DE19964220C2

DE19964220C2 - Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche

Info

Publication number: DE19964220C2
Application number: DE19964220A
Authority: DE
Inventors: Gerhard Hartwich
Original assignee: Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH
Current assignee: FRIZ BIOCHEM GESELLSCHAFT FUER BIOANALYTIK MBH, 814
Priority date: 1998-11-23
Filing date: 1999-04-29
Publication date: 2003-07-03
Anticipated expiration: 2019-04-30
Also published as: US7056664B1; IL142758A0; TR200101179T2; PL348144A1; JP2002532386A; BR9915526A; AU751220B2; EP1133514A1; AU1383600A; CN1324365A; RU2213095C2; WO2000031101A1; CA2345157A1

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche, wobei ein Nukleinsäure-Oligomer oder ein modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomerstrang hybridisiert wird und in Form des Doppelstranghybrids auf eine leitfähige Oberfläche aufgebracht wird. Die Modifikation des Nukleinsäure-Oligomers besteht dabei in der Anbindung einer redoxaktiven Substanz, die bei einem Potential phi mit 2,0 V >= phi >= -2,0 V, gemessen gegen Normalwasserstoffelektrode, selektiv oxidierbar und reduzierbar ist.

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche.

Stand der Technik

Zur Sequenzanalyse von DNA und RNA, z. B. in der Krankheitsdiagnose, bei toxikologischen Testverfahren, in der genetischen Forschung und Entwicklung, sowie auf dem Agrar- und pharmazeutischen Sektor, werden im allgemeinen gel- elektrophoretische Verfahren mit autoradiographischer oder optischer Detektion verwendet.

Zur Veranschaulichung des wichtigsten gel-elektrophoretischen Verfahrens mit optischer Detektion (Sanger-Verfahren) ist in Fig. 1b ein DNA-Fragment mit Primer dargestellt. Bei dem Sanger-Verfahren wird eine DNA enthaltende Lösung in vier Ansätze aufgeteilt und der Primer jedes Ansatzes mit je einem bei verschiedener Wellenlänge emitierenden Fluoreszenzfarbstoff kovalent modifiziert. Wie in Fig. 1b dargestellt wird zu jedem Ansatz Desoxyribonucleosid-Triphosphat der Basen A (Adenin), T (Thymin), C (Cytosin), und G (Guanin), also dATP, dTTP, dCTP und dGTP, gegeben, um den Einzelstrang, ausgehend vom Primer, durch DNA- Polymerase I enzymatisch zu replizieren. Zusätzlich zu den vier Desoxyribonucleosid-Triphosphaten enthält jedes Reaktionsgemisch noch genügend des 2',3'-Didesoxyanalogons (Fig. 1a) eines dieser Nukleosidtriphosphate als Stoppbase (je eine der 4 möglichen Stoppbasen pro Ansatz), um die Replikation an allen möglichen Bindungsstellen zu stoppen. Nach Vereinigung der vier Ansätze entstehen replizierte DNA-Fragmente aller Längen mit stoppbasenspezifischer Fluoreszenz, die gel-elektrophoretisch der Länge nach sortiert und durch Fluoreszenz-Spektroskopie charakterisiert werden können (Fig. 1c).

Ein anderes optisches Detektionsverfahren basiert auf der Anlagerung von Fluoreszenzfarbstoffen wie z. B. Ethidiumbromid an Oligonukleotide. Die Fluoreszenz solcher Farbstoffe steigt im Vergleich zur freien Lösung des Farbstoffs um etwa das 20-fache an, wenn sie sich an doppelsträngige DNA oder RNA anlagern und kann deshalb zum Nachweis hybridisierter DNA oder RNA verwendet werden.

Bei der radioaktiven Markierung wird ³²P in das Phosphatgerüst der Oligonukleotide eingebaut, wobei ³²P gewöhnlich am 5'-Hydroxylende durch Polynukleotid-Kinase addiert wird. Die markierte DNA wird anschließend an jeweils einem der vier Nukleotidtypen bevorzugt gespalten und zwar unter definierten Bedingungen, so dass pro Kette durchschnittlich eine Spaltung erfolgt. Damit liegen im Reaktionsgemisch für einen bestimmten Basentyp Ketten vor, die sich von der ³²P- Markierung bis zur Position dieser Base erstrecken (bei mehrfachem Auftreten der Base erhält man entsprechend Ketten unterschiedlicher Länge). Die vier Fragmentgemische werden anschließend auf vier Bahnen gel-elektrophoretisch aufgetrennt. Danach wird vom Gel ein Autoradiogramm angefertigt, an dem die Sequenz unmittelbar abgelesen werden kann.

Vor einigen Jahren wurde ein weiteres, auf optischer (oder autoradiographischer) Detektion beruhendes Verfahren zur DNA-Sequenzierung entwickelt, nämlich die Sequenzierung durch Oligomerhybridisierung (vgl. z. B. Drmanac et al., Genomics 4, (1989), S. 114-128 oder Bains et al., Theor. Biol. 135, (1988), S. 303-307). Bei diesem Verfahren wird ein vollständiger Satz kurzer Oligonukleotide bzw. Oligomere (Sonden-Oligonukleotide), z. B. alle 65 536 möglichen Kombinationen der Basen A, T, C und G eines Oligonukleotid-Oktamers auf ein Trägermaterial gebunden. Die Anbindung geschieht in einem geordneten Raster aus 65 536 Test-Sites, wobei jeweils eine größere Menge einer Oligonukleotid-Kombination ein Test-Site definiert und die Position jeder einzelnen Test-Site (Oligonukleotid-Kombination) bekannt ist. Auf solch einer Hybridisierungsmatrix, dem Oligomerchip, wird ein DNA-Fragment, dessen Sequenz man ermitteln will, das Target, mit Fluoreszenz-Farbstoff (oder ³²P) markiert und unter Bedingungen, die nur eine spezifische Doppelstrangbildung erlauben, hybridisiert. Dadurch bindet das Target-DNA-Fragment nur an die Oligomere (im Beispiel an die Oktamere), deren komplementäre Sequenz exakt einem Teil (einem Oktamer) seiner eigenen Sequenz entspricht. Durch optische (oder autoradiographische) Detektion der Bindungsposition des hybridisierten DNA- Fragments werden damit alle im Fragment vorhandenen Oligomersequenzen (Oktamersequenzen) bestimmt. Aufgrund der Überlappung benachbarter Oligomersequenzen kann durch geeignete mathematische Algorithmen die fortlaufende Sequenz des DNA-Fragments bestimmt werden. Die Vorteile dieses Verfahrens liegen unter anderem in der Miniaturisierung der Sequenzierung und damit in der enormen Datenmenge, die gleichzeitig in einem Arbeitsgang erfasst wird. Daneben kann auf Primer und auf das gel-elektrophoretische Auftrennen der DNA-Fragmente verzichtet werden. Beispielhaft ist dieses Prinzip in Fig. 2 für ein 13 Basen langes DNA-Fragment gezeigt.

Die Verwendung radioaktiver Markierungen bei der DNA-/RNA-Sequenzierung ist mit mehreren Nachteilen verbunden, wie z. B. aufwendige, gesetzlich vorgeschriebene Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit radioaktiven Materialien, die Strahlenbelastung, das begrenzte räumliche Auflösungsvermögen (maximal 1 mm²) und eine Sensitivität, die nur dann hoch ist, wenn die Strahlung der radioaktiven Fragmente entsprechend lange (Stunden bis Tage) auf einen Röntgenfilm einwirkt. Es kann zwar die räumliche Auflösung durch zusätzliche Hard- und Software erhöht und die Detektionszeit durch die Verwendung von β-Scannern verkürzt werden, beides ist jedoch mit erheblichen zusätzlichen Kosten verbunden.

Die Fluoreszenzfarbstoffe, die üblicherweise zur Markierung der DNA verwendet werden, sind zum Teil (z. B. Ethidiumbromid) mutagen und erfordern, ebenso wie die Anwendung der Autoradiographie, entsprechende Sicherheitsvorkehrungen. In fast allen Fällen erfordert die Verwendung optischer Detektion den Gebrauch von einem oder mehreren Lasersystemen und somit geschultes Personal und entsprechende Sicherheitsvorkehrungen. Die eigentliche Detektion der Fluoreszenz erfordert zusätzliche Hardware, wie z. B. optische Bauelemente zur Verstärkung und, bei verschiedenen Anregungs- und Abfragewellenlängen wie im Sanger-Verfahren, ein Kontrollsystem. Abhängig von den benötigten Anregungswellenlängen und der gewünschten Detektionsleistung können somit erhebliche Investitionskosten entstehen. Bei der Sequenzierung durch Hybridisierung auf dem Oligomerchip ist die Detektion noch (kosten)aufwendiger, da, neben dem Anregungssystem, zur 2- dimensionalen Detektion der Fluoreszenzspots hochauflösende CCD-Kameras (Charge Coupled Device Kameras) benötigt werden.

Obwohl es also quantitative und extrem sensitive Methoden zur DNA-/RNA- Sequenzierung gibt, sind diese Methoden zeitaufwendig, bedingen aufwendige Probenpräparation und teure Ausstattung und sind im allgemeinen nicht als transportable Systeme verfügbar.

Ein wichtiger Schritt bei der oben beschriebenen Sequenzierung durch Oligomerhybridisierung ist das Aufbringen der Sonden-Oligonukleotide auf das Trägermaterial. Es muss nämlich darauf geachtet werden, dass zwischen den einzelnen Sonden-Oligonukleotid-Strängen genügend Platz verbleibt, um ein Hybridisieren der Target-DNA zu ermöglichen.

Darstellung der Erfindung

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche bereitzustellen, durch das Sonden-Oligonukleotid- Stränge in definierter Weise so auf die leitfähige Oberfläche aufgetragen werden, dass ein zur Hybridisierung nötiger Raum zwischen den einzelnen Strängen gewährleistet wird.

Diese Aufgabe wird durch die Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche gemäß den unabhängigen Patentansprüchen 1 und 4 gelöst.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt:

In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Nukleinsäure-Oligomere oder modifizierte Nukleinsäure-Oligomere, die durch chemische Anbindung einer redoxaktiven Substanz modifiziert sind, an eine leitfähige Oberfläche gebunden. Als Nukleinsäure-Oligomer wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verbindung aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Nukleotiden oder aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin- Basen (z. B. Adenin oder Guanin), bevorzugt ein DNA-, RNA- oder PNA-Fragment, verwendet. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff Nukleinsäure auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Rückgrat-Strukturen, wie z. B. ein Thio-Phosphat-, ein Dithio-Phosphat- oder ein Phosphoramid-Rückgrat. Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist, dass sie natürlich vorkommende cDNA oder RNA sequenzspezifisch binden kann. Alternativ zu dem Begriff "Nukleinsäure-Oligomer" werden die Begriffe "(Sonden-) Oligonukleotid", "Nukleinsäure" oder "Oligomer" verwendet.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche, wobei ein Nukleinsäure-Oligomer oder ein modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer auf eine leitfähige Oberfläche aufgebracht wird.

Bindung einer redoxaktiven Substanz an ein Nukleinsäure-Oligomer

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können modifizierte Nukleinsäure-Oligomere an eine leitfähige Oberfläche gebunden werden. Die Modifikation der Nukleinsäure- Oligomere besteht in der Bindung einer redoxaktiven Substanz an das Nukleinsäure- Oligomer. Dazu kann jede redoxaktive Substanz verwendet werden, solange sie bei einem Potential ϕ, das der Bedingung 2,0 V ≧ ϕ ≧ -2,0 V genügt, selektiv oxidierbar und reduzierbar ist. Das Potential bezieht sich hierbei auf die freie, unmodifizierte, redoxaktive Substanz in einem geeigneten Lösungsmittel, gemessen gegen Normalwasserstoffelektrode. Der Potentialbereich 1,7 V ≧ ϕ ≧ -1.7 V ist bevorzugt, der Bereich 1,4 V ≧ ϕ ≧ -1,2 V ist besonders bevorzugt und der Bereich 0,9 V ≧ ϕ ≧ - 0,7 V, in dem die redoxaktive Substanz des Anwendungsbeispiels reduziert und reoxidiert wird, ist ganz besonders bevorzugt. Unter dem Begriff "selektiv oxidierbar und reduzierbar" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Redoxreaktion, also Abgabe oder Aufnahme eines Elektrons, verstanden, welche selektiv am Ort der redoxaktiven Substanz stattfindet. Durch das angelegte Potential wird also letztendlich kein anderer Teil des Nukleinsäure-Oligomers reduziert oder oxidiert, sondern ausschließlich die an das Nukleinsäure-Oligomer gebundene redoxaktive Substanz.

Unter redoxaktiver Substanz wird jedes beliebige Molekül verstanden, das im elektrochemisch zugänglichen Potentialbereich der jeweiligen Trägeroberfläche (Elektrode) durch Anlegen einer äußeren Spannung an dieser Elektrode elektrooxidiert/-reduziert werden kann. Neben üblichen organischen und anorganischen redoxaktiven Substanzen wie z. B. Hexacyanoferraten, Ferrocenen, Acridinen oder Phtalocyaninen eignen sich zur Anbindung an das Sonden- Oligonukleotid insbesondere redoxaktive Farbstoffe wie z. B. (Metallo-)Porphyrine der allgemeinen Formel 1, (Metallo-)Chlorophylle der allgemeinen Formel 2 oder (Metallo-)Bakteriochlorophylle der allgemeinen Formel 3, (farbige) natürlich vorkommende Oxidations-Agentien wie z. B. Flavine der allgemeinen Formel 4, Pyridin-Nukleotide der allgemeinen Formel 5 oder Pyrrolo-Chinolin-Chinone (PQQ) der allgemeinen Formel 6 oder sonstige Chinone wie z. B 1,4-Benzochinone der allgemeinen Formel 7, 1,2-Benzochinone der allgemeinen Formel 8, 1,2- Naphtochinone der allgemeinen Formel 9, 1,4-Naphtochinone der allgemeinen Formel 10 oder 9,10-Anthrachinone der allgemeinen Formel 11.

M = 2H, Mg, Zn, Cu, Ni, Pd, Co, Cd, Mn, Fe, Sn, Pt etc.; R₁ bis R₁₂ sind unabhängig voneinander H oder beliebige Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder Heteroalkinyl-Substituenten.

R₁ bis R₈ sind unabhängig voneinander H oder beliebige Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder Heteroalkinyl-Substituenten.

Eine redoxaktive Substanz wird an ein Oligonukleotid kovalent durch die Reaktion des Oligonukleotids mit der redoxaktiven Substanz gebunden. Diese Bindung kann auf drei verschiedene Arten durchgeführt werden:

a) Als reaktive Gruppe zur Bindungsbildung am Nukleinsäure-Oligomer wird eine freie Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppe des Oligonukleotid-Rückgrats, insbesondere eine Gruppe an einem der beiden Enden des Oligonukleotid-Rückgrats, verwendet. Die freien, endständigen Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppen weisen eine erhöhte Reaktivität auf und gehen daher leicht typische Reaktionen wie z. B. Amidbildung mit (primären oder sekundären) Aminogruppen bzw. mit Säuregruppen, Esterbildung mit (primären, sekundären oder tertiären) Alkoholen bzw. mit Säuregruppen, Thioesterbildung mit (primären, sekundären oder tertiären) Thio-Alkoholen bzw. mit Säuregruppen oder die Kondensation von Amin und Aldehyd mit anschließender Reduktion der entstandenen CH=N Bindung zur CH₂-NH Bindung ein. Die zur kovalenten Anbindung der redoxaktiven Substanz nötige Kopplungsgruppe (Säure-, Amin-, Alkohol-, Thioalkohol- oder Aldehydfunktion) ist entweder natürlicherweise an der redoxaktiven Substanz vorhanden oder wird durch chemische Modifikation der redoxaktiven Substanz erhalten.
b) Das Nukleinsäure-Oligomer ist über einen kovalent angebundenen Molekülteil (Spacer) beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen), insbesondere der Kettenlänge 1 bis 14, am Oligonukleotid-Rückgrat bzw. an einer Base mit einer reaktiven Gruppe modifiziert. Die Modifikation erfolgt bevorzugt an einem der Enden des Oligonukleotid-Rückgrats bzw. an einer terminalen Base. Als Spacer kann z. B. ein Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder Heteroalkinylsubstituent verwendet werden. Mögliche einfache Reaktionen zur Ausbildung der kovalenten Bindung zwischen redoxaktiver Substanz und des so modifizierten Nukleinsäure-Oligomers sind wie unter a) beschrieben, die Amidbildung aus Säure- und Amino-Gruppe, die Esterbildung aus Säure- und Alkohol-Gruppe, die Thioesterbildung aus Säure- und Thio-Alkohol-Gruppe oder die Kondensation von Aldehyd und Amin mit anschließender Reduktion der entstandenen CH=N Bindung zur CH₂-NH Bindung.
Bevorzugt ist das Nukleinsäure-Oligomer durch eine redoxaktive Substanz modifiziert, die Bereiche mit einem überwiegend planaren, in einer Ebene ausgedehnten p-π-Orbital-System aufweist, wie z. B. das PQQ des Beispiels 1 oder die Chinone der Formel 5 oder 7-12 oder die porphinoiden Strukturen der Formeln 1 -4 bzw. die Pyridin-Nukleotide der allgemeinen Formel 6 bzw. Derivate dieser redoxaktiven Substanzen. In diesem Fall kann der Spacer, über den die redoxaktive Substanz an das Nukleinsäure-Oligomer gebunden ist, so gewählt werden, dass sich die Ebene der π-Orbitale der redoxaktiven Substanz parallel zu den p-π-Orbitalen der an die redoxaktive Substanz angrenzenden Basen des Nukleinsäure-Oligomers anordnen kann. Diese räumliche Anordnung von redoxaktiver Substanz mit teilweise planarem in einer Ebene ausgedehnten p-π-Orbitalen erweist sich als besonders günstig.
c) Bei der Synthese des Nukleinsäure-Oligomers wird eine terminale Base durch die redoxaktive Substanz ersetzt.

Die Bindung der redoxaktiven Substanz an das Oligonukleotid kann wie unter a) und b) beschrieben vor oder nach der Bindung des Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche erfolgen. Die Anbindung der redoxaktiven Substanz an das auf der leitfähigen Oberfläche gebundene Oligonukleotid erfolgt dann ebenfalls wie unter a) und b) beschrieben.

Bei mehreren verschiedenen Oligonukleotid-Kombinationen (Test-Sites) auf einer gemeinsamen Oberfläche ist es vorteilhaft, die (kovalente) Anbindung der redoxaktiven Substanz an die Sonden-Oligonukleotide durch geeignete Wahl der reaktiven Gruppe an den freien Sonden-Oligonukleotidenden der verschiedenen Test-Sites für die gesamte Oberfläche zu vereinheitlichen.

Die leitfähige Oberfläche

Unter dem Begriff "leitfähige Oberfläche" wird jeder Träger mit einer elektrisch leitfähigen Oberfläche beliebiger Dicke verstanden, insbesondere Oberflächen aus Platin, Palladium, Gold, Cadmium, Quecksilber, Nickel, Zink, Kohlenstoff, Silber, Kupfer, Eisen, Blei, Aluminium und Mangan. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe "Elektrode" und "leitfähige (Träger-)Oberfläche" alternativ zu "leitfähige Oberfläche " gebraucht.

Daneben können auch beliebige dotierte oder nicht dotierte Halbleiteroberflächen beliebiger Dicke verwendet werden. Sämtliche Halbleiter können als Reinsubstanzen oder als Gemische Verwendung finden. Als nicht einschränkend gemeinte Beispiele seien an dieser Stelle Kohlenstoff, Silizium, Germanium, α-Zinn, Cu(I)- und Ag(I)- Halogenide beliebiger Kristallstruktur genannt. Geeignet sind ebenfalls sämtliche binären Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur der Elemente der Gruppen 14 und 16, der Elemente der Gruppen 13 und 15, sowie der Elemente der Gruppen 15 und 16. Daneben können ternäre Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur der Elemente der Gruppen 11, 13 und 16 oder der Elemente der Gruppen 12, 13 und 16 verwendet werden. Die Bezeichnungen der Gruppen des Periodensystems der Elemente beziehen sich auf die IUPAC-Empfehlung von 1985.

Bindung eines Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche

Erfindungsgemäß wird ein Oligonukleotid direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Trägeroberflächenatomen oder -molekülen einer leitfähigen Trägeroberfläche der oben beschriebenen Art verknüpft. Diese Bindung kann auf drei verschiedene Arten durchgeführt werden:

a) Die Oberfläche wird so modifiziert, dass eine reaktive Molekül-Gruppe zugänglich ist. Dies kann durch direkte Derivatisierung der Oberflächenmoleküle, z. B. durch naßchemische oder elektrochemische Oxidation/Reduktion geschehen. So kann z. B. die Oberfläche von Graphitelektroden durch Oxidation naßchemisch mit Aldehyd- oder Carbonsäure-Gruppen versehen werden. Elektrochemisch besteht z. B. die Möglichkeit durch Reduktion in Gegenwart von Aryl-Diazoniumsalzen das entsprechende (funktionalisierte, also mit einer reaktiven Gruppe versehene) Aryl- Radikal oder durch Oxidation in Gegenwart von R'CO₂H das (funktionalisierte) R'- Radikal auf der Graphit-Elektrodenoberfläche anzukoppeln. Ein Beispiel der direkten Modifikation von Halbleiteroberflächen ist die Derivatisierung von Siliziumoberflächen zu reaktiven Silanolen, d. h. Silizium-Träger mit Si-OR" Gruppen an der Oberfläche, wobei R" ebenso wie R' einen beliebigen, funktionalisierten, organischen Rest darstellt (z. B. Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder Heteroalkinylsubstituent). Alternativ kann die gesamte Oberfläche durch die kovalente Anbindung einer reaktiven Gruppe eines bifunktionalen Linkers modifiziert werden, so dass auf der Oberfläche eine monomolekulare Schicht beliebiger Moleküle entsteht, die, bevorzugt endständig, eine reaktive Gruppe enthalten. Unter dem Begriff "bifunktionaler Linker" wird jedes Molekül beliebiger Kettenlänge, insbesondere der Kettenlängen 2-14, mit zwei gleichen (homo-bifunktional) oder zwei verschiedenen (hetero-bifunktional) reaktiven Molekül-Gruppen verstanden.
Sollen mehrere verschiedene Test-Sites auf der Oberfläche durch Ausnutzen der Methodik der Photolithographie gebildet werden, so ist mindestens eine der reaktiven Gruppen des homo- oder hetereo-bifunktionalen Linkers eine photoinduzierbar reaktive Gruppe, d. h. eine erst durch Lichteinstrahlung bestimmter oder beliebiger Wellenlänge reaktiv werdende Gruppe. Dieser Linker wird so aufgebracht, dass die/eine photoaktivierbare reaktive Gruppe nach der kovalenten Anbindung des Linkers auf der Oberfläche zur Verfügung steht. An die so modifizierte Oberfläche werden die Nukleinsäure-Oligomere kovalent angebunden, wobei diese selbst über einen Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 1-14, mit einer reaktiven Gruppe modifiziert sind, bevorzugt in der Nähe eines Endes des Nukleinsäure-Oligomers. Bei der reaktiven Gruppe des Oligonukleotids handelt es sich um Gruppen, die direkt (oder indirekt) mit der modifizierten Oberfläche unter Ausbildung einer kovalenten Bindung reagieren. Daneben kann an die Nukleinsäure-Oligomere in der Nähe ihres zweiten Endes eine weitere reaktive Gruppe gebunden sein, wobei diese reaktive Gruppe wiederum, wie oben beschrieben, direkt oder über einen Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 1-14, angebunden ist. Desweiteren kann die redoxaktive Substanz alternativ zu dieser weiteren reaktiven Gruppe, an diesem zweiten Ende des Nukleinsäure-Oligomers angebunden sein.
b) Das Nukleinsäure-Oligomer, das auf die leitfähige Oberfläche aufgebracht werden soll, ist über einen kovalent angebundenen Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 1-14, mit einer oder mehreren reaktiven Gruppe modifiziert, wobei sich diese reaktiven Gruppen bevorzugt in der Nähe eines Endes des Nukleinsäure-Oligomers befinden. Bei den reaktiven Gruppen handelt es sich um Gruppen, die direkt mit der unmodifizierten Oberfläche reagieren können. Beispiele hierfür sind: (i) Thiol-(HS-) oder Disulfid-(S-S-) derivatisierte Nukleinsäure-Oligomere der allgemeinen Formel (n × HS-Spacer)-oligo, (n × R-S-S- Spacer)-oligo oder oligo-Spacer-S-S-Spacer-oligo, die mit einer Goldoberfläche unter Ausbildung von Gold-Schwefelbindungen reagieren oder (ii) Amine, die sich durch Chemi- oder Physisorption an Platin- oder Silizium-Oberflächen anlagern. Daneben kann an die Nukleinsäure-Oligomere in der Nähe ihres zweiten Endes eine weitere reaktive Gruppe gebunden sein, wobei diese reaktive Gruppe wiederum, wie oben beschrieben, direkt oder über einen Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 1-14, angebunden ist. Desweiteren kann die redoxaktive Substanz, alternativ zu dieser weiteren reaktiven Gruppe, an diesem zweiten Ende des Oligonukleotids angebunden sein. Insbesondere Nukleinsäure-Oligomere, die mit mehreren Spacer-verbrückten Thiol oder Disulfidbrücken modifiziert sind ((n × HS-Spacer)-oligo bzw. (n × R-S-S-Spacer)- oligo), haben den Vorteil, dass solche Nukleinsäure-Oligomere unter einem bestimmten Anstellwinkel gegen die leitfähige Oberfläche (Winkel zwischen der Oberflächennormalen und der Helixachse eines doppelsträngigen helikalen Nukleinsäure-Oligomers bzw. zwischen der Oberflächennormalen und der Achse senkrecht zu den Basenpaaren eines doppelsträngigen nicht-helikalen Nukleinsäure- Oligomers) aufgebracht werden können, wenn die die Thiol- bzw. Disulfid-Funktionen an das Nukleinsäure-Oligomer anbindenden Spacer, von einem Ende der Nukleinsäure her betrachtet, eine zunehmende bzw. abnehmende Kettenlänge besitzen.
c) Als reaktive Gruppe am Sonden-Nukleinsäure-Oligomer werden die Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppen des Oligonukleotid-Rückgrats, insbesondere endständige Gruppen, verwendet. Die Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppen weisen eine erhöhte Reaktivität auf und gehen daher leicht typische Reaktionen wie z. B. Amidbildung mit (primären oder sekundären) Amino- bzw. Säuregruppen, Esterbildung mit (primären, sekundären oder tertiären) Alkoholen bzw. Säuregruppen, Thioesterbildung mit (primären, sekundären oder tertiären) Thio- Alkoholen bzw. Säuregruppen oder die Kondensation von Amin und Aldehyd mit anschließender Reduktion der entstandenen CH=N Bindung zur CH₂-NH Bindung ein. Die nötige Kopplungs-Gruppe zur kovalenten Anbindung an die Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppe ist in diesem Fall ein Teil der Oberflächenderivatisierung mit einer (monomolekularen) Schicht beliebiger Moleküllänge, wie unter a) in diesem Abschnitt beschrieben, oder die Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppe kann direkt mit der unmodifizierten Oberfläche reagieren, wie unter b) in diesem Abschnitt beschrieben. Daneben kann an die Oligonukleotide in der Nähe ihres zweiten Endes eine weitere reaktive Gruppe gebunden sein, wobei diese reaktive Gruppe wiederum, wie oben beschrieben, direkt oder über einen Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 1-14, angebunden ist. Desweiteren kann die redoxaktive Substanz, alternativ zu dieser weiteren reaktiven Gruppe, an diesem zweiten Ende des Nukleinsäure-Oligomers angebunden sein.

Die Bindung des Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche kann alternativ vor oder nach der Anbindung der redoxaktiven Substanz an das Oligonukleotid bzw. vor oder nach Anbinden des mit einer reaktiven Gruppe versehenen Spacers zur Bindung der redoxaktiven Substanz erfolgen. Die Bindung des bereits modifizierten Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche, d. h. die Bindung an die Oberfläche nach der Anbindung der redoxaktiven Substanz an das Oligonukleotid bzw. nach der Anbindung des mit einer reaktiven Gruppe versehenen Spacers zur Bindung der redoxaktiven Substanz, erfolgt ebenfalls wie unter a) bis c) (Abschnitt "Bindung eines Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche") beschrieben.

Bei der Herstellung der Test-Sites muß bei der Anbindung der Einzelstrang- Oligonukleotide an die Oberfläche darauf geachtet werden, dass zwischen den einzelnen Oligonukleotiden ein genügend großer Abstand verbleibt, um den für eine Hybridisierung mit dem Target-Oligonukleotid nötigen Freiraum zur Verfügung zu stellen. Dazu bieten sich unter anderem zwei verschiedene Vorgehensweisen an:

1. In einem bekannten Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Trägeroberfläche wird eine Anbindung eines hybridisierten Oligonukleotids durchgeführt, also eine Trägeroberflächen-Derivatisierung mit hybridisiertem Sonden-Oligonukleotid statt mit Einzelstrang-Sonden-Oligonukleotid. Der zur Hybridisierung verwendete Oligonukleotidstrang ist unmodifiziert (die Oberflächenanbindung wird durchgeführt wie unter a)-c) im Abschnitt "Bindung eines Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche" beschrieben). Anschließend wird der hybridisierte Oligonukleotid-Doppelstrang thermischer dehybridisiert, wodurch eine Einzelstrang-Oligonukleotid modifizierte Trägeroberfläche mit größerem Abstand zwischen den Proboligonukleotiden hergestellt wird.
2. In den erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Trägeroberfläche wird eine Anbindung eines Einzelstrang- oder Doppelstrang- Oligonukleotids durchgeführt, wobei während der Trägeroberflächen-Derivatisierung ein geeigneter monofunktionaler Linker zugesetzt wird, der neben dem Einzelstrang- oder Doppelstrang-Oligonukleotid auch an die Oberfläche gebunden wird (die Oberflächenanbindung wird durchgeführt wie unter a)-c) im Abschnitt "Bindung eines Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche" beschrieben). Erfindungsgemäß hat der monofunktionale Linker eine Kettenlänge, die der Kettenlänge des Spacers zwischen Trägeroberfläche und Oligonukleotid identisch ist oder um maximal acht Kettenatome abweicht. Bei der Verwendung von Doppelstrang-Oligonukleotid zur Trägeroberflächen- Derivatisierung wird nach der Anbindung des Doppelstrang-Oligonukleotids und des Linkers an die Trägeroberfläche der hybridisierte Oligonukleotid-Doppelstrang thermisch dehybridisiert, wie oben unter 1.) beschrieben. Durch die gleichzeitige Anbindung eines Linkers an die Oberfläche wird der Abstand zwischen den ebenfalls an die Oberfläche gebundenen Einzel- oder Doppelstrang-Nukleinsäure-Oligomeren vergrößert. Im Falle der Verwendung von Doppelstrang-Nukleinsäure-Oligomer wird dieser Effekt durch die anschließende thermische Dehybridisierung noch verstärkt.

Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäureoligomerhybriden

Vorteilhafterweise werden zur elektrochemischen Detektion mehrere Sonden- Oligonukleotide unterschiedlicher Sequenz, idealerweise alle nötigen Kombinationen des Nukleinsäure-Oligomers, auf einem Oligomer- oder DNA-Chip aufgebracht, um die Sequenz eines beliebigen Target-Oligomers oder einer (fragmentierten) Target- DNA sicher zu detektieren bzw. um Mutationen im Target aufzuspüren und sequenzspezifisch nachzuweisen. Dazu werden auf einer leitfähigen Trägeroberfläche die Trägeroberflächenatome oder -moleküle eines definierten Bereichs (einer Test-Site) mit DNA-/RNA-/PNA-Oligonukleotiden bekannter, aber beliebiger Sequenz, wie oben beschrieben, verknüpft. Der DNA-Chip kann aber auch mit einem einzigen Sonden-Oligonukleotid derivatisiert werden. Als Sonden- Oligonukleotide werden Nukleinsäure-Oligomere (DNA-, RNA- oder PNA-Fragmente) der Basenlänge 3 bis 50, bevorzugt der Länge 5 bis 30, besonders bevorzugt der Länge 7 bis 25 verwendet. An die Sonden-Oligonukleotide wird entweder vor oder nach deren Bindung an die leitfähige Oberfläche eine redoxaktive Substanz gebunden.

Erfolgt die Modifikation der Sonden-Oligonukleotide vor der Bindung an die leitfähige Oberfläche, so werden die bereits modifizierten Sonden-Oligonukleotide wie oben beschrieben an die leitfähige Oberfläche gebunden. Alternativ werden die nicht modifizierten, an die leitfähige Oberfläche gebundenen Sonden-Oligonukleotide am zweiten, freien Ende der Oligonukleotidkette direkt oder indirekt über einen Spacer mit einer redoxaktive Substanz modifiziert.

In beiden Fällen entsteht ein Oberflächen-Hybrid der allgemeinen Struktur Elek- Spacer-ss-oligo-Spacer-Redox (Fig. 3). Die elektrische Kommunikation zwischen der (leitfähigen) Trägeroberfläche und der über ein Einzelstrang-Oligonukleotid verbrückten redoxaktiven Substanz ("Redox") in der allgemeinen Struktur Elek- Spacer-ss-oligo-Spacer-Redox ist schwach oder gar nicht vorhanden. Die Verbrückungen können natürlich auch ohne Spacer oder mit nur einem Spacer (Elek-ss-oligo-Spacer-Redox bzw Elek-Spacer-ss-oligo-Redox) durchgeführt werden.

In einem nächsten Schritt werden die Test-Sites mit der zu untersuchenden Oligonukleotid-Lösung (Target) in Kontakt gebracht. Dabei kommt es nur in dem Fall zur Hybridisierung, in dem die Lösung Oligonukleotid-Stränge enthält, die zu den an die leitfähige Oberfläche gebundenen Sonden-Oligonukleotiden komplementär, oder zumindest in weiten Bereichen komplementär sind. Im Falle der Hybridisierung zwischen Sonden- und Target-Oligonukleotid kommt es zu einer verstärkten Leitfähigkeit zwischen der Trägeroberfläche und der redoxaktiven Substanz, da diese nunmehr über das aus einem Doppelstrang bestehende Oligonukleotid verbrückt ist (in Fig. 3 an einem Beispiel der Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Redox schematisch gezeigt).

Durch die Veränderung der elektrischen Kommunikation zwischen der (leitfähigen) Trägeroberfläche und der redoxaktiven Substanz aufgrund der Hybridisierung von Sonden-Oligonukleotid und dem dazu komplementären Oligonukleotid-Strang (Target) kann somit ein sequenzspezifisches Hybridisierungsereignis durch elektrochemische Verfahren wie z. B. Cyclovoltametrie, Amperometrie oder Leitfähigkeitsmessungen detektiert werden.

Bevorzugt wird eine redoxaktive Substanz verwendet, die Bereiche mit einem überwiegend planaren, in einer Ebene ausgedehnten p-π-Orbital-System aufweist, wie z. B. das PQQ des Beispiels 1 (vgl. Fig. 3), oder die Chinone der Formel 5 oder 7-12 oder die porphinoiden Strukturen der Formeln 1-4, die Pyridin-Nukleotide der allgemeinen Formel 6 sowie Derivate dieser redoxaktiven Substanzen. In diesem Fall wird der Spacer zwischen Nukleinsäure-Oligomer und der redoxaktiven Substanz so gewählt, dass sich die Ebene der π-Orbitale der redoxaktiven Substanz parallel zu den p-π-Orbitalen des an die redoxaktive Substanz angrenzenden Basenpaars des mit Komplimentärstrang hybridisierten Nukleinsäure-Oligomers anordnen kann. Diese räumliche Anordnung von redoxaktiver Substanz mit teilweise planarem in einer Ebene ausgedehnten p-π-Orbitalen erweist sich für die elektrische Leitfähigkeit der Doppelstrang-Nukleinsäure-Oligomere als besonders günstig.

Bei der Cyclovoltametrie wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode zeitabhängig linear verändert. Ausgehend von einem Potential bei dem keine Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet, wird das Potential solange verändert bis die redoxaktive Substanz oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungskurve einen zunächst ansteigenden Strom, einen Maximalstrom (Peak) und dann einen allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Verhalten der Produkte der Elektrooxidation oder -reduktion aufgezeichnet.

Eine alternative elektrische Detektionsmethode, die Amperometrie, wird dadurch ermöglicht, dass die redoxaktive Substanz durch Anlegen eines geeigneten, konstant gehaltenen Elektrodenpotentials zwar elektrooxidiert (elektroreduziert) wird, die Rereduktion (Reoxidation) der redoxaktiven Substanz in den ursprünglichen Zustand aber nicht durch Änderung des Elektrodenpotentials erreicht wird, wie in der Cyclovoltametrie, sondern durch ein der Targetlösung zugesetztes geeignetes Reduktionsmittel (Oxidationsmittel), wodurch der Stromkreis des Gesamtsystems geschlossen wird. Solange Reduktionsmittel (Oxidationsmittel) vorhanden ist bzw. solange verbrauchtes Reduktionsmittel (Oxidationsmittel) an der Gegenelektrode rereduziert (reoxidiert) wird, fließt Strom, der amperometrisch detektiert werden kann und der proportional zur Zahl der Hybridisierungsereignisse ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Erfindung soll nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigen

Fig. 1 Schematische Darstellung des Sanger-Verfahrens der Oligonukleotid- Sequenzierung;

Fig. 2 Schematische Darstellung der Oligonukleotid-Sequenzierung durch Hybridisierung auf einem Chip;

Fig. 3 Schematische Darstellung des Oberflächen-Hybrids der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Redox mit einem 12 Bp Sonden- Oligonukleotid der exemplarischen Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3' (links) und Au-S-ss-oligo-PQQ im hybridisierten Zustand als Ausführungsbeispiel einer Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Redox, wobei nur ein Teil des Sonden-Oligonukleotids mit hybridisierten Komplementärstrang gezeigt ist (rechts) und die Anbindung des Oligonukleotids an die Oberfläche über einen -S-CH₂CH₂-Spacer sowie die Anbindung der redoxaktiven Substanz PQQ über den Spacer -CH₂-CH=CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH- erfolgte;

Fig. 4 Cyclovoltagramm einer Test-Site aus Au-S-ss-oligo-PQQ (gepunktet) im Vergleich zu einer identischen Test-Site mit vollständig hybridisiertem Target (Au-S-ds-oligo-PQQ, durchgezogene Linie);

Fig. 5 Cyclovoltagramm einer Test-Site mit vollständig hybridisiertem Target (Au-S-ds-oligo-PQQ) (durchgezogene Linie) im Vergleich zu einer Test- Site mit hybridisiertem Target, das 2 Basenpaar Mismatches aufweist (Au-S-ds-oligo-PQQ mit 2 Bp Mismatches, gestrichelt).

Wege zur Ausführung der Erfindung

Eine exemplarische Test-Site mit hybridisiertem Target (Au-S-ds-oligo-PQQ) der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ds-oligo-Spacer-Redox ist in Fig. 3 dargestellt. In dem Beispiel der Fig. 3 ist die Trägeroberfläche eine Gold-Elektrode. Die Verbindung zwischen Gold-Elektrode und Sonden-Oligonukieotid wurde mit dem Linker (HO-(CH₂)₂-S)₂ aufgebaut, der mit der endständigen Phosphatgruppe am 3' Ende zu P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH verestert wurde und nach homolytischer Spaltung der S-S Bindung an der Gold-Oberfläche je eine Au-S Bindung bewirkte, womit 2-Hydroxy mercaptoethanol und Mercaptoethanol-verbrücktes Oligonukleotid auf der Oberfläche koadsorbiert wurde. Die redoxaktive Substanz im Beispiel der Fig. 3 ist tricarboxylisches Pyrrolo-Chinolin-Chinon (PQQ), wobei eine der drei Carbonsäurefunktionen des PQQ (im Beispiel die C-7-CO₂H-Funktion) zur kovalenten Anbindung des PQQ an das Sonden-Oligonukleotid verwendet wurde (Amidbildung unter Wasserabspaltung mit der terminalen Aminofunktion des an die C-5-Position des 5'-Thymins angebundenen -CH=CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH₂ Spacers). Sowohl freies, unmodifiziertes PQQ als auch über einen kurzen Spacer der Kettenlänge 1-6, wie z. B. -S-(CH₂)₂-NH-, oder über (modifiziertes) Doppelstrang- Oligonukleotid mit der Trägeroberfläche verbrücktes PQQ wird, z. B. in HEPES Puffer mit 0.7 molarem Zusatz von TEATFB (siehe Abkürzungen), im Potentialbereich 0,7 V ≧ ϕ ≧ 0,0 V, gemessen gegen Normalwasserstoffelektrode, selektiv reduziert und reoxidiert.

Die elektrische Kommunikation zwischen der (leitfähigen) Trägeroberfläche und dem über Einzelstrang-Oligonukleotid verbrückten Redoxpaar in der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ds-oligo-Spacer-Redox ist schwach oder gar nicht vorhanden. Für die exemplarische Test-Site Au-S-ss-oligo-PQQ (mit 12-Bp Sonden-Oligonukleotiden) ist dies anhand der Cyclovoltametrie (Fig. 4) gezeigt. Ohne an eine theoretische Beschreibung gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass die negativen Ladungen des Phosphatgerüsts eine gegenseitig Abstoßung der Oligonukleotid- Einzelstränge bedingen und so einen Aufbau der -Spacer-ds-oligo-Spacer-Redox Kette (in Richtung Helixachse) unter einem Winkel ϕ < 70° zur Normalen der Trägeroberfläche ("stehende Röhren") erzwingen. Die (hybridisierte) Test-Site Au-S- ds-oligo-PQQ der Fig. 3 weist einen Aufbau mit ϕ = 30° auf. Aufgrund der Länge der -Spacer-ds-oligo-Spacer-Redox Kette (z. B. ca. 40 Å Länge eines 12-Basenpaar- Oligonukleotids; die Spacer und das angebundene PQQ sind rund 10 Å lang) entsteht bei ϕ < 70° zwischen Trägeroberfläche und redoxaktiver Substanz ein Abstand von < 17 Å. Dadurch kann ein direkter Elektron- oder Lochtransfer zwischen Trägeroberfläche und redoxaktiver Substanz ausgeschlossen werden. Durch Behandlung der Test-Site(s) mit einer zu untersuchenden Oligonukleotid-Lösung, kommt es, im Falle der Hybridisierung zwischen Sonde und Target zu einer verstärkten Leitfähigkeit zwischen der Trägeroberfläche und dem über das Doppelstrang-Oligonukleotid verbrückten Redoxpaar. Die Änderung der Leitfähigkeit äußert sich cyclovoltammetrisch in einem deutlichen Stromfluß zwischen Trägeroberfläche und redoxaktiver Substanz (Fig. 4). Damit ist es möglich, die sequenzspezifische Hybridisierung des Targets mit den Sonden-Oligonukleotiden durch elektrochemische Verfahren wie z. B. cyclische Voltametrie zu detektieren.

Daneben können fehlerhafte Basenpaarungen (Basenpaar Mismatches) durch eine geänderte cyclovoltammetrische Charakteristik erkannt werden (Fig. 5). Ein Mismatch äußert sich in einem größeren Potentialabstand zwischen den Strommaxima der Elektoreduktion und der Elektroreoxidation (Umkehrung der Elektroreduktion bei umgekehrter Potentialvorschubrichtung) bzw. der Elektrooxidation und Elektrorereduktion in einem cyclovoltammetrisch reversiblen Elektronenübertragungsprozess zwischen der elektrisch leitenden Trägeroberfläche und der redoxaktiven Substanz. Dieser Umstand wirkt sich vor allem in der amperometrischen Detektion günstig aus, da dort der Strom bei einem Potential getestet werden kann, bei dem zwar das perfekt hybridisierende Oligonukleotid- Target signifikant Strom liefert, nicht aber das fehlerhaft gepaarte Oligonukleotid- Target. Im Beispiel der Fig. 5 ist dies bei einem Potential E-E₀ von ca. 0,03 V möglich.

Beispiel 1 Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S-ds-oligo-PQQ

Die Herstellung von Au-S-ds-oligo-PQQ gliedert sich in 4 Teilabschnitte, nämlich Darstellung der Trägeroberfläche, Hybridisierung des Sonden-Oligonukleotids mit dem komplementären Doppelstrang (Hybridisierungsschritt), Derivatisierung der Trägeroberfläche mit dem Doppelstrang-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) und Anbindung der redoxaktiven Substanz (Redoxschritt).

Das Trägermaterial für die kovalente Anbindung der Doppelstrang-Oligonukleotide bildet ein ca. 100 nm dünner Gold-Film auf Mica (Muskovit Plättchen). Dazu wurde in einer elektrischen Entladungskammer frisch gespaltenes Mica mit einem Argon- Ionenplasma gereinigt und durch elektrische Entladung Gold (99.99%) in einer Schichtdicke von ca. 100 nm aufgebracht. Anschließend wurde der Gold-Film mit 30% H₂O₂,/70% H₂SO₄ von Oberflächenverunreinigungen befreit (Oxidation organischer Ablagerungen) und für ca. 20 Minuten in Ethanol getaucht, um an der Oberfläche adsorbierten Sauerstoff zu verdrängen. Nach Abspülen der Trägeroberfläche mit bidestilliertem Wasser wird auf die horizontal gelagerte Trägeroberfläche eine vorher bereitete 1 × 10^-4 molare Lösung des (modifizierten) Doppelstrang-Oligonukleotids aufgetragen, so dass die komplette Trägeroberfläche benetzt wird (Inkubationsschritt, siehe auch unten).

Zur Bereitung der ds-Oligonukleotid Lösung wurde ein doppelt modifiziertes 12 Bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3' verwendet, das an der Phosphatgruppe des 3' Endes mit (HO-(CH₂)₂-S)₂ zum P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH verestert ist. Am 5'-Ende ist die endständige Base des Oligonukleotids, Thymin, am C-5 Kohlenstoff mit -CH=CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH₂ modifiziert. Eine 2 × 10^-4 molare Lösung dieses Oligonukleotids im Hybridisierungspuffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5 mit 0.7 molarem Zusatz von TEATFB, siehe Abkürzungen) wurde mit einer 2 × 10^-4 molaren Lösung des (unmodifizierten) komplementären Strang im Hybridisierungspuffer bei Raumtemperatur für ca. 2 h hybridisiert (Hybridisierungsschritt). Während einer Reaktionszeit von ca. 12 bis 24 h wurde der Disulfidspacer P-O-(CH₂)₂-S-S-(CH₂)₂-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit den Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1 Koadsorption des ds- Oligonukleotids und des 2-Hydroxy-mercaptoethanols kommt (Inkubationsschritt).

Die so mit einer dichten (1 : 1) Monolayer aus ds-Oligonukleotid und 2-Hydroxy mercaptoethanol modifizierte Goldelektrode wurde mit bidestilliertem Wasser gewaschen und anschließend mit einer Lösung von 3 × 10^-3 molarem Chinon PQQ, 10^-2 molarem EDC und 10^-2 molarem sulfo-NHS in HEPES Puffer benetzt. Nach einer Reaktionszeit von ca. 1 h bindet der -CH=CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH₂ Spacer das PQQ kovalent an (Amidbildung zwischen der Aminogruppe des Spacers und einer Säurefunktion des PQQ, Redoxschritt).

Die Aufklärung der Oberflächenbeschaffenheit mit XPS (X-Ray Photoelektronen spektroskopie) ergab eine maximal dicht gepackte Monolayer aus 1 : 1 koadsorbiertem ds-Oligonukleotid und 2-Hydroxy-mercaptoethanol (4.7 × 10¹² ds- Oligonukleotide/cm²), wobei die lange Achse (Richtung der Helixachse) der ds- Oligonukleotide mit der Flächennormalen der Goldoberfläche einen Winkel von ϕ ≈ 30° bildet.

Beispiel 2 Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S-ss-oligo-PQQ

Analog zur Darstellung des Systems Au-S-ds-oligo-PQQ wird die Trägeroberfläche mit modifiziertem Einzelstrang-Oligonukleotid derivatisiert, wobei lediglich auf die Hybridisierung des modifizierten Oligonukleotids der Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA- 3' mit seinem komplementären Strang verzichtet wurde und im Inkubationsschritt nur das doppelt modifizierte 12 Bp Einzelstrang-Sonden-Oligonukleotid (siehe Beispiel 1) als 1 × 10^-4 molare Lösung in Wasser und in Gegenwart von 10^-2 molarem Tris, 10^-3 molarem EDTA und 0.7 molarem, TEATFB (oder 1 molarem NaCl) bei pH 7.5 verwendet wurde. Der Redoxschritt wurde, wie in Beispiel 1 angegeben, durchgeführt.

Beispiel 3 Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S-ds-oligo-PQQ mit 2-Bp- Mismatches

Die Herstellung einer Trägeroberfläche derivatisiert mit modifiziertem Doppelstrang-Oligonukleotid wurde analog zur Darstellung des Systems Au-S-ds- oligo-PQQ durchgeführt, wobei lediglich bei der Hybridisierung des modifizierten Oligonukleotids der Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3' ein komplementärer Strang verwendet wurde (Sequenz: 5'-ATCAGATTTCGT-3'), bei dem die eigentlich komplementären Basen Nr. 6 und 7 (vom 5'-Ende gezählt) von C nach A bzw. von C nach T modifiziert wurden, um so zwei Basenpaar Mismatches einzuführen.

Das Beispiel 4a betrifft ein Vergleichsbeispiel.

Beispiel 4 Herstellung einer Oligonukleotid-Elektrode Au-S-ss-oligo-PQQ mit erhöhtem Inter-Oligonukleotid-Abstand

Bei der Herstellung der Test-Sites muß bei der Derivatisierung der Trägeroberfläche mit Einzelstrang-Sonden-Oligonukleotid darauf geachtet werden, dass zwischen den angebundenen Einzelsträngen genügend Platz verbleibt, um eine Hybridisierung mit dem Target-Oligonukleotid zu ermöglichen. Dazu bieten sich drei verschiedene Vorgehensweisen an: (a) Herstellung einer Au-S-ds-oligo-PQQ Elektrode wie in Beispiel 1 beschrieben mit anschließender thermischer Dehybridisierung der Doppelstränge bei Temperaturen von T < 40°C. (b) Herstellung einer Au-ss-oligo-PQQ Elektrode wie unter Beispiel 2 beschrieben, aber im Inkubationsschritt zur Derivatisierung der Goldoberfläche mit (doppelt derivatisiertem) Einzelstrang-Oligonukleotid wird 2-Hydroxy mercaptoethanol oder ein anderer Thiol- oder Disulfid-Linker geeigneter Kettenlänge 10^-5 bis 10^-1 molar zugesetzt (je nach gewünschtem Inter-Oligonukleotid-Abstand), das gemeinsam mit dem Einzelstrang Oligonukleotid an die Goldoberfläche koadsorbiert. (c) Herstellung einer Au-ss-oligo-PQQ Elektrode wie unter Beispiel 2 beschrieben, aber unter Weglassen des 0.7 molaren Zusatzes an Elektrolyten (im Beispiel TEATFB) im Inkubationsschritt zur Derivatisierung der Goldoberfläche mit (doppelt derivatisiertem) Einzelstrang-Oligonukleotid. Die Phosphatgruppen und Basen-Sickstoffatome des Oligonukleotids sind durch die Abwesenheit des Salzes elektrostatisch nicht abgeschirmt und wechselwirken stark mit der Goldoberfläche. Dadurch kommt es zu einer flachen Anlagerung der Oligonukleotide auf der Elektrodenoberfläche (ϕ < 60°) und es werden pro Flächeneinheit deutlich weniger Oligonukleotide gebunden. Anschließend können die Oligonukleotide wieder in die gewünschte Position gebracht werden, indem in einem 2. Inkubationsschritt (vor oder nach Anbringen des PQQ) 2-Hydroxy-mercaptoethanol oder ein anderer Thiol- oder Disulfid-Linker geeigneter Kettenlänge kovalent an die noch freien Oberflächen- Goldatome angebunden wird. Dazu wird die weniger dicht mit Einzelstrang- Oligonukleotid belegte Elektrode vor oder nach Modifikation mit PQQ (Au-S-ss-oligo bzw. Au-S-ss-oligo-PQQ) mit einer ca. 5 × 10^-2 molaren Lösung des 2-Hydroxy mercaptoethanols oder eines andereren Thiol- oder Disulfid-Linkers geeigneter Kettenlänge in Ethanol oder HEPES Puffer (bzw. einem Gemisch daraus, abhängig von der Löslichkeit des Thiols) benetzt und 2 bis 24 h inkubiert.

Beispiel 5 Durchführung der cyclovoltammetrischen Messungen

Die cyclovoltammetrischen Messungen wurden mit einem Computer-kontrolliertem Bipotentiostaten (CH Instruments, Model 832) bei Raumtemperatur in einer Standard Zelle mit 3-Elektroden-Anordung vermessen. Die modifizierte Goldelektrode wurde als Arbeitselektrode verwendet, als Hilfselektrode (Gegenelektrode) diente ein Platindraht und als Referenzelektrode zur Potentialbestimmung wurde eine über eine Luggin Kapillare vom Probenraum abgetrennte Ag/AgCl-Elektrode mit interner gesättigter KCl Lösung verwendet. Als Elektrolyt diente 0.7 molares TEATFB oder 1 molares NaCl. Ein Cyclovaltagramm der Au-S-ds-oligo-PQQ Elektrode im Vergleich zu einer Au-S-ss-oligo-PQQ Elektrode ist in Fig. 4 gezeigt, die Auswirkung der 2 Bp Mismatches auf das Cyclovoltagramm der Au-S-ds-oligo-PQQ Elektrode ist in Abb. 5 dargestellt. Die Potentiale sind jeweils als E-E₀, also relativ zum Halbstufenpotential angegeben.

Aus Fig. 4 ist ein deutlich erhöhter Stromfluß bei Vorliegen eines Doppelstrang- Oligonukleotids gegenüber der nicht hybridisierten Form zu erkennen. Dadurch können sequenzspezifische Hybridisierungsereignisse detektiert werden. Aus Fig. 5 wird deutlich, dass bei Hybridisierung mit einem Target-Oligonukleotid-Strang, der 2 Basenpaar-Mismatches aufweist, zum einen ein geringerer Strom fließt, zum anderen die Differenz der Strommaxima vergrößert wird.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche, wobei ein Nukleinsäure-Oligomer oder ein durch Anbindung einer redoxaktiven Substanz, die bei einem Potential ϕ mit 2,0 V ≧ ϕ ≧ -2,0 V, gemessen gegen Normalwasserstoffelektrode, selektiv oxidierbar und reduzierbar ist, modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer in Gegenwart von weiteren chemischen Verbindungen, die ebenfalls an die leitfähige Oberfläche angebunden werden, auf die leitfähige Oberfläche aufgebracht wird, wobei es sich bei den chemischen Verbindungen um Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Hetero-Alkinyl-Ketten handelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsäure-Oligomer oder das modifizierte Nukleinsäure-Oligomer mit dem dazu komplementären Nukleinsäure- Oligomerstrang hybridisiert wird und in Form des Doppelstranghybrids auf eine leitfähige Oberfläche aufgebracht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Doppelstranghybrid nach dem Aufbringen auf die leitfähige Oberfläche thermisch dehybridisiert wird.

4. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche, wobei ein Nukleinsäure-Oligomer oder ein durch Anbindung einer redoxaktiven Substanz, die bei einem Potential ϕ mit 2,0 V ≧ ϕ ≧ -2,0 V, gemessen gegen Normalwasserstoffelektrode, selektiv oxidierbar und reduzierbar ist, modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer in einem Puffer ohne Zusatz von Leitsalz zur Verminderung der elektrostatischen Abschirmung des Nukleinsäure-Oligomers auf die leitfähige Oberfläche aufgebracht wird und anschließend weitere chemische Verbindungen, die ebenfalls an die leitfähige Oberfläche angebunden werden, auf die leitfähige Oberfläche aufgebracht werden, wobei es sich bei den chemischen Verbindungen um Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Hetero-Alkinyl- Ketten handelt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Hetero-Alkinyl-Ketten eine Kettenlänge von 1 bis 20 Atomen aufweisen.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Hetero-Alkinyl-Ketten eine Kettenlänge von 1 bis 14 Atomen aufweisen.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure- Oligomere oder die modifizierten Nukleinsäure-Oligomere an die leitfähige Oberfläche kovalent oder durch Physisorption angebunden werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei eine der Phosphorsäure-, Carbonsäure- oder Amin-Einheiten, eine der Zucker-Einheiten oder eine der Basen des Nukleinsäure- Oligomers oder des modifizierten Nukleinsäure-Oligomers kovalent oder durch Physisorption an die leitfähige Oberfläche angebunden wird, insbesondere eine endständige Einheit des Nukleinsäure-Oligomers oder des modifizierten Nukleinsäure-Oligomers.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Nukleinsäure-Oligomere oder die modifizierten Nukleinsäure-Oligomere kovalent an verzweigte oder unverzweigte Molekülteile beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge angebunden sind und diese Molekülteile kovalent oder durch Physisorption an die leitfähige Oberfläche angebunden werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Kettenlänge des verzweigten oder unverzweigten Molekülteils 1 bis 14 Atome beträgt.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei der verzweigte oder unverzweigte Molekülteil an eine der Phosphorsäure-, Carbonsäure- oder Amin-Einheiten, an eine der Zucker-Einheiten oder an eine der Basen des Nukleinsäure-Oligomers kovalent gebunden ist, insbesondere an eine endständige Einheit des Nukleinsäure- Oligomers.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich die Kettenlänge der weiteren chemischen Verbindung und die Kettenlänge des verzweigten oder unverzweigten Molekülteils um maximal 8 Atome unterscheiden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die chemische Verbindung und der verzweigte oder unverzweigte Molekülteil gleiche Kettenlänge aufweisen.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine oder mehrere Arten von Nukleinsäure-Oligomeren in Form des Doppelstranghybrids an eine leitfähige Oberfläche gebunden werden und ausschließlich die an die leitfähige Oberfläche gebundenen Nukleinsäure-Oligomere durch Anbindung einer redoxaktiven Substanz an die Nukleinsäure-Oligomere modifiziert werden.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Anbindung der redoxaktiven Substanz an das Nukleinsäure-Oligomer durch Reaktion der redoxaktiven Substanz mit einer Phosphorsäure-Einheit, einer Zucker-Einheit oder einer der Basen des Nukleinsäure-Oligomers erfolgt, insbesondere durch Reaktion mit einer endständigen Einheit des Nukleinsäure-Oligomers.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die redoxaktive Substanz kovalent an einen verzweigten oder unverzweigten Molekülteil beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge angebunden wird und der verzweigte oder unverzweigte Molekülteil an eine der Phosphorsäure-, Carbonsäure- oder Amin-Einheiten, an eine der Zucker- Einheiten oder an eine der Basen des Nukleinsäure-Oligomers angebunden wird, insbesondere an eine endständige Einheit des Nukleinsäure-Oligomers.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als redoxaktive Substanz ein Farbstoff verwendet wird, insbesondere ein Flavin-Derivat, ein Porphyrin-Derivat, ein Chlorophyl-Derivat oder ein Bakteriochlorophyl-Derivat.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei als redoxaktive Substanz ein Chinon, insbesondere ein Pyrrolo-Chinolin-Chinon (PQQ), ein 1,4-Benzochinon, ein 1,2-Naphtochinon, ein 1,4-Naphtochinon oder ein 9,10-Anthrachinon verwendet wird.

19. Verfahren nach den Ansprüchen 17 oder 18, wobei die redoxaktive Substanz kovalent an eine der Phosphorsäure-, Carbonsäure- oder Amin-Einheiten, an eine der Zucker-Einheiten oder an eine der Basen des Nukleinsäure-Oligomers angebunden ist, insbesondere an eine endständige Einheit des Nukleinsäure- Oligomers.

20. Verfahren nach den Ansprüchen 17 oder 18, wobei die redoxaktive Substanz kovalent an einen verzweigten oder unverzweigten Molekülteil beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge angebunden ist und der verzweigte oder unverzweigte Molekülteil an eine der Phosphorsäure-, Carbonsäure- oder Amin- Einheiten, an eine der Zucker-Einheiten oder an eine der Basen des Nukleinsäure- Oligomers angebunden ist, insbesondere an eine endständige Einheit des Nukleinsäure-Oligomers.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die redoxaktive Substanz kovalent an einen verzweigten oder unverzweigten Molekülteil angebunden ist, dessen kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den verbundenen Strukturen 1 bis 14 Atome umfasst.

22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das modifizierte Nukleinsäure-Oligomer ein Desoxyribonukleinsäure-, Ribonukleinsäure-, ein Peptidnukleinsäure-Oligomer oder ein Nukleinsäure-Oligomer mit strukturell analogem Rückgrat ist.

23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die leitfähige Oberfläche aus einem Metall oder einer Metalllegierung besteht, insbesondere einem Metall ausgewählt aus der Gruppe Platin, Palladium, Gold, Cadmium, Quecksilber, Nickel, Zink, Kohlenstoff, Silber, Kupfer, Eisen, Blei, Aluminium, Mangan und deren Mischungen.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die leitfähige Oberfläche aus einem Halbleiter besteht, insbesondere einem Halbleiter ausgewählt aus der Gruppe Kohlenstoff, Silizium, Germanium und α-Zinn.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die leitfähige Oberfläche aus einer binären Verbindung der Elemente der Gruppen 14 und 16, einer binären Verbindung der Elemente der Gruppen 13 und 15, einer binären Verbindung der Elemente der Gruppen 15 und 16, oder einer binären Verbindung der Elemente der Gruppen 11 und 17 besteht, insbesondere aus einem Cu(l)-Halogenid oder einem Ag(l)-Halogenid.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die leitfähige Oberfläche aus einer ternären Verbindung der Elemente der Gruppen 11, 13 und 16 oder einer ternären Verbindung Elemente der Gruppen 12, 13 und 16 besteht.