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Technisches Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung betrifft DNA-Detektoren und insbesondere einen Detektor
für DNA-
und RNA-Sequenzen und DNA-Mutationen, der auf molekular gesteuerten
Halbleiterwiderständen
basiert.
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Technischer Hintergrund
der Erfindung
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Desoxyribonucleinsäure (DNA)
ist der genetische Informationsträger, der überwiegend im Kern lebender
Zellen zu finden ist und das primäre genetische Material aller
zellulären
Organismen und DNA-Viren bildet.
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DNA
ist ein lineares oder ringförmiges
doppelsträngiges
Helixpolymer, wobei jeder Strang eine Zucker-Phosphat-Hauptkette enthält, die
aus Desoxyribose-Zucker-Komponenten besteht, die an ihren 5'- und 3'-Hydroxylen durch
Phosphatgruppen substituiert sind, wobei die Zuckergruppen an 4
Purin- und Pyrimidinbasen
gebunden sind, die gewöhnlich
durch ihre Anfangsbuchstaben bezeichnet werden, nämlich Adenin
(A), Guanidin (G), Cytosin (C) und Thymin (T). Die zwei Einzelstränge der
DNA (ssDNA) sind durch Wasserstoffbindungen zwischen den komplementären Basenpaaren
A-T und C-G (den Watson-Crick-Basenpaaren)
der beiden Stränge
verbunden.
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Gene
sind Segmente von DNA-Molekülen;
die alle für
die Synthese eines Produkts erforderlichen Informationen enthalten,
d. h. einer Protein/Polypeptid-Kette mit einer bestimmten biologischen
Funktion oder eines RNA-Moleküls.
Eine Mutation in einem Gen, z. B. eine Änderung in einem oder mehreren
Basenpaaren des normalen Gens, kann zu einem Proteinprodukt mit
einer Veränderung
der biologischen Funktion und daher zu einem genetischen Defekt
oder einer Krankheit führen.
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Im
biologischen Syntheseprozeß von
Polypeptidketten ist der erste Schritt die Transkription, wodurch die
doppelsträngige
DNA (dSDNA) als Schablone für
die Synthese einer einzel strängigen
Ribonucleinsäure (RNA)
mit einer zu einem Strang der doppelsträngigen DNA komplementären Basensequenz
dient. Im zweiten Schritt, der Translation, wird die Polypeptidkette
unter Verwendung der RNA als Schablone synthetisiert. Die Aminosäuresequenz
des Proteins wird durch die Basensequenz in der RNA vollständig bestimmt,
die wiederum durch die Basensequenz in der DNA des Gens, aus dem
sie transkribiert wird, vollständig
bestimmt wird.
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Die
zwei Einzelstränge,
welche die doppelsträngige
DNA (dsDNA) bilden, können
in einem als Denaturierung bezeichneten Prozeß durch Erhitzen der DNA auf
~90°C oder
durch Erhöhen
des pH-Werts auf extreme Werte getrennt werden. Die denaturierten
komplementären
Stränge
können
in einem als Hybridisierung bezeichneten Prozeß durch langsames Abkühlen der
DNA auf die Körpertemperatur,
oder indem der pH-Wert wieder auf neutrale Werte vermindert wird,
wieder zu dsDNA reagieren.
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Der
Hybridisierungsprozeß bietet
auf Grund der selektiven Bindung einer einzelsträngigen DNA (ssDNA) an ihren
komplementären
Strang ein leistungsfähiges
Verfahren zur Erkennung von Mutationen in einer DNA-Sequenz. Diese
spezifische Eigenschaft der DNA wird als "Erkennungsprozeß" bezeichnet.
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Die
Selektivität
der Hybridisierung wird durch die Bedingungen beeinflußt, unter
denen dieser Prozeß durchgeführt wird,
d. h. durch das Lösungsmittel
(Ionenstärke)
und die Temperatur. Es wird erwartet, daß die Hybridisierungskinetik
von der Anzahl komplementärer
Basen abhängig
ist. Die Differenz der Hybridisierungsgeschwindigkeiten, wenn sich
die Anzahl komplementärer
Basen ändert,
ist ein Anzeichen der Selektivität
des Prozesses.
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Schnelle
und effiziente Bestimmung von DNA-Sequenzen und besonders die Identifikation
von Mutationen, die in DNA-Sequenzen
auftreten, ist von großer
Bedeutung bei der Diagnose von Erbkrankheiten und in gewissen Fällen von
Krebs.
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In
den letzten Jahren sind verschiedene Methoden zur Erkennung und
Isolierung konkreter DNA-Sequenzen entwickelt worden, beispielsweise
für Diagnose-Anwendungen.
Einige dieser Methoden basieren auf molekularer Hybridisierung,
wodurch die Bildung eines teilweise oder voll komplementären Nucleinsäure- Doppelstrangs durch
Assoziation von Einzelsträngen
auftritt, gewöhnlich
zwischen DNA- und RNA-Strängen,
aber auch zwischen RNA-Strängen.
Bei dem Verfahren der In-situ-Hybridisierung wird eine bekannte
Nucleinsäuresequenz,
einzelsträngig
und gewöhnlich
mit radioaktiven oder fluoreszierenden Markern, auf eine DNA-haltige
Probe angewandt, und eine Reassoziierung tritt in situ auf.
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Es
gibt herkömmliche
Verfahren für
automatisierte DNA-Sequenzierung
und Mutationsnachweis. Einige von diesen Verfahren schließen jedoch
radioaktive Markierung ein, die spezielle Handhabungstechniken erfordert.
Außerdem
kann die Ermittlung von Ergebnissen unter Anwendung der alten Verfahren
mehrere Tage dauern. Die computerisierten Verfahren mit ähnlichen
Prinzipien sind schneller, aber teuer.
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Die
Sensoren, die gegenwärtig
für den
Mutationsnachweis eingesetzt werden, basieren gewöhnlich auf
einer Sonden-ssDNA, die auf einem Substrat immobilisiert wird, das
Silicium, Polymer, Gold usw. sein kann. Das Substrat wird mit einem
Meßwandler
verbunden, der das Signal der an der Oberfläche auftretenden Ereignisse
in physikalisch meßbare
Parameter umwandelt. Die Anlagerung der Target-DNA an verschiedene Proben
auf dem Substrat und ihr Hybridisierungsgrad werden durch eine Änderung
des Signals angezeigt. Die Hybridisierung zwischen zwei voll komplementären Strängen liefert
eine Änderung
des Signals, die sich signifikant von der Hybridisierung zwischen
zwei nichtkomplementären
oder teilweise komplementären
Strängen unterscheiden
sollte.
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Die
gegenwärtig
entwickelten Detektoren können
nach den von ihnen genutzten Detektionsverfahren eingestuft werden.
Elektrochemische Detektoren, Detektoren auf Fluoreszenz- und Transistorbasis
sind bekannt, wobei der erste Schritt in ihrer Entwicklung der Immobilisierungsprozeß ist, in
dem der DNA-Strang
an ein Substrat gebunden wird.
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Ein
Beispiel von DNA-Sensoren, das auf Fluoreszenznachweis basiert,
wird von Nemoto et al. (US-A-5 556 529) oder von Livache et al.,
1994, beschrieben. Bei diesem Verfahren werden DNA-Sequenzen zur
Verbesserung der Empfindlichkeit durch Replikation amplifiziert
und dann zu doppelsträngiger
RNA trans kribiert. Die Synthese von doppelsträngiger RNA wird durch Fluoreszenz
quantitativ bestimmt.
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Ein
zweites Beispiel von DNA-Sensoren ist elektrochemisch begründet, wie
z. B. die von Wang et al., 1966, oder von Burton et al. (US-A-6
221 586) beschriebenen Sensoren. Bei diesem DNA-Sensortyp werden Elektroden
(z. B. Goldelektroden) mit DNA-Doppelhelices modifiziert und zur Überwachung
der Elektrochemie gebundener redoxaktiver Interkalatoren eingesetzt.
Der Basenpaarstapel innerhalb der Doppelhelix-DNA bietet ein effektives
Mittel zum Ladungstransport, und die Reaktion zwischen der an der
Elektrode adsorbierten einzelsträngigen
DNA und dem komplementären
Strang wird durch chronopotentiometrische Messungen überwacht.
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Ein
weiteres Nachweisverfahren für
biologische Reaktionen basiert auf der Anwendung eines Feldeffekttransistors
(Schenk, US-A-4 238 757), wodurch der Strom zwischen zwei Elektroden
in einem Transistor auf Siliciumbasis als Funktion der Spannung
an einer dritten, in eine biologische Lösung eingesetzten Elektrode
gemessen wird, die in dem Zwischenraum zwischen den zwei Elektroden
angeordnet wird.
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Die
PCT-Veröffentlichung
Nr. WO 98/19151 (Cahen et al., 1998) der gleichen Anmelder wie der
vorliegenden Patentanmeldung, die hier durch Verweis einbezogen
wird, so als ob sie in ihrer Gesamtheit hierin beschrieben wäre, beschreibt
ein organisch-anorganisches Hybrid-Halbleiterelement und darauf
basierende Sensoren, wobei das Element dadurch gekennzeichnet ist,
daß es
die folgenden Bestandteile aufweist:
- (i) mindestens
eine Schicht aus einem leitenden Halbleiter;
- (ii) mindestens eine isolierende Schicht;
- (iii) ein multifunktionelles organisches Sensormolekül, das an
einer seiner Oberflächen
direkt chemisch adsorbiert ist, wobei das multifunktionelle organische
Sensormolekül
mindestens eine funktionelle Gruppe, die sich an die Oberfläche bindet,
und mindestens eine weitere funktionelle Gruppe aufweist, die als
Sensor dient; und
- (iv) zwei Anschlußinseln
auf der obersten Schicht, die elektrischen Kontakt mit der elektrisch
leitenden Schicht (i) herstellen, so daß in einer endlichen Distanz
von der Oberfläche
des Bauelements elektrischer Strom zwischen ihnen fließen kann.
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Diese
molekular gesteuerten Halbleiterwiderstände, hier als MOCSER bezeichnet,
sind organisch-anorganische Hybrid-Halbleiterelemente, die aus einer oder
mehreren isolierenden oder halbisolierenden Schichten, einer leitenden
Halbleiterschicht, zwei Anschlußinseln
und einer Schicht aus multifunktionellen organischen Molekülen besteht,
dadurch gekennzeichnet, daß:
(i) die leitende Halbleiterschicht auf der isolierenden oder der
halbisolierenden Schicht angeordnet ist, (ii) die zwei Anschlußinseln
zu beiden Seiten auf einer oberen Schicht angeordnet sind, die entweder
die leitende Halbleiterschicht oder eine weitere von den isolierenden
oder halbisolierenden Schichten ist und elektrischen Kontakt mit
der leitenden Halbleiterschicht herstellt, und (iii) die Schicht
aus multifunktionellen organischen Molekülen durch mindestens eine der
funktionellen Gruppen direkt an die Oberfläche der oberen Schicht zwischen
den beiden Anschlußinseln
gebunden ist, und daß mindestens
eine weitere funktionelle Gruppen der multifunktionellen organischen
Moleküle
Chemikalien bindet oder Licht absorbiert. Die multifunktionellen
organischen Moleküle
werden durch mindestens eine funktionelle Gruppe, die unter einer
oder mehreren aliphatischen oder aromatischen Carboxyl-, Thiol-,
acyclischen Sulfid-, cyclischen Disulfid-, Hydroxamsäure- und
Trichlorsilan-Gruppen ausgewählt
ist, direkt an die Oberfläche
der oberen leitenden Halbleiterschicht oder der isolierenden oder
halbisolierenden Schicht gebunden. Die mindestens eine weitere chemikalienbindende
funktionelle Gruppe der multifunktionellen organischen Moleküle kann
eine metallbindende und Metallnachweisgruppe sein, die unter Radikalen
ausgewählt
wird, die von Hydroxamsäuren,
Bipyridyl, Imidazol und Hydroxychinolin abgeleitet sind, und die
ein Metallion nachweisen kann, wie z. B. Cu2+-,
Fe2+- und Ru2+-Metallionen.
Die mindestens eine weitere funktionelle Gruppe der multifunktionellen
organischen Moleküle,
die Licht absorbiert, wird unter aliphatischen oder aromatischen
Hydroxamaten, substituierten aromatischen Gruppen, wie z. B. Cyanobenzoyl
und Methoxy benzoyl, Bipyridylgruppen, Hydroxychinolingruppen oder
Imidazolylgruppen ausgewählt,
an die ein Metallporphyrin- oder ein Metalphthalocyaninrest gebunden
ist. Beispiele der multifunktionellen organischen Moleküle sind
2,3-Di(p-cyanobenzoyl)tartarsäure (DCDC),
4,5-Di(p-cyanobenzoyloxy)-1,2-dithian
(DCDS), 4,5-Di(p-methoxybenzoyloxy)-1,2-dithian (DMDS) und 1,2-Dithian-4,5-di(hydroxychinolin)
und der Cu2+-Komplex davon.
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Das
in WO 98/19151 beschriebene Bauelement ist ein generischer bzw.
universeller Verstärker
für chemische
Prozesse, die an seiner Oberfläche
auftreten. In einem Beispiel basiert das Bauelement auf einer GaAs/(Al,Ga)As-Struktur,
die so aufgebaut ist, daß der
durch das Bauelement fließende
Strom äußerst empfindlich
auf das elektrische Potential an seiner Oberfläche reagiert. Als Ergebnis
reagiert das Bauelement sehr empfindlich auf jede Änderung
der Ladungsverteilung in Molekülen,
die an seiner Oberfläche
adsorbiert sind (Gartsman et al., 1998; Vilan et al., 1998).
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Zusammenfassung der Erfindung
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Es
hat sich jetzt gezeigt, daß gemäß der vorliegenden
Erfindung ein Bauelement wie z. B. das in WO 98/19151 beschriebene
als DNA-Sensor dienen kann und speziell zur DNA-Analyse und als Detektor für DNA-Mutationen
angewandt werden kann. Dieses Bauelement wird hierin manchmal als
MOCSER bezeichnet.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft daher ein Halbleiterbauelement (MOCSER)
und ein Verfahren zum Nachweis einer Target-DNA oder -RNA gemäß den Patentansprüchen.
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Die
leitende Halbleiterschicht (2) eines erfindungsgemäßen MOCSERs
kann ein Halbleiter sein, der unter einem III-V-Material und einem II-VI-Material oder
deren Gemischen ausgewählt
ist, wobei III, V, II und VI die folgenden Elemente des Periodensystems
bezeichnen: III = Ga, In; V = As, P; II = Cd, Zn; VI = S, Se, Te.
Da die Adsorption von DNA auf GaAs bekannt ist, wie z. B. in WO
98/04740 und WO 99/19510 offenbart, ist in bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung die leitende Halbleiterschicht (2)
dotiertes n-GaAs oder n-(Al,Ga)As,
vorzugsweise dotiert mit Si.
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In
einer weiteren Ausführungsform
sind die eine oder die mehreren isolierenden oder halbisolierenden Halbleiterschichten
(1) eines erfindungsgemäßen Bauelements,
die als Basis für
das Bauelement dienen können,
ein Dielektrikum, das unter Siliciumoxid, Siliciumnitrid oder unter
einem undotierten Halbleiter ausgewählt wird, der unter einem III-V-
und einem II-VI-Material oder deren Gemischen ausgewählt ist,
wobei III, V, II und VI die folgenden Elemente des Periodensystems
bezeichnen: III = Ga, In; V = As, P; II = Cd, Zn; VI = S, Se, Te,
und sind vorzugsweise undotiertes GaAs- oder (Al,Ga)As-Substrat.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
basiert der erfindungsgemäße MOCSER
auf einer GaAs/(Al,GA)As-Struktur.
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Gemäß dieser
bevorzugten Ausführungsform
wird ein MOCSER bereitgestellt, wobei die leitende Halbleiterschicht
(2) aus dotiertem n-GaAs auf einer halbisolierenden Schicht
(1) aus (Al,Ga)As aufgebracht ist, die auf einer weiteren
halbisolierenden Schicht (1) aus GaAs aufgebracht ist,
und wobei auf der leitenden Halbleiterschicht (2) aus dotiertem
n-GaAs eine halbisolierende undotierte GaAs-Schicht (1)
aufgebracht ist, an der die Schicht aus der mindestens einen einzelsträngigen DNA-Sonde
(4) fixiert ist.
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Gemäß der gleichen
bevorzugten Ausführungsform
wird ferner ein MOCSER bereitgestellt, wobei die leitende Halbleiterschicht
(2) aus dotiertem n-(Al,Ga)As auf einer isolierenden Schicht
(1) aus undotiertem GaAs aufgebracht ist, die auf einer
halbisolierenden Schicht (1) aus GaAs aufgebracht ist,
wobei auf der leitenden dotierten n-(Al,Ga)As-Halbleiterschicht (2) eine
halbisolierende undotierte (Al,Ga)As-Schicht (1) aufgebracht
ist, auf der eine obere undotierte halbisolierende GaAs-Schicht
(1) aufgebracht ist, und wobei die Schicht aus mindestens
einer einzelsträngigen
DNA-Sonde (4)
an der oberen undotierten halbisolierenden GaAs-Schicht (1) fixiert ist.
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Die
einzelsträngige
DNA-Sonde variiert entsprechend dem Nachweiszweck und dem nachzuweisenden
DNA- oder RNA-Typ. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Sonde
eine Sequenz auf, die zu einer Sequenz der Target-DNA oder -RNA
komplementär
ist.
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Viele
Erbkrankheiten und genetische Störungen
werden durch eine einzige Mutation oder mehrere Mutationen in einem
Gen verursacht. Zum Beispiel sind Mutationen in Genen bekannt, die
für genetische
Störungen
wie Zystofibrose (CF), Hämophilie,
das Tay-Sachs-Syndrom, das Gaucher-Syndrom, Sichelzellenanämie usw.
verantwortlich sind, und mehr als 50% bösartige Tumoren bei Menschen
tragen eine Mutation in dem Tumorsuppressorgen p53.
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Wenn
gemäß der Erfindung
der Nachweis einer derartigen Mutation beabsichtigt ist, d. h. wenn
die Target-DNR in einer Probe eine Mutation eines Gens aufweist,
das für
eine Erbkrankheit oder genetische Störung verantwortlich ist, dann
weist die einzelsträngige
DNA-Sonde eine zu der Mutationssequenz komplementäre Sequenz
auf. Wenn zwei oder mehrere verschiedene Mutationen in dem gleichen
Gen oder in getrennten Genen bekannt sind, kann das Bauelement zwei
oder mehrere einzelsträngige
DNA-Sonden aufweisen, wobei jede Sonde eine Sequenz aufweist, die
zu einer anderen Mutationssequenz des Gens oder der Gene komplementär ist, die
für eine
Erbkrankheit oder genetische Störung
verantwortlich sind.
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Die
Erfindung betrifft außerdem
eine Matrix von Halbleiterbauelementen (MOCSER), wie oben beschrieben,
wobei jedes Bauelement in der Matrix eine andere DNA-Sonde trägt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
trägt mindestens
einer der MOCSER in der Matrix eine DNA-Sonde, die eine Sequenz
aufweist, die zu einer Sequenz einer Target-DNA oder -RNA komplementär ist.
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Zum
Nachweis einer Mutation in einem Target-Gen, das für eine Erbkrankheit
oder genetische Störung verantwortlich
ist, trägt
mindestens eines der Bauelemente in der Matrix eine DNA-Sonde, die
eine Sequenz aufweist, die zu der Mutationssequenz komplementär ist, und
mindestens ein weiteres Bauelement in der Matrix trägt eine
Kontroll-DNA-Sonde, die eine Sequenz aufweist, die zu der Sequenz
des der Mutation entsprechenden normalen Gens komplementär ist. Wenn
zwei oder mehrere bekann te Mutationen vorhanden sind, weist die
Matrix ebenso viele Bauelemente mit DNA-Sonden auf, die zu den Mutationen
komplementär
sind, und ebenso viele Bauelemente mit Kontroll-DNA-Sonden, die zu den
entsprechenden Sequenzen des normalen Gens komplementär sind.
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Die
MOCSER-Matrix kann auch als Alternative zu DNA-Chips für die Genexpressionsanalyse
verwendet werden, zum Beispiel zur Analyse der DNA- oder RNA-Expression
in Geweben oder in irgendeinem anderen Expressionssystem.
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Die
Erfindung beinhaltet ferner ein Verfahren zum Nachweis einer Target-DNA
oder -RNA, das aufweist:
- (i) Einwirkenlassen
einer Probe, welche die Target-DNA oder -RNA enthält, unter
Hybridisierungsbedingungen auf die einzelsträngige DNA-Sonde mindestens
eines Halbleiterbauelements oder einer Matrix gemäß der vorliegenden
Erfindung; und
- (ii) Überwachen
entweder der aus dem Hybridisierungsprozeß resultierenden Stromänderung,
wenn ein konstantes elektrisches Potential zwischen den zwei Anschlußinseln
angelegt wird, oder Messen der Änderung
des elektrischen Potentials, die erforderlich ist, um einen konstanten
Strom aufrechtzuerhalten.
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Im
Gegensatz zu dem in WO 98/19151 beschriebenen Bauelement, in dem
die Bildung kovalenter Bindungen zur Veränderung der Elektroneneigenschaften
des Halbleitersubstrats führt,
wird in dem erfindungsgemäßen MOCSER
die Änderung
der Elektroneneigenschaften des Substrats, die zu einer Änderung
des Stromflusses durch das Substrat führt, durch Hybridisierung verursacht,
d. h. durch die Reaktion zwischen der einzelsträngigen DNA-Sonde und der Target-DNA
oder -RNA. Wenn zwischen den zwei Elektroden des MOCSERs eine Spannung
angelegt wird, fließt
ein Strom durch das Halbleitersubstrat, jedoch im Gegensatz zu weiter
oben im Abschnitt über
den technischen Hintergrund beschriebenen elektrochemischen DNA-Sensoren gibt
es keinen Ladungstransport durch die DNA.
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendete DNA-Sonde ist von geeigneter
Länge,
wie sie gewöhnlich
in der DNA-Technologie
verwendet wird. Vorzugsweise ist die Sonde ein Oligonucleotid aus
mehr als 10 Nucleotiden. Für
den Nachweis von Mutationen sind die besten Ergebnisse mit 10–20-meren
Oligonucleotiden zu erwarten. Für
die DNA-Analyse können
größere Oligonucleotide
geeignet sein.
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Für den Nachweis
eine einzelnen Mutation läßt man eine
Probe, die eine Target-DNA mit dieser Mutation aufweist, mit einer
einzelsträngigen
DNA-Sonde eines erfindungsgemäßen MOCSERs
reagieren, der eine Sequenz aufweist, die zu der Mutationssequenz
komplementär
ist. Für
den Nachweis mehrerer Mutationen können mehrere komplementäre DNA-Sonden
auf der oberen Schicht eines einzigen MOCSERs adsorbiert werden,
oder es kann eine Matrix von MOCSERn mit jeweils einer anderen komplementären DNA-Sonde verwendet
werden.
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Das
Hybridisierungsverfahren wird nach Standardverfahren ausgeführt, die
dem Fachmann bekannt sind. An eine erfolgreiche Hybridisierung zwischen
den zwei komplementären
DNA-Strängen schließt sich
eine Änderung
des Stroms an, wenn ein konstantes elektrisches Potential zwischen
den zwei Anschlußinseln
angelegt wird, oder eine Änderung
des elektrischen Potentials, das erforderlich ist, um einen konstanten
Strom zu halten.
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Zum
Beispiel kann für
den Nachweis von Zystofibrose (CF) eine Matrix von MOCSER-Einheiten,
die DNA-Sonden mit zu den vorherrschenden CF-Mutationen komplementären Sequenzen
tragen, mit Target-DNA-Proben hybridisiert werden, die man von verschiedenen
Personen erhält.
Ein Vergleich der Signale, die von der Matrix von MOCSER-Einheiten
empfangen werden, welche die mit der DNA der getesteten Proben reassoziierten
CF-spezifischen
Sonden tragen, kann nicht nur anzeigen, daß die getestete DNA eine CF-Mutation
trägt,
sondern auch die exakte CF-Mutation innerhalb der DNA-Probe identifizieren.
Daher kann die MOCSER-Technologie eine vorteilhafte Alternative
sein, um umständlichere
und kostenaufwendigere Verfahren zu ersetzen, die gegenwärtig zum
Nachweis von DNA-Mutationen genutzt werden.
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Die
erfindungsgemäße MOCSER-Technologie
kann außerdem
für die
Genexpressionsanalyse als Alternative zu DNA-Chips genutzt werden,
wodurch die Notwendigkeit zur Verwendung von markierter DNA vermieden
wird. So können
beispielsweise zur Analyse der Expression eines bekannten Gens in
einem Gewebe oder in irgendeinem Expressionssystem, wie z. B. Bakterien,
Hefe, Säugetierzellen,
Pflanzenzellen usw., RNA-Proben mit einer Matrix von MOCSER-Einheiten
hybridisiert werden, die DNA-Sonden
tragen, die zu den Sequenzen des Target-Gens komplementär sind.
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Eine
weitere Anwendung der MOCSER-Technologie besteht in der Analyse
von nichtidentifizierten DNA-Sequenzen, wie z. B. von EST-Sequenzen.
So werden MOCSER-Einheiten, die DNA-Sonden tragen, die komplementär zu den
Sequenzen bekannter und unbekannter Gene sind, z. B. von Genen,
die spezifisch in bestimmten Geweben exprimiert sind, unter Hybridisierungsbedingungen
Proben ausgesetzt, die eine nichtidentifizierte denaturierte DNA-Sequenz
enthalten. Die Hybridisierung zu einer bekannten DNA-Sonde einer MOCSER-Einheit
ist ein Werkzeug für
die Charakterisierung der nichtidentifizierten DNA, z. B. zur Identifikation
des Ursprungsgewebes.
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Mit
den erfindungsgemäßen Bauelementen
und Verfahren können
weitere Anwendungen des Nachweises und der Analyse von DNA durchgeführt werden.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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Die
vorliegende Erfindung läßt sich
anhand der folgenden ausführlichen
Beschreibung in Verbindung mit den Beispielen und Zeichnungen vollständiger verstehen
und einschätzen.
Dabei zeigen:
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Die 1a–1b Schemata
des MOCSER-Bauelements gemäß der vorliegenden
Erfindung: 1a – die Schichtstruktur; 1b – die Anordnung;
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die 2A–C Infrarotspektren
(IR-Spektren) von ssDNA: freie DNA (Zystofibrose (CF), 33-meres Peptid)
in KBr-Pellet (A);
DNA (Kontrolle B2) auf GaAs, nach dem Waschen mit Ethanol (B) und
nach dem Spülen
in Wasser (C);
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3 IR-Spektren
von adsorbierter ssDNA (Kontrolle B2) – nach dem Spülen (ausgezogene
Linie), nach der Hybridisierung mit dem komplementären Strang
(dicke ausgezogene Linie), und nach Reaktion mit dem gleichen Strang
(gestrichelte Linie) und mit dem nichtkomplementären Strang aus drei Basen modifiziert (punktierte
Linie). Die dargestellten Hybridisierungsspektren sind nach der
Subtraktion des Spektrums der adsorbierten ssDNA (Spülen) dargestellt;
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4 IR-Spektren
von adsorbierter dsDNA (Kontrolle B2) (dicke ausgezogene Linie),
adsorbierter ssDNA (ausgezogene Linie) und adsorbierter ssDNA nach
der Hybridisierung mit ihrem komplementären Strang (gestrichelte Linie);
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5 den
gemessenen Stromfluß durch
den MOCSER während
der Adsorption von ssDNA (CF-Sequenz). Zwischen der Source- und
der Drain-Elektrode wird ein konstantes Potential von 100 mV gehalten;
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die 6A–B zeigen
den gemessenen Stromfluß durch
den MOCSER, während
eine adsorbierte ssDNA (CF-Sequenz) mit ihrem komplementären Strang
(6A) und mit einem nichtkomplementären Strang (F-508)(6B)
reagiert.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Ein
erfindungsgemäßer molekular
gesteuerter Halbleiterwiderstand (MOCSER), wurde, wie in WO 98/19151
offenbart, als mehrschichtiges Bauelement auf GaAs-Basis entwickelt,
wie in 1 dargestellt, das eine obere
n-dotierte GaAs-Schicht (aktive Schicht, 50 nm dick) enthält, die
nahe der Oberfläche
liegt. Die aktive Schicht liegt zwischen halbisolierenden Schichten,
z. B. einer undotierten GaAs-Schicht (etwa 5 nm dick) und einer
halbisolierenden AlGaAs-Schicht (etwa 150 nm dick) über einem
halbisolierenden GaAs-Substrat, das mit zwei ohmschen Kontakten,
z. B. AuGeNi, verbunden ist.
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In
dem MOCSER-Bauelement liegt, wie zuvor offenbart (Gartsman et al.,
1998), die maximale Elektronendichte in einer Tiefe von 30–50 nm von
der Oberfläche
in der aktiven Schicht. Daher beeinflussen kleine Änderungen
an der Oberfläche,
die das Oberflächenpotential
verändern,
den Widerstand des Bauelements. Der MOCSER reagiert sehr empfindlich
auf chemische Änderungen
an der Oberfläche,
wird aber auch durch Licht, Temperatur usw. beeinflußt. Um ihn
zu einem zuverlässigen
Sensor zu machen, sind daher die Änderungen in dem gemessenen
Strom, die sich aus einem chemischen Prozeß ergeben, von den anderen
Effekten zu unterscheiden.
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Der
Unterschied zwischen dem MOCSER und einem gewöhnlichen Si-FET-Bauelement
(Feldeffekttransistor) besteht darin, daß in dem letzteren der spezifische
Widerstand empfindlich auf ein äußeres Feld
reagiert, das durch die Gate-Elektrode angelegt werden kann, während in
dem MOCSER die adsorbierten Moleküle das innere Feld modifizieren
(Vilan et al., 1998).
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Bauelement zum Nachweis von Unregelmäßigkeiten
in einer DNA-Sequenz bereitgestellt, das auf einer MOCSER-Struktur
basiert, vorzugsweise ein GaAs/(AlGa)As-Bauelement, wobei auf einer
seiner Oberflächen
eine einzelsträngige
DNA-Sequenz adsorbiert ist. Ein Strom fließt durch das Halbleitersubstrat
des Bauelements, wenn zwischen seinen beiden Elektroden eine Spannung
angelegt wird. Wenn die adsorbierte einzelsträngige DNA in Wechselwirkung
mit ihrer komplementären
DNA-Sequenz tritt und Hybridisierung auftritt, dann ändert sich
der durch das Substrat fließende
Strom. Daher kann eine spezifische Bindung nachgewiesen werden,
und die Kinetik der Hybridisierung der adsorbierten einzelsträngigen DNA
mit ihrem komplementären
DNA- oder RNA-Strang
kann überwacht
werden.
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Die
vorliegende Erfindung wird aus der nachstehenden ausführlichen
Beschreibung und den Beispielen in Verbindung mit den Zeichnungen
vollständiger
einschätzbar.
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Nachstehend
wird auf 1 Bezug genommen, die schematisch
einen erfindungsgemäßen DNA-Detektor
darstellt, der auf einem Feldeffekttransistor (FET) basiert, in
dem zwei Elektroden benutzt werden. Diese FET-ähnliche Bauelementstruktur
weist eine zusätzliche
halbisolierende/undotierte (AlGa)As-Pufferschicht (1) (150 nm dick)
auf einem halbisolierenden GaAs-Substrat (1), eine dünne leitende
n-GaAs-Halbleiterschicht
(2) (50 nm dick) (aktive Schicht) auf der halbisolierenden
(AlGa)As-Schicht (1), eine obere dünne Schutzschicht aus einer
undotierten halbisolierenden GaAs-Schicht (1) (5 nm dick), welche
die leitende n-GaAs-Halbleiterschicht
(2) bedeckt und eine dünne
Schicht (4) aus einzelsträngiger DNA auf, die an der
undotierten GaAs-Oberfläche (1)
adsorbiert ist. Zwei leitende AuGeNi-Elektroden (23) dienen
als elektrische Kontakte. Dies sind die zwei ohm schen Kontakte – Source
und Drain, die mit der n-dotierten aktiven GaAs-Schicht verbunden
sind, die zwischen den halbisolierenden Schichten liegt.
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Dieser
molekular gesteuerte Halbleiterwiderstand (MOCSER) reagiert hochempfindlich
auf chemische Änderungen
an seiner Oberfläche.
Die Moleküle,
die an der GaAs-Oberfläche
adsorbiert werden, verändern das
Oberflächenpotential,
das den Widerstand des MOCSERs beeinflußt. Der MOCSER weist außerdem eine kurze
Ansprechzeit auf (Vilan et al., 1998), und seine Funktionsweise
ist sehr einfach.
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Der
Nachweis einer bestimmten DNA-Sequenz ist wichtig für die Diagnose
von Krankheiten, die auf genetische Defekte zurückzuführen sind, d. h. auf Veränderungen
in der natürlich
vorkommenden DNA-Sequenz.
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Die
Hybridisierungsreaktion zwischen komplementären DNA-Strängen ist ein sehr wichtiges
Werkzeug für
den Nachweis von DNA-Sequenzen. Die Kombination der Empfindlichkeit
des MOCSERs mit den Erkennungseigenschaften von DNA sind die Grundprinzipien
hinter der vorliegenden Erfindung. Die Entwicklung eines DNA-Detektors,
der empfindlich auf die Hybridisierungsreaktion zwischen komplementären Strängen reagiert,
wird durch die vorliegende Erfindung durch Adsorption eines DNA-Einzelstrangs
auf dem MOCSER erreicht, wobei die ssDNA mit ihrem in einer Probe
vorhandenen komplementären
DNA- oder RNA-Strang
reagiert. Da diese Reaktion Änderungen
des Stroms hervorruft, der durch das Halbleitersubstrat des MOCSERs fließt, wird
die Stromänderung
durch ein kleines elektrisches Potential gemessen, das zwischen
den zwei Elektroden angelegt wird, die Kontakt mit der leitenden
Schicht in dem Bauelement haben. Die Stromänderungen sollten spezifisch
für die
Hybridisierungsreaktion sein und sollten sich von den Stromänderungen
unterscheiden, die durch andere Reaktionen verursacht werden. Die
Stromänderung
zeigt an, daß die
adsorbierte einzelsträngige
DNA an ihren komplementären
Strang gebunden ist. Die Geschwindigkeit der Stromänderung korreliert
direkt mit der Geschwindigkeit der Hybridisierung zwischen den Molekülen.
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Die
Erfindung wird durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert.
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BEISPIELE
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a) Allgemeines Verfahren
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Die
elektronischen Eigenschaften von Halbleiterbauelementen werden stark
durch die Eigenschaften der Oberfläche beeinflußt, die
durch adsorbierte Moleküle
modifiziert werden können.
Die Wechselwirkung zwischen dem Adsorbat und dem Substrat bewirken
den Transport von Elektronen vom Adsorbat zum Substrat oder umgekehrt,
in Abhängigkeit
von der Lage der Energiezustände
in den beiden Phasen. Daher können
die Oberflächenladungsdichte
und -verteilung durch die Adsorbate verändert werden, und die Auswirkung
der Adsorbat kann bestimmt werden.
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GaAs
ist ein Halbleiter aus III-V-Verbindungen mit einem direkten Bandabstand
von 1,42 V. In den hierin beschriebenen Experimenten wurde eine
GaAs (100)-Oberfläche
benutzt, und die einzelsträngige
(ss)DNA wurde an der GaAs-Oberfläche
adsorbiert. Es ist wichtig, festzustellen, daß es in der Literatur keine
Berichte über
die Bindung von DNA an GaAs gibt. Durch Charakterisieren des Adsorptionsprozesses
und anderer Reaktionen an der GaAs-Oberfläche läßt sich die Wirkung von DNA
auf den MOCSER besser verstehen.
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Bei
Verwendung einer MOCSER-Oberfläche
aus GaAs(100) dient die Adsorption von DNA auf einem GaAs-Wafer
als Modell für
die Adsorption auf dem MOCSER. Die ssDNA wird aus einem Tropfen
ihrer Lösung in
Wasser auf dem GaAs-Wafer abgeschieden. Die ssDNA ist entweder unmodifiziert
oder an einem Ende des Strangs mit einer funktionellen Gruppe modifiziert,
wie z. B. mit Carboxyl, Thiol oder Sulfid, in welchem Fall diese
Gruppen chemisch an GaAs binden.
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Der
Adsorptionsprozeß wird
mittels Fourier-Transform Infrarotspektroskopie (FTIR-Spektroskopie) und
Kontaktwinkelmessungen überwacht.
Durch FTIR können
die Natur und die Orientierung der adsorbierten Moleküle auf der
GaAs-Oberfläche
charakterisiert werden. Die ssDNA, zum Beispiel ein Oligonucleotid,
weist mehrere Schwingungsbanden auf, die durch IR-Spektroskopie nachgewiesen
werden können.
Die Hauptmerkmale sind: (1) Carbonylgruppen aus unterschiedlichen
Bereichen in den DNA-Basen; (2) C=C- und C=N-Bindungen aus den konjugierten
Ringen der Basen; (3) die aliphatische Zucker-Gruppe; und (4) die
Phosphatgruppe.
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Kontaktwinkelmessungen
können
benutzt werden, um die Packung der adsorbierten DNA-Moleküle auf der
GaAs-Oberfläche
zu untersuchen.
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Die
Reaktion der ssDNA mit dem komplementären DNA-Strang wird über Änderungen des Stromflusses
durch den MOCSER überwacht.
Ein Tropfen der Lösung
des komplementären
DNA-Strangs wird
abgeschieden, gefolgt von Reassoziierung, um die Bindung der Stränge über die
komplementären
Basenpaare zu ermöglichen.
Diese Reaktion findet sowohl auf dem GaAs-Wafer als auch auf dem
MOCSER statt. Die Änderung
des Stromflusses durch den MOCSER sollte reproduzierbar und spezifisch
für die
Hybridisierungsreaktion sein.
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Die
Strom-Spannungs-(I-V-)Charakteristik des MOCSERs zeigt die Änderung
des Oberflächenpotentials,
die von den adsorbierten DNA-Molekülen herrührt. Die chemischen Änderungen
auf der MOCSER-Oberfläche
beeinflussen seinen Widerstand und daher den Strom. Die zeitlichen Änderungen
des Stroms werden bei konstanten Spannungswerten überwacht.
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Die
Selektivität
der Reaktion wird durch Verwendung fehlgepaarter, nicht komplementärer DNA-Stränge bestimmt.
Daher sollten sich die Größe und die
Zeitkonstante der Änderung
des Stromflusses durch den MOCSER während der fehlgepaarten Reaktion
von den Stromänderungen
während
der Hybridisierungsreaktion der mit dem passenden bzw. gepaarten
DNA-Strang unterscheiden.
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b) Die DNA-Lösungen
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Die
auf dem GaAs-Wafer adsorbierte DNA wurde chemisch synthetisiert
und dann gereinigt (im Oligonucleotid-Syntheselabor am Weizman Institute of
Science, Rehovot, Israel), um nahezu 100 der erforderlichen Sequenz
zu erhalten. Für
die Untersuchungen mittels XPS (Photoelektronenspektroskopie mit
Röntgenstrahlanregung)
und mit dem MOCSER wurde die DNA nicht gereinigt, und es wurde geschätzt, daß sie etwa
50% des spezifizierten Strangs enthielt. Die anderen Stränge in der
Gemischlösung
waren kürzer.
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Die
Oligonucleotide wurden in Wasser aufgelöst (HPLC, nach dem Autoklaven),
um Lösungen
von 1,3 mM zu erhalten. Die Sequenzen der verwendeten adsorbierten
ssDNA waren entweder ein Oligonucleotid mit einer Sequenz des Gens,
das für
die Erbkrankheit Zystofibrose (CF) verantwortlich ist, hierin als
CF-normal (33 Basen) gekennzeichnet, oder ein kürzeres Kontroll-Oligonucleotid,
hierin als Kontrolle B2 (20 Basen) bezeichnet, der folgenden Sequenzen:
CF-normal:
5'-ACCATTAAAGAAAATATCATCTTTGGTGTTTCC-3'
Kontrolle B2:
5'-GTCAAGATGCTACCGTTCAG-3'
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Die
verwendeten CF-komplementären
und CF-nichtkomplementären
Stränge
waren:
CF-komplementär:
3'-TGGTAATTTCTTTTATAGTAGAAACCRCAAAGG-5'
CF-nichtkomplementär (F-508):
5'-GGRAACACCAATGATATTTTCTTTAATGGT-3'
Kontrolle B2-komplementär: 3'-CAGTTCTACGATGGCAAGTC-5'
Kontrolle B2-nichtkomplementär (3 Basen
verschieden):
5'-CTGAATTATAGCATCTTGAC-3'
Kontrolle B2-nichtkomplementär:
5'-CTGAATTATAGCATCTTGAC-3'
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Die
komplementären
oder nichtkomplementären
Stränge
wurden in einer Hybridisierungslösung
aus den folgenden Bestandteilen aufgelöst: 1 M NaCl, 10 mM Tris pH
7,6 und 0,005% Triton X-100, hergestellt nach den Anwesungen des
Anbieters (Affymetrix, Gene Chip, Ye6100).
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Die
adsorbierte dsDNA wurde wie folgt hergestellt: gleiche Anteile der
ssDNA und ihres komplementären
Strangs wurden vermischt. Das Gemisch wurde 10 min in einem Wasserbad
von 70°C
erwärmt,
um die Trennung der Stränge
zu unterstützen.
Langsames Abkühlen
auf 35°C
in etwa 80–90
Minuten ermöglichte
die Hybridisierung zwischen den komplementären Strängen. Die abgekühlte Lösung wurde
auf 1,4 mM eingeengt.
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c) Adsorption auf dem
GaAs-Wafer
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Die
Proben aus 4 × 4
mm2 undotiertem GaAs(100) (Am. Xtal Tech)
wurden in jedem der folgenden Materialien 10 Minuten zum Sieden
gebracht: Trichlorethylen (chemisch rein), Aceton (analysenrein)
und Methanol (wasserfrei).
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Das Ätzen wurde
gemäß dem Brom/Methanol-Verfahren
durchgeführt:
jede Probe wurde durch einen mehrstufigen Zyklus aktiv gespült, beginnend
mit einer Spülung
von 15 Sekunden in einer Br2/Methanol-Lösung von
0,05 Vol.-% (extrareines Brom in wasserfreiem Methanol). Als nächstes wurde
die Probe jeweils 7–8 Sekunden
in wasserfreiem Methanol und Wasser und anschließend 15 Sekunden in 1 M KOH
gespült.
Der Zyklus wurde durch Spülen
in Wasser und in Methanol und schließlich in Br2/Methanol-Lösung abgeschlossen. Dieser
Zyklus wurde dreimal wiederholt, und dann wurde die Probe weitere
8 Sekunden in wasserfreiem Methanol gespült und anschließend unter
Stickstoff getrocknet.
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Die
sauberen und geätzten
Proben wurden in offene trockene Fläschchen eingebracht, die in
eine mit Wasser gefüllte
Petrischale gelegt wurden. Die Schalen mit den Proben wurden bei
23–28°C unter Stickstoffatmosphäre in einen
Ofen eingebracht. Die DNA wurde aus einem 15 μl-Tropfen der Lösung auf
die Probe abgeschieden. Nach dem Einbringen der DNA-Lösung wurde
für eine
Adsorption über
Nacht die Ofentür
geschlossen und der Stickstofffluß unterbrochen.
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d) Der Hybridisierungsprozeß
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Die
GaAs-Proben mit der adsorbierten ssDNA wurden in das gleiche System
eingelegt wie bei dem ssDNA-Adsorptionsverfahren. Die Temperatur
des Ofens betrug 55–60°C. Der komplementäre/nichtkomplementäre Strang
in der Hybridisierungslösung
wurde 5 Minuten in einem Wasserbad von 95–100°C erhitzt, um die Denaturierung
der DNA einzuleiten. Der Hybridisierungsprozeß wurde durchgeführt indem
ein 15 μl-Tropfen
Lösung
der komplementären/nichtkomplementären Stränge im Verlauf
von ~70 Minuten auf der Probe abgeschieden wurde.
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Nach
der Hybridisierung wurden die Proben 90 Sekunden in einer Waschlösung von
3 ml × 20
SSPE, 5 μl
10%-gem Triton X- 100
und 7 ml Wasser gespült,
die nach den Anweisungen des Anbieters (Affymetrix, Gene Chip, Ye6100),
aber mit einer 6 mal höheren
Konzentration hergestellt wurde.
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e) Infrarotmessungen
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Infrarotspektroskopie
(IR-Spektroskopie) untersucht die Eigenschwingung in Molekülen. Dieses
Verfahren kann zur Charakterisierung von adsorbierten Molekülen auf
Oberflächen,
ihres chemischen Zustands und ihrer Orientierung dienen. Das Spektrum
wird als Intensität
in Abhängigkeit
von der Energie (in Wellenzahleinheiten) aufgetragen. Eine besondere
Schwingung in einer bestimmten chemischen Bindung absorbiert eine bestimmte
Energie und weist ein gut charakterisiertes Merkmal im Spektrum
auf. Daher können
Veränderungen
in den Bindungen oder in ihrer Umgebung durch Veränderungen
in der Intensität
oder als Verschiebungen der Absorptionsenergie in dem Spektrum erkannt
werden.
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Einige
von den Vorteilen bei der Untersuchung von DNA mit IR-Spektroskopie
im Vergleich zu anderen Verfahren sind: die Möglichkeit, Proben in verschiedenen
physikalischen Zuständen
zu testen (Lösungen, Feststoffe
usw.), die Möglichkeit
zur Untersuchung von Molekülen
unterschiedlicher Größe und die
hohe Empfindlichkeit, welche die Untersuchung einer kleinen Materialmenge
ermöglichen.
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Der
untersuchte Spektralbereich ist 1800–800 cm–1,
und das Spektrum besteht aus Banden unterschiedlicher Gruppen: der
(Nucleotid-)Basen, von Zucker und Phosphat. Unterschiedliche Konformationen
(A, B oder Z) von DNA und der Übergang
zwischen ihnen als Ergebnis unterschiedlicher Bedingungen können ermittelt
werden. Wenn zum Beispiel die relative Feuchtigkeit (RH) verringert
wird, ändert
sich die Konformation von B (100 RH) nach A (58% RH), wie durch
die Änderungen
im Spektralbereich von 1000–800
cm–1 angezeigt
wird. Durch Analysieren der Änderungen
in den charakteristischen Banden kann auch die an die Oberfläche gebundene
Gruppe bestimmt werden.
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GaAs
wurde von Vilan et al., 1998, als Substrat für die Adsorption von Dicarbonsäurederivaten
durch die Carboxylgrup pen verwendet. Die Adsorption wird durch die Änderungen
in den Banden dieser Gruppen angezeigt.
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Die
Ergebnisse wurden mit einem Vergleichsspektrum verglichen. Die Vergleichsprobe
wurde nach dem Reinigen und Ätzen
aus einer GaAs-Probe gewonnen, wie oben beschrieben. Die adsorbierten
Proben wurden gemessen, nachdem sie 30 Sekunden in Ethanol gewaschen
und anschließend
10 Sekunden in Aceton gespült
und mit Stickstoff getrocknet wurden. Diese Messung ergab das Spektrum,
das auf einen DNA-Überschuß an der
Oberfläche
schließen
läßt. Als
nächstes
wurde die Probe 90 Sekunden in Wasser gespült und unter Stickstoff getrocknet,
um die überschüssige DNA
zu entfernen.
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Die
Proben nach dem Hybridisierungsprozeß wurden wie folgt gemessen:
die erste Messung wurde nach dem Trocknen mit Stickstoff durchgeführt (Überschußspektrum),
gefolgt von der Messung nach dem Spülen der Probe in einer Waschlösung, wie
oben unter (c) beschrieben.
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f) Experimente mit dem
MOCSER
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Der
für die
Lösungsreaktionen
verwendete MOCSER ist nadelförmig.
Der Kontakt zwischen der Lösung
und den elektrischen Kontakten wird durch Kapselungsmaterial vermieden.
In dieser Arbeit wurde Epoxidharz (1b) für die Kapselung
eingesetzt.
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Vor
der Adsorption von DNA wurde die Oberfläche des MOCSERs geätzt. Das Ätzverfahren
wurde durchgeführt,
indem der MOCSER 3 Sekunden in einer NH4OH:Wasser-Lösung im
Volumenverhältnis
1:10 gespült,
anschließend
10 Sekunden in Wasser gespült
und mit Stickstoff getrocknet wurde.
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Der
geätzte
MOCSER wurde in einen Probenhalter und in ein Glasfläschchen
mit Stickstoff eingebracht. Das Fläschchen wurde in einem Exsikkator
abgesetzt, der mit einer Folie bedeckt wurde, um die Lichtwirkung
auf den MOCSER zu vermindern. Die DNA wurde aus einem Tropfen von
1–2 μl der Lösung abgeschieden.
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Die
Adsorption auf dem MOCSER wurde mit einem 236-Source-Meßgerät von Keithly, USA, überwacht.
Das Potential zwischen Source- und Drain-Elektrode wurde auf 100
mV eingestellt, und der Strom wurde als Funktion der Zeit gemessen.
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Der
Hybridisierungsprozeß auf
dem MOCSER wurde an der adsorbierten Probe durchgeführt, während sie
sich in dem Fläschchen
mit dem Stickstoff befand. Das Fläschchen mit der Probe wurde
in einen auf ~80°C
erwärmten
Ofen eingesetzt. Die komplementären/nichtkomplementären Stränge wurden
aus einem Tropfen von 1–2 μl Lösung der
DNA in Wasser angelagert. Die Hybridisierung wurde ~100 Minuten
durchgeführt,
während
gleichzeitig der Strom durch den MOCSER überwacht wurde.
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Beispiel 1. Adsorption
von ssDNA auf der GaAs-Oberfläche
-
Zur
Untersuchung der Adsorption von DNA auf der GaAs-Oberfläche und zur Überprüfung der
Reaktivität
der adsorbierten DNA wurde IR-Spektroskopie angewandt. Erstens wurde
die bindende Gruppe bestimmt. Zweitens wurde der Hybridisierungsprozeß der adsorbierten
DNA charakterisiert. Die adsorbierten DNA-Stränge waren entweder die CF-Sequenz
(33 Basen) oder die Kontrollsequenz B2 (20 Basen), wie oben in Abschnitt
(b) beschrieben.
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2 zeigt die IR-Spektren von freier DNA
(2A) und der auf GaAs adsorbierten ssDNA (2B, C).
Die freie DNA wurde als KBr-Pellet von trockener ssDNA (CF-Sequenz,
vermischt mit Hexan) gemessen. Die adsorbierte ssDNA wurde durch
Abscheiden eines Tropfens DNA (Kontrolle B2) auf einer GaAs-Probe gewonnen, wie
im Abschnitt Experimente beschrieben. Die Vergleichsprobe war eine
sauber geätzte
GaAs-Probe. Das 'Überschuß'-Spektrum (2B)
wurden nach dem Waschen der adsorbierten Probe mit Ethanol aufgenommen.
Als Ergebnis des Waschens wurde weißer Feststoff auf der Oberfläche einiger
Proben ausgefällt, und
andere Proben wiesen eine dunkle Deckschicht auf. Das Spektrum 'Spülen' (2C)
wurde nach dem Spülen
der Probe mit Wasser aufgenommen. Der größte Teil des sichtbaren Abdeckmaterials
war entfernt, und die Oberfläche
war klar.
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Um
die Gruppe zu bestimmen, welche die DNA an die Oberfläche bindet,
wurden die Banden in den Spektren zugeordnet (Tabelle I), und die
Verschiebungen in den Hauptbanden der Ba sen und des Phosphats können aus
den Positionsänderungen
der Banden analysiert werden.
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Im
allgemeinen ist das Spektrum der freien DNA (2A) ähnlich dem
Spektrum von kristalliner DNA, wie sie von Urpi et al., Nuc. Acid
Res., 17: 6669 (1989) gewonnen wurde. Das 'Überschuß'-Spektrum (2B) ist ähnlich dem
Spektrum von freier DNA. Das Spektrum nach dem Spülen (Fig.
C) unterscheidet sich jedoch von den beiden obigen Spektren.
-
Die
Banden, die den Basen der DNA zugeordnet werden, sind unter anderem
die Amidcarbonyl-Bande bei 1690–1660
cm–1 und
die Banden bei 1650–1530
cm–1 des
Amids und der Doppelbindungen im Basenring. In diesem Spektralbereich
sind die Peaks im 'Überschuß'-Spektrum von ähnlicher
Form und liegen an ähnlicher
Position wie die der freien DNA. Im Überschuß-Spektrum ist jedoch der Peak bei 1665
cm–1 der
freien DNA niedriger, und ein neuer Peak erscheint bei 1648 cm–1.
Nach dem Spülen
ist die relative Intensität
dieses Spektralbereichs im Vergleich zum Phosphatbereich niedriger.
Innerhalb des Spektralbereichs der Basen ist die relative Intensität der Peaks
verändert,
aber die Positionen sind nahezu die gleichen wie im Überschuß-Spektrum.
Der Peak bei 1685 cm–1 wird nach 1686 cm–1 verschoben,
und der Peak bei 1648 cm–1 wird nach 1639 cm–1 verschoben.
Ihre relative Intensität
wird jedoch umgekehrt. Der Peak bei 1602 cm–1 ist
im Spektrum der 'adsorbierten
DNA' nicht sichtbar
und ist wahrscheinlich ein Teil der breiten Bande bei 1639 cm–1. Die
Peaks, die bei 1575 cm–1 und 1531 cm–1 lagen,
sind im Spektrum 'Spülen' zu einem Peak bei
1562 cm–1 verschmolzen.
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Tabelle
1 – Zuordnungen
der IR-Banden (Figuren 2A–C)
zu den DNA-Gruppen
-
Die
Banden im Spektralbereich von ~1230–800 cm–1 werden
den Phosphat- und Zucker-Phosphat-Schwingungen in der Hauptkette
der DNA zugeordnet. Dieser Spektralbereich im 'Überschuß'-Spektrum sieht ähnlich aus
wie das Spektrum der freien DNA. Man erhält zwei getrennte Bereiche:
den Bereich mit einem Peak bei ~1227 cm–1 und
den Bereich mit dem Peak bei ~1062 cm–1.
Die antisymmetrische Phosphat-Streckschwingung bei 1227 cm–1 in
der freien DNA wird im Überschuß-Spektrum
beobachtet, und ein zusätzlicher Peak
ist bei 1201 cm–1 sichtbar. Die symmetrische
Phosphat-Streckschwingung bei 1062 cm–1 ist
leicht nach 1057 cm–1 verschoben. Die Intensität des Peaks
bei 1089 cm–1 ist
im Vergleich zu den benachbarten Peaks niedriger.
-
Nach
dem Spülen
sind die zwei Bereiche der Phosphatbanden zu einer starken Bande
mit einem Peak bei 1091 cm–1 vereinigt. Die Bande
bei 1226 cm–1 ist
erheblich nach niedrigeren Frequenzen verschoben und ist jetzt nicht
als getrennter Peak sichtbar. Der andere Bereich der Phosphatbanden
ist ein wenig in die entgegengesetzte Richtung verschoben. Der Peak
bei 960 cm–1 ist
nur leicht nach 949 cm–1 verschoben. Der Peak bei
887 cm–1 aus
dem Überschuß-Spektrum
ist wahrscheinlich in dieser breiten Bande enthalten.
-
Aus
den Änderungen
im Spektrum der adsorbierten DNA im Vergleich zum Überschuß-DNA-Spektrum können wir
schließen,
daß die
Adsorption von ssDNA auf GaAs durch größere Verschiebungen in den
Phosphat-Banden angezeigt wird. Kleinere Verschiebungen werden in
den Banden beobachtet, die den Basen zugeordnet werden.
-
Beispiel 2. Reaktionen
der adsorbierten DNA
-
3 zeigt
die IR-Spektren der adsorbierten ssDNA (ausgezogene Linie) nach
Reaktionen mit komplementären
(dicke ausgezogene Linie) und mit nichtkomplementären (gestrichelte
und punktierte Linien) Strängen.
Der nichtkomplementäre
Strang ist entweder die gleiche Sequenz wie der adsorbierte Strang
oder die gleiche wie die komplementäre Sequenz, aber durch 3 Basen
modifiziert.
-
Tabelle
2 zeigt die Positionen der Hauptbanden in den IR-Spektren vor und
nach dem Hybridisierungsprozeß.
-
Die
verschiedenen Spektren nach der Hybridisierung unterscheiden sich
voneinander in ihren relativen Intensitäten der Peaks. Die Intensität des Spektrums
des komplementären
Strangs ist im Vergleich zu den Spektren der nichtkomplementären Stränge ein
wenig niedriger. Die Peak-Positionen erscheinen jedoch bei ähnlichen
Frequenzen und in der Energie nur leicht gegeneinander verschoben.
-
Die
den Basen entsprechenden Banden im Spektralbereich von ~1700–1550 cm–1 sind
im Anschluß an
die Hybridisierung leicht verändert.
Die Schulter bei 1688 cm–1 im Spektrum der adsorbierten
ssDNA wird nach der Hybridisierung noch beobachtet. Es gibt jedoch
auch neue Merkmale im Bereich von 1665–1650 cm–1 und
bei 1619 cm–1,
und der Peak, der bei 1638 cm–1 in der adsorbierten
ssDNA beobachtet wird, verringert sich nach der Hybridisierung.
-
Tabelle
2 – Die
Zuordnungen von IR-Spektralbanden (Fig. 3) zu den DNA-Gruppen
-
Der
Spektralbereich der Phosphatbanden ist nach dem Hybridisierungsprozeß verändert. Anstelle
einer breiten Bande bei 1090 cm–1,
wie in dem Spektrum der adsorbierten ssDNA zu sehen, werden zwei
Peaks bei 1139–1134
cm–1 und
bei 1065–1061
cm–1 beobachtet.
In dem Spektrum des komplementären
Strangs sind diese Banden gegenüber
den nichtkomplementären
Strängen
leicht nach höheren
Frequenzen verschoben. Der im Spülspektrum
bei 955 cm–1 auftretende
Peak ist nach der Hybridisierung nach höheren Frequenzen verschoben.
-
Beispiel 3. Adsorption
von doppelsträngiger
DNA (dsDNA)
-
4 zeigt
das IR-Spektrum von adsorbierter dsDNA (dicke ausgezogene Linie),
das mit adsorbierter ssDNA (ausgezogene Linie) und mit der Hybridisierung
mit dem komplementären
Strang(gestrichelte Linie) verglichen wird. Die dsDNA (Kontrolle
B2) wurde auf die gleiche Weise wie die ssDNA auf den GaAs-Proben adsorbiert.
-
Tabelle
3 – Zuordnungen
von IR-Spektralbanden (Fig. 4) zu den DNA-Gruppen
-
Um
festzustellen, daß tatsächlich die
DNA durch das Phosphat adsorbiert wird, wird das Spektrum der dsDNA
mit dem Spektrum der adsorbierten ssDNA verglichen. Um den Hybridisierungsprozeß weiter
zu charakterisieren, wird das Spektrum der adsorbierten ssDNA nach
der Reaktion mit ihrem komplementären Strang mit dem der adsorbierten
dsDNA verglichen. Die Banden in 4 sind in
der obigen Tabelle 3 zugeordnet.
-
Die
Merkmale im Basenspektralbereich (~1700–1550 cm–1)
sehen in allen Spektren ähnlich
aus. Im Phosphatbereich wird die antisymmetrische Streckschwingung
bei der dsDNA beobachtet (1206 cm–1)
und ist gegen diejenige der ssDNA (1190 cm–1)
verschoben. Im Spektrum des komplementären Strangs ist dieser Peak
ein Teil der breiten Bande, die einen Peak bei 1093 cm–1 aufweist.
Die symmetrische Streckschwingung in der dsDNA erscheint bei 1094
cm–1 und
bei 1061 cm–1.
In den Spektren der ssDNA bzw. des komplementären Strangs erscheinen diese
Banden bei 1097 cm–1 bzw. 1093 cm–1.
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Die
spektralen Merkmale der dsDNA und der ssDNR sind nahezu identisch.
Das Spektrum des komplementären
Strangs ist im allgemeinen dem der dsDNA ähnlich.
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Beispiel 4. MOCSER-Messungen
-
Die
Wirkung der Adsorption von DNA auf den durch den MOCSER fließenden Strom
wurde untersucht. Nach der Adsorption der ssDNA wurden die Reaktionen
mit den komplementären
und nichtkomplementären
Strängen
durchgeführt.
Die Ergebnisse werden im folgenden dargestellt. Bei diesen Experimenten
wurde die CF-Sequenz verwendet.
-
4.1 Adsorption von ssDNA
-
5 zeigt
die Änderung
des Stromflusses durch den MOCSER im Anschluß an die Adsorption von ssDNA.
Ein Tropfen ssDNA wurde auf den geätzten MOCSER aufgebracht, und
der Strom wurde als Funktion der Zeit aufgezeichnet.
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Der
Strom durch das blanke Bauelement vor der Adsorption betrug 1,54 μA. Im Anschluß an das
Aufbringen des Tropfens steigt der Strom nach ~15 min auf einen
Wert von ~2,85 μA
an. Nach etwa 16 h wird eine langsamere Abnahme des Stroms auf einen
Wert von 1,98 μA
beobachtet. Nachdem der MOCSER 90 Sekunden in Wasser gespült wurde,
nahm der Strom auf 1,88 μA
ab (im Diagramm nicht dargestellt).
-
Daher
wird die Adsorption von ssDNA auf dem MOCSER durch eine Nettozunahme
des Stroms durch den MOCSER angezeigt.
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4.2 Reaktionen der adsorbierten
ssDNA
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6 zeigt die Änderung des Stromflusses durch
den MOCSER im Anschluß an
die Reaktionen der adsorbierten ssDNA. 6A zeigt
den gemessenen Strom während
der Hybridisierung mit dem komplementären Strang. 6B zeigt
den gemessenen Strom bei der Durchführung der Reaktion mit einem
nichtkomplementären
Strang (F-508). Beide Reaktionen wurden etwa 2 Stunden bei 60–85°C gemessen.
-
Der
Strom durch die blanken Bauelemente vor der Adsorption betrug 1,94 μA bzw. 2,54 μA für die Bauelemente,
die zur Ermittlung der in den 6A bzw. 6B dargestellten
Ergebnisse verwendet wurden. Nach dem Aufbringen des Tropfens stieg
der Strom in beiden Bauelementen wesentlich an. Dann nahm der Strom
ab, bis er nach etwa 80 min seinen Endwert erreichte. Wenn ein komplementärer Strang
zugesetzt wurde, betrug der Endstrom 2,04 μA, und im Fall des nichtkomplementären Strangs
betrug er 2,5 μA.
-
Nach
dem Abkühlen
der Bauelemente wurden diese 90 Sekunden in Wasser gespült. Als
Ergebnis nahm der Strom bei dem komplementären Strang bzw. bei dem nichtkomplementären Strang
auf 1,85 μA
bzw. auf 1,82 μA
ab (nicht dargestellt).
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Der
Nettoanstieg des Stroms durch den MOCSER war für das Bauelement mit dem komplementären Strang
höher als
für das
Bauelement mit dem nichtkomplementären Strang.
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Beispiel 5. Messungen
mit Röntgenphotoelektronenspektroskopie
(XPS)
-
Zur
weiteren Charakterisierung der Adsorption von DNA auf der GaAs-Oberfläche wurden
XPS-Messungen durchgeführt.
Die XPS-Daten liefern eine quantitative chemische Analyse, die zur
Berechnung der Schichtdicke benutzt werden kann. Außerdem kann
sie über
die entsprechenden Linienverschiebungen und die Tiefenprofil-Informationen
auf die tatsächliche
Bindung an das Substrat hinweisen.
-
Die
ssDNA und die dsDNA (CF-Sequenzen) wurden bei dem Verfahren, das
für Adsorption
auf GaAs angewandt wird, auf GaAs-Proben adsorbiert.
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5.1
Die Dicke der adsorbierten Schicht Tabelle
4. Berechnete Dicke der Deckschicht (in Ångström) von GaAs-Proben, die mit
ssDNA oder mit dsDNA bedeckt wurden
-
Aus
der Abschwächung
der Photoelektronen kann die Dicke der adsorbierten ssDNA und dsDNA
nach drei verschiedenen Verfahren berechnet werden. Das erste und
das zweite Verfahren basieren auf den Elektronen, die nur aus dem
Substrat (aus Ga und As) emittiert werden. Unter Ausnutzung der
Tatsache, daß die Elektronenabschwächung von
ihrer kinetischen Energie abhängig
ist, kann ein Vergleich verschiedener Ga- oder As-Linien die Dicke
der Deckschicht liefern. Das dritte Verfahren basiert auf dem Verhältnis der
Deckschicht- und der Substrat-Signale.
Die nach den verschiedenen Verfahren berechneten Dickenwerte sind
in der obigen Tabelle 4 dargestellt.
-
Die
mittlere berechnete Dicke ist: 12–20 Å bzw. 8–16 Å für adsorbierte ssDNA bzw. dsDNA.
Die berechnete Dicke bei streifendem Ausfallwinkel ist größer als
bei senkrechtem Winkel. Offensichtlich ist die aus dem Signal von
Ga berechnete Dicke größer als
der Wert, der aus dem As-Peak ermittelt wird. Dies läßt auf das
Vorhandensein von As-Oxiden an der Grenzfläche schließen. Die relative Konzentration
von Ga ist jedoch größer als
die von As. Dies könnte
von der Verwendung eines falschen Empfindlichkeitsfaktors während der Datenanalyse
oder von oxidiertem Ga auf der Oberfläche herrühren. Dies kann dar auf zurückzuführen sein, daß das oxidierte
As spektral aufgelöst
wird, aber nicht das oxidierte Ga. Die mittlere Dicke der Oxidschicht wird
zu ~5 Å berechnet
(unter Anwendung der Verfahrens 3 für das Verhältnis zwischen dem Oxid-Peak
und dem As-Peak). Es scheint, daß Ga-Oxide eine erheblich niedrigere
Intensität
aufweisen; daher "sehen" die aus Ga ausgestoßenen Elektronen
eine dickere Bedeckung, die sowohl die adsorbierten Moleküle als auch
die Oxide auf dem As enthält
(~5 Å).
Daraus schließen
wir, daß die
Dicke der DNA ~10–15 Å beträgt.
-
Beispiel 6. MOCSER-Matrizen
-
Die
Notwendigkeit, die Komplexität
des genetischen Codes und der Genexpression zum Zweck des Wirkstoffdesigns
zu entziffern, hat die Notwendigkeit einer schnellen und effizienten
Durchmusterung einer großen
Zahl von DNA-Molekülen
diktiert. Die DNA-Durchmusterung ist für verschiedene Anwendungen,
zu denen die Suche nach einem unbekannten Gen aus einem Pool bekannter
Gene, die Identifikation von Einzelbasenmutationen innerhalb eines
charakterisierten Gens von mehreren tausend Basen Länge gehören; oder für die Bestimmung
des Expressionsmusters von Hunderten von Genen in bestimmten Geweben
erforderlich. DNA-Matrizen, auch bekannt als DNA-Chips, wurden als
Werkzeug entwickelt, um der technischen Herausforderung derartiger
zeitraubender Durchmusterungsanwendungen zu begegnen. DNA-Matrizen
an sich scheinen das Werkzeug der Biotechnologie des nächsten Jahrzehnts
zu werden.
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Zum
Kern der Technologie der DNA-Chips gehört eine Oberfläche, auf
der die zu durchmusternden DNA-Proben auf organisierte Weise angebracht
werden und eine Punktmatrix oder ein Punktgitter bilden. Jeder Punkt
enthält
eine andere DNA-Sequenz.
In der bisher angewandten Technologie läßt man die Target- oder Proben-DNA,
die eine radioaktive oder fluoreszierende Markierung trägt, mit
der an der Matrix fixierten DNA hybridisieren. Der Hybridisierungsgrad
der Target-DNA mit den verschiedenen Punkten der Matrix wird durch Abtasten
der Matrix und Überwachen
der Markierungskonzentration (Radioaktivität, Fluoreszenz usw.) in jedem
Punkt erfaßt.
Die durch die Technologie der DNA-Chips gestellten Anforderungen
rühren
von der matrixförmig
angeordneten Natur des Bauelements her: 1. Anbringen einer großen Zahl
verschiedener DNA-Sequenzen als diskrete Punkte in enger Nachbarschaft
auf einer Oberfläche.
2. Die Forderung nach einer fehlerfreien Ausrichtung zwischen dem
Detektorgitter und der Matrix, um eine hochauflösende Erfassung des Hybridisierungssignals
innerhalb eines eng beabstandeten Gitters zu erzielen. Diese technischen
Schwierigkeiten sind der Grund für
die hohen Kosten von gegenwärtig
im Handel erhältlichen
DNA-Chips. Außerdem
kompliziert die Notwendigkeit der Verwendung einer radioaktiven
oder fluoreszierenden DNA-Sonde sowohl die Sondenherstellung als
auch, was von größerer Bedeutung
ist, die Analyse der Ergebnisse aufgrund eines niedrigen Signal-Rausch-Verhältnisses.
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Die
MOCSER-Technologie bietet eine hervorragende und überlegene
Alternative zu DNA-Chips beim Abtasten einer großen Anzahl von DNA-Targetmolekülen mit
einer DNA-Sonde. Aufgrund der Fähigkeit
des MOCSERs, durch verschiedene elektrische Ströme zwischen einzel- und doppelsträngiger DNA
zu unterscheiden, kann jeder Punkt auf einer DNA-Matrix durch eine
MOCSER-Einheit ersetzt werden, die einen Typ einer einzelsträngigen DNA-Sonde
enthält.
Die Schwierigkeit bei der Herstellung der matrixförmig angeordneten Punkte
in einem herkömmlichen
DNA-Chip wird daher beseitigt. Nach Anlagerung einer nicht markierten
einzelsträngigen
Target-DNA an jede MOC-SER-Einheit
wird der Hybridisierungsgrad des Targets mit jeder Sondensequenz
innerhalb einer MOCSER-Einheit elektrisch erfaßt. Daher wird die Notwendigkeit
hoher Auflösung und
fehlerfreier Ausrichtung zwischen dem Detektor und der Matrix überwunden.
Außerdem
ist keine Markierung der DNA-Sonde erforderlich.
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Diskussion
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Die
Analyse von IR-Spektren und die XPS-Daten lassen auf das Phosphat
als die bindende Gruppe der DNA an die GaAs-Oberfläche schließen. Die Adsorption von DNA
kann durch die Veränderungen
in den IR-Spektren erkannt werden. Die überschüssige DNA auf der GaAs-Oberfläche (2B)
weist ein IR-Spektrum
auf, das dem der freien DNA (2A) ähnlich ist.
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Beide
Spektren sind dem Spektrum von kristalliner DNA ähnlich. Die Adsorption von
DNA-Molekülen durch
die Hauptkette wird auch durch die Adsorption von dsDNA angezeigt.
Das IR-Spektrum der adsorbierten dsDNA hat ähnliche spektrale Merkmale
wie die adsorbierte ssDNA (4). Die
Bindung von dsDNA an die Oberfläche
ist nur durch die Hauptkette und nicht durch Basen möglich, die
durch Wasserstoffbindungen gebunden werden. Daraus schließen wir,
daß eine ähnliche
Hauptkette-Substrat-Bindung in der ssDNA auftritt.
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Die
XPS-Messungen liefern eine weitere Bestätigung der Schlußfolgerung,
daß die
Adsorption der DNA durch das Phosphat erfolgt.
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Gemäß der Erfindung
zeigten wir die Bindung der DNA direkt an die GaAs-Oberfläche ohne
jede Modifikation. Dies steht im Gegensatz zu früher entwickelten DNA-Sensoren,
bei denen die Sonden-DNA durch eine zusätzliche bindende Gruppe auf
die Oberfläche
adsorbiert wurde. An Siliconoberflächen wird ssDNR über eine
modifizierte bindende Aminogruppe gebunden, und die Bindung von
DNA an eine Goldoberfläche erfolgt,
nachdem die adsorbierte DNA am Ende mit Sulfiden modifiziert wird.
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Bei
Adsorption von ssDNA auf dem MOCSER wird ein Nettoanstieg des Stroms
durch den MOCSER beobachtet (2). Unmittelbar
auf das Aufbringen der DNA folgt ein steiler Anstieg des gemessenen
Stroms. Dies kann der Lösung
zugeschrieben werden, da wir festgestellt haben, daß ein steiler
Anstieg des gemessenen Stroms beobachtet wird, wenn wir einen Tropfen
reines Wasser auf den MOCSER aufbringen (die Ergebnisse sind in
dieser Arbeit nicht dargestellt). Im Fall der DNA-Adsorption erhält man einen
Nettoanstieg des Stroms sogar nach sehr langer Zeit. Dieser Endanstieg
des Stroms ist auf die Änderung
des Oberflächenpotentials
des MOCSERs durch die adsorbierte DNA zurückzuführen. Diese Änderung
verursacht eine Verminderung der Verarmung der aktiven Schicht,
und daher nimmt der Widerstand des MOCSERs ab.
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Die
Selektivität
der Hybridisierungsprozesses wurde sowohl an dem GaAs-Wafer als
auch an dem MOCSER untersucht.
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Betrachtet
man die Intensitätsänderungen
der IR-Spektren
(3), dann ist die Intensität des Spektrums bei dem komplementären Strang
(dicke ausgezogene Linie) im Vergleich zu den nichtkomplementären Strängen (gestrichelte
und punktierte Linien) erniedrigt. Insbesondere vermindert sich
die Intensität
der Peaks für
die Banden der Basen bei 1619 cm–1 und
1560 cm–1 und
bei der Phosphatbande bei 1139 cm–1.
Dies läßt sich
durch die stärkere
Basenstapelungs-Wechselwirkung im Anschluß an den Hybridisierungsprozeß erklären. Nach
dem Denaturierungsprozeß (der
Trennung der dsDNA) nehmen die IR-Spektralbanden der Basen und des Phosphats
zu. Die nach der Adsorption von dsDNA erhaltenen Ergebnisse (4)
liefern weitere Belege für
diese Schlußfolgerung.
Die Intensitäten
der Peaks der Basen und des Phosphats (besonders die Peaks bei 1641
cm–1 und
bei 1206 cm–1)
sind niedriger als diejenigen von ssDNA. Das nach der Reaktion eines komplementären Strangs
mit einer adsorbierten ssDNA erhaltene Spektrum (4,
gestrichelte Linie) hat in diesen Banden eine höhere Intensität als die
dsDNA (4, ausgezogene Linie). Dies läßt sich durch zusätzliche
Einzelstränge
erklären,
die sich adsorptiv an die Oberfläche
anlagern. Sie werden teilweise als ssDNA adsorbiert, und nicht alle
wurden hybridisiert. Als Ergebnis sind die Intensitäten von
Peaks, die zu den Basen und zu dem Phosphat gehören, im Vergleich zum dsDNA-Spektrum
erhöht.
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Die
Hybridisierung auf dem MOCSER führte
sowohl bei den komplementären
als auch bei den nichtkomplementären
Strängen
zu einem Nettoanstieg des gemessenen Stroms. Der Strom stieg jedoch
nach der Reaktion mit dem komplementären Strang stärker an.
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Die
adsorbierte DNA stabilisiert die Oberfläche des MOCSERs, wie an dem
gemessenen Strom zu beobachten ist, der stabil ist und ein hohes
Signal-Rausch-Verhältnis
aufweist. Dies ist ein Vorteil hinsichtlich der Stabilisierung der
GaAs-Oberfläche des
MOCSERs.
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Etwa
2 Monate nach der Adsorption von DNA waren die MOCSER, die unter
Vakuum bei Raumtemperatur gelagert wurden, noch aktiv (nicht dargestellt).
Dieses Ergebnis ist für
die Entwicklung eines Sensors wichtig, der langfristig aktiv sein
kann.
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Die
Empfindlichkeit des MOCSERs ist hoch. Bei Verwendung von 1,3 mM
DNA-Lösung
lag die Stromänderung
in der Größenordnung
von Zehntel Mikroampere. Die Selektivität des MOCSERs in den vorläufigen Ergebnissen
sieht vielversprechend aus, da wir bei der Reaktion mit einem komplementären Strang
im Vergleich zu dem nichtkomplementären Strang unterschiedliche
Stromänderungen
erhielten.
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Die
Adsorption von DNA an einer GaAs-Oberfläche ist der erste Schritt zu
einer Entwicklung eines DNA-Sensors, der auf dem MOCSER basiert.
In dieser Arbeit wurde DNA durch die Phosphatgruppen direkt an die
GaAs-Oberfläche
gebunden, ohne irgendeine Modifikation der Oberfläche oder
des Substrats zu verwenden. Die Chemie der Adsorption an dem GaAs-Wafer
wurde charakterisiert. Die elektrische Veränderung des MOCSERs als Ergebnis
der Adsorption auf seiner Oberfläche
wurde ermittelt.
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Die
selektive Bindung der komplementären
Stränge
während
des Hybridisierungsprozesses wird in DNA-Sequenzdetektoren genutzt. Hier konnten
wir sowohl bei dem GaAs-Wafer als auch bei dem MOCSER zwischen der
Reaktion der adsorbierten ssDNA mit ihrem komplementären Strang
und der Reaktion mit den nichtkomplementären Strängen unterscheiden.
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Literaturangaben
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- 1. Gartsman K., Cahen D., Kadyshevitch A.,
Moav T., Naaman R., Shanzer A., Umansky V. und Vilan A., "Molecular control
of a GaAs transistor (Molekulare Steuerung eines GaAs-Transistors), Chem.
Phys. Lett., 283, 301 (1998).
- 2. Livache T., Fouque B., Teoule R., Anal. Biochem., 217, 248
(1994).
- 3. Vilan A., Ussyshkin V. R., Gartsman K., Cahen D., Naaman
R., Shanzer A., "Real
time monitoring of adsorption kinetics: Evidence for 2-site adsorption
mechanism of dicarboxylic acids on GaAs(100)" (Echtzeitüberwachung der Adsorptionskinetik:
Nachweis für
Zweipunkt-Adsorptionsmechanismus von Dicarbonsäuren auf GaAs(100)), J. Phys.
Chem. (b), 102, 3307–3309
(1998).
- 4. Wang J., Cai X., Rivas G., Shiraishi H., Farias P. A. M.,
Dontha N., Anal. Chem., 68, 2629 (1996).
