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Die
vorliegende Erfindung betrifft selbstorganisierende Monoschichten
(SAMs). Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Herstellung
eines verbesserten Haftvermittlersystems für Edelmetalloberflächen, wie
sie bei SAMs zum Einsatz kommen, sowie die Herstellung und Verwendung
des Haftvermittlersystems. Aufgrund des Herstellungsverfahrens weist
das erfindungsgemäße Haftvermittlersystem keine
oberflächendeckende
Monoschichten auf, so dass an der frei zugänglichen Edelmetalloberfläche elektrochemische
Reaktionen stattfinden können.
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Ein
erheblicher Anteil des Edelmetallverbrauchs, beispielsweise 10%
des Goldverbrauchs, geht auf Anwendungen in der Elektrotechnik und Elektronik
zurück.
Edelmetalle, insbesondere Gold, dienen hierbei zur Herstellung hochwertiger
Drahtverbindungen und Kontakte, sowie auch zur Herstellung von Thermoelementen
und Ultrarotreflektoren. So werden im Korrosionsschutz oder als
Barriereschichten gegen Gasdiffusion insbesondere dünne Goldauflagen
eingesetzt. Bei den vorstehend aufgeführten Anwendungen besteht ein
wesentlicher Vorteil von Gold oder der anderen Edelmetallen in der hohen
Beständigkeit
gegenüber
Korrosion oder Chemikalien. Diese Eigenschaft geht im Wesentlichen auf
die Tatsache zurück,
dass Edelmetalle nur unter extremen Bedingungen eine Oxidschicht
ausbilden. Bei den meisten dieser Anwendungen wird daher die Oberfläche der
Edelmetallschicht aus reinem Edelmetall gebildet.
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Die
geringe Neigung von Edelmetallen zur Oxidation oder zum Eingehen
anderer chemischen Verbindungen spiegelt sich in den hohen Redoxpotentialen
und der niedrigen Polarität
wieder. Derart niederenergetische (unpolare) Oberflächen von Edelmetallen
weisen jedoch eine geringe Oberflächenenergie auf, was den Nachteil
mit sich bringt, dass ein zusätzliches
Funktionalisieren der Goldoberfläche,
wie beispielsweise durch Lacke oder Klebstoffe, erschwert ist. So
gilt allgemein beim Aufbringen von Substanzen auf Oberflächen, dass
die Grenzflächenenergie
der Oberfläche
mindestens so groß sein
sollte, wie die Oberflächenspannung
der aufzubringenden Substanz.
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Eine
der wenigen Möglichkeiten
zur nachträglichen
Funktionalisierung von Edelmetalloberflächen liegt daher in der Behandlung
mit organischen Thiolen oder Dithiolen. Goldoberflächen lassen
sich beispielsweise durch Umsetzung mit n-Alkylthiolen (V.M. Mirsky et
al., Biosensors & Bioelectronics,
12 (9-10) (1997), 977-989) oder Di-n-Alkyldisulfiden (M. Glodde
et al., Intern. J. of Adhesion & Adhesives
18 (1998), 359-364) hydrophobieren. Es bilden sich hochorientierte
selbstorganisierende Monoschichten (A. Ulman, An Introduction
to Ultrathin Organic Films: From Langmuir-Blödgett
to Self-Assembly. Academic Press, Boston, MA 1991, 254-281; L.H.
Dubois und R.G. Nuzzo, Annu. Rev. Phys. Chem. 43 (1992), 437-463).
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Eine
selbstorganisierende Monoschicht bildet sich im Allgemeinen spontan
beim Eintauchen in geeignete oberflächenaktive oder organische
Substanzen, wie beispielsweise Alkanthiole, Trichlorsilane und Fettsäuren, die
in Lösung
oder suspendiert vorliegen können.
Diese Substanzen bilden auf Edelmetallen aber auch anderen Elementen,
wie beispielsweise Silizium, einfache Monoschichten mit einer hohen
inneren Ordnung. Derart behandelte Oberflächen sind in Luft über längere Zeiträume stabil.
Im Gegensatz zu herkömmlichen
Beschichtungsverfahren, wie beispielsweise der chemischen Gasphasenabscheidung,
weisen SAMs eine definierte Schichtdicke im Bereich von ungefähr 0,1 bis
2 nm auf.
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Die
so erhaltenen selbstorganisierenden Monoschichten können wiederum
im Anschluss durch die Kopplung mit weiteren funktionellen Gruppen
modifiziert werden. Die einfache Herstellung einer Monoschicht auf
beispielsweise einer Goldoberfläche
ist daher die wesentliche Ursache dafür, dass diese Systeme im Bereich
der Biosensoren für
die Anbindung von Biomolekülen
eine gängige
Methode darstellen (X. Kang et al, Electrochemistry Communication
(2001) 489-493).
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Bei
der Herstellung organischer Monoschichten durch Selbstorganisation
von Organothiolen ist hierbei die Wahl geeigneter Moleküle entscheidend,
die drei funktionell verschiedene Untereinheiten aufweisen müssen; die
Ankergruppe, die an die Substratoberfläche bindet, den Mittelteil,
der gewissermaßen
als Rückrat
für die
Orientierung und mechanische Stabilität der Filme verantwortlich
ist, sowie die Endgruppe, die die physikalischen und chemischen
Eigenschaften bzw. die Funktionalität der entstehenden Filme bestimmt.
Im Fall der Organothiole ist der Anker eine Thiofunktion(-SH), die
beim Kontakt mit den Münzmetallen
Au, Ag, Cu stabile Thiolate ausbildet. Bei dem eigentlichen Adsorptionsvorgang,
z.B. auf Goldoberflächen,
reagiert die SH-Gruppe unter Abspaltung von Wasserstoff zu einem
stabilen Goldthiolat. Die entstandene Bindung weist einen ausgeprägt kovalenten
Charakter mit einer Bindungsstärke
von ca. 130 kJ mol-1 auf. Dementsprechend
sind die Filme bis zu Temperaturen von über 120°C stabil.
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Selbstorganisierende
Monoschichten werden beispielsweise in der Halbleitertechnologie
zur Oberflächenstabilisierung
und maßgeschneiderten Funktionalisierung
von Elektroden eingesetzt. Je nach Länge der verwendeten Alkylketten
wird dabei die Permeabilität
und die Ladungstransfergeschwindigkeit beeinflusst. Das Anwendungsgebiet
von mit selbstorganisierenden Monoschichten modifizierten Elektroden
ist sehr breit. Unter anderem wird die Technik der selbstorganisierenden
Monoschicht beim elektrochemischen Rastertunnelmikroskop, bei Zelluntersuchungen,
bei der Sensorik und in der Nanoelektronik verwendet.
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Eine
aktuelle Anwendung ist die Ausrüstung von
Mess-Punkten (Messspots) mit interdigitalen Goldelektroden auf Biochips
mit Thiol-modifizierten Fänger-Oligonukleotiden.
Diese Fän ger-Oligonukleotide
dienen dazu, in einer hochspezifischen Hybridisierungsreaktion mit
zum Beispiel diagnostisch interessanten Zielmolekülen zu reagieren.
Sind diese Zielmoleküle
beispielsweise mit Biotin modifiziert, dann können an den hybridisierten
Zielmolekülen
in einem weiteren Reaktionsschritt Enzyme, wie die alkalische Phosphatase,
andocken. Wird nun diesem System ein Enzymsubstrat wie para-Aminophenylphosphat
angeboten, dann wird dieses Molekül enzymatisch in Phospat und
para-Aminophenol gespalten. Das para-Aminophenol kann anschließend einfach
in einem Redoxcyclingprozess am Interdigitalelektrodensystem elektrochemisch
nachgewiesen werden und somit die hochspezifische Hybridisierung der
Zielmoleküle
analytisch verifizieren (R. Thewes et al., Labor Praxis
5 (2002), 42-45). Dies ist nur möglich, da die auf den Goldelektroden
immobilsierten Fängermoleküle keine
dichte SA-Schicht ausbilden und somit die Hybridisierung mit entsprechenden Zielmolekülen durch
entsprechende Zwischenräume und
die notwendigen elektrochemischen Reaktionen durch eine frei zugängliche
Goldoberfläche
(ohne Gold-Thio-Bindungen)
ermöglichen.
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Sollen
diese diagnostischen Erkennungsreaktionen nun aus Gründen einer
höheren
Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit in 3-dimensionale Gelschichten
stattfinden, die sich auf den jeweiligen Messspots befinden, dann
müssen
diese Schichten folgende Eigenschaften aufwiesen: Zunächst muss die
gesamte oben aufgeführte
Biochemie, d.h. Immobilisierung der Fängermoleküle, Hybridisierung, Andockung
des Enzyms und enzymatische Reaktionen in der Gelschicht ablaufen.
Die Gelschichten müssen während des
gesamten Assayablaufes auf den Messspots haften bleiben und weiterhin
muss genügend
freie Elektrodenfläche
verbleiben, um elektrochemisches Auslesen zu ermöglichen. Dies bedeutet, das
eine Haftvermittlerchemie erforderlich ist, die einerseits eine
ausreichende Haftung zwischen Messspot und Gelschicht ermöglicht und
andererseits ausreichend Goldoberfläche für das Redoxcycling frei lässt.
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Die
WO 2004/020659 betrifft
Immobilisierungsschichten für
Biosensoren und deren Verwendung in DNA-Chips zur Erzeugung biosensorischer Erkennungsschichten.
Die Immobilisierungsschichten sind hierbei ein über Radikale vernetztes und
ein fotostrukturiertes Hydrogel auf Basis von Polyacrylamid, welche
den Aufbau von Sensorarrays mit biologischen Erkennungsmolekülen in einer
dreidimensionalen Matrix erlauben.
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Da
für den
Aufbau der vorstehend aufgeführten
Gelschichten weiterhin bevorzugt epoxidhaltige Matrizes in Frage
kommen, bieten sich als Haftvermittler auf Gold in erster Näherung längerkettige ω-Aminoalkylthiole
an. Diese Verbindungen weisen allerdings den Nachteil auf, dass
sie einerseits schwierig zu synthetisieren sind und andererseits
hochorientierte SA-Schichten auf Gold ausbilden, so dass sie die
Elektrodenoberfläche
isolieren (M. Zhu et al., Langmuir 17 (2001), 6471-6476).
Die Verwendung im Handel erhältlicher,
kurzkettiger ω-Aminoalkylthiole
scheidet schon aufgrund der der leichten Desorbition dieser Verbindungen
von Gold aus (V.M. Mirsky et al., Biosensors & Bioelectronics,
12 (9-10) (1997), 977-989).
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Nachdem
eine Verwendung von ω-Aminoalkylthiolen
als Haftvermittler nicht in Frage kommt, verbleibt als einzige weitere
mögliche
Vorgehensweise, die epoxidhaltigen Gele über die Passivierungsschicht
zwischen den Elektroden, z.B. Siliziumnitrid, zu immobilisieren.
Dies erfordert erfahrungsgemäß jedoch
im Verhältnis
zur Elektrodenoberfläche
große Passivierungsflächen. Die
für das
Redoxcycling notwendigen Abmessungen der Interdigitalelektroden erfordern
jedoch beispielsweise eine Breite und einen Abstand der Elektroden
von etwa 1 μm
(R. Thewes et al., Labor Praxis 5 (2002), 42-45).
Die Schwierigkeiten der Haftvermittlung für epoxidhaltige Gelschichten
auf diesen Interdigitalgoldelektroden sind daher bis heute nicht
befriedigend gelöst.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Bereitstellung
eines Haftvermittlersystem für
Edelmetallober flächen,
das die vorstehend aufgeführten
Schwierigkeiten löst
und weiterhin in der Lage ist, eine wirksame Haftvermittlung für epoxidhaltige
Gelschichten auf Interdigitalelektroden bereitzustellen.
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Die
vorstehenden Aufgaben werden durch die Bereitstellung eines aminofunktionellen
Haftvermittlersystems für
Edelmetalloberflächen
gelöst. Hierbei
ist ein N-Aminoalkyl-(ω-thio)-Carbonsäureamid
mit der Formel (I)
über den Thiolrest auf der Oberfläche eines
Edelmetalls immobilisiert bzw. aufgebracht. Die vorliegende Erfindung
betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines auf einer
Edelmetalloberfläche
immobilisierten N-Aminoalkyl-(ω-thio)-Carbonsäureamids
sowie dessen Verwendung bei der Katalyse, der Modifizierung von
Edelmetalloberflächen
unter Beibehaltung der Leitfähigkeit
oder der Herstellung von Biochips oder von Microarrays.
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Von
Vorteil ist hierbei, dass bei der Synthese der selbstorganisierenden
Monoschichten das N-Aminoalkyl-(ω-thio)-Carbonsäureamid
nicht als vollständiges
Molekül
auf die Edelmetalloberfläche aufgebracht,
sondern über
eine zweistufige Reaktion auf der Edelmetalloberfläche aufgebaut
wird. Zu diesem Zweck wird zuerst ein ω-Carboxylalkylthiol über die
Thio-Funktionalität
bzw. den Thio-Rest auf der Oberfläche immobilisiert. Aufgrund
von Wasserstoffbrückenbindungen
zwischen den Carboxylfunktionalitäten der ω-Carboxylalkylthiole kommt
es hierbei zur Entstehung von unregelmäßigen Monoschichten, bei denen
die einzelnen Carboxylalkylthiole einen größeren Abstand untereinander
aufweisen als beispielsweise bei einer selbstorganisierenden Monoschicht von ω-Aminoalkylthiolen.
Dies hat den Vorteil, dass eine freizugängliche Edelmetalloberfläche verbleibt, die
beispielswei se zum elektrochemischen Nachweis von zu detektierenden
Molekülen
verwendet werden kann. Weiterhin kann aufgrund der Wechselwirkungen
zwischen den Carboxylgruppen und der damit einhergehenden größeren Beabstandung
der immobilisierten ω-Carboxylalkylthiole
untereinander, auf den Einsatz von beispielsweise Schablonen beim Aufbringen
der Monoschichten verzichtet werden.
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Grundsätzlich könnten bereits
die freien ω-ständigen Carboxylgruppen
mit beispielsweise Epoxidgruppen der Gelmatrizes zur Reaktion gebracht werden.
Unter den erforderlichen Reaktionsbedingungen besteht hierbei allerdings
die Möglichkeit, dass
die Epoxidgruppen größtenteils
bzw. vollständig mit
den ω-Carboxylgruppen
reagieren, wodurch ein Anbringen von Biomolekülen, wie beispielsweise Fänger-Oligonukleotiden,
an den Epoxidgruppen unzureichend erfolgt oder gänzlich unterbleibt.
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Daher
werden die Carboxylreste des ω-Carboxylalkylthiols
weiterhin jeweils mit einer Aminogruppe von (1, ω)-Diaminoalkylen zur Reaktion
gebracht. Die freie endständige
Aminogruppe kann anschließend
weiterhin zum Anbringen von beispielsweise Biomolekülen unter
milden Reaktionsbedingungen eingesetzt werden.
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Die 1A zeigt
Wechselwirkungen zwischen den endständigen Carboxylgruppen von
auf einer Goldoberfläche
immobilisierter (ω-thio)-Hexadekansäure.
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Die 1B zeigt
ein aminofunktionalisiertes Haftvermittlersystem, in dem auf die
Carboxylgruppen der (ω-thio)-Hexadekansäure aus 1 (1,2)-Diaminoethan aufgebracht wurde.
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Die 2A und 2B zeigen
Reaktionschemata für
die Synthese von 2-Aminoethyl-(16-thio)-Hexadekansäureamid
auf einer Goldoberfläche.
(1) ist hierbei die immobilisierter ω-thio-Hexadekansäure, deren Carboxylfunktion
mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid
(EDC; 2A) bzw. N- Hydroxysuccinimid (NHS; 2B) aktiviert
wird. Die daraus erhaltenen Zwischenverbindungen (2) bzw. (5) werden
jeweils mit (1,2)-Diaminoethan (3) zur Bildung von 2-Aminoethyl-(16-thio)-Hexadekansäureamid
(4) umgesetzt.
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In
einer Ausführungsform
wird ein aminofunktionelles Haftvermittlersystem für Edelmetalloberflächen bereitgestellt,
dass ein Edelmetall mit einer Oberfläche und ein N-Aminoalkyl-(ω-thio)-Carbonsäureamid
mit der Formel (I)
aufweist. Das N-Aminoalkyl-(ω-thio)-Carbonsäureamid
ist hierbei über
den Thiorest auf der Edelmetalloberfläche immobilisiert und die Reste
R' und R'' weisen unabhängig voneinander eine Länge von
C
5-C
80 auf.
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Der
Ausdruck "aminofunktionelles
Haftvermittlersystem" bezeichnet,
dass über
die freie Aminogruppe des N-Aminoalkyl-(ω-thio)-Carbonsäureamids
eine Möglichkeit
zur Reaktion mit anderen Molekülen,
wie beispielsweise Biomolekülen,
zum kovalenten Anbringen gegeben ist. Biomoleküle umfassen beispielsweise
Peptide, Proteine, Fusionsproteine, Proteinkomplexe, Enzyme, Antikörper und
Nukleinsäuren.
Weitere geeignete Moleküle
können
beispielsweise Polymere aus Gelmatrizen, wie in der
WO 2004/020659 beschrieben, sein.
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Edelmetalle
sind die Metalle Kupfer (Cu), Ruthenium (Ru), Rhodium (Rh), Palladium
(Pd), Silber (Ag), Rhenium (Re), Osmium (Os), Iridium (Ir), Platin (Pt),
Gold (Au) und Quecksilber (Hg). Die Metalle weisen eine für das anzubringende
Molekül
zugängliche
Oberfläche
auf und können
beispielsweise auf geeigneten Trägern
aufgebracht sein. Weiterhin kann die Oberfläche irgendeine geeignete Form
aufweisen. Die Oberfläche
des Metalls ist vorzugsweise von irgendwelchen Verunreinigungen,
wie beispielsweise Fetten, befreit.
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Das
N-Aminoalkyl-(ω-thio)-Carbonsäureamid
weist die beiden Alkylketten R' und
R'' auf. Die Alkylketten
können
hierbei unabhängig
voneinander verschiedene Längen,
beispielsweise C5-C80,
aufweisen und nicht oder mit anderen Resten substituiert sein.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform ist
das das Edelmetall ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Cu, Ru, Rh, Pd, Ag, Re, Os, Ir, Pt,
Au und Hg, vorzugsweise ist das Edelmetall eines der Münzmetalle
Cu, Au, Ag und noch bevorzugter Au.
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Gemäß einer
Ausführungsform
sind R' und R'' unabhängig voneinander substituierte
oder nicht-substituierte Alkylreste. Substituierte Alkylreste umfassen
hierbei die Modifikation der Alkylketten mit einer oder mehreren
Funktionalitäten,
wie beispielsweise F, Cl, Br, I, OH, NH2 etc,
aber auch anderen Alkylresten. Substituierte Alkylreste können weiterhin eine
oder mehrere Doppelbindungen und/oder Dreifachbindungen umfassen.
Vorzugsweise sind die Alkylreste linear und weisen keinerlei Verzweigungen und/oder
Substituenten auf.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
weisen die Alkylreste R' und
R'' unabhängig voneinander eine
Länge von
C5-C50, vorzugsweise
von C5-C40, C5-C30, C5-C20 oder C10-C20 und am meisten bevorzugt von C13-C17 auf.
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In
einer weitern Ausführungsform
ist das N-Aminoalkyl-(ω-thio)-Carbonsäureamid
an 50-95%, vorzugsweise an 60-95%, 70-95%, 80-95%, 90-95%, 91-95%
und am meisten bevorzugt an 92-95% der Oberfläche des Edelmetalls immobilisiert.
D.h., dass zumindest 5% der Edelmetallfläche für beispielsweise den Nachweis
von zu detektierenden Molekülen zur
Verfügung
steht.
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Es
wurde darüber
hinaus gefunden, dass zwischen der Länge des Alkylrestes R' des eingesetzten ω-Carboxylalkylthiols
und dem erzielten durchschnittlichen intramolekularen Abstand der
im mobilisierten ω-Carboxylalkylthiole
ein Zusammenhang steht. So können
durch den Einsatz längerer
Alkylreste R' größere durchschnittliche
intramolekulare Abstände
erzielt und somit eine insgesamt größere freie Oberfläche des
Edelmetalls erreicht werden.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
wird ein Verfahren zur Herstellung eines aminofunktionellen Haftvermittlersystems
für Edelmetalloberflächen bereitgestellt.
Das Verfahren umfasst die Schritte von, (i) Bereitstellen eines
Edelmetalls mit einer Oberfläche;
(ii) Immobilisieren eines ω-Carboxylalkyithiols über den
Thiolrest auf der Oberfläche;
(iii) Wahlweise Aktivieren des ω-Carboxylalkylthiols;
und (iv) Binden eines (1, ω)-Diaminoalkyls
an den Carboxylrest des ω-Carboxylalkylthiols,
um ein aminofunktionelles Haftvermittlersystem auf einer Edelmetalloberfläche zu erhalten,
in dem N-Aminoalkyl-(ω-thio)-Carbonsäureamid
mit der Formel (I) über die
Thio-Funktion auf der Edelmetalloberfläche immobilisiert und die Aminogruppe
für Folgereaktionen zugänglich ist.
Die Durchführung
der einzelnen Reaktionsschritte ist dem Fachmann bekannt und kann der
einschlägigen
Literatur entnommen werden.
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Gemäß einer
Ausführungsform
erfolgt das Aktivieren des ω-Carboxylalkyithiols
durch ein Carbodiimid, vorzugsweise 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid
(EDC) oder N-Hydroxy-succinimid (NHS). Das Aktivieren des Carboxylrests
von Carbonsäuren
mittels Carbodiimiden oder NHS und anschließender Reaktion mit einem Amin
ist dem Fachmann bekannt und kann für verschiedene Verbindungen
mit geringen Modifikationen der Reaktionsbedingungen durchgeführt werden
(V.M. Mirsky et al., Biosensors & Bioelectronics, 12 (9-10) (1997), 977-989).
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
wird das Edelmetall in Schritt (i) mit gereinigter Oberfläche bereitgestellt.
Dies kann beispielsweise durch Reinigen mit verdünnter Salzsäure (0,1-0,2 M) erfolgen.
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Gemäß einer
Ausführungsform
wird in Schritt (iv) eine Aminoguppe des (1, ω)-Diaminoalkyls mit einer Schutzgruppe
versehen, um die Reaktion der anderen Aminogruppe zu verhindern.
Geeignete Schutzgruppen umfassen beispielsweise die Benzyloxycarbonyl-
und die tert-Butoxycarbonyl-Gruppe. Weitere geeignete Schutzgruppen,
sowie ein Anbringen und Abspalten derselben sind dem Fachmann bekannt.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung des aminofunktionellen
Haftvermittlersystems für
Edelmetalloberflächen
zur Herstellung eines Biochips oder eines Microarrays, in der Katalyse,
insbesondere der heterogenen Katalyse, oder zur Modifizierung von
Edelmetalloberflächen
unter Beibehaltung der Leitfähigkeit
vorgesehen.
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Als "Biochip" oder "Microarray" wird ein Trägermaterial
bezeichnet, auf dem sich eine große Anzahl biologischer oder
biochemischer Nachweise oder Tests auf kleinem Raum befinden und
stellt ein Sammelbegriff für
eine Vielzahl unterschiedlichster Testverfahren und technischer
Verfahren dar. Ein Microarray, im Gegensatz zu einem Biochip, basiert nicht
auf Halbleitern oder elektrischen Leitern, weshalb Microarrays im
Allgemeinen keine integrierten Schaltkreise aufweisen. Microarrays
ermöglichen
somit ausschließlich
Testverfahren, die auf Interaktion zwischen den auf dem Träger immobilisierten
Molekülen
und anderen Molekülen
ohne Einbezug der Oberfläche
des Trägers
beruhen. Bei Biochips hingegen werden zusätzlich die Eigenschaften des
Trägers
zum Bestimmen von beispielsweise Redoxcyclingprozessen, bei denen
ein Molekül
verschiedene Oxidationsstufen durchläuft, verwendet.
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Ein
Mikroarray oder auch ein Biochip kann beispielsweise für die Bestimmung
von Polymorphismen, klinisch relevanten Mutationen, Expressionsmonitoring,
Fingerprinting und Sequenzierung verwendet werden. Der Mikroarray
besteht vorzugsweise aus Fängermolekülen, die
auf einer bestimmten Stelle auf der Oberfläche oder in dem Träger oder
auf dem den Träger
bede ckenden Substrat abgeschieden sind. Vorzugsweise handelt es
sich bei Mikroarrays um feste Träger,
die auf ihrer Oberfläche
eine Reihe einzelner Bereiche enthalten, die Fänger-Nukleotidsequenzen tragen, die (über Hybridisierung)
an eine oder mehrere entsprechende Ziel-Nukleotidsequenzen binden
können,
die möglicherweise
in einer zu analysierenden Probe vorhanden sind und ein charakteristisches
Muster auf dem Mikroarray ergeben. Falls die Zielsequenz geeignet
markiert ist, kann ein Signal unmittelbar an der Bindestelle erfasst, identifiziert
und gemessen werden. Die Intensität des jeweiligen Signals ermöglicht eine
Abschätzung
der Menge an in der Probe vorliegenden Zielsequenzen. Die zu identifizierende
Nukleotidsequenz wird zweckmäßigerweise
vor ihrer Hybridisierung mit den einzelsträngigen Fänger-Nukleotidsequenzen markiert. Das
Markieren, ein dem Fachmann bekanntes Verfahren, wird vorzugsweise
während
des Amplifikationsschrittes durch Einbau markierter Nukleotide oder nach
Vervollständigung
davon durch Anbringen eines Markers an die Hybride durchgeführt. Im
Fall eines Einbaus markierter Nukleotide während der Amplifikationsreaktion,
wird der Assay sensitiver je länger
die amplifizierte Sequenz ist und je mehr Marker in dem hybridisierten
Ziel vorliegt.
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Fänger-Nukleinsäuren können auf
dem festen Träger
an bestimmten Stellen unter Verwendung von Masken bei jedem Verfahrensschritt
unmittelbar synthetisiert oder als ganzes befestigt/angebracht werden.
Die Synthese umfasst das Hinzufügen
eines neuen Nukleotids an eine verlängernde Nukleinsäure, um
eine erwünschte
Sequenz an einer bestimmten Stelle zu erhalten. Dieses Verfahren
ist aus dem photolitographischen Verfahren abgeleitet und verwendet
Photo-Schutzgruppen, die vor einem Hinzufügen eines neuen Nukleotids
entfernt werden müssen
(beispielsweise die
EP 0476014 ,
US 5,445,934 ,
US 5,143,854 und
US 5,510,270 ). Allerdings liegen nur
kleine Oligonukleotide auf der Oberfläche vor und das Verfahren wird
hauptsächlich
zur Sequenzierung oder Identifizierung einer Sequenz über ein
Muster positiver Stellen verwendet, die verschiedenen auf dem Array
gebundenen Oligonukleotiden entspre chen, wobei jede der Sequenzen
aus kleinen Oligonukleotidsequenzen besteht und an verschiedene Teile
der Zielsequenz binden kann. Die Charakterisierung eine Zielsequenz
wird durch Vergleich eines bestimmten Musters mit einer Referenzsequenz
erhalten.
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Feste
Träger
können
in irgendeiner Form (beispielsweise als Kügelchen) vorliegen, weisen
jedoch vorzugsweise eine ebene Form auf und können aus verschiedenen Materialien
bzw. Werkstoffen bestehen, die insbesondere verschiedene Metalle,
Glas und Kunststoffe umfassen.
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Der
Begriff Nukleotid umfasst DNA und RNA, wobei sie Adenin, Cytosin,
Guanin, Thymin und Uracil als Basen und Desoxyribose und Ribose
als die strukturgebenden Elemente enthalten. Ein Nukleotid kann
allerdings weiterhin irgendeine modifizierte (künstliche) der momentanen Technologie
bekannte Base umfassen, die unter Verwendung von mindestens einer
der vorstehend genanten Basen (beispielsweise Inosin) zur Basenpaarung
befähigt
ist. Weiterhin sind in dem Begriff Nukleotid die Derivate der vorstehend
genannten Verbindungen, insbesondere Derivate mit Farbstoffen von
fluoreszierenden Markeren, enthalten.
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Irgendein
Verfahren gemäß des Standes
der Technik kann zum Anbringen von einzelnen Nukleotiden oder der
Nukleinsäuren
als ganzes auf den Träger
verwendet werden, das eine zeitweilige oder permanente Immobilisierung,
Fixierung oder Adhäsion des
Sondennukleotids auf eine Stelle oder einen Bereich des Trägers, durch
beispielsweise die Bildung von kovalenten, metallorganischen oder
ionischen Bindungen, Bindungen basierend auf van der Waal's Kräften oder
irgendwelchen Arten von Enzym Substrat Wechselwirkungen oder dem
so genannten Affinitätsbinden
bewirkt.
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Irgendeine
Zahl von Spacern bzw. Abstandshalter-Molekülen kann zwischen dem Träger und
den auf den Träger
aufgebrachten Nukleotiden angeordnet sein, wobei im Falle einer
Verwendung von SAMs als Trägermaterial,
die Monoschichten als Abstandshalter dienen können. Der Spacer kann beispielsweise
ein auf Polymer-basierender Spacer sein, kann jedoch ebenso aus
einer Alkankette oder irgendwelchen Derivaten davon mit einer geeigneten
Länge bestehen,
die an jedem Ende jeweils funktionelle Gruppen zum Anbringen an
den festen Träger
und die Nukleinsäure
umfasst. Vorzugsweise wurden 15-Thymidine Spacer mit einem Ende
auf den festen Träger
und mit dem anderen Ende auf das 3'-terminale Ende des/der jeweiligen zu
immobilisierenden Nukleotids/Nukleinsäure immobilisiert.
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Bei
der Nukleinsäure
kann es sich sowohl um Oligo- als auch Polynukleotide im Fall von
DNA Arrays genauso wie um Ribonukleinsäuren im Fall von RNA Arrays
handeln. Die Nukleinsäuren
des Arrays sind entweder über
eine chemische, kovalente Bindung oder durch Adhäsion immobilisiert. Die Länge der
immobilisierten Nukleinsäuren
umfasst zumindest den Bereich von 10 bis 100 Nukleinsäuren (10 mers
bis 100 mers), vorzugsweise beträgt
die Länge zumindest
20 bis 80 Nukleinsäuren,
mehr bevorzugt mindestens 20 bis 50 Nukleinsäuren genauso wie mindestens
20 bis 40 Nukleinsäuren
und am meisten bevorzugt mindestens 20 bis 30 Nukleinsäuren. Die Nukleinsäuren können entweder
unmittelbar aus Versuchsproben von Säugetieren oder auf eine dem Fachmann
gut bekannte Art synthetisiert werden.
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Zur
Implementierung eines gewöhnlichen Mikroarrays
werden drei Komponenten benötigt.
Zuerst den Mikroarray, beziehungsweise den Träger, zweitens eine Leseeinheit
und drittens Mittel zur Bewertung der Ergebnisse, beispielsweise
eine geeignete Computersoftware. Die Leseeinheit umfasst im Allgemeinen
einen beweglichen Boden (tray), Fokusierlinse(n), Spiegel und einen
geeigneten Detektor, beispielsweise eine CCD Kamera. Der bewegliche Boden
trägen
den Mikroarray und kann bewegt werden, um den Mikroarray in dem
Lichtweg einer oder mehrerer geeigneter Lichtquellen, beispielsweise
ein Laser mit einer geeigneten Wellenlänge zur Anregung einer fluoreszierenden
Verbindung, zu platzieren. Das Auswertungsprogramm oder Software
kann beispielsweise zum Erkennen spe zifischer Muster auf dem Array
dienen oder zur Analyse von verschiednen Expressionsprofilen von
Genen. In diesem Fall sucht die Software farbige Punkte auf dem Array
und vergleicht die Intensität
verschiedener Farbspektren des gleichen Punktes. Das Ergebnis kann
von einer Analyseeinheit interpretiert und danach in einem geeigneten
Dateiformat zur Weiterverarbeitung gespeichert werden.
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Sonden
sind im Allgemeinen an zwei oder mehr fluoreszierende Farbstoffe
kovalent gebunden und die Intensität der Fluoreszenz bei verschiedenen Wellenlängen eines
jeden Punkts wird mit dem Hintergrund verglichen. Der Detektor,
beispielsweise ein Photomultiplier oder CCD Array, wandelt geringe Lichtintensitäten in ein
elektrisches Signal um, das verstärkt werden kann. Andere Verfahren
verwenden verschiedene Enzyme, die an das Nukleotid mit einem Linkermolekül kovalent
gebunden sind. Die enzymatische Colorimetrie verwendet beispielsweise alkalische
Phosphatase und Meerrettich Peroxidase als Marker. Durch Kontaktieren
mit einem geeigneten Molekül
kann ein nachweisbarer Farbstoff erhalten werden. Andere chemolumineszierende
oder fluoreszierende Marker umfassen Proteine, die ein Chemolumineszenz-
oder Fluoreszenz-Signal ausstrahlen können, wenn sie mit Licht einer
bestimmten, spezifischen Wellenlänge,
beispielsweise 488 nm für
das Grüne
Fluoreszenzprotein, bestrahlt werden. Radioaktive Marker werden
im Fall verwendet, dass niedrige Nachweisgrenzen erforderlich sind,
sind allerdings aufgrund ihrer gesundheitsschädlichen Eigenschaften nicht
weit verbreitet. Eine Fluoreszenzmarkierung wird mit Nukleotiden
vorgenommen, die an ein fluoreszierendes Chromophor gebunden sind. Kombinationen
von Nukleotiden und fluoreszierendem Chromophor umfassen im Allgemeinen
Cy3 (Cyanin 3)/Cy5 (Cyanin 5) markiertes dUTP as Farbstoff, da sie
leicht aufgenommen werden können,
der Elektronenübergang
für die
Fluoreszenz durch gewöhnliche
Laser angeregt werden kann und sie ebenso bestimmte Emmisionsspektren
aufweisen.
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Eine
Hybridisierung von Mikroarrays folgt im Wesentlichen den herkömmlichen
Bedingungen von Southern oder Northern Hybridi sierungen, die dem Fachmann
gut bekannt sind. Die Schritte umfassen eine Vor-Hybridisierung,
die eigentliche Hybridisierung und einen Waschschritt nach dem Eintreten
der Hybridisierung. Die Bedingungen müssen derart gewählt werden,
dass Hintergrundsignale klein gehalten werden, dass eine minimale
Kreuzhybridisierung (im Allgemeinen eine verringerte Anzahl von
Abweichungen) auftritt und dass die Signalstärke ausreichend ist, die für manche
Anwendungen zur Konzentration des Zielmoleküls proportional sein muss.
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Das
Hybrdisierungsereignis kann im Allgemeinen durch zwei verschiedene
Arten von Array-Scannern nachgewiesen werden. Ein Verfahren bedient
sich des Prinzips der konfokalen Lasermikroskopie, das zumindest
einen Laser zur Durchmusterung des Arrays auf eine Punkt-zu-Punkt
Art verwendet. Eine Fluoreszenz wird anschließend durch Photomultiplier
nachgewiesen, die das ausgestrahlte Licht verstärken. Die kostengünstigeren
GGD basierenden Leseeinheiten verwenden für gewöhnlich gefiltertes weißes Licht
zur Anregung. Die Oberfläche des
Arrays wird mit diesem Verfahren in Abschnitten durchmustert, was
den schnelleren Erhalt von Ergebnissen einer niedrigen Aussagekraft
ermöglicht.
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Von
Wichtigkeit ist ebenso das so genannte Gridding zur Analyse der
Ergebnissen bei dem ein idealisiertes Modell des Mikroarraylayouts
mit den durchmusterten Daten verglichen wird, um die Punkt (spot)
Bestimmung zu erleichtern. Bildpunkte werden als Punkt (Vordergrund)
oder Hintergrund eingestuft (segmentiert), um die Punkt-Maske zu
erzeugen. Segmentierungsverfahren können in feste Segmentierungskreise,
anpassende Kreissegmentierung, anpassende Formsegmentierung und
Histogrammsegmentierung unterteilt werden. Die Verwendung dieser Verfahren
hängt von
der Form der Punkte (regelmäßig, unregelmäßig) und
der Qualität
der Nahanordnung der Punkte ab.
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Ein
anderer wichtiger Punkt für
die Auswertung der Ergebnisse liegt in der Intensität der verschiedenen
Punkte, da die Kon zentration der hybridisierten Nukleotide in einem
Punkt zu der Gesamtfluoreszenz dieses Punktes proportional ist.
Die gesamte Bildpunktintensität
und das Verhältnis
der verwendeten verschieden fluoreszierenden Chromophore (im Fall
con Cy3 und Cy5, grün
und rot) sind insbesondere für
die Berechnung der Punktintensität
von Wichtigkeit. Neben der Punktintensität muss ebenso die Hintergrundintensität berücksichtigt
werden, da verschiedene Effekte die Fluoreszenz der Punkte stören können, beispielsweise
die Fluoreszenz des Trägers
und der für
die Hybridisierung verwendeten Chemikalien. Dies kann durch die
so genannte Normalisierung durchgeführt werden, die die vorstehend genannten
Effekte und andere beinhaltet, wie Fluktuationen der Lichtquelle,
die geringere Verfügbarkeit/Aufnahme
der verschiednen Markermoleküle (Cy5
schlechter als Cy3) und deren Unterschiede bei Emmisionsintensitäten. Von
Wichtigkeit für
die Normalisierung ist weiterhin die Referenz gegen die normalisiert
werden soll. Im Allgemeinen kann es ein bestimmter Satz von Genen
oder eine Gruppe von Kotrollmolekülen sein, die auf dem Mikroarray
vorliegen. Die Ergebnisse können
weiterhin durch verfügbare
Softwarewerkzeuge und gemäß dem Wissenstand
der Bioinformatik weiterverarbeitet werden
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Eine
Verwendung der erfindungsgemäßen aminofunktionellen
Haftvermittlersysteme für
Edelmetalloberflächen
ist sowohl bei "zweidimensionalen" Biochips, wie
R.
Thewes et al., Labor Praxis 5 (2002), 42-45) beschrieben,
als auch "dreidimensionalen" Biochips vorgesehen.
Dreidimensionale Biochips können
durch Kombinationation der erfindungsgemäßen Haftvermittlersysteme mit
geeigneten Gelschichten, wie beispielsweise in der
WO 2004/020659 beschrieben, erzeugt
werden.
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Weiterhin
können
die erfindungsgemäßen Haftvermittlersysteme
als Träger
verwendet werden auf denen geeignete Moleküle, beispielsweise Biomoleküle, zur
Katalyse, insbesondere zur heterogenen Katalyse, angebracht sind.
In dem vorstehend beschrieben Fall dienen die Biomoleküle nicht
mehr zum Nachweis anderer Moleküle,
sondern ausschließlich
zum Umsetzen ent sprechender Substrate, um gewünschte Reaktionsprodukte zu
erhalten. Von Vorteil ist hierbei, dass oberflächenimmonbilisierte Enzyme
häufig
eine gesteigerte Enzymaktivität im
Vergleich zu einem Vorliegen in Lösung aufweisen. Katalytische
Verfahren mit SAMs sind beispielsweise in B.H. Rehm; Biochem
J. (2003) Nov 15; 376(Pt 1)15-33 und X.W. Kan et
al., Ann Chim. (2005) Jul-Aug; 95 (7-8):593-600 beschrieben.