischen den Teststellen unterbrechen.
2. Substrat nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Trägerplatte aufweist, auf deren Oberfläche die Teststellen angeordnet sind.
3. Substrat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerplatte mit einer flächigen Schutzschicht versehen ist, die die O- berfläche von der Umgebung trennt.
4. Substrat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die flächige Schutzschicht eine Dicke zwischen 10 μm und 500 μm, bevor- zugt zwischen 100 μm und 400 μm aufweist.
5. Substrat nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Einsenkung des Trägers durch einen Bereich reduzierter Dicke der Schutzschicht gebildet ist.
6. Substrat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke der Schutzschicht in der Einsenkung um 50% bis 99,5%, bevorzugt um 90% bis 99% reduziert ist.
7. Substrat nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzschicht in der Einsenkung eine Dicke von 5 μm bis 50 μm, be- vorzugt von etwa 10 μm aufweist.
8. Substrat nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen durch sich zur Oberfläche der Trägerplatte erstreckende vertikale Aussparungen in der Schutzschicht definiert sind.
9. Substrat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen eine charakteristische Ausdehnung von etwa 5 μm bis etwa 200 μm, bevorzugt von etwa 10 μm bis etwa 100 μm aufweisen.
10.Substrat nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die vertikalen Aussparungen einen im Wesentlichen rechteckigen, elliptischen oder kreisförmigen Querschnitt aufweisen.
11.Substrat nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzschicht zwischen den Teststellen Vertiefungsgebiete aufweist, deren an die Teststellen grenzende Ränder die Mikrowälle bilden.
12. Substrat nach einem der Ansprüche 3 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzschicht aus einem Material besteht, das an die zu benetzende Oberfläche der Trägerplatte physisorbiert, chemisorbiert oder kovalent, koordinativ bzw. über Komplexbildung bindet.
13. Substrat nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzschicht durch einen positiven oder negativen Photolack, einen Lötstopplack, ein organisches Polymer, insbesondere Cellulose, Dextran oder Collagen gebildet ist.
14.Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen in Form einer n x m Matrix mit n Zeilen und m Spalten angeordnet sind, wobei n und m größer oder gleich 1 sind.
15. Substrat nach einem der Ansprüche 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerplatte durch eine einseitig starre Trägerplatte, eine doppelseitig starre Trägerplatte, eine starre Mehrlagenträgerplatte, eine einseitig oder doppelseitig flexible Trägerplatte, insbesondere aus einer Polyimidfolie, oder eine starrflexible Trägerplatte gebildet ist.
16. Substrat nach einem der Ansprüche 2 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerplatte einen Grundkörper aus Kunststoff, Metall, Halbleiter, Glas,
Verbundstoff, einem porösen Material oder einer Kombination dieser Materialien aufweist.
17. Substrat nach einem der Ansprüche 2 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerplatte einen Grundkörper aus einem Basismaterial aufweist, das ausgewählt ist aus der Gruppe Bismaleinimid-Triazinharz mit Quarzglas (BT), Cyanatester mit Quarzglas (CE), Hartpapierkern mit FR4-Außenlagen (CEM1 ), Glasvlieskern mit FR4-Außenlagen (CEM3), Phenolharzpapier (FR2), Hartpapier (FR3), Epoxid-Glashartgewebe (FR4), Epoxid- Glashartgewebe mit vernetztem Harzsystem (FR5), Polyimidharz mit Ara- midverstärkung (PD), Polytetrafluoräthylen mit Glas oder Keramik (PTFE), hochvernetzte Kohlenwasserstoffe mit Keramik (CHn) und Glas.
18. Substrat nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Grundkörper der Trägerplatte mit einer leitfähigen Schicht, insbesondere aus Silizium, Platin oder Gold versehen ist, die die Oberfläche der Trägerplatte bildet.
19.Substrat nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Grundkörper der Trägerplatte mit einer homogenen leitfähigen Schicht versehen ist, die bevorzugt eine Dicke von etwa 20 nm bis etwa 5 μm, besonders bevorzugt von etwa 100 nm bis etwa 500 nm aufweist.
20. Substrat nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Grundkörper der Trägerplatte mit einem Leiterbild mit beabstandeten Leiterbahnen und Anschlusskontaktflächen versehen ist, und dass die Teststellen auf den Leiterbahnen angeordnet sind.
21. Substrat nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Leiterbahnen einen Metallkern aus einem gut leitenden Unedelmetall und eine den Metallkern umgebende Goldschicht aufweisen, und dass die Leiterbahnen bevorzugt durchgehend mit einer Diffusionssperrschicht ver- sehen sind, die einen direkten Kontakt der Analytflüssigkeit mit dem Metallkern verhindert.
22. Substrat nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass der Metallkern Kupfer, Wolfram und/oder Aluminium umfasst.
23. Substrat nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Diffusionssperrschicht eine zwischen dem Metallkern und der äußeren
Goldschicht angeordnete Zwischenschicht aus Nickel, Titan und/oder Platin umfasst, die bevorzugt eine Dicke von etwa 2 μm bis etwa 10 μm, besonders bevorzugt von etwa 3 μm bis etwa 8 μm, und ganz besonders bevorzugt von etwa 4 μm bis etwa 6 μm aufweist.
24.Substrat nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Goldschicht eine Dicke von etwa 0,15 μm bis etwa 10 μm, bevorzugt von etwa 1 μm bis etwa 5 μm, besonders bevorzugt von etwa 2 μm bis et- wa 3 μm aufweist.
25. Substrat nach einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Leiterbahnen eine Breite von 50 μm bis 250 μm, insbesondere von 80 μm bis 200 μm aufweisen.
26. Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Leiterbahnen eine Rand-zu-Rand-Abstand von etwa 10 μm bis etwa 400 μm, bevorzugt von etwa 200 μm bis etwa 300 μm aufweisen.
27.Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen mit spezifischen Ligatmolekülen funktionalisiert sind, insbe- sondere, dass Ligatmoleküle an Teststellen an die Oberfläche der Trägerplatte physisorbiert, chemisorbiert oder kovalent, koordinativ oder über Komplexbildung gebunden sind.
28. Substrat nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen mit Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert sind, die mit einer oder mehreren reaktiven Gruppen modifiziert sind.
29. Substrat nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen im Bereich einer Goldschicht angeordnet sind und mit Thiol- (HS-) oder Disulfid- (S-S-) derivatisierten Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert sind.
30. Substrat nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure-Oligomere mit einem Fluorophor und/oder einem Redox- label modifiziert sind.
31.Verfahren zum Herstellen eines Substrats zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 18 oder 20 bis 30, mit den Verfahrensschritten:
a) Bereitstellen einer Trägerplatte,
b) Aufbringen eines Leiterbilds mit beabstandeten Leiterbahnen und Anschlusskontaktflächen auf die Trägerplatte,
c) Aufbringen einer flächigen Schutzschicht auf die mit dem Leiterbild ver- sehene Trägerplatte, wodurch zwischen den beabstandeten Leiterbahnen Vertiefungsgebiete entstehen,
d) Strukturieren der Schutzschicht zur Erzeugung zumindest einer Einsenkung mit reduzierter Schutzschichtdicke, und
e) Erzeugen vertikaler Aussparungen in der Einsenkung, die sich zu den Leiterbahnen des Leiterbilds erstrecken und Teststellen auf der Träger- platte definieren, so dass die Ränder der Vertiefungsgebiete Mikrowelle für die Teststellen bilden.
32. Verfahren zum Herstellen eines Substrats zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 19 oder 27 bis 30, mit den Verfahrensschritten:
a) Bereitstellen einer Trägerplatte mit einer homogenen leitfähigen Oberfläche,
b) Aufbringen einer flächigen Schutzschicht auf die Trägerplatte,
c) Strukturieren der Schutzschicht zur Erzeugung zumindest einer Einsenkung mit reduzierter Schutzschichtdicke,
d) Erzeugen von vertikalen Aussparungen in der Einsenkung, die sich zur Oberfläche der Trägerplatte erstrecken und Teststellen auf der Trägerplatte definieren, und
e) Erzeugen von Vertiefungsgebieten zwischen den Teststellen, so dass die Ränder der Vertiefungsgebiete Mikrowälle für die Teststellen bilden.
33. Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, dass als Schutzschicht ein Lötstopplack mit einem Vorhanggießverfahren auf- gebracht wird.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Aussparungen, die Einsenkungen und im Fall des Anspruchs 32 die Vertiefungsgebiete mittels Laserablation, insbesondere durch Bestrahlung von Teilbereichen der Schutzschicht mit kontinuierlicher oder gepulster La- serstrahlung einer vorbestimmten Wellenlänge, bevorzugt im ultravioletten Spektralbereich erzeugt werden.
35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass eine Oberflächenregion der Trägerplatte beim Erzeugen der Aussparungen im Bereich der Teststellen aufgeschmolzen wird.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen in einem Schritt f) mit spezifischen Ligatmolekülen funktio- nalisiert werden.
37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen in Schritt f) mit einem Spotting-Verfahren mit Nukleinsäure- Oligomeren funktionalisiert werden.
38. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen in Schritt f) durch Befüllen der Einsenkung mit einer Lösung mit Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert werden.
39. Verfahren zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand- Bindungsreaktionen mit einem Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 26 oder einem nach einem der Ansprüche 31 bis 35 herstellbaren Substrat, mit den Verfahrensschritten:
a) Funktionalisieren der Teststellen mit spezifischen Ligatmolekülen,
b) Befüllen der Einsenkung mit einer Analytflüssigkeit, die potentiell nachzuweisende Ligandmoleküle enthält,
c) Teilweises oder vollständiges Eintrocknen der Analytflüssigkeit zur Erhöhung der Analytkonzentration in den Teststellen, und d) Nachweis von Ligat-Ligand-Bindungsreaktionen in den Teststellen.
40. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen in Schritt a) mit einem Spotting-Verfahren mit Nukleinsäure-
Oligomeren funktionalisiert werden.
41. Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen in Schritt a) durch Befüllen der Einsenkung mit einer Lö- sung mit Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert werden.
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 41 , dadurch gekennzeichnet, dass das Eintrocknen der Analytflüssigkeit in Schritt c) durch einen Gasstrom oder durch Temperieren kontrolliert beschleunigt wird.
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass
Ligat-Ligand-Bindungsreaktionen in Schritt d) durch ein elektrochemisches oder ein fluoreszenzspektroskopisches Verfahren nachgewiesen werden.
44.Verfahren zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-
Bindungsreaktionen mit einem Substrat nach einem der Ansprüche 27 bis 30 oder einem nach einem der Ansprüche 36 bis 38 herstellbaren Sub- strat, mit den Verfahrensschritten:
a) Befüllen der Einsenkung mit einer Analytflüssigkeit, die potentiell nachzuweisende Ligandmoleküle enthält,
b) Teilweises oder vollständiges Eintrocknen der Analytflüssigkeit zur Erhöhung der Analytkonzentration in den Teststellen, und c) Nachweis von Ligat-Ligand-Bindungsreaktionen in den Teststellen.
45. Verfahren nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass das Eintrocknen der Analytflüssigkeit in Schritt b) durch einen Gasstrom oder durch Temperieren kontrolliert beschleunigt wird.
46. Verfahren nach Anspruch 44 oder 45, dadurch gekennzeichnet, dass Ligat-Ligand-Bindungsreaktionen in Schritt c) durch ein elektrochemisches oder ein fluoreszenzspektroskopisches Verfahren nachgewiesen werden.
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US6210986B1 (en) * 1999-09-23 2001-04-03 Sandia Corporation Microfluidic channel fabrication method
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