DE10326758A1

DE10326758A1 - Substrat zur kontrollierten Durchführung von spezifischen Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen und ein Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE10326758A1
Application number: DE10326758A
Authority: DE
Inventors: Gerhard Hartwich; Heiko Hillebrandt; Sabine Kiermaier
Original assignee: Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH
Current assignee: FRIZ BIOCHEM GESELLSCHAFT FUER BIOANALYTIK MBH, 814
Priority date: 2003-06-13
Filing date: 2003-06-13
Publication date: 2005-01-05

Abstract

Ein Substrat zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen weist einen Träger mit zumindest einer Einsenkung zur Aufnahme einer Analytflüssigkeit, die potentiell nachzuweisende Ligandmoleküle enthält, und eine Mehrzahl von in der Einsenkung angeordneten Teststellen zur Aufnahme von Ligatmolekülen auf. Die Teststellen sind dabei von Mikrowällen umgeben, die oberhalb eines vorbestimmten Flüssigkeitspegels der Analytflüssigkeit eine Fließverbindung zwischen den Teststellen erlauben und bei Unterschreiten des vorbestimmten Flüssigkeitspegels die Fließverbindung zwischen den Teststellen unterbrechen.

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft Substrat zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen. Die Erfindung betrifft ferner ein Herstellungsverfahren für ein solches Substrat, sowie ein Verfahren zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen mit einem derartigen Substrat.

Im Bereich der Biowissenschaften, der Medizintechnik und der Sensorik wurde in den letzten Jahren die Herstellung von mikrostrukturierten Substraten für die Analytik von Flüssigkeiten vorangetrieben, um Lab-on-a-chip Produkte zu erhalten. Diese Produkte sollen es im so genannten High-throughput-screening (HTS) ermöglichen, in paralleler Weise eine Vielzahl von möglichen spezifischen Reaktionen in kurzer Zeit automatisiert zu untersuchen. Für diese Analytik von Flüssigkeiten werden typischerweise 2 verschiedene Ansätze eingesetzt.

Die Reaktion zweier Komponenten kann durch das Mischen zweier flüssiger, die Komponenten enthaltenden Phasen in einem Reaktionsgefäß untersucht werden. Durch diese Reaktion ändern sich Eigenschaften der Flüssigkeiten im Reaktionsgefäß in detektierbarer Weise. Die Analytik in der Volumenphase hat auf der einen Seite den Vorteil, dass speziell Proteine ihre spezifischen Funktionen beibehalten, wobei auf der anderen Seite die oft benötigten großen Vo lumina von Nachteil sind. Somit ist es nötig, Substrate zu schaffen, die extrem kleine Reaktionsgefäße zur Verfügung stellen.

Im zweiten Ansatz benutzt man Oberflächen, die mit verschiedenen Kopplungsgruppen versehen sind und spezifisch bestimmte Analyten binden können, um unbekannte Flüssigkeiten auf das Vorhandensein dieser Analyten zu untersuchen. Hierzu muss die Sensoroberfläche zunächst mit den Kopplungsgruppen funktionalisiert, dann mit der unbekannten Flüssigkeit in Kontakt gebracht und anschließend das Anbinden des Analyten detektiert werden. Für die Detektion solcher Bindungsereignisse an Oberflächen steht im Stand der Technik eine Vielzahl von Verfahren wie Fluoreszenzspektroskopie, Radiometrie, Elektrochemie und eine Vielzahl Oberflächen-sensitiver Methoden wie AFM, SPR oder Schwingquarze zur Verfügung.

Speziell im Bereich der DNA-Analytik oder der Proteom-Forschung bestehen die unbekannten Analyt-Flüssigkeiten meistens aus einer großen Anzahl verschiedener Substanzen in zum Teil sehr kleinen Mengen, so dass ein potentieller Sensor zur Analyse dieser Flüssigkeiten mit Hinblick auf die für industrielle Anwendungen wichtigen Faktoren wie Kosten oder Zeit einen hohen Grad an Parallelisierung aufweisen, mit sehr kleinen Materialmengen auskommen und sehr sensitiv sein muss. Die Parallelisierung einer solchen Analyse kann entweder durch eine laterale Strukturierung der Sensoroberfläche in Bereiche verschiedener Funktionalitäten bzw. im Falle eines Volumenansatzes durch eine große Anzahl an Reaktionsgefäßen erreicht werden.

Für die Parallelisierung von Analysen in der Volumenphase stehen kommerziell erhältliche Mikrotitter-Platten zur Verfügung, die mit Volumina von nur etwa 10 μl pro Reaktionsgefäß betrieben werden können. Um aber das parallele Befüllen der Platten mit solchen kleinen Volumina in kurzer Zeit zu erreichen, sind meist teure Pipetier-Roboter nötig.

Für die Analyse einer unbekannten Flüssigkeit mit Hilfe der oben beschriebenen Sensoroberflächen mit lateral begrenzten Bereichen unterschiedlicher Funktionalitäten stehen im Weiteren zwei Möglichkeiten zur Verfügung: das Benetzen des gesamten Substrats oder aber das gezielte Benetzen nur der funktionalisierten Bereiche des Substrats mit der Analyt-Flüssigkeit. Beide gerade erwähnten Varianten der Analyse einer unbekannten Flüssigkeit mit einer Sensoroberfläche weisen jedoch entscheidende Nachteile auf.

Das Benetzen der gesamten Sensoroberfläche führt zu großen Todvolumen, so dass dieses Verfahren sehr große Analytmengen benötigt. Durch die gezielte Benetzung nur der funktionalisierten Bereiche der Substratoberfläche wird zwar die zu verwendende Flüssigkeitsmenge drastisch reduziert, auf der anderen Seite werden aber spezielle Geräte benötigt, die dieses gezielte Aufbringen kleiner Volumina ermöglichen. Aus dem Stand der Technik sind für das gezielte Aufbringen kleiner Volumina kommerziell erhältliche Spotter (z.B. der Firma Cartesian Technologies) bekannt, die aber mit erheblichen Anschaffungskosten verbunden sind und geschultes Personal erfordern.

Ein weiteres Verfahren zur partiellen Benetzung eines Substrates mit einer Flüssigkeit ist das Mikrokontakt-Drucken μCP (mico-contact-printing), das erstmals von Whitesides 1994 (A. Kumar, G.M. Whitesides, Science, 1994, 263, 60; US-A-6 048 623) vorgestellt wurde. Bei diesem Verfahren wird ein mikrostrukturierter Stempel mit einer Flüssigkeit benetzt, anschließend in direktem Kontakt mit dem zu bearbeitenden Substrat gebracht und so der Oberfläche eine laterale chemische Struktur aufgeprägt. Eine große Schwierigkeit dieser Technik ist die Realisierung eines gleichförmigen Kontakts zwischen Stempel und Substrat, der für das Gelingen bzw. die Qualität von entscheidender Bedeutung ist.

Alle Arten der oben beschriebenen Sensoren mit funktionalisierten Oberflächen benötigen zur Analyse von flüssigen Probensubstanzen in der Regel Analytkonzentrationen oberhalb eines kritischen Wertes. Somit kann es bei be stimmten Sensoren z.B. nötig werden, die Konzentrationen einer biologischen Probe vor der Untersuchung durch zusätzliche Präparationsschritte vor der Analyse zu erhöhen.

Darstellung der Erfindung

Hier setzt die Erfindung an. Der Erfindung, wie sie in den Ansprüchen gekennzeichnet ist, liegt die Aufgabe zugrunde, ein Substrat und ein Verfahren zu seiner Herstellung anzugeben, das die eingangs genannten Nachteile des Stands der Technik vermeiden. Insbesondere soll das Substrat die Analyse von Analytflüssigkeiten geringster Konzentration erlauben und so insbesondere eine Analyse biologischer Proben ohne zusätzliche Präparationsschritte ermöglichen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Substrat nach Anspruch 1, das Herstellungsverfahren nach Anspruch 31 oder 32 und das Verfahren zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen nach Anspruch 39 oder 44 gelöst. Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Figuren und den Beispielen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt: Allgemeines

Genetik

Chemikalien

Erfindungsgemäß umfasst ein Substrat zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen einen Träger mit zumindest einer Einsenkung zur Aufnahme einer Analytflüssigkeit, die potentiell nachzuweisende Ligandmoleküle enthält, und eine Mehrzahl von in der Einsenkung angeordneten Teststellen zur Aufnahme von Ligatmolekülen. Die Teststellen sind dabei von Mikrowällen umgeben, die oberhalb eines vorbestimmten Flüssigkeitspegels der Analytflüssigkeit eine Fließverbindung zwischen den Teststellen erlauben und bei Unterschreiten des vorbestimmten Flüssigkeitspegels die Fließverbindung zwischen den Teststellen unterbrechen.

Als Substrat wird im Rahmen dieser Erfindung ein Festkörper mit einer frei zugänglichen Oberfläche bezeichnet, der somit mit einer Flüssigkeit benetzt werden kann. Als Festkörpersubstrate kommen sowohl Kunststoffe, als auch Metalle, Halbleiter, Gläser, Verbundstoffe oder poröse Materialien in Frage. Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter Flüssigkeiten nicht nur reine flüssige Stoffe, sondern auch Flüssigkeiten mit Detergenz, jede Art von gelösten organischen oder anorganischen Stoffen, sowie Emulsionen, Suspensionen und kolloidalen Lösungen.

Das erfindungsgemäße Substrat ermöglicht eine kontrollierte Erhöhung der Analytkonzentration der Testflüssigkeiten, um den Anteil an spezifischen Bindungsereignissen zu steigern. Die Bindungsreaktion zwischen einem Liganden und einem Ligaten gehorcht stets einer Bindungskinetik, die über eine Assoziationskonstante beschrieben wird (z.B. Langmuir-Isotherme). Das thermodynamische Gleichgewicht der Reaktion kann über die Konzentrationen der beteiligten Reaktionspartner eingestellt werden. Erhöht man dementsprechend die Target-Konzentration in der Analytflüssigkeit durch Reduktion des Volumens bei gleichbleibender Analytmenge, so erhöht man auch den Anteil der spezifischen Bindungsereignisse an der Sensoroberfläche.

Das kontrollierte Eintrocknen der Analytflüssigkeit auf dem erfindungsgemäßen Substrat hat den Vorteil, dass beliebige Proben, unabhängig von den Konzentrationen der enthaltenen Analyten sofort, ohne zusätzliche externe Präparationsschritte untersucht werden können. Das teilweise sehr aufwendige Aufkonzentrieren von z.B. biologischen Proben auf einen benötigten Konzentrationswert ist mit der vorliegenden Erfindung nicht mehr nötig. Ohne das Aufkonzentrieren liegen die Proben in relativ großen Volumina vor, so dass hier auf teure Spotter-Geräte oder Pipetier-Roboter verzichtet werden kann.

Die Erhöhung der spezifischen Bindungsereignisse durch die wachsende Analytkonzentration während des Eintrocknens des Lösungsmittels analog einer Bindungskinetik findet nur bis zu einem bestimmten Grenzwert statt, da bei zu hohen Konzentrationen unspezifische Adsorption durch das Ausfallen der Substanzen zunimmt. Ohne gezielte Maßnahmen ist dieser Endpunkt des Eintrocknens sehr unbestimmt, so dass ein Verfahren, bei dem Einzeltropfen auf räumlich voneinander getrennten Benetzungsgebieten platziert werden, beim Eintrocknen zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen führt. Somit beruht die Erfindung auf einer kontrollierten Erhöhung der Konzentrationen in der Analytflüssigkeit bis zu einem genau definierten Endzustand.

Das kontrollierte Eintrocknen der Erfindung wird dadurch realisiert, dass die Teststellen innerhalb der mit Analytflüssigkeit gefüllten Einsenkungen von Mikrowällen umgeben sind, an deren Rändern der Flüssigkeitsfilm gegen Ende des Eintrockenvorgangs reißt und somit die Fließverbindung zwischen den einzelnen Teststellen unterbrochen wird. Zu dem Zeitpunkt, an dem der Flüssigkeitsfilm reißt, ist jede der Teststellen noch mit einem definierten Endvolumen benetzt, das durch das Volumen des von den Mikrowällen eingeschlossenen Bereichs gegeben ist und das nur einen kleinen Bruchteil der gesamten Target-Menge enthält.

Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung weist der Träger eine Trägerplatte auf, auf deren Oberfläche die Teststellen angeordnet sind. Die Trägerplatte ist dabei vorteilhaft mit einer flächigen Schutzschicht versehen, die die Oberfläche von der Umgebung trennt. Zweckmäßig weist die flächige Schutzschicht eine Dicke zwischen 10 μm und 500 μm, bevorzugt zwischen 100 μm und 400 μm auf.

Die Einsenkung des Trägers kann insbesondere durch einen Bereich reduzierter Dicke der Schutzschicht gebildet sein. Dabei ist die Dicke der Schutzschicht in der Einsenkung vorteilhaft um 50% bis 99,5%, bevorzugt um 90% bis 99% reduziert. Beispielsweise kann die Schutzschicht in der Einsenkung eine Dicke von 5 μm bis 50 μm, bevorzugt von etwa 10 μm aufweisen.

Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung sind die Teststellen durch sich zur Oberfläche der Trägerplatte erstreckende vertikale Aussparungen in der Schutzschicht definiert. Sie können beispielsweise eine charakteristische Ausdehnung von etwa 5 μm bis etwa 200 μm, bevorzugt von etwa 10 μm bis etwa 100 μm aufweisen. Die vertikalen Aussparungen weisen vorteilhaft einen im Wesentlichen rechteckigen, elliptischen oder kreisförmigen Querschnitt auf.

Gemäß der Erfindung ist es bevorzugt, wenn die Schutzschicht zwischen den Teststellen Vertiefungsgebiete aufweist, deren an die Teststellen grenzende Ränder die Mikrowälle bilden.

Die auf die Trägerplatte aufgebrachte Schutzschicht besteht vorzugsweise aus einem Material, das an die zu benetzende Oberfläche der Trägerplatte physisorbiert, chemisorbiert oder kovalent, koordinativ bzw. über Komplexbildung bindet. Insbesondere kann die Schutzschicht durch einen positiven oder negativen Photolack, einen Lötstopplack, ein organisches Polymer, insbesondere Cellulose, Dextran oder Collagen gebildet sein.

Die in der Einsenkung angeordneten Teststellen sind vorzugsweise in Form einer n × m Matrix mit n Zeilen und m Spalten angeordnet sind, wobei n und m größer oder gleich 1 sind.

Die Trägerplatte kann durch eine einseitige starre Trägerplatte, eine doppelseitige starre Trägerplatte, eine starre Mehrlagenträgerplatte, eine einseitige oder doppelseitige flexible Trägerplatte, insbesondere aus einer Polyimidfolie, oder durch eine starrflexible Trägerplatte gebildet sein. In vorteilhaften Ausgestaltungen weist die Trägerplatte einen Grundkörper aus Kunststoff, Metall, Halbleiter, Glas, Verbundstoff, einem porösen Material oder einer Kombination dieser Materialien auf. Insbesondere kann die Trägerplatte einen Grundkörper aus einem Basismaterial aufweisen, das ausgewählt ist aus der Gruppe Bis-maleinimid-Triazinharz mit Quarzglas (BT), Cyanatester mit Quarzglas (CE), Hartpapierkern mit FR4-Außenlagen (CEM1), Glasvlieskern mit FR4-Außenlagen (CEM3), Phenolharzpapier (FR2), Hartpapier (FR3), Epoxid-Glashartgewebe (FR4), Epoxid-Glashartgewebe mit vernetztem Harzsystem (FR5), Polyimidharz mit Aramidverstärkung (PD), Polytetrafluoräthylen mit Glas oder Keramik (PTFE), hochvernetzte Kohlenwasserstoffe mit Keramik (CHn) und Glas.

Der Grundkörper der Trägerplatte ist zweckmäßig mit einer leitfähigen Schicht, insbesondere aus Silizium, Platin oder Gold versehen, die die Oberfläche der Trägerplatte bildet.

Dabei ist in einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung der Grundkörper der Trägerplatte mit einer homogenen leitfähigen Schicht versehen, die an jedem Punkt der Trägerplatte im Wesentlichen dieselbe Dicke aufweist. Die Dicke der homogenen leitfähigen Schicht beträgt bevorzugt etwa 20 nm bis etwa 5 μm, und liegt besonders bevorzugt zwischen etwa 100 nm und etwa 500 nm.

In einer anderen, ebenfalls vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist der Grundkörper der Trägerplatte mit einem Leiterbild mit beabstandeten Leiterbahnen und Anschlusskontaktflächen versehen. Die Teststellen sind dabei auf den Leiterbahnen angeordnet.

In diesem Zusammenhang weisen die Leiterbahnen vorteilhaft einen Metallkern aus einem gut leitenden Unedelmetall und eine den Metallkern umgebende Goldschicht auf. Die Leiterbahnen sind bevorzugt durchgehend mit einer Diffusionssperrschicht versehen, die einen direkten Kontakt der Analytflüssigkeit mit dem Metallkern verhindert. Der Metallkern kann dabei insbesondere Kupfer, Wolfram und/oder Aluminium umfassen.

Die Diffusionssperrschicht umfasst mit Vorteil eine zwischen dem Metallkern und der äußeren Goldschicht angeordnete Zwischenschicht aus Nickel, Titan und/oder Platin, die bevorzugt eine Dicke von etwa 2 μm bis etwa 10 μm, besonders bevorzugt von etwa 3 μm bis etwa 8 μm, und ganz besonders bevorzugt von etwa 4 μm bis etwa 6 μm aufweist. Ohne eine Diffusionssperrschicht kann der auf den Substraten vorgesehene Unedelmetallkern, typischerweise Kupfer, das Messsignal bei der elektrochemischen Detektion stark beeinflussen. So führt beispielsweise die Kupferoxidation zu einem Signalpeak bei einem Potential von 250 mV relativ zu einer Ag/AgCl Referenzelektrode. In diesem Potentialbereich werden auch viele der als bevorzugt angegebenen elekt rochemischen Nachweisverfahren durchgeführt. Insbesondere wenn sehr kleine Mengen einer Testsubstanz in einer Analyflüssigkeit nachgewiesen werden sollen, kann schon eine vergleichsweise kleine Anzahl an Kupferatomen zu einer Verfälschung oder unerwünschten Beeinflussung des Messsignals führen. Eine Diffusionssperrschicht, insbesondere mit einer oben genannten Zwischenschicht verhindert wirkungsvoll die Diffusion von Atomen aus dem Unedelmetallkern in die umgebende Elektrolytlösung und ermöglicht damit höchstempfindliche elektrochemische Nachweisverfahren.

Die genannte Goldschicht weist vorteilhaft eine Dicke von etwa 0,15 μm bis etwa 10 μm, bevorzugt von etwa 1 μm bis etwa 5 μm, besonders bevorzugt von etwa 2 μm bis etwa 3 μm auf.

Die Leiterbahnen sind zweckmäßig mit einer Breite von 50 μm bis 250 μm, insbesondere von 80 μm bis 200 μm ausgebildet. Der Abstand zwischen den Leiterbahnen bestimmt das zur Verfügung stehende Todvolumen der Vertiefungsgebiete. Als geeignet haben sich Abstände zwischen den Rändern der Leiterbahnen von etwa 10 μm bis etwa 400 μm herausgestellt. Bei üblichen Breiten der Leiterbahnen, beispielsweise etwa 150 μm, haben Abstände von etwa 200 μm bis etwa 300 μm zwischen den Rändern gute Ergebnisse erbracht.

Nach einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung sind die Teststellen mit spezifischen Ligatmolekülen funktionalisiert. Insbesondere sind Ligatmoleküle an den Teststellen an die Oberfläche der Trägerplatte physisorbiert, chemisorbiert oder kovalent, koordinativ oder über Komplexbildung gebunden. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung sind die Teststellen mit Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert, die mit einer oder mehreren reaktiven Gruppen modifiziert sind. Insbesondere können die Teststellen im Bereich einer Goldschicht angeordnet sein und mit Thiol-(HS-) oder Disulfid-(S-S-) derivatisierten Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert sein. Zum Nachweis von Bin dungsreaktionen sind die Nukleinsäure-Oligomere mit Vorteil mit einem Fluorophor und/oder einem Redoxlabel modifiziert.

Ein Verfahren zum Herstellen eines Substrats zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen, insbesondere der oben beschriebenen Art, umfasst die Verfahrensschritte:

a) Bereitstellen einer Trägerplatte,
b) Aufbringen eines Leiterbilds mit beabstandeten Leiterbahnen und Anschlusskontaktflächen auf die Trägerplatte,
c) Aufbringen einer flächigen Schutzschicht auf die mit dem Leiterbild versehene Trägerplatte, wodurch zwischen den beabstandeten Leiterbahnen Vertiefungsgebiete entstehen,
d) Strukturieren der Schutzschicht zur Erzeugung zumindest einer Einsenkung mit reduzierter Schutzschichtdicke, und
e) Erzeugen vertikaler Aussparungen in der Einsenkung, die sich zu den Leiterbahnen des Leiterbilds erstrecken und Teststellen auf der Trägerplatte definieren, so dass die Ränder der Vertiefungsgebiete Mikrowälle für die Teststellen bilden.

Ein anderes Verfahren zum Herstellen eines Substrats zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen, insbesondere der oben beschriebenen Art, umfasst die Verfahrensschritte:

a) Bereitstellen einer Trägerplatte mit einer homogenen leitfähigen Oberfläche,
b) Aufbringen einer flächigen Schutzschicht auf die Trägerplatte,
c) Strukturieren der Schutzschicht zur Erzeugung zumindest einer Einsenkung mit reduzierter Schutzschichtdicke,
d) Erzeugen von vertikalen Aussparungen in der Einsenkung, die sich zu einer Oberfläche der Trägerplatte erstrecken und Teststellen auf der Trägerplatte definieren, und
e) Erzeugen von Vertiefungsgebieten zwischen den Teststellen, so dass die Ränder der Vertiefungsgebiete Mikrowälle für die Teststellen bilden.

In beiden Verfahrensvarianten wird vorteilhaft als Schutzschicht ein Lötstopplack mit einem Vorhanggießverfahren aufgebracht.

Die Aussparungen, die Einsenkungen und im Fall des letztgenannten Verfahrens die Vertiefungsgebiete werden bevorzugt mittels Laserablation, insbesondere durch Bestrahlung von Teilbereichen der Schutzschicht mit kontinuierlicher oder gepulster Laserstrahlung einer vorbestimmten Wellenlänge, bevorzugt im ultravioletten Spektralbereich erzeugt. Die Laserstrahlung kann dabei direkt oder über eine Optik bzw. eine Maske auf die abzutragende Schutzschicht gerichtet werden. Die Reihenfolge, in der die Aussparungen und die Vertiefungsgebiete erzeugt werden, ist dabei für die Erfindung nicht wesentlich.

Beim Erzeugen der Aussparungen wird bevorzugt eine Oberflächenregion der Trägerplatte im Bereich der Teststellen aufgeschmolzen. Durch das Aufschmelzen der Oberfläche ergeben sich eine reduzierte Oberflächenrauigkeit und eine verbesserte Homogenität der Oberfläche der Trägerplatte. Durch das Aufschmelzen werden außerdem wenige Goldschichten von der Oberfläche ablatiert, und somit das Substrat von Oberflächenverunreinigungen befreit. Die so freigelegten Stellen des Substrats lassen sich anschließend mit geeigneten Molekülen funktionalisieren.

Die Teststellen können in beiden Verfahrensvarianten in einem Schritt f) mit spezifischen Ligatmolekülen funktionalisiert werden. Dabei können die Teststellen mit einem Spotting-Verfahren oder alternativ durch Befüllen der Einsenkung mit einer Lösung mit Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert werden.

Die Erfindung umfasst ferner Verfahren zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen mit einem Substrat der oben beschriebenen Art. Die Verfahren unterscheiden sich danach, ob ein erfindungs gemäßes Substrat mit unbelegten Teststellen oder mit bereits funktionalisierten Teststellen eingesetzt wird.

Wird ein Substrat mit unbelegten Teststellen verwendet, so umfasst das Verfahren erfindungsgemäß die Schritte:

a) Funktionalisieren der Teststellen mit spezifischen Ligatmolekülen,
b) Befüllen der Einsenkung mit einer Analytflüssigkeit, die potentiell nachzuweisende Ligandmoleküle enthält,
c) Teilweises oder vollständiges Eintrocknen der Analytflüssigkeit zur Erhöhung der Analytkonzentration in den Teststellen, und
d) Nachweis von Ligat-Ligand-Bindungsreaktionen in den Teststellen.

Die Teststellen können in Schritt a) beispielsweise mit einem Spotting-Verfahren oder durch Befüllen der Einsenkung mit einer Lösung mit Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert werden. Die Einsenkung wird bevorzugt möglichst vollständig mit der Analyflüssigkeit befüllt, um eine größtmögliche Anzahl an Ligandmolekülen bereitzustellen. Die Erfindung umfasst jedoch auch Varianten, in denen die Einsenkung nur teilweise befüllt wird, etwa weil das Standardvolumen einer Pipette oder einer anderen Zuführvorrichtung eingefüllt wird.

Das Eintrocknen der Analytflüssigkeit in Schritt c) wird vorzugsweise durch einen Gasstrom, wie etwa einen Luft-, Argon-, Stickstoff- oder einen anderen Inertgasstrom bzw. durch Temperieren kontrolliert beschleunigt. Beim beschleunigtem Eintrocknen durch Temperaturerhöhung muss beachtet werden, dass die Temperatur nicht über der Schmelztemperatur T_m der spezifischen Hybride liegt. Im Falle von z.B. 20mer Oligomeren liegt diese Schmelztemperatur im Bereich von 60 °C, und die Temperatur kann beim Eintrocknen ohne Komplikation auf etwa 40–50 °C erhöht werden. Zum Nachweis der Ligat-Ligand-Bindungsreaktionen in Schritt d) wird mit Vorteil auf ein elektrochemisches oder ein fluoreszenzspektroskopisches Verfahren zurückgegriffen.

Bei Verwendung eines Substrats mit bereits funktionalisierten Teststellen umfasst das Verfahren erfindungsgemäß die Schritte:

a) Befüllen der Einsenkung mit einer Analytflüssigkeit, die potentiell nachzuweisende Ligandmoleküle enthält,
b) Teilweises oder vollständiges Eintrocknen der Analytflüssigkeit zur Erhöhung der Analytkonzentration in den Teststellen, und
c) Nachweis von Ligat-Ligand-Bindungsreaktionen in den Teststellen.

Auch in diesem Fall wird die Einsenkung bevorzugt möglichst vollständig mit der Analyflüssigkeit befüllt und das Eintrocknen der Analytflüssigkeit in Schritt b) durch einen Gasstrom, insbesondere einen Luft-, Argon-, Stickstoff- oder einen anderen Inertgasstrom, bzw. durch Erhöhung der Temperatur (unter Beachtung der Bedingung T < T_m) kontrolliert beschleunigt. Auch der Nachweis der Ligat-Ligand-Bindungsreaktionen in Schritt c) erfolgt bevorzugt mit einem elektrochemischen oder fluoreszenzspektroskopischen Verfahren.

Die erfindungsgemäße Erhöhung der Konzentration der Analytflüssigkeit beim Eintrocknen ist durch das Verhältnis von Anfangs- und Endvolumen bestimmt und kann über verschiedene geometrische Parameter des Substratdesigns wie der Schutzschichtdicke oder der Dicke der Schutzschicht in den Vertiefungen eingestellt werden. Der Bruchteil der Target-Moleküle pro Teststelle nach dem Reißen des Films ist durch das Verhältnis der Größe der eigentlichen Sensorfläche und der gesamten Benetzungsfläche bestimmt. Bei Aussparungen mit einem Durchmesser von 10–40 μm und einer Lackschichtdicke der Wälle von 10–20 μm hat man beispielsweise ein kontrolliertes Endvolumen auf den Elektroden von nur 0.8–25 pL. Kommerziell erhältliche Spotter geben hingegen pro Benetzungsvorgang Volumina von etwa 1 nL oder mehr ab.

Insgesamt wurde ein Substrat beschrieben, das die kontrollierte Reaktion von kleinen Probenmengen spezifischer Bindungspartnern auf seiner strukturierten Oberfläche ermöglicht. Das kontrollierte Eintrocknen der Analytflüssigkeit ist besonders für die Analyse von biologischen Proben geeignet, da diese in der Regel mehrere Analyten in beliebigen Konzentrationen enthalten. Die Proben können zum einen ohne aufwendige zusätzliche Präparationsschritte verwendet werden., zum anderen erlaubt das erfindungsgemäße Substrat auch für Flüssigkeiten, die mehrere Analyten in verschiedenen Konzentrationen enthalten, eine parallelisierte Untersuchung aller Bestandteile. Für diese parallele Analyse sind nach der Erfindung weder teure Pipetier-Roboter noch große Analytmengen nötig.

Weitere Ausgestaltungen und Vorteile der Erfindung werden nachfolgend im Detail beschrieben:

Sensor-Substrate

Die Substrate für den Nachweis spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen der Erfindung werden nachfolgend auch als Sensor-Substrate oder kurz Sensoren bezeichnet. Als Trägerplatten für derartige Sensor-Substrate eignen sich im Rahmen dieser Erfindung alle Festkörper mit einer frei zugänglichen Oberfläche, die mit Biomolekülen funktionalisiert und mit einer flüssigen Testsubstanz benetzt werden können. Als Festkörpersubstrate kommen sowohl Kunststoffe, als auch Metalle, Halbleiter, Gläser, Verbundstoffe oder poröse Materialien in Frage. Die Bezeichnung Oberfläche ist unabhängig von den räumlichen Dimensionen der Oberfläche.

Die Oberfläche der Sensorsubstrate lässt sich in räumlich getrennte Bereiche unterteilen. Dies lässt sich durch Strukturierung des Festkörpersubstrats in aktive und inaktive Bereiche und/oder durch die partielle Funktionalisierung der homogenen Oberflächen realisieren. Auf homogenen Substraten kann man die Strukturierung durch das weiter unten beschriebene Aufbringen und Modifizieren von Passivierungsschichten bzw. Schutzschichten realisieren.

In einer bevorzugten Art der Erfindung werden elektrisch leitfähige Materialien wie Platin, Palladium, Gold, Cadmium, Quecksilber, Nickel, Zink, Kohlenstoff, Silber, Kupfer, Eisen, Blei, Aluminium, Mangan, beliebige dotierte oder nicht-dotierte Halbleiter und binäre oder ternäre Verbindungen als Sensoroberfläche verwendet. Zur Realisierung von räumlich getrennten aktiven Teststellen bzw. Spots auf dem Sensor können homogene elektrisch leitfähige Oberflächen z.B. über eine Schutzschicht strukturiert werden (siehe 3) oder aber leitfähige Materialien auf räumlich getrennte Bereiche eines nicht-leitfähigen Substrats, wie z.B. Glas oder Kunststoff in beliebiger Dicke aufgebracht werden (siehe 1 und 2).

In einer besonders bevorzugten Art der Erfindung werden als Sensorsubstrate isolierende Trägerplatten verwendet, die zweckmäßig einseitig starre Trägerplatten, doppelseitig starre Trägerplatten oder starre Mehrlagenträgerplatten sind. Alternativ kann die isolierende Trägerplatte eine einseitig oder doppelseitig flexible Trägerplatte, insbesondere aus einer Polyimidfolie, oder eine starrflexible Trägerplatte sein. Sie besteht mit Vorteil aus einem Basismaterial, das ausgewählt ist aus der Gruppe BT (Bismaleinimid-Triazinharz mit Quarzglas), CE (Cyanatester mit Quarzglas), CEM1 (Hartpapierkern mit FR4-Außenlagen), CEM3 (Glasvlieskern mit FR4-Außenlagen), FR2 (Phenolharzpapier), FR3 (Hartpapier), FR4 (Epoxid-Glashartgewebe), FR5 (Epoxid-Glashartgewebe mit vernetztem Harzsystem), PD (Polyimidharz mit Aramidverstärkung), PTFE (Polytetrafluoräthylen mit Glas oder Keramik), CHn (Hochvernetzte Kohlenwasserstoffe mit Keramik) und Glas.

Diese Trägerplatten haben eine gewisse Anzahl von Leiterbahnen aus einem unedlen Metallkern (z.B. Kupfer und Nickel, vergleiche 1) mit einer Goldoberfläche, die z.B. mit einer Lötstopplackschicht als Passivierung überzogen werden können. An einem Ende der Leiterbahnen befinden sich Kontakte zur elektrischen Messapparatur, auf der anderen Seite können mit Hilfe der Laser-Ablation freie Goldstellen für die spätere Funktionalisierung in den Lack gebrannt werden.

Die gerade beschriebenen Leiterbahn-Substrate eignen sich sowohl für elektrochemische Messmethoden als auch für die Fluoreszenz-Spektroskopie.

Aufbringen einer Schutzschicht auf das Substrat

Nach bevorzugten Ausgestaltungen wird eine Schutzschicht (im Rahmen dieser Anmeldung auch Passivierungsschicht genannt) auf das Substrat aufgebracht. Diese Schutzschicht kann den kritischen Zeitraum zwischen der Produktion der Substrate und ihrer Weiterverarbeitung überbrücken, da die Schutzschicht das Adsorbieren von Verunreinigungen verhindert.

Erfindungsgemäß kann hierfür jedes beliebige Material verwendet werden, das an einer Oberfläche eine geschlossene Schicht bildet, somit die Substratoberfläche von der Umgebung trennt und zu einem späteren Zeitpunkt z.B. durch Laser-Ablation an gewünschten Stellen entweder in seiner gesamten Dicke rückstandsfrei entfernt oder aber auf Bruchteile der ursprünglichen Dicke reduziert werden kann. Hierbei ist es möglich für ein gewünschtes Substrat eine ideale Schutzschicht auszuwählen, die in Bezug auf die Haftung zwischen Substrat und Schutzschicht optimiert ist. Ebenfalls lässt sich der Schutzfilm hinsichtlich der zu verwendenden Flüssigkeiten optimieren.

Neben üblichen bekannten Lacken aus der Lithographie (positive und negative Photolacke) und der Leiterplatten-Technologie (Lötstopplacke) eignen sich auch organische Polymere wie Cellulose, Dextran oder Collagen. Auch ist es denkbar, Lacke zu kreieren, deren spezielle Bestandteile beim Trocknen des Materials an der Oberfläche vorteilhafte Funktionalisierungen für besondere Anwendungen ausbilden. Die Schutzschicht kann z.B. durch Sprühen im Falle der Photolacke, durch Spincoating oder Physisorption im Falle der organischen Polymere oder durch Siebdruck bzw. Vorhanggießen im Falle der Lötstopplacke auf das Substrat aufgebracht werden.

In einer bevorzugten Art der Erfindung werden auf die Substrate Schutzschichten aus von der Leiterplattentechnologie bekannten Lötstopplacken aufgebracht. Es eignen sich 2-Komponenten oder 1-Komponenten Lötstopplacke, die über Vorhanggießverfahren, Siebdruck oder Sprayverfahren aufgebracht werden und anschließend an der Luft oder durch UV-Bestrahlung aushärten können. Alternativ eignet sich auch ein Folien-Laminierverfahren, bei dem Kunststofffolien auf das Substrat gelegt werden und durch Erhöhung der Temperatur mit dem Substrat verschmelzen.

Ein Vorteil beim Vorhanggießverfahren und dem Folien-Laminierverfahren besteht darin, dass die Dicke der Schutzschicht durch die Geschwindigkeit der Substrate unter dem Lackvorhang bzw. durch die Dicke der Folie beliebig in einem großen Bereich eingestellt werden kann. Ein weiterer Aspekt dieser Verfahren ist, dass die Oberflächenmorphologie des Substrats beim Beschichten in etwa erhalten bleibt (vergleiche 2 und 5) und folglich die Schutzschicht an jeder Stelle des Substrats eine vergleichbare, über z.B. die Geschwindigkeit unter dem Lackvorhang bestimmte Dicke hat. Wie am Bild des Querschnitts der Leiterplatten (5) zu erkennen, kommt es an den Kanten der Leiterbahnen zum Verlaufen des Lacks und dadurch zu einer erhöhten Schichtdicke zwischen den Bahnen. Im Falle der Laminierung kommt es zu keinem Verlaufen der Schicht und die Morphologie ist genau erhalten.

Laser-Ablation der Schutzschicht in beliebiger Geometrie

Unter dem Begriff "Laser-Ablation" versteht man nicht nur das partielle oder vollständige Entfernen von organischen oder anorganischen Schutzschichten, sondern auch das Entfernen von Verunreinigungen auf einem Substrat durch Einstrahlung von Laserlicht. Erfindungsgemäß wird die Laser-Ablation zur Entfernung oder Strukturierung der aufgebrachten Schutzschicht an gewünschten Stellen des Substrats in beliebiger Geometrie verwendet. Somit ist es möglich, verschiedene, genau definierte freie Substratflächen, Vertiefungen oder Einsenkungen in der Schutzschicht in variabler Größe und Tiefe auf ein und dem selben Substrat-Design nur durch Veränderung der Laser-Belichtung zu realisieren.

Durch die Laser-Ablation mit Licht einer gewissen Intensität und Bestrahlzeit wird eine durch die Eindringtiefe der Strahlung bestimmte Dicke der Schutzschicht entfernt. Wird also ein Bereich des Substrats mit der gleichen Anzahl an Pulsen einer gewissen Intensität bestrahlt, so bleibt die durch das Substrat und die Schutzschicht vorgegebene Morphologie bei der Reduktion der Schichtdicke erhalten (vergleiche 2 und 3).

Ein weiterer Gesichtspunkt der Laser-Ablation ist das Aufschmelzen der Substratoberfläche bei vollständigem Entfernen der Schutzschicht, das durch Einstellung der Laserintensität oder der Bestrahlzeit auf die Gegebenheiten des Substrats und der Schutzschicht erreicht werden kann. Dieses kurzfristige, oberflächennahe Aufschmelzen des Substrats schließt, neben der Reduktion der Oberflächenrauigkeit, auch vorhandene Poren im Material und trägt somit zur Homogenität der freien Substratflächen bei (siehe 4). Durch das Aufschmelzen werden außerdem wenige Goldschichten von der Oberfläche ablatiert, und somit das Substrat von Oberflächenverunreinigungen befreit.

Für die vorliegende Erfindung kann die Laser-Ablation durch direkte Einstrahlung von Licht oder durch Einstrahlen des Lichts über eine Optik bzw. eine Maske erfolgen. Die Größe oder die Form der einzelnen freizulegenden oder strukturierten Substratstellen und ihr lateraler Abstand sind hierbei beliebig und nur von der jeweiligen Anwendung abhängig. Die Wellenlänge des verwendeten Laserlichts, sowie Einstrahldauer bzw. Anzahl und Dauer der Pulse hängen von der Kombination aus Schutzschicht und Substratmaterial ab und können für jedes Paar optimiert werden.

In einer bevorzugten Art der Erfindung werden mit einem Excimer-Laser über mehrere Masken in mehreren Prozessschritten Strukturen aus Einsenkungen, freien Substratstellen und gegebenenfalls Vertiefungen zwischen den Teststel len in einen Lötstopplack geschrieben, die das Befüllen mit Flüssigkeiten zum Zwecke der Funktionalisierung der freigelegten Stellen mit Liganden bzw. der Zugabe von Analytflüssigkeiten ermöglichen.

In Lötstopplackschichten von typischerweise 10–400 μm Dicke werden mit einer bestimmten Anzahl an Laser-Pulsen verschiedene Bereiche mit um 5–390 μm reduzierter Schichtdicke (Einsenkungen) geschnitten und dann innerhalb dieser Bereiche die eigentliche Sensorfläche (aktive Bereiche des Sensors aus z.B. Gold bei Platinen-Elektrodenarrays) an ein oder mehreren Stellen mit Durchmessern von etwa d = 10 – 100 μm durch weitere Laser-Pulse freigelegt, um die Teststellen zu bilden.

Zwei nicht einschränkende Beispiele für eine Struktur aus Vertiefungen mit freigelegten Substratstellen sind in den schematischen 2 und 3 dargestellt, die ein strukturiertes Leiterplattensubstrat (vgl. auch 1) bzw. ein Substrat mit homogener leitfähiger Oberfläche und je eine erfindungsgemäße Prozessführung zur Herstellung zeigen. In 2 und 3 ist exemplarisch je nur eine Zeile an Teststellen gezeigt, die ein Teil einer Teststellen-Matrix mit n Zeilen und m Spalten sein kann.

Funktionalisierung der aktiven Flächen mit Biomolekülen

Erfindungsgemäß lassen sich die Teststellen als aktive Bereiche des Sensors (also die eigentlichen Sensorflächen mit freigelegtem Substrat innerhalb der Einsenkungen) mit Biomolekülen funktionalisieren, die als Sonden für in der Testsubstanz vorhandene Targets fungieren. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung eignen sich alle Arten von Ligaten, um Analytflüssigkeiten auf das Vorhandensein ihrer spezifischen Liganden zu untersuchen. Als Ligaten werden Moleküle bezeichnet, die spezifisch mit einem Liganden unter Ausbildung eines Komplexes wechselwirken. Beispiele von Ligaten im Sinne der vorliegenden Schrift sind Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme als Komplexbindungspartner eines Proteins (Enzyms), Antikörper (als Komplexbindungspart ner eines Antigens), Antigene (als Komplexbindungspartner eines Antikörpers), Rezeptoren (als Komplexbindungspartner eines Hormons), Hormone (als Komplexbindungspartner eines Rezeptors), Nukleinsäure-Oligomere (als Komplexbindungspartner des komplementären Nukleinsäure-Oligomers) oder Metallkomplexe.

Für die Kopplung der Biomoleküle mit der Sensoroberfläche steht aus dem Stand der Technik eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Verfügung. Beispiele hierfür sind: (i) Thiol- (HS-) oder Disulfid- (S-S-) Gruppen, die an Oberfläche aus Au, Ag, Cd, Hg, Cu und GaAs koppeln, (ii) Amine, die sich durch Chemi- oder Physisorption an Platin-, Silizium- oder Kohlenstoff-Oberflächen anlagern, (iii) Silane, die mit oxidischen Oberflächen eine kovalente Bindung eingehen und (iv) Epoxy-Zement, der an alle leitfähigen Oberflächen bindet (Heller et. al., Sensors and Actuators, 1993, 180, 13–14; Pishko et al., Anal. Chem., 1991, 63, 2268; Gregg and Heller, J. Phys. Chem., 1991, 95, 5970–5975).

In einer bevorzugten Art der Erfindung werden die freien Substratstellen mit modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren in wässriger Lösung benetzt. Das Nukleinsäure-Oligomer, das auf die freie Oberfläche aufgebracht werden soll, ist über einen kovalent angebundenen Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge mit einer oder mehreren reaktiven Gruppen modifiziert, wobei sich diese reaktiven Gruppen bevorzugt in der Nähe eines Endes des Nukleinsäure-Oligomers befinden. Bei den reaktiven Gruppen handelt es sich bevorzugt um Gruppen, die direkt mit der unmodifizierten Oberfläche reagieren können. Beispiele hierfür sind: (i) Thiol- (HS-) oder Disulfid- (S-S-) derivatisierte Nukleinsäure-Oligomere der allgemeinen Formel (n × HS-Spacer)-oligo, (n × R-S-S-Spacer)-oligo oder oligo-Spacer-S-S-Spacer-oligo, die mit einer Goldoberfläche unter Ausbildung von Gold-Schwefelbindungen reagieren, (ii) Nukleinsäure-Oligomere mit Aminen, die sich durch Chemi- oder Physisorption an Platin- oder Silizium-Oberflächen anlagern und (iii) Nukleinsäure-Oligomere mit Silanen, die mit oxidischen Oberflächen eine kovalente Bindung eingehen. Bei diesen Arten der Anbindung von Nukleinsäure-Oligomeren werden in der Re gel Belegungen mit Sonden-DNA realisiert, die kleiner als die dichteste Packung sind, so dass für eine spätere Hybridisierung mit den Targets ausreichend Platz auf der Oberfläche zur Verfügung steht.

An der anderen Seite des Sonden-Nukleinsäure-Oligomers kann das Molekül bei Bedarf über einen weiteren Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge zusätzlich mit einem elektrochemischen Label (z.B. Ferrocen-Derivate oder Osmium-Komplexe) oder einem Fluorophor (z.B. Fluorescein) modifiziert werden, so dass die Funktionalisierung der freien Substratstellen und/oder die spätere Hybridisierung mit Hilfe elektrochemischer oder spektroskopischer Methoden untersucht werden soll.

Auch ohne die Modifikation der Sonden-Oligonukleotide mit einem Label können entsprechende Methoden zur Untersuchung der Hybridisierungsereignisse verwendet werden, wenn alternativ die Target-Moleküle mit einem Label versehen sind bzw. nach der Hybridisierung die vorhandenen freien Bindungsplätze mit gelabelten Signal-Oligomeren abgeprüft werden (sog. Rücktitration).

Eine spezielle elektrochemische Detektionsvariante stellt ein Verdrängungsassay dar, bei dem an den ungelabelten Sonden-Oligomeren gebundene, kurzkettige Signal-Oligomere mit Redox-Label von ungelabelten Target-Oligomeren der Komplementärsequenz verdrängt werden.

Für die Funktionalisierung der freigelegten Teststellen innerhalb einer Einsenkung eignen sich vor allem zwei Techniken. Beim Spotting-Verfahren werden nur kleine Volumina benötigt und jede Teststelle des Substrats kann mit verschiedenen Molekülen funktionalisiert werden. Alternativ können alle freigelegten Teststellen, die jeweils in einer der Einsenkungen liegen, über das Befüllen mit einer die Sonden-Moleküle enthaltenen Flüssigkeit funktionalisiert werden.

Ausführung der spezifischen Bindungsreaktionen

Mit Hilfe der funktionalisierten Substrate lassen sich Flüssigkeiten auf das Vorhandensein von Analyten untersuchen, die spezifisch an die Sonden des Sensors binden. Hierfür stehen mehrere Möglichkeiten zur Verfügung.

In einem Fall werden nur die funktionalisierten Spots gezielt mit kleinen Volumina der Testflüssigkeit durch Verwendung eines Spotters benetzt. Nach einer gewissen Inkubationszeit kann das Substrat gespült werden und der Sensor wird auf mögliche Bindungsereignisse ausgelesen.

Alternativ kann die gesamte Einsenkung des Substrats, das die freigelegten Teststellen enthält mit der Testflüssigkeit in gewünschter Höhe befüllt werden. Auch hier kann das Substrat nach einer gewissen Inkubationszeit gespült werden und der Sensor wird auf mögliche Bindungsereignisse ausgelesen. Bei diesem Verfahren benötigt man zwar ein größeres Volumen der Testflüssigkeit, jedoch kann auf den Spotter verzichtet werden.

In einer bevorzugten Variante zur Ausführung der spezifischen Bindungsreaktionen wird die die Teststellen enthaltene Einsenkung z.B. bis zur Lackoberkante (vergleiche 2f bzw. 3g) mit Analyflüssigkeit befüllt, so dass ein nur durch die Geometrie der strukturierten Lackschicht bestimmtes Volumen (V₀) injiziert wird. Anschließend wird das Verdunsten z.B. durch einen Inertgasstrom oder durch Erhöhung der Temperatur (mit T < T_m) kontrolliert forciert, um die Konzentration der Analyten in der Testflüssigkeit zu erhöhen (2g bzw. 3h).

Die Fließverbindung zwischen den räumlich getrennten Benetzungsstellen wird automatisch unterbrochen, wenn der Flüssigkeitsfilm über den Lackerhöhungen der Benetzungsstellen reißt (vgl. 2h und 3i). Somit ergibt sich ein durch die Höhe der Wälle (h_W) an den Sensoroberflächen und dem Durchmesser der Lackaussparungen (d_s) genau definiertes Endvolumen pro räumlich getrennter Teststelle (V_S) mit gegenüber den Anfangswerten deutlich erhöhten Konzentration c_E der Analyten (c_E/c₀ = V₀/V_E) und nur einem kleinen, durch das Verhältnis Sensorfläche zu gesamter Benetzungsfläche (A_S/A_B) gegebenen Bruchteil der vorhandenen Analyt-Moleküle. Durch das gegenüber dem Anfangsvolumen (V₀) deutlich reduziertem Endvolumen (V_E) führt weiteres Eintrocknen der Flüssigkeit in den n räumlich getrennten Benetzungsstellen mit nur einem kleinen Bruchteil aller Analyt-Moleküle (N_S = N₀/n·A_S/A_B) nur noch in geringem Maße zu Veränderungen der Anzahl an Bindungsereignissen und es kann ein sehr genauer Endwert der Bindungseffizienz erreicht werden.

Ist der Endzustand des obigen Verdunstungsprozesses erreicht, so kann das Substrat bei Bedarf sofort gespült werden, da die spezifischen Bindungsereignisse bereits während der Reduktion des Lösungsmittels stattgefunden haben.

Nach dem Spülen kann das Substrat für die Visualisierung der spezifischen Bindungsereignisse wieder je nach Modifikation der Ligaten z.B. über elektrochemische oder fluoreszenzspektroskopische Techniken ausgelesen werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Nachfolgend soll die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Dabei sind nur die für das Verständnis der Erfindung wesentlichen Elemente dargestellt. Es zeigt
1 schematische Darstellungen eines auf Leiterplatten-Technologie basierenden Sensor-Substrats nach einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. Dabei zeigen die Ausschnitte in a) eine Aufsicht auf ein Leiterbahnen-Substrat mit 3 Zuleitungen für Arbeitselektroden und einer Gegenelektrode, b) einen Querschnitt durch ein Substrat mit 3 Zuleitungen, und c) ein Substrat mit Lackschichten zweier Dicken (dunkelgrau: ursprüngliche Dicke, hellgrau: Einsenkung) und freigelegten Teststellen (weiß) auf den Arbeitselektroden;
2 in a) bis h) schematische Darstellungen zur Illustration des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens eines Substrats mit einem Einsenkungsbereich und mit auf die Leiterbahnen des Substrats ausgerichteten freigelegten Spots (Teststellen) zur Funktionalisierung mit Ligat-Molekülen. Die Konzentration der Targets wird während der spezifischen Reaktion der Bindungspartner durch Verdunsten des Lösungsmittels erhöht;
3 in a) bis i) schematische Darstellung zur Illustration des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens eines Substrats mit einem Einsenkungsbereich, Vertiefungen und bis zur leitfähigen, homogenen Oberfläche reichenden Spots (Teststellen) zur Funktionalisierung mit Ligat-Molekülen;
4 in a) und b) SEM-Aufnahmen von durch Laser-Ablation freigelegten Oberflächenbereichen einer Stopplack-Schutzschicht mit quadratischem bzw. rundem Profil,
in c) ein AFM-Bild einer gelaserten und aufgeschmolzenen Gold-Oberfläche und
in d) ein Querschnitts-Höhenprofil entlang der Linie A-A aus a);
5 SEM-Aufnahmen eines Schnitts durch die Leiterplattensubstrate mit einer dünnen Lackschicht, wobei a) einen Ausschnitt mit 3 Leiterbahnen und b) ein Detailbild einer Leiterbahn mit freigelegtem Bereich in der Lackschicht zeigt;
6 eine Visualisierung der Funktionalisierung der Teststellen mit Fluoreszenz-markierten Oligomeren. a) zeigt einen Ausschnitt von 4 Teststellen, b) die Verteilung der Fluoreszenzintensität über 48 Teststellen; und
7 in a) ein schematisches Bild eines Hybridisierungs-Experiments mit 2 Redox-Labeln, und in b) und c) ACV-Kurven (U_ac = 10 mV, f = 5 Hz) eines typischen Experiments auf einer Arbeitselektrode mit d = 10 μm vor und nach der Hybridisierung. Der linke Peak bei etwa U = 220 mV zeigt das Osmium der Sonde, der rechte Peak bei etwa U = 360 mV zeigt das Ferrocen des Targets. Die Potentiale sind gegen eine Ag/AgCl Referenz-Elektrode angegeben. 7b) zeigt ein Experiment mit konstanter Analytkonzentration, während 7c) das analoge Experiment mit Eintrocknen des Lösungsmittels zeigt.
Wege zur Ausführung der Erfindung
Eine exemplarische Prozessführung zur Herstellung eines Substrats mit Bereichen reduzierter Dicke (Einsenkungen) und freigelegten Spots (Teststellen) mit angrenzenden Mikrowällen gliedert sich in folgende Stufen: i) Bereitstellen der Trägerplatte und gegebenenfalls Aufbringen eines Leiterbildes, ii) Aufbringen einer Schutzschicht, iii) Strukturierung der Schutzschicht durch Laser-Ablation zur Herstellung der Einsenkungen und gegebenenfalls der Vertiefungsgebiete, und iv) Laser-Ablation zur Herstellung von freigelegten Substratstellen (Teststellen) innerhalb der Einsenkungen.
In den Bereichen, an denen die Substratoberfläche durch die Laser-Ablation freigelegt wurde, lässt sich eine Funktionalisierung mit Ligat-Molekülen durchführen und das Substrat kann als Sensor für in einer oder mehreren Flüssigkeiten vorhandene Ligand-Moleküle benutzt werden. Abschließend wird das Substrat hinsichtlich möglicher Bindungsereignisse ausgelesen.
In den folgenden Beispielen ist die gesamte Substratoberfläche oder aber die Oberfläche der Leiterbahnen aus Gold und als Schutzschicht wird ein Film aus Lötstopplack verwendet.
In den Beispielen werden die durch Laser-Ablation freigelegten Goldstellen des Substrats exemplarisch mit doppelt modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren beschichtet, die an dem einen Ende eine Thiol-Gruppe zur Bindung an die Goldoberfläche und an dem anderen Ende ein Fluorophor (z. B. Fluoresceinisothiocyanat) oder ein Redox-Label (z.B. ein Osmium-Komplex) besitzen. Die Belegung der Substrate mit den Nukleinsäure-Oligomeren kann mittels Fluoreszenzspektroskopie oder elektrochemischer Methoden visualisiert werden.
Die funktionalisierten Substratstellen werden mit einer Analytflüssigkeit (z.B. einer Lösung, die potentiell komplementäre Nukleinsäure-Oligomere enthält) in Kontakt gebracht und der Sensor anschließend auf mögliche Bindungsreaktionen mit Hilfe eines Fluoreszenz-Scanners oder einer elektrochemischen Technik ausgelesen.
Im Falle von auf einer leitfähigen Goldoberfläche immobilisierten Oligonukleotiden mit Fluoreszenz-Farbstoff kann man die Hybridisierungsereignisse über eine veränderte Fluoreszenzintensität detektieren. Bei hohem Salzgehalt der Flüssigkeit liegt das oberflächengebundene, einzelsträngige Oligonukleotid in einer eher komprimierten Konformation vor, die sich durch einen kleinen Abstand des Fluorophores von der leitfähigen Oberfläche auszeichnet und somit durch Fluoreszenzlöschen zu einer niedrigen Fluoreszenzintensität führt.
Durch die Hybridisierung der gebundenen Oligonukleotide mit einem komplementären Oligomer-Strang vergrößert sich der Abstand zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Oberfläche, so dass durch die Hybridisierung eine höhere Fluoreszenzintensität zu beobachten ist.
Im Falle von immobilisierten Oligonukleotiden mit einem elektrochemischen Label (z.B. ein Osmium-Komplex), die mit komplementären Oligomeren hybridisieren, die ebenfalls mit einem Redox-Label modifiziert sind, gibt es eine Vielzahl elektrochemischer Messmethoden zum Auslesen des Sensors. Eine bevorzugte Messmethode zur Analyse der Belegung und der Hybridisierungs-Effizienz ist die AC (alternating current) Voltammetrie. Aus dem ACV-Strom am Redox-Potential des Labels lässt sich nach O'Connor et al. (J. Electroanal. Chem., 466, 1999, 197–202) die Anzahl der beteiligten Label berechnen und die Experimente sind somit quantitativ auswertbar.
Auch ohne die Modifikation der Sonden- und Target-Oligonukleotide mit einem Redox-Label können elektrochemische Methoden zur Untersuchung der Hybridisierungsereignisse verwendet werden. Diese elektrochemische Detektionsvariante stellt ein Verdrängungsassay dar, bei dem an die ungelabelten Sonden-Oligomere gebundene, kurzkettige Signal-Oligomere mit Redox-Label von ungelabelten Target-Oligomeren der Komplementärsequenz verdrängt werden und sich so die Kommunikation zwischen Redox-Label und Elektrode ändert.
Die in den folgenden Beispielen geschilderten Verfahren sind für den Fachmann ohne weiteres auf die Beschichtung anderer strukturierter Substrate mit anderen Materialien und verschiedenen Ligat/Ligand-Bindungsereignissen übertragbar.
Beispiel 1: Substrate mit homogener leitfähiger Oberfläche
Schritt 1: Herstellung der Substrate mit strukturierter Lötstopplackschicht.
Mit Bezug auf 3 wird ein Glasgrundkörper mit einer aufgedampften, 5 nm dicken CrNi-Kontaktschicht und einer darauf aufgedampften Goldschicht mit einer Dicke von etwa 200 nm beschichtet, um eine Trägerplatte 12 für das Substrat zu bilden (3a). Anschließend wird die Trägerplatte 12 mit einer 350 μm dicke Passivierungsschicht 22 aus strukturierbarem, optisch aushärtbaren Lack (2-Komponenten Lötstopplack, Elpemer GL 2467 SM-DG, Fa. Peters) überzogen, der in einem aus der Leiterplatten-Technologie bekanntem Vorhanggieß-Verfahren auf die Trägerplatte 12 aufgebracht wird, 3b.
Nach dem Trocknen des Lackes wird die Schutzschicht 22 mit einem Excimer-Laser der Firma Lambda-Physics strukturiert. Der Laser kann über verschiedene Masken verkleinert auf dem Substrat abgebildet werden, wobei die Flächenintensität der Bestrahlung über die Abbildungsvorrichtung eingestellt wird. Je nach Maske lassen sich so verschiedene Geometrien der ablatierten Regionen realisieren (siehe 4a und 4b).
In die Schutzschicht 22 wird durch hochenergetische Pulse des Excimer-Lasers zunächst eine Einsenkung 23A mit reduzierter Schutzschichtdicke in den Lack geschrieben, 3c. Um die Dicke der Schutzschicht 22 in ausgewählten Bereichen z.B. um 300 μm zu reduzieren, benötigt man etwa 2200 Pulse á 20 ns des Lasers mit einer Flächenleistung von 600–1200 mJ/cm².
In einem zweiten Strukturierungsschritt wird dann der Lack an ausgewählten Stellen 23B innerhalb der Einsenkung 23A über eine zweite Maske durch zusätzliche Laser-Belichtung weiter auf 10 μm verdünnt, 3d. Dadurch werden Vertiefungsgebiete 23B geschaffen, die zusammen mit den anschließend eingebrachten Aussparungen 24 die erfindungsgemäßen Mikrowälle bilden. Innerhalb der entstandenen Plateaus werden schließlich in einem dritten Strukturierungsschritt die Aussparungen 24 für die eigentlichen Teststellen erzeugt und so das Substrat für die Funktionalisierung freigelegt und aufgeschmolzen, 3e. Diese freigelegten Stellen haben typischerweise Durchmesser von etwa 10–100 μm und dienen der späteren Aufnahme der Ligaten 26. Das Aufschmelzen der Oberfläche führt zum Verschluss von Oberflächenporen der Goldschicht, zu einer Reduktion der Oberflächenrauigkeit und zum Entfernen von Oberflächenverunreinigungen.
Schritt 2: Funktionalisierung der freigelegten Teststellen des Substrats mit Fluoreszenz-markierten Nukleinsäure-Oligomeren 26
Alternative 1: Spotting-Verfahren.
Die im Schritt 1 beschriebenen freigelegten Teststellen werden z.B. über ein Spotting-Verfahren mit den Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert.
Die Synthese der Oligonukleotide erfolgt in einem automatischen Oligonukleotid-Synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA/RNA-Synthesizer) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Syntheseprotokolle für eine 1.0 μmol Synthese. Bei den Synthesen mit dem 1-O-Dimethoxytrityl-propyl-disulfid-CPG-Träger (Glen Research 20-2933) werden die Oxidationsschritte mit einer 0.02 M Iodlösung durchgeführt, um eine oxidative Spaltung der Disulfidbrücke zu vermeiden. Modifikationen an der 5'-Position der Oligonukleotide erfolgen mit einem auf 5 min verlängerten Kopplungsschritt. Der Amino-Modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) wird in die Sequenzen mit den jeweiligen Standardprotokollen eingebaut. Die Kopplungseffizienzen werden während der Synthese online über die DMT-Kationen-Konzentration photometrisch bzw. konduktometrisch bestimmt.
Die Oligonukleotide werden mit konzentriertem Ammoniak (30%) bei 37 °C 16 h entschützt. Die Reinigung der Oligonukleotide erfolgt mittels RP-HPL Chromatographie nach Standardprotokollen (Laufmittel: 0,1 M Triethylammoniumacetat-Puffer, Acetonitril), die Charakterisierung mittels MALDI-TOF MS. Die aminmodifizierten Oligonukleotide werden an die entsprechenden aktivierten Fluorophore (z. B. Fluoresceinisothiocyanat) entsprechend der dem Fachmann bekannten Bedingungen gekoppelt. Die Kopplung kann sowohl vor als auch nach der Anbindung der Oligonukleotide an die Oberfläche erfolgen.
Die Substrate aus dem Schritt 1 werden mit doppelt modifiziertem 20 by Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation eins: die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH₂)₂-S)₂ zum P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH verestert ist, Modifikation zwei: an das 5' Ende ist der Flourescein-Modifier Fluorescein-Phosphoramidite (Proglio Biochemie GmbH) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) als 5 × 10^–5 molare Lösung in Puffer (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7 mit 0.05 vol% SDS) mit Zusatz von ca. 10^–5 bis 10^–1 molarem Propanthiol (oder anderen Thiolen oder Disulfiden geeigneter Kettenlänge) mit Hilfe eines Spotters (Carthesian) aufgebracht und für 2 min–24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1 Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy-mercaptoethanols kommt. Das in der Inkubationslösung gleichzeitig anwesende, freie Propanthiol wird ebenfalls durch Ausbildung einer Au-S Bindung koadsorbiert. Statt des Einzelstrang-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.
Für die Belegung mit dem Spotter der Firma Cartesian Technologies (Micro-Sys PA) werden Split-Pin Nadeln (Arraylt Chipmarker Pins der Firma Tele-Chem) verwendet, die ein Ladevolumen von 0.2 bis 0.6 μL haben und Volumina von etwa 1 nL pro Benetzungsvorgang abgeben. Die Kontaktfläche dieser Nadeln hat einen Durchmesser von etwa 130 μm und ist damit deutlich größer als die bei der Laser-Ablation freigelegten Bereiche des Substrats. Die Positionierung der Nadel über dem Substrat erfolgt mit einer Genauigkeit von 10 μm bei einer Luftfeuchtigkeit von etwa 70–80 %. Der Tropfen wird beim Kontakt der Spitze mit der Schutzschicht abgegeben und es kommt zu keiner direkten Berührung mit dem Substrat („Pseudo-Kontakt-Drucken"). Mit Hilfe eines Fluoreszenz-Scanners der Firma Lavision Biotech kann die Belegung der freien Substratstellen mit fluoreszenz-modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren visualisiert werden (6).
Alternative 2: Befüllen der Einsenkung
Ein Substrat wird wie in Schritt 1 beschrieben hergestellt. Anschließend wird der Bereich der Einsenkung 23A mit einer Lösung der oben beschriebenen Nukleinsäure-Oligomeren gefüllt, das Substrat nach einer Inkubationszeit von 2 min–24 h gespült und die Funktionalisierung der freien Stellen mit Nukleinsäure-Oligomeren 26 mit Hilfe eines Fluoreszenz-Scanners der Firma Lavision Biotech visualisiert.
Beispiel 2: Leiterplatten-Substrate.
Schritt 1: Herstellung der Leiterplatten-Substrate mit strukturierter Lötstopplackschicht.
Auf einer Trägerplatte aus Epoxid-Glashartgewebe FR4 wird ein Leiterbild aus im Ausführungsbeispiel fünfzig parallelen Leiterbahnen aufgebracht. 1a zeigt nur einen Ausschnitt dieses Leiterbahnenbildes. Der Ausschnitt zeigt 3 der 48 Arbeitselektroden (20A bis 20C) und einen Teil der Gegenelektrode 28.
1b zeigt einen Schnitt durch ein Leiterbahnensubstrat mit 3 gleichen Leiterbahnen. Jede der Leiterbahnen 20 besteht aus einem Kupferkern 14, der durchgehend von einer Nickel-Sperrschicht 16 und einer Goldschicht 18 überzogen ist. Im Ausführungsbeispiel hat der Kupferkern eine Dicke von etwa 28 μm. Er stellt einen preiswerten und gut leitfähigen Grundbestandteil der Leiterbahnen dar. Um hochgenaue Messungen bei der elektrochemischen Detektion im wässrigen Medium zu ermöglichen, ist der unedle Kupferkern mit einer 6 μm dicken, durchgehenden Nickelschicht als Diffusionssperre überzogen. Auf dieser Nickel-Schicht wird als Oberfläche eine 2 μm dicke Goldschicht aufgebracht.
Die Leiterbahnen des Ausführungsbeispiels sind etwa 150 μm breit und mit einem Abstand von etwa 200 μm (Mitte-Mitte) auf der Trägerplatte angeordnet. Die Arbeitselektroden, die Gegenelektrode und eine gegebenenfalls ebenfalls vorgesehene Referenzelektrode sind zur Kontaktierung jeweils mit nicht dargestellten Anschlusskontaktflächen des elektrischen Substrats verbunden.
Mit Bezug auf 2 wird das gesamte Leiterbild wie in Beispiel 1 mit einer 350 μm dicken Schutzschicht 22 aus strukturierbarem, optisch aushärtbaren Lack (2-Komponenten Lötstopplack, Elpemer GL 2467 SM-DG, Fa. Peters) überzogen, der in einem aus der Leiterplatten-Technologie bekanntem Vorhanggieß-Verfahren auf die Substrate aufgebracht wurde.
Nach dem Trocknen wird in die Schutzschicht 22 durch hochenergetische Pulse des Excimer-Lasers ein Bereich reduzierter Dicke 23 in den Lack geschrieben. Um die Dicke der Schutzschicht 22 in ausgewählten Bereichen z.B. um 340 μm zu reduzieren, benötigt man etwa 2500 Pulse á 20 ns des Lasers mit einer Flächenleistung von 600–1200 mJ/cm².
In einem zweiten Strukturierungsschritt wird dann über eine zweite Maske an ausgewählten Stellen 24 (24A-C, 1c) innerhalb des Bereichs des ersten Strukturierungsschrittes der restliche Lack durch zusätzliche Laser-Belichtung entfernt und so die Oberfläche der Leiterbahnen 20A–20C freigelegt und lokal aufgeschmolzen. Diese freigelegten Stellen haben typischerweise Durchmesser von etwa 10–100 μm. Das Aufschmelzen der Oberfläche führt zum Verschluss von Oberflächenporen der Goldschicht, zu einer Reduktion der Oberflächenrauigkeit und zum Entfernen von Oberflächenverunreinigungen. In den folgenden Ausführungsbeispielen haben die Leiterbahnen kreisrunde Ausnehmungen mit Durchmessern von 10 μm (1c).
Schritt 2: Funktionalisierung der freigelegten Stellen des Substrats mit Redoxmarkierten Nukleinsäure-Oligomeren.
Die Funktionalisierung in diesem Anwendungsbeispiel kann analog den beiden Alternativen aus dem Beispiel 1, also über ein Spotting-Verfahren oder das Befüllen der Einsenkung 23 erfolgen. Die Synthese der Nukleinsäure-Oligomere wird ebenfalls analog zum Beispiel 1 durchgeführt, wobei aber das Fluoreszenz-Label durch ein Redox-Label ersetzt wird. In diesem Beispiel werden die Nukleinsäure-Oligomere an dem amino-modifizierten 5' Ende mit dem Osmium-Komplex [Os(bipy)₂ Cl imidazolacrylsäure] nach dem jeweiligen Standardprotokoll modifiziert.
Schritt 3: Analyse einer Probenflüssigkeit mit Nukleinsäure-Oligomeren.
Alternative 1: Befüllen der Einsenkungen
7 zeigt exemplarisch die ACV-Messung (U_ac = 10 mV, f = 5 Hz) einer mit Osmium-modifizierten Oligomeren funktionalisierten Arbeitselektrode (Symbole ∎ in 7b und c).
Nach der Funktionalisierung können die Arbeitselektroden bei Bedarf noch vor der Hybridisierung mit den komplementären, Ferrocen-modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren in einem Nachbelegungsschritt für 30 Minuten mit einer 1 mM Lösung Propanthiol in Kontakt gebracht werden. Hierbei werden die Räume zwischen den Nukleinsäure-Oligomeren hydrophobisiert und verschieben das Redox-Potential des Ferrocens zu positiveren Werten, um eine bessere Separation vom Osmium-Potential zu erreichen.
Die komplementären Nukleinsäure-Oligomere für die Hybridisierung (Targets) werden analog dem Beispiel 1, aber ohne die Thiol-Modifikation am 3' Ende synthetisiert. Für die Modifikation mit dem Redox-Label Ferrocen werden die amino-modifizierten Nukleinsäure-Oligomere am 5' Ende mit Ferrocenessigsäure (FcAc) nach dem jeweiligen Standardprotokoll gekoppelt.
Die Ferrocen-modifizierten Nukleinsäure-Oligomere werden der Target-Lösung mit einer Konzentration von 1 μM in 500 mM Phosphat-Puffer (pH 7, mit 1 M NaCl und 0.05 vol% SDS) zugegeben und die Einsenkung des Sensors bis zu einer gewünschten Höhe mit dieser Target-Lösung befüllt. Nach einer gewissen Inkubationszeit unter hybridisierenden Bedingungen bei kontrollierter Luftfeuchtigkeit (70–80 %), die das Eintrocknen der Flüssigkeit verhindert, wird das Substrat gespült und erneut eine elektrochemische ACV-Messung (U_ac = 10 mV, f = 5 Hz) durchgeführt (Symbole ⎕ in 7b). Die Messdaten zeigen einen zweiten Redox-Peak und das Verhältnis der Peak-Ströme des Osmium-Labels und des Ferrocen-Labels entsprechen der Hybridisierungs-Effizienz des Experiments.
Die Arbeitselektroden in dieser Verfahrensalternative zeigen Hybridisierungseffizienzen von etwa 40–50 %.
Alternative 2: Lösungsmittel-Reduktion.
In dieser Verfahrensalternative wird die Hybridisierung mit komplementären Nukleinsäure-Oligomeren unter Reduktion des Lösungsmittels durchgeführt. Der Bereich reduzierter Schutzschichtdicke mit einer Länge von etwa 1.7 cm und einer Breite von etwa 500 μm beinhaltet alle 48 Arbeitselektroden des Leiterplatten-Substrats. Die aufgetragene Lackschicht hat eine Dicke von 350 μm, die im Einsenkungsbereich 23 auf 10 μm reduziert wurde. Der Einsenkungsbereich dieses Verfahrensbeispiels hat ein Fassungsvermögen von etwa 2.5 μl. Die Flüssigkeit kann in dieser Verfahrensalternative mit einer kommerziellen Pipette in den Einsenkungsbereich eingefüllt und dann an Luft eingetrocknet werden. Nach etwa 1 Stunde ist der Endzustand, bei dem der Flüssigkeitsfilm an den Erhebungen der Benetzungsstellen abreißt erreicht und das Substrat kann bei Bedarf gespült und auf potentielle Bindungsereignisse ausgelesen werden.
Die Benetzungsstellen mit Durchmessern von 10 μm wurden wie in Alternative 1 mit Os-modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert und die Analytflüssigkeit enthält wieder FcAc-modifizierte Nukleinsäure-Oligomere mit in diesem Beispiel einer Konzentration von 0.01 μM. Durch die erfindungsgemäße Reduktion des Lösungsmittels auf etwa 8 nl am Zustand vor dem Reißen des Flüssigkeitsfilms wird die Anfangskonzentration im Ausführungsbeispiel auf etwa 3 μM erhöht und dadurch die Hybridisierungseffizienz bereits auf über 90 % gesteigert (siehe 7c).
Ab dem Zeitpunkt, an dem der Flüssigkeitsfilm reißt, ist die Kommunikation der räumlich getrennten Benetzungsstellen nicht mehr möglich, so dass jedem Spot nur noch ein sehr kleiner Bruchteil der vorhandenen Target-Moleküle zur Verfügung steht und somit auch bei weiterem Eintrocknen quasi keine Bindungsereignisse mehr stattfinden können. In diesem Verfahrensbeispiel ist das Verhältnis aus eigentlicher Sensorfläche A_S = π·r_S ² = 79 μm² und der gesamten Benetzungsfläche A_B = 500 μm·350 μm = 1.75·10⁵ μm² pro Spot A_B/A_S = 2215, d.h. jedem der 48 Spots steht ab dem Zeitpunkt des Reißens nur noch ein Bruchteil von 1/(48·2215) = 9.4·10^–6 der ursprünglichen Stoffmenge zur Verfügung.
Bei einer typischen Belegung der Spots von etwa 1·10^–13 Mol/cm² besitzen die Benetzungsstellen jeweils 4.8·10⁶ Sonden. Auf den gesamten Sensor wurden hier 1.5·10¹⁰ Target-Moleküle aufgebracht, so dass jeder der räumlich isolierten Spots dann nur noch mit 1.4·10⁵ Molekülen in Kontakt steht, die entsprechend der vorliegenden Belegung maximal nur etwa 3 % Hybridisierung bewirken könnten. Der Endzustand der Hybridisierung, an dem der Flüssigkeitsfilm reißt ist also in diesem Anwendungsbeispiel mit einem maximalen Fehler von nur 3 % behaftet und somit im Vergleich zu einem herkömmlichen Eintrockenprozess sehr genau bestimmt.

Claims

Substrat zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen mit – einem Träger mit zumindest einer Einsenkung zur Aufnahme einer Analytflüssigkeit, die potentiell nachzuweisende Ligandmoleküle enthält, und – einer Mehrzahl von in der Einsenkung angeordneten Teststellen zur Aufnahme von Ligatmolekülen, wobei die Teststellen von Mikrowällen umgeben sind, die oberhalb eines vorbestimmten Flüssigkeitspegels der Analytflüssigkeit eine Fließverbindung zwischen den Teststellen erlauben und bei Unterschreiten des vorbestimmten Flüssigkeitspegels die Fließverbindung zwischen den Teststellen unterbrechen.
Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Trägerplatte aufweist, auf deren Oberfläche die Teststellen angeordnet sind.
Substrat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerplatte mit einer flächigen Schutzschicht versehen ist, die die Oberfläche von der Umgebung trennt.
Substrat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die flächige Schutzschicht eine Dicke zwischen 10 μm und 500 μm, bevorzugt zwischen 100 μm und 400 μm aufweist.
Substrat nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Einsenkung des Trägers durch einen Bereich reduzierter Dicke der Schutzschicht gebildet ist.
Substrat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke der Schutzschicht in der Einsenkung um 50% bis 99,5%, bevorzugt um 90% bis 99% reduziert ist.
Substrat nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzschicht in der Einsenkung eine Dicke von 5 μm bis 50 μm, bevorzugt von etwa 10 μm aufweist.
Substrat nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen durch sich zur Oberfläche der Trägerplatte erstreckende vertikale Aussparungen in der Schutzschicht definiert sind.
Substrat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen eine charakteristische Ausdehnung von etwa 5 μm bis etwa 200 μm, bevorzugt von etwa 10 μm bis etwa 100 μm aufweisen.
Substrat nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die vertikalen Aussparungen einen im Wesentlichen rechteckigen, elliptischen oder kreisförmigen Querschnitt aufweisen.
Substrat nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzschicht zwischen den Teststellen Vertiefungsgebiete aufweist, deren an die Teststellen grenzende Ränder die Mikrowälle bilden.
Substrat nach einem der Ansprüche 3 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzschicht aus einem Material besteht, das an die zu benetzende Oberfläche der Trägerplatte physisorbiert, chemisorbiert oder kovalent, koordinativ bzw. über Komplexbildung bindet.
Substrat nach einem der Ansprüche 3 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzschicht durch einen positiven oder negativen Photolack, einen Lötstopplack, ein organisches Polymer, insbesondere Cellulose, Dextran oder Collagen gebildet ist.
Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen in Form einer n × m Matrix mit n Zeilen und m Spalten angeordnet sind, wobei n und m größer oder gleich 1 sind.
Substrat nach einem der Ansprüche 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerplatte durch eine einseitig starre Trägerplatte, eine doppelseitig starre Trägerplatte, eine starre Mehrlagenträgerplatte, eine einseitig oder doppelseitig flexible Trägerplatte, insbesondere aus einer Polyimidfolie, oder eine starrflexible Trägerplatte gebildet ist.
Substrat nach einem der Ansprüche 2 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerplatte einen Grundkörper aus Kunststoff, Metall, Halbleiter, Glas, Verbundstoff, einem porösen Material oder einer Kombination dieser Materialien aufweist.
Substrat nach einem der Ansprüche 2 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerplatte einen Grundkörper aus einem Basismaterial aufweist, das ausgewählt ist aus der Gruppe Bismaleinimid-Triazinharz mit Quarzglas (BT), Cyanatester mit Quarzglas (CE), Hartpapierkern mit FR4-Außenlagen (CEM1), Glasvlieskern mit FR4-Außenlagen (CEM3), Phenolharzpapier (FR2), Hartpapier (FR3), Epoxid-Glashartgewebe (FR4), Epoxid-Glashartgewebe mit vernetztem Harzsystem (FR5), Polyimidharz mit Aramidverstärkung (PD), Polytetrafluoräthylen mit Glas oder Keramik (PTFE), hochvernetzte Kohlenwasserstoffe mit Keramik (CHn) und Glas.
Substrat nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Grundkörper der Trägerplatte mit einer leitfähigen Schicht, insbesondere aus Silizium, Platin oder Gold versehen ist, die die Oberfläche der Trägerplatte bildet.
Substrat nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Grundkörper der Trägerplatte mit einer homogenen leitfähigen Schicht versehen ist, die bevorzugt eine Dicke von etwa 20 nm bis etwa 5 μm, besonders bevorzugt von etwa 100 nm bis etwa 500 nm aufweist.
Substrat nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Grundkörper der Trägerplatte mit einem Leiterbild mit beabstandeten Leiterbahnen und Anschlusskontaktflächen versehen ist, und dass die Teststellen auf den Leiterbahnen angeordnet sind.
Substrat nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Leiterbahnen einen Metallkern aus einem gut leitenden Unedelmetall und eine den Metallkern umgebende Goldschicht aufweisen, und dass die Leiterbahnen bevorzugt durchgehend mit einer Diffusionssperrschicht versehen sind, die einen direkten Kontakt der Analytflüssigkeit mit dem Metallkern verhindert.
Substrat nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Metallkern Kupfer, Wolfram und/oder Aluminium umfasst.
Substrat nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Diffusionssperrschicht eine zwischen dem Metallkern und der äußeren Goldschicht angeordnete Zwischenschicht aus Nickel, Titan und/oder Platin umfasst, die bevorzugt eine Dicke von etwa 2 μm bis etwa 10 μm, besonders bevorzugt von etwa 3 μm bis etwa 8 μm, und ganz besonders bevorzugt von etwa 4 μm bis etwa 6 μm aufweist.
Substrat nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Goldschicht eine Dicke von etwa 0,15 μm bis etwa 10 μm, bevorzugt von etwa 1 μm bis etwa 5 μm, besonders bevorzugt von etwa 2 μm bis etwa 3 μm aufweist.
Substrat nach einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Leiterbahnen eine Breite von 50 μm bis 250 μm, insbesondere von 80 μm bis 200 μm aufweisen.
Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Leiterbahnen eine Rand-zu-Rand-Abstand von etwa 10 μm bis etwa 400 μm, bevorzugt von etwa 200 μm bis etwa 300 μm aufweisen.
Substrat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen mit spezifischen Ligatmolekülen funktionalisiert sind, insbesondere, dass Ligatmoleküle an Teststellen an die Oberfläche der Trägerplatte physisorbiert, chemisorbiert oder kovalent, koordinativ oder über Komplexbildung gebunden sind.
Substrat nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen mit Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert sind, die mit einer oder mehreren reaktiven Gruppen modifiziert sind.
Substrat nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen im Bereich einer Goldschicht angeordnet sind und mit Thiol-(HS-) oder Disulfid-(S-S-) derivatisierten Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert sind.
Substrat nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure-Oligomere mit einem Fluorophor und/oder einem Redoxlabel modifiziert sind.
Verfahren zum Herstellen eines Substrats zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 18 oder 20 bis 30, mit den Verfahrensschritten: a) Bereitstellen einer Trägerplatte, b) Aufbringen eines Leiterbilds mit beabstandeten Leiterbahnen und Anschlusskontaktflächen auf die Trägerplatte, c) Aufbringen einer flächigen Schutzschicht auf die mit dem Leiterbild versehene Trägerplatte, wodurch zwischen den beabstandeten Leiterbahnen Vertiefungsgebiete entstehen, d) Strukturieren der Schutzschicht zur Erzeugung zumindest einer Einsenkung mit reduzierter Schutzschichtdicke, und e) Erzeugen vertikaler Aussparungen in der Einsenkung, die sich zu den Leiterbahnen des Leiterbilds erstrecken und Teststellen auf der Träger platte definieren, so dass die Ränder der Vertiefungsgebiete Mikrowälle für die Teststellen bilden.
Verfahren zum Herstellen eines Substrats zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 19 oder 27 bis 30, mit den Verfahrensschritten: a) Bereitstellen einer Trägerplatte mit einer homogenen leitfähigen Oberfläche, b) Aufbringen einer flächigen Schutzschicht auf die Trägerplatte, c) Strukturieren der Schutzschicht zur Erzeugung zumindest einer Einsenkung mit reduzierter Schutzschichtdicke, d) Erzeugen von vertikalen Aussparungen in der Einsenkung, die sich zur Oberfläche der Trägerplatte erstrecken und Teststellen auf der Trägerplatte definieren, und e) Erzeugen von Vertiefungsgebieten zwischen den Teststellen, so dass die Ränder der Vertiefungsgebiete Mikrowälle für die Teststellen bilden.
Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, dass als Schutzschicht ein Lötstopplack mit einem Vorhanggießverfahren aufgebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Aussparungen, die Einsenkungen und im Fall des Anspruchs 32 die Vertiefungsgebiete mittels Laserablation, insbesondere durch Bestrahlung von Teilbereichen der Schutzschicht mit kontinuierlicher oder gepulster La serstrahlung einer vorbestimmten Wellenlänge, bevorzugt im ultravioletten Spektralbereich erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass eine Oberflächenregion der Trägerplatte beim Erzeugen der Aussparungen im Bereich der Teststellen aufgeschmolzen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen in einem Schritt f) mit spezifischen Ligatmolekülen funktionalisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen in Schritt f) mit einem Spotting-Verfahren mit Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen in Schritt f) durch Befüllen der Einsenkung mit einer Lösung mit Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert werden.
Verfahren zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen mit einem Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 26 oder einem nach einem der Ansprüche 31 bis 35 herstellbaren Substrat, mit den Verfahrensschritten: a) Funktionalisieren der Teststellen mit spezifischen Ligatmolekülen, b) Befüllen der Einsenkung mit einer Analytflüssigkeit, die potentiell nachzuweisende Ligandmoleküle enthält, c) Teilweises oder vollständiges Eintrocknen der Analytflüssigkeit zur Erhöhung der Analytkonzentration in den Teststellen, und d) Nachweis von Ligat-Ligand-Bindungsreaktionen in den Teststellen.
Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen in Schritt a) mit einem Spotting-Verfahren mit Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass die Teststellen in Schritt a) durch Befüllen der Einsenkung mit einer Lösung mit Nukleinsäure-Oligomeren funktionalisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass das Eintrocknen der Analytflüssigkeit in Schritt c) durch einen Gasstrom oder durch Temperieren kontrolliert beschleunigt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass Ligat-Ligand-Bindungsreaktionen in Schritt d) durch ein elektrochemisches oder ein fluoreszenzspektroskopisches Verfahren nachgewiesen werden.
Verfahren zur kontrollierten Durchführung spezifischer Ligat/Ligand-Bindungsreaktionen mit einem Substrat nach einem der Ansprüche 27 bis 30 oder einem nach einem der Ansprüche 36 bis 38 herstellbaren Substrat, mit den Verfahrensschritten: a) Befüllen der Einsenkung mit einer Analytflüssigkeit, die potentiell nachzuweisende Ligandmoleküle enthält, b) Teilweises oder vollständiges Eintrocknen der Analytflüssigkeit zur Erhöhung der Analytkonzentration in den Teststellen, und c) Nachweis von Ligat-Ligand-Bindungsreaktionen in den Teststellen.
Verfahren nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass das Eintrocknen der Analytflüssigkeit in Schritt b) durch einen Gasstrom oder durch Temperieren kontrolliert beschleunigt wird.
Verfahren nach Anspruch 44 oder 45, dadurch gekennzeichnet, dass Ligat-Ligand-Bindungsreaktionen in Schritt c) durch ein elektrochemisches oder ein fluoreszenzspektroskopisches Verfahren nachgewiesen werden.