WO2003040678A2 - Fluoreszenz-quenchen zur detektion von ligat-ligand-assoziationsereignissen in elektrischen feldern - Google Patents

Fluoreszenz-quenchen zur detektion von ligat-ligand-assoziationsereignissen in elektrischen feldern Download PDF

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WO2003040678A2
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Gerhard Hartwich
Thomas KRATZMÜLLER
Herbert Wieder
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Friz Biochem Gmbh
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    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to a method for the detection of ligate-ligand association events by fluorescence quenching.
  • Immunoassays and increasingly sequence analysis of DNA and RNA are used in disease diagnosis, in toxicological test procedures, in genetic research and development, as well as in the agricultural and pharmaceutical sectors.
  • serial methods with autoradiographic or optical detection parallel detection methods using array technology, so-called DNA or protein chips, are increasingly being used. With these parallel methods, too, the detection is based on optical, radiographic, mass spectrometric or electrochemical methods.
  • probe oligonucleotides For gene analysis on a chip, a library of known DNA sequences ("probe oligonucleotides”) is fixed in an ordered grid on one surface, so that the probe oligonucleotides.
  • Target oligonucleotides present in the test solution, the sequences of which are complementary to certain probe oligonucleotides on the chip, can be identified by
  • Radio label e.g. 32 P
  • a fluorescent dye e.g. fluorescein, Cy3 TM or
  • Fluorescence scanners are increasingly using radio labels.
  • the fluorescence scanners currently available on the market enable the detection of
  • Fluorophore in the subattomole range Fluorophore in the subattomole range.
  • labeled targets to detect hybridization events has some drawbacks.
  • the marking must take place before the actual measurement, which means an additional synthesis step and thus additional work. It is also difficult to ensure homogeneous marking of the sample material.
  • stringent washing conditions are necessary in order to remove non-specific or non-specifically bound material following hybridization.
  • targets antibodies or antigen or DNA fragment
  • the targets do not have to be modified with a detection label and after the hybridization no complicated washing steps are necessary are.
  • the probe molecules are labeled with appropriate fluorescent dyes.
  • the so-called molecular beacons work according to this principle. These single-stranded oligonucleotides have a hairpin structure (stem-and-loop) and carry a fluorophore (e.g. Fluorescein, TexasRed®) at one end of the sequence and a suitable fluorescence quencher (e.g. DABCYL) at the other end of the sequence. Due to the special geometric arrangement, the fluorescent group and the unit that leads to the quenching of the fluorescence are located in close proximity to one another. Therefore the probes show only an extremely low fluorescence.
  • a fluorophore e.g. Fluorescein, TexasRed®
  • DABCYL fluorescence quencher
  • gold nanoparticles are also used as efficient quenchers (Nature Biotech. Vol. 19, 2001, page 365).
  • the quenching of fluorescence by metals is based primarily on a radiationless energy transfer from the dye molecule to the metal.
  • a greater sensitivity is observed when using gold nanoparticles than with organic quenchers.
  • dyes are efficiently quenched into the near infrared range.
  • a disadvantage of this method is that gold nanoparticles do not at temperatures above 50 ° C are more stable. Another disadvantage is that this method is limited to the investigation of solutions and therefore only a few sequences can be examined at the same time, so the degree of parallelization of this approach is low.
  • the object of the present invention is therefore to create a method for the detection of ligate-ligand association events by fluorescence quenching which does not have the disadvantages of the prior art.
  • PNA Peptide nucleic acid synthetic DNA or RNA in which the Sugar-phosphate unit is replaced by an amino acid.
  • synthetic DNA or RNA in which the Sugar-phosphate unit is replaced by an amino acid.
  • Nucleic acid contains two or more covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine (e.g. cytosine, thymine or uracil) or purine bases (e.g. adenine or guanine).
  • the term nucleic acid refers to any "backbone" of the covalently linked pyrimidine or purine bases, e.g. on the sugar-phosphate backbone of the DNA, cDNA or RNA, on a peptide backbone of the PNA or on analogous structures (e.g. phosphoramide, thio-phosphate or dithio-phosphate backbone).
  • An essential feature of a nucleic acid in the sense of the present invention is the ability for sequence-specific binding of naturally occurring cDNA or RNA.
  • Nucleic acid oligomer Nucleic acid of unspecified base length (e.g. nucleic acid octamer: A nucleic acid with any backbone in which 8 pyrimidine or purine bases are covalently bound to one another). ns oligomer Nucleic acid oligomer
  • Oligomer equivalent to nucleic acid oligomer Oligomer equivalent to nucleic acid oligomer.
  • Oligonucleotide equivalent to oligomer or nucleic acid oligomer for example a DNA, PNA or RNA fragment of a base length not specified in more detail.
  • Mismatch To form the Watson-Crick structure of double-stranded oligonucleotides, the two single strands hybridize in such a way that the base A (or C) of one strand forms hydrogen bonds with the base T (or G) of the other strand (for RNA, T is by uracil ) replaced. Any other base pairing does not form hydrogen bonds, distorts the structure and is referred to as a "mismatch". ss Single Strand ds double Strand
  • Antibody complex binding partner of an antigen is Antibody complex binding partner of an antigen.
  • Antigen complex binding partner of an antibody is Antigen complex binding partner of an antibody.
  • Receptor complex binding partner of a hormone Receptor complex binding partner of a hormone.
  • Fluorophore chemical compound (chemical substance) that is able to emit a longer-wave (red-shifted) fluorescent light when excited with light. fluorophores
  • Fluorescent dyes can absorb light in a wavelength range from ultraviolet (UV) through the visible (VIS) to the infrared (IR) range.
  • UV ultraviolet
  • VIS visible
  • IR infrared
  • the absorption and emission maxima are usually shifted by 15 to 40 nm (Stokes shift).
  • Fluorescein resorcin phthalein fluorescent dye
  • Rhodamine 6G Basic Red 1 fluorescent dye
  • Texas Red® fluorescent dye from Molecular Probes, Inc.
  • Quench surface conductive (metal) surface that can quench fluorescence through an energy transfer (especially gold, silver, copper surfaces etc.)
  • EDTA ethylenediamine tetraacetate (sodium salt) ligand Term for molecules that are specifically bound by ligates;
  • ligands in the context of the present invention are substrates, cofactors or coenzymes of a protein (enzyme), antibodies (as ligand of an antigen), antigens (as ligand of an antibody), receptors (as ligand of a hormone), hormones (as ligand of a receptor) ) or nucleic acid oligomers (as ligand of the complementary nucleic acid oligomer)
  • Ligate Term for (macro) molecule with specific recognition and binding sites for the formation of a complex with a ligand (template).
  • linkers are commercially available as alkyl, alkenyl, alkynyl, hetero-alkyl, hetero-alkenyl or hetero-alkynyl chains, the chain being derivatized at two points with (identical or different) reactive groups. These groups form a covalent one in simple / known chemical reactions with the corresponding reaction partner chemical bond.
  • the reactive groups can also be photoactivatable, ie the reactive groups are only activated by light of certain or any wavelength.
  • Preferred linkers are those of chain length 1-60, in particular chain length 5-40, the chain length here being the shortest continuous connection between the structures to be connected, i.e. between the two molecules or between a surface atom, a surface molecule or a surface molecule group and another Molecule.
  • Spacer linker which is covalently bonded via the reactive groups to one or both of the structures to be connected (see linker).
  • Preferred spacers are those of chain length 1-60, in particular chain length 5-40, the chain length being the shortest continuous connection between the structures to be connected.
  • the terminal phosphate group of the oligonucleotide at the 3 'end is esterified with (HO- (CH 2 ) 2 -S) 2 to PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 rOH, the SS bond being cleaved homolytically and each causes an Au-SR bond.
  • the probe oligonucleotide carries a covalently linked fluorophore (FP) such as Cy3 TM, Cy5 TM, Texas Red®, Rhodamine 6G, fluorescein etc.
  • FP covalently linked fluorophore
  • Au-S- (CH 2 ) 2 -ds-oligo-Au-S- (CH 2 ) 2 -ss-oligo-FP hybridizes with the oligonucleotide complementary to ss-oligo FP.
  • Css geometric change potential of the surface-bound single-stranded probe potential when it passes through in positive Towards the single-stranded probe undergoes a change from a more elongated conformation protruding into the solution to a more compressed shape pressed against the surface. (Change of conformation from "standing” to "lying")
  • the geometric change potential of the surface-bound double-stranded probe / target potential, when it passes through in the positive direction, the double-stranded probe / target undergoes a change from a more elongated conformation protruding into the solution to a more compressed form pressed against the surface , (Change of conformation from "standing” to "lying")
  • the present invention relates to a method for the detection of ligate-ligand association events by fluorescence quenching, which comprises providing a modified surface as a first step.
  • the modification of the surface consists in the attachment of at least one type of modified ligate, the ligates being modified by attachment of at least one type of fluorophore.
  • the further steps of the method according to the invention are providing a sample with ligands, applying an electric field and setting a defined strength of the electric field at the location of the modified ligates, bringing the sample into contact with the modified surface, detection of the fluorescence of the fluorophore and comparison of the detected fluorescence intensities with reference values.
  • a comparison of the detected fluorescence intensities with reference values is required in the method according to the invention. These reference values can already exist from previous measurements and therefore do not need to be detected in the most general case in the course of the method according to the invention.
  • Fluorophors performed.
  • the values obtained in this way are then used as reference values.
  • a normalization measurement is also carried out.
  • sites are applied to the modified surface to which a very specific degree of association can be assigned after adding the sample.
  • the signal obtained during the detection is then characteristic of this particular degree of association and can be used to normalize the signals from the test sites.
  • the present invention namely also encompasses methods in which a modified surface is used which has been modified by binding at least two types of modified ligates.
  • the different types of ligates are bound to the surface in spatially essentially separated areas.
  • “Substantially separated areas” are understood to mean areas of the surface that are largely modified by binding a certain type of ligate. Only in areas in which two such essentially separated areas adjoin one another can spatial mixing of different types of ligate occur.
  • a ligand is added to the sample before the sample is brought into contact with the modified surface, the ligand being a binding partner with a high association constant with a certain type of ligate, which is in a certain range ( Site T 100 ) is bound to the surface.
  • the ligand is added to the sample in an amount that is greater than the amount of ligand that is necessary to fully associate the ligates of the T 100 sites.
  • the last step of this method is the comparison of the values obtained in the detection of the fluorescence of the fluorophore with that for the region T-
  • the value obtained for the area T 100 thus corresponds to the value when the association is complete (100%).
  • a modified surface which has been modified by attaching at least three types of ligates.
  • the different types of ligates are bound to the surface in spatially essentially separated areas.
  • at least one type of ligate is bound to the surface in a certain area (site T 0 ), from which it is known that there is no binding partner with a high association constant in the sample, that is to say the corresponding association partner or ligand does not appear in the sample .
  • site T 0 a certain area
  • the addition of a ligand to the sample the ligand being a binding partner with a high association constant with a certain type of ligate, which is present in a certain region (site T 10 o) bound to the surface.
  • the ligand is added to the sample in an amount that is greater than the amount of ligand that is necessary to fully associate the ligates of the T 10 o sites.
  • the last step of this method is the comparison of the values obtained in the detection of the fluorescence of the fluorophore with the value obtained for the area T 100 and with the value obtained for the area T 0 .
  • the value obtained for the area T 0 thus corresponds to the value in the absence of association (0%).
  • At least one further type of ligand is added to the sample before the sample is brought into contact with the modified surface, it being known that this ligand is not contained in the original sample.
  • This further type of ligand has an association constant> 0 to a type of ligate that is bound to the surface in a certain region (site T n ).
  • the ligand is added to the sample in such an amount that after contacting the sample with the modified surface, n% of the ligates of the site T n are in an associated form.
  • the last step of this method is the comparison of the values obtained in the detection of the fluorescence of the fluorophore with the value obtained for the area T 10 o, with the value obtained for the area T 0 and with the values obtained for the areas T n .
  • the value obtained for a particular test site T n thus corresponds to the value in the presence of n% ligate-ligand associates based on the total number of ligates of the type.
  • the amount of ligand which has to be brought into contact with the modified surface in order to bring about an n% association at the site T n can be determined by the person skilled in the art by simple routine tests. For this purpose, for example after detection of the values for T 0 and T 1 00, a calibrated measurement is carried out, in which the signal intensity is determined by (different) detection labels with which the ligate and the ligand are equipped. The ratio of the intensities of the ligand label signal to the ligate label signal corresponds to n%.
  • the present invention also includes a kit for carrying out a method for the detection of ligate-ligand association events by fluorescence quenching.
  • the kit comprises a modified surface, the modification consisting in the attachment of at least one type of modified ligate and the ligates being modified by attachment of at least one type of fluorophore.
  • the reference values are already included in the kit, so that the fluorescence of the fluorophore only has to be detected once by the end user. The values obtained in this detection then only need to be compared with the existing reference values.
  • the kit comprises a modified surface which has at least one area T 0 and at least one area T 100 .
  • the modified surface additionally comprises at least one region T n .
  • surface denotes any carrier material which is suitable for adding fluorophore-derivatized ligates directly or after appropriate chemical modification wear that are covalently immobilized on the surface and whose fluorescence close to the surface (at a distance of approx. 1 to 50 A from the surface) by fluorescence quenching (radiation-free energy transfer between the fluorophore as emitter and the surface as absorber) significantly (> 10% of the expected fluorescence intensity of the fluorophore in the absence of the surface under otherwise identical conditions) is reduced.
  • Gold and silver are particularly suitable as quench surface material.
  • the term surface is independent of the spatial dimensions of the surface and also includes nanoparticles (particles or clusters of a few individual to several hundred thousand surface atoms or molecules).
  • the surface can also be bound to a solid support such as glass, metal or plastic.
  • Immobilization can e.g. covalently via hydroxyl, epoxy, amino or carboxy groups of the support material with thiol, hydroxyl, amino or carboxyl groups which are naturally present on the ligate or are attached to the ligate by derivatization.
  • the ligate can be connected directly or via a linker / spacer to the surface atoms or molecules of a surface.
  • the ligate can be anchored by the methods customary in immunoassays, e.g.
  • nucleic acid oligomers are used as ligates, the chemical modification of the probe nucleic acid oligomers with a surface anchor group can already be introduced in the course of automated solid phase synthesis or in separate reaction steps.
  • the nucleic acid oligomer is also linked directly or via a linker / spacer to the surface atoms or molecules of a surface of the type described above. This binding can be carried out in various ways known from the prior art (cf. e.g. Hartwich, G .: ELECTROCHEMICAL DETECTION OF
  • nucleic acid oligomers When connecting the nucleic acid oligomers, care must be taken that they are either bound to the surface completely without additional co-adsorbate or, if a co-adsorbate appears necessary, that it forms a layer as thin as possible above the surface. Either a direct attachment of the nucleic acid oligomer to the surface must be carried out or it must be coated with short-chain co-adsorbates such as short-chain thiols. Co-adsorbates of chain length 1 to 30, particularly preferably chain length 1 to 20, in particular chain length 1 to 10 are preferred.
  • a particular disadvantage in this connection is the binding of the nucleic acid oligomers in the form of a surface-biotin-avidin-biotin-oligomer compound.
  • the fluorophore is always shielded from the surface by a very thick layer of biotin-avidin-biotin, which is associated with corresponding disadvantages in the detection of fluorescence.
  • ligands Molecules that specifically interact with the ligate (probe) immobilized on a surface to form a complex are referred to as ligands.
  • fluorescent dyes such as e.g. Texas Red®, rhodamine dyes, cyanine dyes such as Cy3 TM, Cy5 TM, fluorescein etc (see Fluka, Amersham and Molecular Probes catalog) are used.
  • Fluorescence quenching is the deactivation of an electronically excited species via a radiationless process. Deactivation can take place by means of impacts or by radiation-free energy transfer to metals. The energy released is dissipated as thermal energy. Gold is an example of a metal that has the ability to quench fluorescence. The quenching has a strong dependence on the distance of the fluorophore from the surface functioning as a fluorescence quencher (inversely proportional to a higher (third to sixth) power of the distance). The effect of fluorescence quenching can therefore only be measured at distances of less than 100 to 200 A. In the range greater than approx. 200 A, further changes in distance no longer lead to a measurable increase in the fluorescence intensity.
  • 1 shows a schematic illustration of the detection of nucleic acid-oligomer hybridization events by modulation of the fluorescence quenching on quench surfaces
  • FIG. 2 shows a schematic illustration of the detection of nucleic acid-oligomer hybridization events by modulation of the fluorescence quenching on quench surfaces supported by E-field;
  • FIG. 3 shows a schematic representation of the detection of nucleic acid oligomer Hybridization events by "immobilized-ion"-assisted modulation of the fluorescence quenching on quench surfaces.
  • oligomer probe 202 probe hybridizes with target 203: surface (e.g. gold)
  • FIG. 1 shows a schematic illustration of the detection of nucleic acid-oligomer hybridization events by modulation of the fluorescence quenching on quench surfaces.
  • the single-stranded probe nucleic acid oligomer 201 prior to hybridization, is in a form which is characterized by a large distance 204 from the fluorophore 102 and the quenching metal surface.
  • the hybridization with the complementary nucleic acid oligomer strand 202 (target) reduces the distance 205 between the fluorescent dye molecule and the metal surface 203 functioning as a quencher. This leads to a decrease in the fluorescence intensity (bar chart in FIG. 1A).
  • FIG. 1A shows a schematic illustration of the detection of nucleic acid-oligomer hybridization events by modulation of the fluorescence quenching on quench surfaces.
  • the single-stranded probe nucleic acid oligomer 201 is in a form before hybridization, which is characterized by a small distance 204 from fluorophore 102 and quenching metal surface.
  • the hybridization with the complementary nucleic acid oligomer strand 202 (target) increases the distance 205 between the fluorescent dye molecule and the metal surface functioning as a quencher. This leads to an increase in the fluorescence intensity (bar chart of FIG. 1B).
  • FIG. 2 shows a schematic illustration of the detection of nucleic acid-oligomer hybridization events by modulation of the fluorescence quenching on quench surfaces supported by E-field.
  • FIG. 2A shows the case in which the single-stranded probe nucleic acid oligomer 201 is in an elongated form due to the electric field.
  • the hybridization with the complementary nucleic acid oligomer strand 202 (target) reduces the distance 205 between the fluorescent dye molecule and the metal surface functioning as a quencher. This leads to a decrease in the fluorescence intensity (bar diagram in FIG. 2A).
  • FIG. 2B shows the case in which the single-stranded probe nucleic acid oligomer 201 is in a compressed form due to the electric field.
  • the hybridization with the complementary nucleic acid oligomer strand 202 (target) increases the distance 205 between the fluorescent dye molecule and the metal surface functioning as a quencher. This leads to an increase in the fluorescence intensity (bar chart in FIG. 2B).
  • FIG. 3 shows a schematic representation of the detection of nucleic acid-oligomer hybridization events by "immobilized-ion"-assisted modulation of the fluorescence quenching on quench surfaces.
  • the single-stranded probe nucleic acid oligomer 201 is in a stretched form due to the repulsive interaction between the negatively charged probe and the immobilized anions 401.
  • the hybridization with the complementary nucleic acid oligomer strand 202 (target) reduces the distance 205 between the fluorescent dye molecule and the metal surface functioning as a quencher. This leads to a decrease in the fluorescence intensity (bar chart in FIG. 3A).
  • FIG. 3 shows a schematic representation of the detection of nucleic acid-oligomer hybridization events by "immobilized-ion"-assisted modulation of the fluorescence quenching on quench surfaces.
  • 3B shows the case in which, due to the attractive effect between the negatively charged probe and the immobilized cations 402, the single-stranded probe nucleic acid oligomer 201 is in a compressed form.
  • the hybridization with the complementary nucleic acid oligomer strand 202 (target) increases the distance 205 between the fluorescent dye molecule and the metal surface functioning as a quencher. This leads to an increase in the fluorescence intensity (bar chart in FIG. 3B).
  • nucleic acid-oligomer probes of different sequences are bound to a support using the immobilization techniques described above.
  • the hybridization event of any target nucleic acid oligomer or (fragmented) target DNA is to be detected, e.g. Detect mutations in the target and demonstrate them in a sequence-specific manner.
  • the surface atoms or molecules of a defined area are linked on a surface with DNA / RNA / PNA nucleic acid oligomers of known but any sequence, as described above.
  • the DNA chip can also be derivatized with a single probe oligonucleotide.
  • Nucleic acid oligomers eg DNA, RNA or PNA fragments
  • a base length of 3 to 70 preferably a length of 5 to 60, particularly preferably a length of 10 to 50, particularly preferably a length of 12 to 40, are used as probe nucleic acid oligomers used.
  • the target oligonucleotides can also comprise a larger number of bases, ie they can be longer than the probe oligonucleotides.
  • the expression “nucleic acid oligomer complementary to the probe oligonucleotide” is understood to mean a nucleic acid oligomer which has a base sequence which is complementary to the probe oligonucleotide in a partial region. The remaining portion (s) of the nucleic acid oligomer then protrude at the end (s) of the probe oligonucleotide beyond its base chain.
  • the fluorescence intensity of the fluorophore-labeled probe oligonucleotides in the single-stranded state is determined in a reference measurement, for example with a fluorescence scanner, on the surfaces thus provided with immobilized and fluorophore-labeled probe oligonucleotides.
  • the (as concentrated as possible) test solution with target oligonucleotide (s) is added to the surface with immobilized probe oligonucleotides.
  • Hybridization occurs only in the case in which the solution contains target nucleic acid oligomer strands which are complementary to the probe-nucleic acid oligomers bound to the surface, or at least in many areas complementary.
  • the fluorescence intensity in the hybridized, double-stranded state is determined in a second fluorescence measurement.
  • the difference between the reference measurement and the second measurement per test site is proportional to the number of complementary (or in many areas complementary) target oligonucleotides originally present in the test solution for the respective test site.
  • the reference measurement can be omitted if the size of the reference signal is known beforehand (e.g. from previous measurements etc.).
  • a sequence-specific hybridization event can be performed by fluorescence-based methods such as e.g. Fluorescence microscopy or measurements with fluorescence scanners can be detected.
  • the single-stranded probe nucleic acid oligomer 201 is in a form which is characterized by a large distance 204 from the fluorophore 102 and the quenching metal surface 203 (high fluorescence intensity).
  • the distance 205 between the fluorescent dye molecule 102 and the metal surface 203 functioning as a quencher changes in such a way that the distance increases and the quenching increases lower fluorescence intensity can be observed after hybridization (see FIG. 1A).
  • the single-stranded probe nucleic acid oligomer 201 is in a form which is characterized by a small distance 204 from the fluorophore 102 and the quenching metal surface 203 (low fluorescence intensity).
  • the distance between the fluorescent dye molecule 102 and the metal surface 203 functioning as a quencher changes in such a way that increasing the distance 205 leads to a reduction in the quenching and one higher fluorescence intensity can be observed after hybridization (see FIG. 1B).
  • single-stranded oligomers are present in a more compressed form due to their greater mobility.
  • double-stranded oligomers are oriented rather perpendicular to the surface due to the rigid helical structure (see FIG. 2B). An increase in the fluorescence intensity is observed through the hybridization.
  • the potential at which the single strand experiences a change from "standing" to “lying” is defined as the geometric change potential of the single strand 9 E SS .
  • the potential at which the double strand undergoes a change from "standing" to "lying” is defined as the geometric change potential of the double strand 9 E S.
  • an external electrical field is usually done by applying a potential to the modified surface.
  • the present invention also includes embodiments according to which e.g. an electric field is generated by placing the modified surface in a capacitor at the location of the modified ligates.
  • Various geometrical arrangements can be realized by immobilizing ions on the modified surface.
  • Anions 401 immobilized on the surface e.g. via corresponding bifunctional molecules with carboxylic acid or sulfonic acid functions, which are present as surface-bound anions in a certain pH range
  • Anions 401 immobilized on the surface lead to an elongated conformation of the single strand 201 due to the repulsion of the negatively charged phosphate backbone.
  • the single-stranded probe is stretched more flexibly than the double-stranded probe / target (see FIG. 3A). A decrease in the fluorescence intensity is observed due to the hybridization.
  • Cations 402 immobilized on the surface lead to a rather compressed conformation of the single strand 201 because of the attraction of the negatively charged phosphate backbone Due to the lower mobility, the double-stranded probe / target is compressed less than the single-stranded probe (see FIG. 3B). An increase in the fluorescence intensity is observed through the hybridization.
  • n nucleotide (nt) long nucleic acid probe (DNA, RNA or PNA, for example a 20 nucleotide long oligo) is near one of its ends (3 'or 5' end) directly or via any spacer a reactive group for covalent anchoring to the surface, e.g. as a 3'-thiol-modified probe oligonucleotide, in which the terminal thiol modification serves as a reactive group for binding to gold.
  • Other covalent anchoring options arise e.g. from amine-modified ligate oligonucleotide, which is used for anchoring to surface-bonded carboxylic acid functions (e.g.
  • a fluorophore is covalently bound in the vicinity of the other terminus of the probe oligonucleotide (cf. Example 1).
  • the nucleic acid probe modified in this way is
  • the (residual) fluorescence of the fluorophore on the probe oligonucleotide is detected by a suitable method, for example by fluorescence measurement with a fluorescence scanner in the presence of an applied electric field.
  • a suitable method for example by fluorescence measurement with a fluorescence scanner in the presence of an applied electric field.
  • E smaller than the geometric change potential of the single strand 9 E SS (E ⁇ 9 E SS )
  • a decrease in the fluorescence intensity is observed due to the hybridization.
  • potentials E in the range between the geometric change potential of the single strand 9 E SS and the geometric change potential of the double strand 9 E ds 9 E SS ⁇ E ⁇ 9 E ds
  • an increase in the fluorescence intensity is observed due to the hybridization.
  • the location of the potentials 9 E SS and 9 E ds depends on the selected conditions. With 100 mM chloride, the potential 9 E SS is approx. 0.2 V (against silver wire as a reference electrode) and the potential 9 E ds is approx. 0.4 V (against silver wire as a reference electrode).
  • the dissolved target is then added, potential hybridization events are made possible under suitable conditions known to the person skilled in the art (arbitrary, freely selectable stringency conditions of the parameters potential temperature / salt / chaotropic salts etc. for the hybridization) and the measurement for the detection of the fluorophore in the presence of the applied one electric field repeated.
  • suitable conditions known to the person skilled in the art (arbitrary, freely selectable stringency conditions of the parameters potential temperature / salt / chaotropic salts etc. for the hybridization) and the measurement for the detection of the fluorophore in the presence of the applied one electric field repeated.
  • the difference in the measurement signal (decrease or increase, depending on the measurement method, cf. FIG. 2) is proportional to the number of hybridization events between probe nucleic acid oligomer on the surface and suitable target nucleic acid oligomer in the test solution.
  • n nucleotide (nt) long nucleic acid probe (DNA, RNA or PNA, for example a 20 nucleotide long oligo) is near one of its ends (3 'or 5' end) directly or via any spacer a reactive group for covalent anchoring to the surface, e.g. as a 3'-thiol-modified probe oligonucleotide, in which the terminal thiol modification serves as a reactive group for binding to gold.
  • Other covalent anchoring options arise e.g. from amine-modified ligate oligonucleotide, which is used for anchoring to surface-bonded carboxylic acid functions (e.g.
  • a fluorophore is covalently bound in the vicinity of the other terminus of the probe oligonucleotide (cf. Example 1).
  • the nucleic acid probe modified in this way is
  • Nucleic acid oligomers are bound together with the bifunctional linker to the surface, which may be correspondingly derivatized, taking care that enough bifunctional linker of suitable chain length is added (about 0.1 to 10-fold excess) in order to allow sufficient space for a between the individual probe oligonucleotides
  • the (residual) fluorescence of the fluorophore on the probe oligonucleotide is detected by a suitable method, e.g. by fluorescence measurement with a fluorescence scanner.
  • the dissolved target is then added, potential hybridization events are made possible under suitable conditions known to those skilled in the art (arbitrary, freely selectable stringency conditions of the parameters potential / temperature / salt / chaotropic salts etc. for the hybridization) and the measurement is repeated to detect the fluorophore.
  • the difference in the measurement signal (decrease or increase, depending on the measurement method, cf. FIG. 3) is proportional to the number of hybridization events between probe nucleic acid oligomer on the surface and suitable target nucleic acid oligomer in the test solution.
  • the embodiments described above can be for a target type (for example a specific target oligonucleotide type with a known sequence) on a surface or - if different probe types are used for each test site - for several target types (same ligand groups as for example several different target - Oligonucleotide types or different antibody types, antigen types etc., but also mixtures thereof) can be used.
  • a target type for example a specific target oligonucleotide type with a known sequence
  • target types for example a specific target oligonucleotide type with a known sequence
  • the synthesis of the oligonucleotides takes place in an automatic oligonucleotide synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA / RNA synthesizer) according to the synthesis protocols recommended by the manufacturer for a 1.0 ⁇ mol synthesis.
  • the oxidation steps are carried out with a 0.02 M iodine solution in order to avoid oxidative cleavage of the disulfide bridge.
  • Modifications to the 5 'position of the oligonucleotides are carried out with a coupling step that is extended to 5 min.
  • the amino modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) is built into the sequences with the respective standard protocol. The coupling efficiencies are determined online during the synthesis via the DMT cation concentration photometrically or conductometrically.
  • the oligonucleotides are deprotected with concentrated ammonia (30%) at 37 ° C for 16 h.
  • the oligonucleotides are purified using RP-HPL chromatography according to standard protocols (eluent: 0.1 M triethylammonium acetate buffer, acetonitrile), and the characterization is carried out using MALDI-TOF MS.
  • the amine-modified oligonucleotides are coupled to the correspondingly activated fluorophores (e.g. fluorescein isothiocyanate) in accordance with conditions known to the person skilled in the art. The coupling can take place both before and after the oligonucleotides have been bound to the surface.
  • fluorophores e.g. fluorescein isothiocyanate
  • oligonucleotide synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA / RNA synthesizer) according to the synthesis protocols recommended by the manufacturer for a 1.0 ⁇ mol synthesis.
  • the oxidation steps are carried out with a 0.02 M iodine solution in order to avoid oxidative cleavage of the disulfide bridge.
  • Modifications to the 5 'position of the oligonucleotides are carried out with a coupling step that is extended to 5 min.
  • the fluorophores are incorporated into the sequences as phosphoramidites (Glen Research 10-1037) in the sequences with the respective standard protocol.
  • the coupling efficiencies are determined online during the synthesis via the DMT cation concentration photometrically or conductometrically.
  • the quench surface (here: gold plate) is treated with a double-modified 20 bp single-strand oligonucleotide of the sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification 1: the phosphate group of the 3' end is with (HO- (CH 2 ) 2 -S) 2 esterified to P-0- (CH 2 ) 2 - SS- (CH 2 ) 2 -OH; modification 2: at the 5 'end is the fluorescein modifier fluorescein phosphoramidite (proligo biochemistry GmbH) installed according to the respective standard protocol) in 5x10 "5 molar buffer solution (phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7) with the addition of approx.
  • 5 molar buffer solution phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7
  • the quench surface (here: gold plate) is treated with a double-modified 20 bp single-strand oligonucleotide of the sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification 1: the phosphate group of the 3' end is with (HO- (CH 2 ) 2 -S) 2 esterified to P-0- (CH 2 ) 2 - SS- (CH 2 ) 2 -OH; modification 2: at the 5 'end is the fluorescein modifier fluorescein phosphoramidite (proligo biochemistry GmbH) according to the respective standard protocol) in 5x10 "5 molar buffer solution (phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7) for 0.5 - 24 h.
  • 5 molar buffer solution phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7
  • this single strand can also be hybridized with its complementary strand.
  • the gold surface modified in this way is completely wetted with an approximately 10 "5 to 10 " 1 molar propanethiol solution (in water or buffer, pH 7-7.5) and incubated for 0.5-24 h.
  • propanethiol covers the free gold surface remaining after the incubation step by forming an Au-S bond.
  • propanethiol another thiol or disulfide of suitable chain length can also be used.
  • the quench surface (here: gold plate) is treated with a double-modified 20 bp single-strand oligonucleotide of the sequence 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '(modification 1: the phosphate group of the 3' end is with (HO- (CH 2 ) 2 -S) 2 esterified to P-0- (CH 2 ) 2 - SS- (CH 2 ) 2 -OH; modification 2: at the 5 'end is fluorescein-modifier fluorescein-phosphoramidite (Proligo Biochemie GmbH ) installed according to the respective standard protocol) in 5x10 "5 molar buffer solution (phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7) for 0.5 - 24 h.
  • 5 molar buffer solution phosphate buffer, 0.5 molar in water, pH 7
  • the disulfide spacer P-0- (CH 2 ) 2 - SS- (CH 2 ) 2 -OH of the oligonucleotide is cleaved homolytically, whereby the spacer forms a covalent Au-S bond with Au atoms on the surface, which leads to coadsorption of the ss-oligonucleotide and the cleaved 2-hydroxy-mercaptoethanol
  • this single strand can also be hybridized with its complementary strand.
  • the gold surface modified in this way is then completely wetted with an approximately 10 "5 to 10 " 1 molar solution of, for example, mercaptopropionic acid, mercaptoethanesulfonic acid or cysteamine (in water or buffer, pH 7-7.5 or in ethanol) and 0.5-24 hours incubated.
  • the free thiol mercaptopropionic acid, mercaptoethanesulfonic acid, cysteamine covers the free gold surface remaining after the incubation step by forming an Au-S bond.
  • other functional thiols or disulfides of suitable chain length with the same or different functional groups can also be used.
  • the probe surface is produced analogously to Example 4.
  • a modified oligonucleotide of the sequence 5'-fluorescein-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '[C 3 -S-SC 3 -OH] is immobilized on gold (50 ⁇ mol oligonucleotide in phosphate buffer (K 2 HP0 4 / KH 2 P0 4 500 mM, pH 7, subsequent coating with propanethiol 1mM in water) and in the form Au-S (CH 2 ) 2 -ss-oligo-fluorescein the fluorescence intensity of the surface was determined with a fluorescence scanner from Lavision Biotech. To measure the A fluorescence potential of 0.3 V is applied to silver wire. In the presence of liquid media (100 mmol chloride), 150 ⁇ l of the medium are added to the gold surface and then covered with a cover slip. Alternatively, hybrid wells or imaging chambers can also be used.
  • the probe surface is produced analogously to Example 5.
  • a modified oligonucleotide of the sequence 5'-fluorescein-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '[C 3 -S-SC 3 -OH] is immobilized on gold (50 ⁇ mol oligonucleotide in phosphate buffer (K 2 HP0 4 / KH 2 P0 4 500 mM, pH 7 and subsequent subsequent coating with an approx.

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen, das als ersten Schritt das Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche umfasst. Die Modifikation der Oberfläche besteht dabei in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Ligaten, wobei die Ligaten durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor modifiziert sind. Die weiteren Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Bereitstellen einer Probe mit Liganden, Anlegen eines elektrischen Feldes und Einstellen einer definierten Stärke des elektrischen Feldes am Ort der modifizierten Ligaten, Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche, Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors und Vergleich der detektierten Fluoreszenzintensitäten mit Referenzwerten.

Description

Fluoreszenz-Quenchen zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen in elektrischen Feldern
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand- Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen.
Stand der Technik
In der Krankheitsdiagnose, bei toxikologischen Testverfahren, in der genetischen Forschung und Entwicklung, sowie auf dem Agrar- und pharmazeutischen Sektor werden Immunoassays und zunehmend auch die Sequenzanalyse von DNA und RNA eingesetzt. Neben den bekannten seriellen Verfahren mit autoradiographischer oder optischer Detektion finden zunehmend parallele Detektionsverfahren mittels Array-Technologie, sogenannten DNA- oder Protein-Chips, Verwendung. Auch bei diesen parallelen Verfahren beruht die Detektion auf optischen, radiographischen, massenspektrometrischen oder elektrochemischen Methoden.
Zur Genanalyse auf einem Chip wird auf einer Oberfläche eine Bibliothek bekannter DNA- Sequenzen ("Sonden-Oligonukleotide") in einem geordneten Raster fixiert, so dass die
Position jeder individuellen DNA-Sequenz bekannt ist. In der Untersuchungslösung anwesende Fragmente aktiver Gene ("Target-Oligonukleotide"), deren Sequenzen zu bestimmten Sonden-Oligonukleotiden auf dem Chip komplementär sind, können durch
Nachweis der entsprechenden Hybridisierungsereignisse auf dem Chip identifiziert werden. Im Allgemeinen erfolgt die Analyse über optische (oder autoradiographische)
Detektionsverfahren unter Verwendung von Target-Oligonukleotiden, die mit einem
Radiolabel (z.B. 32P) oder einem Fluoreszenzfarbstoff (z.B. Fluorescein, Cy3™ oder
Cy5™) markiert sind. Die Verwendung von Fluoreszenzlabel und entsprechenden
Fluoreszenz-Scannern überwiegt dabei zunehmend die Anwendung von Radiolabel. Die zur Zeit auf dem Markt erhältlichen Fluoreszenz-Scanner ermöglichen den Nachweis von
Fluorophoren im Subattomol-Bereich. Die Verwendung von markierten Targets zum Nachweis von Hybridisierungsereignissen beinhaltet jedoch einige Nachteile. Zum einen muss die Markierung vor der eigentlichen Messung erfolgen, was einen zusätzlichen Syntheseschritt und damit zusätzlichen Arbeitsaufwand bedeutet. Zudem ist es schwierig, eine homogene Markierung des Probenmaterials zu gewährleisten. Außerdem sind stringente Waschbedingungen notwendig, um im Anschluss an eine Hybridisierung nicht oder unspezifisch gebundenes Material zu entfernen.
Sowohl für die Protein- als auch für die DNA-Analyse ist es daher wünschenswert und für den Anwender vorteilhaft, wenn die Targets (Antikörper bzw. Antigen oder DNA- Fragment) nicht mit einem Detektionslabel modifiziert werden müssen und nach der Hybridisierung keine komplizierten Waschschritte notwendig sind.
Die Nachteile der Markierung des Probenmaterials mit radioaktiven Elementen oder Fluoreszenzfarbstoffen können umgangen werden, wenn an Stelle der Targets die Sondenmoleküle mit entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden. Nach diesem Prinzip funktionieren die sogenannten molekularen Leuchten (molecular beacons). Diese einsträngigen Oligonukleotide weisen eine Haarnadelstruktur (hairpin, stem-and-loop) auf und tragen am einen Ende der Sequenz einen Fluorophor (z.B. Fluorescein, TexasRed®) und am anderen Ende der Sequenz einen geeigneten Fluoreszenzlöscher (z.B. DABCYL). Durch die spezielle geometrische Anordnung befinden sich die fluoreszierende Gruppe und die Einheit, die zur Löschung der Fluoreszenz führt, in räumlicher Nähe zueinander. Daher zeigen die Sonden nur eine äußerst geringe Fluoreszenz. In Gegenwart der entsprechenden zur Sequenz der Schlinge (loop) komplementären Sequenz (Target) erfolgt eine Hybridisierung in diesem Bereich. Dies führt zu einer Änderung der Konformation und zur Trennung von Fluorophor und Quencher, was als starke Zunahme der Fluoreszenz beobachtet werden kann.
Neben organischen Molekülen (wie DABCYL) werden auch Gold-Nanopartikel als effiziente Quencher eingesetzt (Nature Biotech. Vol. 19, 2001, Seite 365). Das Quenchen der Fluoreszenz durch Metalle beruht primär auf einem strahlungslosen Energietransfer vom Farbstoffmolekül zum Metall. Bei Verwendung von Gold-Nanopartikeln wird eine größere Sensitivität beobachtet als bei organischen Quenchern. Außerdem werden Farbstoffe bis in den nahen Infrarot-Bereich effizient gequencht. Ein Nachteil dieser Methode liegt allerdings darin, dass Gold-Nanopartikel bei Temperaturen über 50°C nicht mehr stabil sind. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass diese Methode auf die Untersuchung von Lösungen beschränkt ist und daher nur wenige Sequenzen zur gleichen Zeit untersucht werden können, der Parallelisierungsgrad dieses Ansatzes also gering ist.
Obwohl es also viele Detektionsmöglichkeiten für Ligat-Ligand-Assoziate gibt, ist der Bedarf an einfachen, kostengünstigen, problemlos durchzuführenden und verlässlichen Detektionsprinzipien vor allem im Bereich der weniger dichten Array-Technologien (DNA- und Protein-Chips mit wenigen einzelnen bzw. bis zu mehreren hunderttausend Test- Sites pro cm2 z.B. für sogenannte POC (Point of Care)- Systeme bzw. für high throughput screening - HTS - Systeme) hoch.
Darstellung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zur Detektion von Ligat- Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen zu schaffen, welches die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren gemäß unabhängigem Patentanspruch 1 und den Kit gemäß unabhängigem Patentanspruch 23 gelöst.
Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Figuren und den Beispielen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt:
Genetik
DNA Desoxyribonukleinsäure
RNA Ribonukleinsäure
PNA Peptidnukleinsäure (synthetische DNA oder RNA, bei der die Zucker-Phosphat-Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei Ersatz der Zucker-Phosphat-Einheit durch die -NH-(CH2)2- N(COCH2-Base)-CH2CO- Einheit hybridisiert PNA mit DNA.)
A Adenin
G Guanin
C Cytosin
T Thymin
U Uracil
Base A, G, T, C oder U
Bp Basenpaar
Nukleinsäure wweenniiggsstteennss zzwweei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z.B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z.B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin- Basen, wie z.B. auf das Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z.B. Phosphoramid-, Thio-Phosphat- oder Dithio-Phosphat-Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit zur sequenzspezifischen Bindung natürlich vorkommender cDNA oder RNA. nt Nukleotid
Nukleinsäure-Oligomer Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z.B. Nukleinsäure-Oktamer: Eine Nukleinsäure mit beliebigem Rückgrat, bei der 8 Pyrimidin- oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind). ns-Oligomer Nukleinsäure-Oligomer
Oligomer Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer.
Oligonukleotid Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z.B. ein DNA-, PNA- oder RNA-Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge. Oligo Abkürzung für Oligonukleotid. Mismatch Zur Ausbildung der Watson-Crick-Struktur doppelsträngiger Oligonukleotide hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, dass die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede andere Basenpaarung bildet keine Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die Struktur und wird als "Mismatch" bezeichnet. ss Single Strand (Einzelstrang) ds double Strand (Doppelstrang)
Substrat, Cofaktor, Komplexbindungspartner eines Proteins (Enzyms). Coenzym
Antikörper Komplexbindungspartner eines Antigens.
Antigen Komplexbindungspartner eines Antikörpers.
Rezeptor Komplexbindungspartner eines Hormons.
KA Assoziationskonstante für die Assoziation von Ligat und Ligand.
Substanzen
Fluorophor chemische Verbindung (chemische Substanz), die in der Lage ist, bei Anregung mit Licht ein längerwelliges (rotverschobenes) Fluoreszenzlicht abzugeben. Fluorophore
(Fluoreszenzfarbstoffe) können Licht in einem Wellenlängenbereich vom ultravioletten (UV) über den sichtbaren (VIS) bis hin zum infraroten (IR) Bereich absorbieren. Die Absorptions- und Emissionsmaxima sind in der Regel um 15 bis 40 nm verschoben (Stokes-Shift).
FP Fluorophor Cy3™ 5,5Λ-disulfo-1 , 1 'd -carbopenteny -SAS^ etramethyl- indodicarbocyanin
(Fluoreszenzfarbstoff der Firma Amersham Life Science, Inc.)
Cy5 TM 5,5\7,7 etrasulfo-1,rdi(-carbopentenyl)-3,3,3\3 etramethyl- benzindodicarbocyanin
(Fluoreszenzfarbstoff der Firma Amersham Life Science, Inc.)
Fluorescein Resorcinphtalein (Fluoreszenzfarbstoff)
Rhodamin 6G Basic Red 1 (Fluoreszenzfarbstoff)
Texas Red® Fluoreszenzfarbstoff der Firma Molecular Probes, Inc.
DABCYL 4-((4'-(Dimethylamino)phenyl)azo)benzoesäure
Fluoreszenzlöschung strahlungsloser Energietransfer
Fluoreszenz-Quenchen Fluoreszenzlöschung
Quench-Oberfläche leitende (Metall)-Oberfläche, die durch einen Energietransfer Fluoreszenz löschen kann (insbesondere Gold-, Silber-, Kupfer- Oberflächen usw. )
EDTA Ethylendiamin-Tetraacetat (Natriumsalz) Ligand Bezeichnung für Moleküle, die von Ligaten spezifisch gebunden werden; Beispiele von Liganden im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme eines Proteins (Enzyms), Antikörper (als Ligand eines Antigens), Antigene (als Ligand eines Antikörpers), Rezeptoren (als Ligand eines Hormons), Hormone (als Ligand eines Rezeptors) oder Nukleinsäure-Oligomere (als Ligand des komplementären Nukleinsäure-Oligomers)
Ligat Bezeichnung für (Makro-) Molekül, an dem sich spezifische Erkennungs- und Bindungsstellen für die Ausbildung eines Komplexes mit einem Liganden befinden (Template).
Linker molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül. In der Regel sind Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Hetero-Alkinylkette käuflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stellen mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reaktionen mit dem entsprechenden Reaktionspartner eine kovalente chemische Bindung aus. Die reaktiven Gruppen können auch photoaktivierbar sein, d. h. die reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge aktiviert. Bevorzugte Linker sind solche der Kettenlänge 1 - 60, insbesondere der Kettenlänge 5 - 40, wobei die Kettenlänge hier die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen, also zwischen den zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, einem Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül, darstellt.
Spacer Linker, der über die reaktiven Gruppen an eine oder beide der zu verbindenden Strukturen (siehe Linker) kovalent angebunden ist. Bevorzugte Spacer sind solche der Kettenlänge 1 - 60, insbesondere der Kettenlänge 5 - 40, wobei die Kettenlänge die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen darstellt.
Modifizierte Oberflächen/Elektroden
Au-S-(CH2)z-ss-oligo- Gold-Oberfläche mit kovalent aufgebrachter Monolayer aus FP derivatisiertem Einzelstrang-Oligonukleotid. Hierbei ist die endständige Phosphatgruppe des Oligonukleotids am 3' Ende mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2rOH verestert, wobei die S-S Bindung homolytisch gespalten wird und je eine Au-S-R Bindung bewirkt. Am freien Ende trägt das Sonden- Oligonukleotid einen kovalent angebunden Fluorophor (FP) wie z.B. Cy3™, Cy5™, Texas Red®, Rhodamin 6G, Fluorescein etc.
Au-S-(CH2)2-ds-oligo- Au-S-(CH2)2-ss-oligo-FP hybridisiert mit dem zu ss-oligo FP komplementären Oligonukleotid.
Elektrochemie
E Elektrodenpotential, das an der Arbeitselektrode anliegt.
Css geometrisches Änderungspotential der oberflächengebundenen einsträngigen Sonde: Potential, bei dessen Durchlauf in positiver Richtung die einsträngige Sonde eine Änderung von einer mehr gestreckten, in die Lösung hineinragenden Konformation in eine mehr komprimierte, an die Oberfläche gedrückte Form erfährt. (Konformationsänderung von "stehend" zu "liegend")
9E -,ds geometrisches Änderungspotential der oberflächengebundenen doppelsträngigen Sonde/Target: Potential, bei dessen Durchlauf in positiver Richtung die doppelsträngige Sonde/Target eine Änderung von einer mehr gestreckten, in die Lösung hineinragenden Konformation in eine mehr komprimierte, an die Oberfläche gedrückte Form erfährt. (Konformationsänderung von "stehend" zu "liegend")
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand- Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen, das als ersten Schritt das Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche umfasst. Die Modifikation der Oberfläche besteht dabei in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Ligaten, wobei die Ligaten durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor modifiziert sind. Die weiteren Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Bereitstellen einer Probe mit Liganden, Anlegen eines elektrischen Feldes und Einstellen einer definierten Stärke des elektrischen Feldes am Ort der modifizierten Ligaten, Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche, Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors und Vergleich der detektierten Fluoreszenzintensitäten mit Referenzwerten.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ein Vergleich der detektierten Fluoreszenzintensitäten mit Referenzwerten erforderlich. Diese Referenzwerte können aus vorangegangenen Messungen bereits vorliegen und brauchen daher im allgemeinsten Fall nicht im Laufe des erfindungsgemäßen Verfahrens detektiert werden.
Da die Referenzwerte aber im Idealfall unter exakt den gleichen äußeren Bedingungen bestimmt werden sollen wie die eigentlichen Messwerte der Fluoreszenzintensitäten, wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nach dem
Anlegen eines elektrischen Feldes und Einstellen einer definierten Stärke des elektrischen
Feldes am Ort der modifizierten Ligaten und vor dem Inkontaktbringen der Targets
(Probe) mit der modifizierten Oberfläche eine erste Detektion der Fluoreszenz des
Fluorophors durchgeführt. Die so erhaltenen Werte werden dann als Referenzwerte verwendet. Gemäß den nachfolgend geschilderten, besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird zusätzlich eine Normierungsmessung durchgeführt. Auf der modifizierten Oberfläche sind in diesen Fällen Sites aufgebracht, denen nach Zugabe der Probe ein ganz bestimmter Assoziationsgrad zugeordnet werden kann. Das bei der Detektion erhaltene Signal ist dann für diesen bestimmten Grad an Assoziation charakteristisch und kann zur Normierung der Signale der Test-Sites herangezogen werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst nämlich auch Verfahren, in denen eine modifizierte Oberfläche verwendet wird, die durch Anbindung von wenigstens zwei Arten von modifizierten Ligaten modifiziert wurde. Die verschiedenen Arten von Ligaten sind in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden. Unter "im wesentlichen abgetrennten Bereichen" werden Bereiche der Oberfläche verstanden, die ganz überwiegend durch Anbindung einer bestimmten Art von Ligat modifiziert sind. Lediglich in Gebieten, in denen zwei solche im wesentlichen abgetrennte Bereiche aneinander grenzen, kann es zu einer räumlichen Vermischung von verschiedenen Ligat- Arten kommen. In dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugten Verfahren erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von einem Liganden zu der Probe, wobei der Ligand ein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante zu einer bestimmten Art von Ligaten ist, die in einem bestimmten Bereich (Site T100) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Der Ligand wird dabei in einer Menge zu der Probe zugegeben, die größer ist als die Menge an Liganden, die notwendig ist, um die Ligaten der T100-Sites vollständig zu assoziieren. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T-|0o erhaltenen Wert. Der für den Bereich T100 erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei vollständiger Assoziation (100%).
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine modifizierte Oberfläche verwendet, die durch Anbindung von wenigstens drei Arten von Ligaten modifiziert wurde. Die verschiedenen Arten von Ligaten sind in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden. Dabei ist wenigstens eine Art von Ligat in einem bestimmten Bereich (Site T0) an die Oberfläche gebunden, von dem bekannt ist, dass in der Probe kein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante enthalten ist, also der entsprechende Assoziationspartner bzw. Ligand nicht in der Probe vorkommt. Auch in diesem besonders bevorzugten Verfahren erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von einem Liganden zu der Probe, wobei der Ligand ein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante zu einer bestimmten Art von Ligaten ist, die in einem bestimmten Bereich (Site T10o) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Der Ligand wird dabei in einer Menge zu der Probe zugegeben, die größer ist als die Menge an Liganden, die notwendig ist, um die Ligaten der T10o-Sites vollständig zu assoziieren. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T100 erhaltenen Wert und mit dem für den Bereich T0 erhaltenen Wert. Der für den Bereich T0 erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei fehlender Assoziation (0%).
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der oben geschilderten Verfahren erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von wenigstens einer weiteren Art von Ligand zu der Probe, wobei bekannt ist, dass dieser Ligand in der ursprünglichen Probe nicht enthalten ist. Diese weitere Art von Ligand weist eine Assoziationskonstante >0 zu einer Art von Ligaten auf, die in einem bestimmten Bereich (Site Tn) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Der Ligand wird in einer solchen Menge zu der Probe gegeben, dass nach dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche n% der Ligaten des Sites Tn in assoziierter Form vorliegen. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T10o erhaltenen Wert, mit dem für den Bereich T0 erhaltenen Wert und mit den für die Bereiche Tn erhaltenen Werten. Der für ein bestimmtes Test-Site Tn erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei Vorliegen von n% Ligat-Ligand-Assoziaten bezogen auf die Gesamtzahl an Ligaten der entsprechend Art.
Die Menge an Ligand, die mit der modifizierten Oberfläche in Kontakt gebracht werden muss, um eine n%ige Assoziation am Site Tn zu bewirken, kann vom Fachmann durch einfache Routineuntersuchungen bestimmt werden. Dazu wird z.B. nach Detektion der Werte für T0 und T100 eine kalibrierte Messung durchgeführt, bei der die Signalintensität von (unterschiedlichen) Detektionslabel bestimmt wird, mit denen der Ligat und der Ligand ausgestattet sind. Das Verhältnis der Intensitäten von Ligand-Label-Signal zu Ligat-Label-Signal entspricht n%.
Wird eine genügende Anzahl an Sites Tn auf der modifizierten Oberfläche aufgebracht, so kann eine Normierungskurve mit hoher Genauigkeit aufgenommen werden. Die Normierung der Messungen der eigentlichen Test-Sites mit Hilfe dieser Normierungskurve verbessert die Reproduzierbarkeit der Analytik mit Hilfe der Chip-Technologie deutlich.
Es soll darauf hingewiesen werden, dass das Auffinden eines Liganden, der nicht in der Probe enthalten ist, insbesondere im Fall der Verwendung von Nukleinsäure-Oligomeren als Liganden und Ligaten keinerlei Probleme bereitet, da auch die umfangreichsten Genome immer noch eine genügende Auswahl an nicht vorhandenen Sequenzen bieten. Für den Fall, dass sich die nicht vorhandene Sequenz von einer anwesenden Sequenz nur durch eine Base unterscheidet, muss der Hybridisierungsschritt unter stringenten Bedingungen durchgeführt werden. Bevorzugt werden aber Sequenzen verwendet, die sich deutlich, also in mehreren Basen, von den in der Probe anwesenden Sequenzen unterscheiden. Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn für die Test-Sites und für die Normierungssites Oligonukleotide mit der gleichen oder zumindest einer ähnlichen Zahl an Basen verwendet werden.
Daneben umfasst die vorliegende Erfindung auch einen Kit zur Durchführung eines Verfahrens zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz- Quenchen. Der Kit umfasst eine modifizierte Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Ligaten besteht und wobei die Ligaten durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor modifiziert sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die Referenzwerte von dem Kit bereits umfasst, sodass die Fluoreszenz des Fluorophors vom Endverbraucher nur einmal detektiert werden muss. Die bei dieser Detektion erhaltenen Werte brauchen dann nur mit den bereits vorhandenen Referenzwerten verglichen zu werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Kit eine modifizierte Oberfläche, die wenigstens einen Bereich T0 und wenigstens einen Bereich T100 aufweist. Besonders bevorzugt werden Ausführungsformen, wonach die modifizierte Oberfläche zusätzlich wenigstens einen Bereich Tn umfasst.
Die Quench-Oberfläche
Mit dem Begriff "Oberfläche" wird jedes Trägermaterial bezeichnet, das geeignet ist, direkt oder nach entsprechender chemischer Modifizierung Fluorophor-derivatisierte Ligaten zu tragen, die kovalent an der Oberfläche immobilisiert sind und deren Fluoreszenz nahe an der Oberfläche (in ca. 1 bis 50 A Abstand zur Oberfläche) durch Fluoreszenzlöschung (strahlungsloser Energietransfer zwischen dem Fluorophor als Emitter und der Oberfläche als Absorber) signifikant (>10% der erwarteten Fluoreszenzintensität des Fluorophors in Abwesenheit der Oberfläche bei ansonsten gleichen Bedingungen) reduziert wird. Insbesondere sind Gold und Silber als Quench-Oberflächenmaterial geeignet. Die Bezeichnung Oberfläche ist unabhängig von den räumlichen Dimensionen der Oberfläche und beinhaltet auch Nanopartikel (Partikel oder Cluster aus wenigen einzelnen bis mehreren hunderttausend Oberflächen-Atomen oder -Molekülen). Die Oberfläche kann zusätzlich an einen festen Träger wie z.B. Glas, Metall oder Plastik gebunden vorliegen.
Bindung des Ligaten an die Oberfläche
Verfahren zur Immobilisierung von Ligat-Molekülen, insbesondere Biopolymeren wie Nukleinsäure-Oligomeren oder Antigenen bzw. Antikörpern an einer Oberfläche sind dem Fachmann bekannt. Die Immobilisierung kann z.B. kovalent über Hydroxyl-, Epoxid-, Amino- oder Carboxygruppen des Trägermaterials mit natürlicherweise am Ligat vorhandenen oder durch Derivatisierung am Ligat angebrachten Thiol-, Hydroxy-, Amino- oder Carboxylgruppen erfolgen. Der Ligat kann direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder -molekülen einer Oberfläche verbunden werden. Daneben kann der Ligat durch die bei Immunoassays üblichen Methoden verankert werden wie z.B. durch Verwendung von biotinylierten Ligaten zur nicht-kovalenten Immobilisierung an Avidin oder Streptavidin-modifizierten Oberflächen. Bei Verwendung von Nukleinsäure- Oligomeren als Ligaten kann die chemische Modifikation der Sonden-Nukleinsäure- Oligomere mit einer Oberflächen-Ankergruppe bereits im Verlauf der automatisierten Festphasensynthese oder aber in gesonderten Reaktionsschritten eingeführt werden. Dabei wird auch das Nukleinsäure-Oligomer direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder -molekülen einer Oberfläche der oben beschriebenen Art verknüpft. Diese Bindung kann auf verschiedene, aus dem Stand der Technik bekannten Arten durchgeführt werden (vgl. z.B. Hartwich, G.: ELEKTROCHEMISCHE DETEKTION VON
SEQUENZSPEZIFISCHEN NUKLEINSÄUREOLIGOMERHYBRIDISIERUNGSEREIGNISSEN (1999), WO 00/42217).
Bei der Anbindung der Nukleinsäure-Oligomere an die Oberflächen ist auf einen besonders wichtigen Punkt zu achten. Grundsätzlich herrschen zur Detektion der Differenz der Fluoreszenzintensität von hybridisierten Nukleinsäure-Oligomeren und einsträngigen Nukleinsäure-Oligomeren dann besonders günstige Bedingungen, wenn der Fluorophor sich in nur einem der Zustände "hybridisiert" oder "nicht hybridisiert" möglichst nahe an der modifizierten Oberfläche befindet. Das Ausmaß des Quench- Vorgangs verändert sich ja bekanntermaßen mit einer höheren (dritte bis sechste) Potenz des Abstandes zwischen Quench-Oberfläche und Fluorophor. Solche besonders günstigen Bedingungen können nur mit speziellen Anbindungstechniken erreicht werden. Es muss bei der Anbindung der Nukleinsäure-Oligomere darauf geachtet werden, dass diese entweder völlig ohne weiteres Co-Adsorbat an die Oberfläche gebunden werden oder, falls ein Co-Adsorbat notwendig erscheint, dass dieses eine möglichst dünne Schicht über der Oberfläche ausbildet. Es muss also entweder eine direkte Anbindung des Nukleinsäure-Oligomers an die Oberfläche erfolgen oder eine Belegung zusammen mit möglichst kurzkettigen Co-Adsorbaten wie z.B. kurzkettigen Thiolen. Bevorzugt werden Co-Adsorbate der Kettenlänge 1 bis 30, besonders bevorzugt der Kettenlänge 1 bis 20, insbesondere der Kettenlänge 1 bis 10.
Insbesondere nachteilig ist in diesem Zusammenhang eine Anbindung der Nukleinsäure- Oligomere in Form einer Verbindung Oberfläche-Biotin-Avidin-Biotin-Oligomer. Bei einer solchen Anbindung ist der Fluorophor immer durch eine sehr dicke Schicht aus Biotin- Avidin-Biotin von der Oberfläche abgeschirmt, was mit entsprechenden Nachteilen in der Detektion der Fluoreszenz einhergeht.
Liganden (Targets)
Als Liganden werden Moleküle bezeichnet, die spezifisch mit dem an einer Oberfläche immobilisierten Ligaten (Sonde) unter Ausbildung eines Komplexes wechselwirken. Beispiele von Liganden im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme als Komplexbindungspartner eines Proteins (Enzyms), Antikörper (als Komplexbindungspartner eines Antigens), Antigene (als Komplexbindungspartner eines Antikörpers), Rezeptoren (als Komplexbindungspartner eines Hormons), Hormone (als Komplexbindungspartner eines Rezeptors) oder Nukleinsäure-Oligomere (als Komplexbindungspartner des komplementären Nukleinsäure-Oligomers). Fluorophore
Als Fluorophore werden kommerziell erhältliche Fluoreszenzfarbstoffe wie z.B. Texas Red®, Rhodamin-Farbstoffe, Cyaninfarbstoffe wie z.B. Cy3™, Cy5™, Fluorescein etc (vgl. Fluka, Amersham und Molecular Probes Katalog) verwendet.
Fluoreszenzlöschung
Mit Fluoreszenzlöschung wird die Deaktivierung einer elektronisch angeregten Spezies über einen strahlungslosen Prozess bezeichnet. Die Deaktivierung kann durch Stöße oder auch durch strahlungslose Energieübertragung auf Metalle erfolgen. Die freiwerdende Energie wird als thermische Energie dissipiert. Gold ist ein Beispiel für ein Metall, das die Fähigkeit zur Fluoreszenzlöschung besitzt. Die Löschung weist eine starke Abhängigkeit vom Abstand des Fluorophors von der als Fluoreszenzlöscher fungierenden Oberfläche auf (umgekehrt proportional zu einer höheren (dritte bis sechste) Potenz des Abstands). Der Effekt der Fluoreszenzlöschung ist daher nur bei Abständen kleiner 100 bis 200 A messbar. Im Bereich größer als ca. 200 A führen weitere Abstandsänderungen nicht mehr zu einer messbaren Erhöhung der Fluoreszenzintensität.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigen
Fig. 1 eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen durch Modulation der Fluoreszenzlöschung an Quench-Oberflächen;
Fig. 2 eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen durch E-Feld unterstützte Modulation der Fluoreszenzlöschung an Quench-Oberflächen;
Fig. 3 eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen durch "lmmobilisierte-lon"-unterstützte Modulation der Fluoreszenzlöschung an Quench-Oberflächen.
Bezugszeichenliste
102: Fluorophor
201: einsträngige Oligomer-Sonde 202: Sonde hybridisiert mit Target 203: Oberfläche (z.B. Gold)
204: Abstand des Fluorophor zur Goldoberfläche vor der Hybridisierung 205: Abstand des Fluorophor zur Goldoberfläche nach der Hybridisierung 301: Vorrichtung zum Anlegen eines elektrischen Feldes 401: an der Oberfläche immobilisierte ionische Gruppen (Anionen) 402: an der Oberfläche immobilisierte ionische Gruppen (Kationen)
Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen durch Modulation der Fluoreszenzlöschung an Quench- Oberflächen. Gemäß Figur 1A liegt vor der Hybridisierung das einsträngige Sonden- Nukleinsäure-Oligomer 201 in einer Form vor, die durch einen großen Abstand 204 von Fluorophor 102 und quenchender Metalloberfläche charakterisiert ist. Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang 202 (Target) verringert sich der Abstand 205 zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche 203. Dadurch kommt es zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität (Balkendiagramm der Figur 1A). Gemäß Figur 1 B liegt das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer 201 vor der Hybridisierung in einer Form vor, die durch einen geringen Abstand 204 von Fluorophor 102 und quenchender Metalloberfläche charakterisiert ist. Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang 202 (Target) vergrößert sich der Abstand 205 zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche. Dadurch kommt es zu einer Zunahme der Fluoreszenzintensität (Balkendiagramm der Figur 1B). Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen durch E-Feld unterstützte Modulation der Fluoreszenzlöschung an Quench-Oberflächen. Durch ein an die modifizierte Oberfläche angelegtes elektrisches Potential wird am Ort des Sonden-Nukleinsäure-Oligomers 201 ein elektrisches Feld erzeugt. In Figur 2A ist der Fall dargestellt, dass das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer 201 aufgrund des elektrischen Feldes in einer gestreckten Form vorliegt. Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang 202 (Target) verringert sich der Abstand 205 zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche. Dadurch kommt es zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität (Balkendiagramm der Figur 2A). Figur 2B zeigt den Fall, dass aufgrund des elektrischen Feldes das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer 201 in einer komprimierten Form vorliegt. Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer- Strang 202 (Target) vergrößert sich der Abstand 205 zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche. Dadurch kommt es zu einer Zunahme der Fluoreszenzintensität (Balkendiagramm der Figur 2B).
Figur 3 zeigt eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen durch "lmmobilisierte-lon"-unterstützte Modulation der Fluoreszenzlöschung an Quench-Oberflächen. Gemäß Figur 3A liegt das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer 201 aufgrund der abstoßenden Wechselwirkung zwischen der negativ geladenen Sonde und den immobilisierten Anionen 401 in einer gestreckten Form vor. Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang 202 (Target) verringert sich der Abstand 205 zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche. Dadurch kommt es zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität (Balkendiagramm der Figur 3A). Figur 3B zeigt den Fall, dass aufgrund der anziehenden Wirkung zwischen der negativ geladenen Sonde und den immobilisierten Kationen 402 das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer 201 in einer komprimierten Form vorliegt. Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer- Strang 202 (Target) vergrößert sich der Abstand 205 zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche. Dadurch kommt es zu einer Zunahme der Fluoreszenzintensität (Balkendiagramm der Figur 3B). Wege zur Ausführung der Erfindung
Im folgenden werden zwei besonders bevorzugte Alternativen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz- Quenchen am Beispiel der Nukleinsäure-Hybridisierung (Ligat: Sonden-Oligonukleotid; Ligand: zum Sonden-Oligonukleotid komplementäres DNA-Teilstück) beschrieben. Diese Verfahrensalternativen sind für den Fachmann ohne weiteres auf die Detektion anderer Ligat / Liganden-Assoziate, wie sie im Abschnitt "Liganden (Targets)" erwähnt wurden, zu übertragen.
Um die Vorteile der DNA-Chip-Technologie auf die Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybriden durch Modulation des Fluoreszenz-Quenchens anzuwenden, werden verschiedene modifizierte Nukleinsäure-Oligomer-Sonden unterschiedlicher Sequenz mit den oben beschriebenen Immobilisierungstechniken an einen Träger gebunden. Mit der Anordnung der Nukleinsäure-Oligomer-Sonden bekannter Sequenz an jeder Position der Oberfläche, einem DNA-Array, soll das Hybridisierungsereignis eines beliebigen Target- Nukleinsäure-Oligomers oder einer (fragmentierten) Target-DNA detektiert werden, um z.B. Mutationen im Target aufzuspüren und sequenzspezifisch nachzuweisen. Dazu werden auf einer Oberfläche die Oberflächenatome oder -moleküle eines definierten Bereichs (einer Test-Site) mit DNA-/RNA-/PNA-Nukleinsäure-Oligomeren bekannter, aber beliebiger Sequenz, wie oben beschrieben, verknüpft. In einer allgemeinsten Ausführungsform kann der DNA-Chip auch mit einem einzigen Sonden-Oligonukleotid derivatisiert werden. Als Sonden-Nukleinsäure-Oligomere werden Nukleinsäure- Oligomere (z.B. DNA-, RNA- oder PNA-Fragmente) der Basenlänge 3 bis 70, bevorzugt der Länge 5 bis 60, besonders bevorzugt der Länge 10 bis 50, insbesondere bevorzugt der Länge 12 bis 40 verwendet.
An dieser Stelle sei erwähnt, dass die Target-Oligonukleotide auch eine größere Anzahl an Basen umfassen können, also länger sein können, als die Sonden-Oligonukleotide. In diesem Fall wird unter dem Ausdruck "zum Sonden-Oligonukleotid komplementäres Nukleinsäure-Oligomer" ein Nukleinsäure-Oligomer verstanden, das eine Basensequenz aufweist, die in einem Teilbereich zu dem Sonden-Oligonukleotid komplementär ist. Der/die restlichen Abschnitte des Nukleinsäure-Oligomers ragen dann an dem/den Enden des Sonden-Oligonukleotids über dessen Basenkette hinaus. An den so bereitgestellten Oberflächen mit immobilisierten und Fluorophor-markierten Sonden-Oligonukleotiden wird in einer Referenzmessung, z.B. mit einem Fluoreszenz- Scanner, die Fluoreszenzintensität der Fluorophor-markierten Sonden-Oligonukleotide im einsträngigen Zustand bestimmt.
Im nächsten Schritt wird die (möglichst konzentrierte) Untersuchungslösung mit Target- Oligonukleotid(en) zur Oberfläche mit immobilisierten Sonden-Oligonukleotiden gegeben. Dabei kommt es nur in dem Fall zur Hybridisierung, in dem die Lösung Target- Nukleinsäure-Oligomer-Stränge enthält, die zu den an die Oberfläche gebundenen Sonden-Nukleinsäure-Oligomeren komplementär, oder zumindest in weiten Bereichen komplementär sind.
Nach der Hybridisierung zwischen Sonde und Target wird in einer zweiten Fluoreszenzmessung die Fluoreszenzintensität im hybridisierten, doppelsträngigen Zustand bestimmt.
Die Differenz aus Referenzmessung und zweiter Messung je Test-Site ist proportional zur Anzahl der ursprünglich in der Untersuchungslösung für das jeweilige Test-Site vorhandenen komplementären (bzw. in weiten bereichen komplementären) Target- Oligonukleotide.
In einer Alternative kann die Referenzmessung weggelassen werden, wenn die Größe des Referenzsignals vorher (z.B. durch vorausgegangene Messungen etc.) hinlänglich genau bekannt ist.
Aufgrund der Hybridisierung von Sonden-Nukleinsäure-Oligomer und dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang (Target) verändert sich der Abstand zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche. Aufgrund des veränderten Abstandes erfährt auch das Ausmaß des Quench-Vorgangs und damit die Intensität der Fluoreszenz eine starke Änderung. Somit kann ein sequenzspezifisches Hybridisierungsereignis durch fluoreszenzbasierte Verfahren wie z.B. Fluoreszenzmikroskopie oder Messungen mit Fluoreszenz-Scanner detektiert werden.
Durch eine gezielte Beeinflussung der Stärke des elektrischen Feldes, in dessen Bereich sich die Fluorophor-modifizierten Sonden-Oligonukleotide befinden, lassen sich für das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer zwei verschiedene räumliche Anordnungen realisieren:
a) Vor der Hybridisierung liegt das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer 201 in einer Form vor, die durch einen großen Abstand 204 von Fluorophor 102 und quenchender Metalloberfläche 203 charakterisiert ist (hohe Fluoreszenzintensität). Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang 202 (Target) verändert sich der Abstand 205 zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül 102 und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche 203 dahingehend, dass es durch die Verringerung des Abstands zu einer Vermehrung des Quenchen kommt und eine geringere Intensität der Fluoreszenz nach der Hybridisierung beobachtet werden kann (siehe Figur 1A).
b) Vor der Hybridisierung liegt das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer 201 in einer Form vor, die durch einen geringen Abstand 204 von Fluorophor 102 und quenchender Metalloberfläche 203 charakterisiert ist (geringe Fluoreszenzintensität). Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang 202 (Target) verändert sich der Abstand zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül 102 und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche 203 dahingehend, dass es durch die Vergrößerung des Abstands 205 zu einer Verringerung des Quenchens kommt und eine höhere Intensität der Fluoreszenz nach der Hybridisierung beobachtet werden kann (siehe Figur 1 B).
Die beiden oben dargestellten geometrischen Anordnungen können durch die Wahl geeigneter Bedingungen erreicht werden, nämlich durch Anlegen eines äußeren elektrischen Feldes oder durch an der modifizierten Oberfläche immobilisierte Ionen:
Anlegen eines äußeren elektrischen Feldes
Durch das Anlegen eines äußeren elektrischen Feldes lassen sich verschiedene geometrische Anordnungen realisieren. Dabei können prinzipiell drei Potential-Bereiche unterschieden werden, deren genaue Lage von den gewählten Messbedingungen (z.B. lonenstärke, Kettenlänge) abhängt. Bei negativen bis hin zu leicht positiven Potentialen (E < 0,2 V gegen Silberdraht) liegen sowohl einzel- als auch doppelsträngige Oligomere aufgrund der Abstoßung des negativ geladenen DNA-Rückgrats in einer eher gestreckten Konformation vor (siehe Figur 2A). Durch die Hybridisierung wird eine Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachtet.
In einem Zwischenbereich bei leicht positiven Potentialen (0,2 V < E < 0,4 V gegen Silberdraht) liegen einsträngige Oligomere wegen der größeren Beweglichkeit in einer eher komprimierten Form vor. Doppelsträngige Oligomere sind in diesem Bereich aufgrund der starren helikalen Struktur eher senkrecht zur Oberfläche ausgerichtet (siehe Figur 2B). Durch die Hybridisierung wird eine Zunahme der Fluoreszenzintensität beobachtet.
Bei stärker positiven Potentialen (E > 0,4 V gegen Silberdraht) werden auch die doppelsträngige Oligomere näher an die Oberfläche gezogen. Daher ergibt sich durch die Hybridisierung nur eine geringe Änderung der Fluoreszenzintensität. Das Potential, bei dem der Einzelstrang eine Änderung von "stehend" nach "liegend" erfährt (ca. 0,2 V) wird als geometrisches Änderungspotential des Einzelstrangs 9ESS definiert. Das Potential bei dem der Doppelstrang eine Änderung von "stehend" nach "liegend" erfährt (ca. 0,4 V) wird als geometrisches Änderungspotential des Doppelstrangs 9E S definiert.
Das Anlegen eines äußeren elektrischen Feldes wird in der Regel durch das Anlegen eines Potentials an die modifizierte Oberfläche erfolgen. Von der vorliegenden Erfindung sind aber auch Ausführungsformen umfasst, gemäß denen z.B. durch Einbringen der modifizierten Oberfläche in einen Kondensator am Ort der modifizierten Ligaten ein elektrisches Feld erzeugt wird.
An der modifizierten Oberfläche immobilisierte Ionen
Durch Immobilisierung von Ionen an der modifizierten Oberfläche lassen sich verschiedene geometrische Anordnungen realisieren. Dabei können prinzipiell zwei Zustände unterschieden werden. An der Oberfläche immobilisierte Anionen 401 (z.B. über entsprechende bifunktionale Moleküle mit Carbonsäure oder Sulfonsäure-Funktionen, die in einem bestimmten pH-Bereich als oberflächengebundene Anionen vorliegen) führen wegen der Abstoßung des negativ geladenen Phosphatrückgrats zu einer gestreckten Konformation des Einzelstrangs 201. Aufgrund der größeren Beweglichkeit wird die einsträngige Sonde stärker gestreckt als die doppelsträngige Sonde/Target (siehe Figur 3A). Durch die Hybridisierung wird eine Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachtet. An der Oberfläche immobilisierte Kationen 402 (z.B. über entsprechende bifunktionale Moleküle mit Amin- oder Ammonium-Funktionen, die in einem bestimmten pH-Bereich als oberflächengebundene Kationen vorliegen) führen wegen der Anziehung des negativ geladenen Phosphatrückgrats zu einer eher komprimierten Konformation des Einzelstrangs 201. Aufgrund der geringeren Beweglichkeit wird die doppelsträngige Sonde/Target weniger komprimiert als die einsträngige Sonde (siehe Figur 3B). Durch die Hybridisierung wird eine Zunahme der Fluoreszenzintensität beobachtet.
Ausführungsformen
E-Feld-unterstützte Modulation der Fluoreszenzlöschung durch Hybridisierung
Die n Nukleotide (nt) lange Nukleinsäure-Sonde (DNA, RNA oder PNA, z.B. ein 20 Nukleotide langes Oligo) ist in der Nähe eines ihrer Enden (3'- oder 5'-Ende) direkt oder über einen (beliebigen) Spacer mit einer reaktiven Gruppe zur kovalenten Verankerung an der Oberfläche versehen, z.B. als 3'-Thiol-modifiziertes Sonden-Oligonukleotid, bei dem die endständige Thiolmodifikation als reaktive Gruppe zur Anbindung an Gold dient. Weitere kovalente Verankerungsmöglichkeiten ergeben sich z.B. aus aminmodifiziertem Ligat-Oligonukleotid, das zur Verankerung an oberflächlich gebundene Carbonsäurefunktionen (z.B. über säurefunktionalisierte Thiole wie Mercaptopropionsäure und eine Aktivierung z.B. als Aktivester) verwendet wird. In der Nähe des anderen Terminus des Sondenoligonukleotids ist ein Fluorophor kovalent angebunden (vgl. Beispiel 1). Die so modifizierte Nukleinsäure-Sonde wird
(i) in Puffer (z.B. 10 - 500 mM Phosphat-Puffer, pH = 7, 1mM EDTA) gelöst mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden-Nukleinsäureoligomers an die - gegebenenfalls entsprechend derivatisierte - Oberfläche angebunden oder
(ii) in Gegenwart eines monofunktionalen Linkers in Puffer (z.B. 100 mM Phosphat-Puffer, pH = 7, 1mM EDTA, 0,1 - 1 M NaCl) gelöst mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden-
Nukleinsäureoligomers gemeinsam mit dem monofunktionalen Linker an die - gegebenenfalls entsprechend derivatisierte - Oberfläche angebunden, wobei darauf geachtet wird, dass genügend monofunktionaler Linker geeigneter Kettenlänge zugesetzt wird (etwa 0.1 bis 10 facher Überschuss), um zwischen den einzelnen Sonden-Oligonukleotiden genügend Freiraum für eine Hybridisierung mit dem Target-Oligonukleotid zur Verfügung zu stellen oder
(iii) in Puffer (z.B. 10 - 350 mM Phosphat-Puffer, pH = 7, 1mM EDTA) gelöst mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden-Nukleinsäureoligomers an die - gegebenenfalls entsprechend derivatisierte - Oberfläche angebunden. Anschließend wird die so modifizierte
Oberfläche mit dem entsprechenden monofunktionalen Linker in Lösung (z.B. Alkanthiole oder ω-Hydroxy-Alkanthiole in Phosphat-Puffer/EtOH-Mischungen bei Thiol-modifizierten Sondenoligonukleotiden) in Kontakt gebracht, wobei der monofunktionale Linker über seine reaktive Gruppe an die - gegebenenfalls entsprechend derivatisierte - Oberfläche anbindet (vgl. Abschnitt "Bindung des
Ligaten an die Oberfläche").
Die (Rest-) Fluoreszenz des Fluorophors am Sonden-Oligonukleotid wird durch ein geeignetes Verfahren detektiert, z.B. durch Fluoreszenzmessung mit einem Fluoreszenz- Scanner in Gegenwart eines angelegten elektrischen Feldes. Bei Potentialen E kleiner als das geometrische Änderungspotential des Einzelstrangs 9ESS (E < 9ESS) wird durch die Hybridisierung eine Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachtet. Bei Potentialen E im Bereich zwischen dem geometrischen Änderungspotential des Einzelstrangs 9ESS und dem geometrischen Änderungspotential des Doppelstrangs 9Eds (9ESS < E < 9Eds) wird durch die Hybridisierung eine Zunahme der Fluoreszenzintensität beobachtet. Die Lage der Potentiale 9ESS und 9Eds ist abhängig von den gewählten Bedingungen. Bei 100 mM Chlorid liegt das Potential 9ESS bei ca. 0,2 V (gegen Silberdraht als Referenzelektrode) und das Potential 9Eds bei ca. 0,4 V (gegen Silberdraht als Referenzelektrode).
Anschließend wird das gelöste Target zugegeben, potentielle Hybridisierungsereignisse werden unter geeigneten, dem Fachmann bekannten Bedingungen ermöglicht (beliebige, frei wählbare Stringenzbedingungen der Parameter Potential Temperatur/Salz/chaotrope Salze etc. für die Hybridisierung) und die Messung zur Detektion des Fluorophors in Gegenwart des angelegten elektrischen Feldes wiederholt. Der Unterschied im Messsignal (Ab- bzw. Zunahme, ja nach Messverfahren, vgl. Fig. 2) ist proportional zur Anzahl der Hybridisierungsereignisse zwischen Sonden- Nukleinsäureoligomer auf der Oberfläche und passendem Target-Nukleinsäure-Oligomer in der Untersuchungslösung.
"lmmobilisierte-lon"-unterstützte Modulation der Fluoreszenzlöschung durch Hybridisierung
Die n Nukleotide (nt) lange Nukleinsäure-Sonde (DNA, RNA oder PNA, z.B. ein 20 Nukleotide langes Oligo) ist in der Nähe eines ihrer Enden (3'- oder 5'-Ende) direkt oder über einen (beliebigen) Spacer mit einer reaktiven Gruppe zur kovalenten Verankerung an der Oberfläche versehen, z.B. als 3'-Thiol-modifiziertes Sonden-Oligonukleotid, bei dem die endständige Thiolmodifikation als reaktive Gruppe zur Anbindung an Gold dient. Weitere kovalente Verankerungsmöglichkeiten ergeben sich z.B. aus aminmodifiziertem Ligat-Oligonukleotid, das zur Verankerung an oberflächlich gebundene Carbonsäurefunktionen (z.B. über säurefunktionalisierte Thiole wie Mercaptopropionsäure und eine Aktivierung z.B. als Aktivester) verwendet wird. In der Nähe des anderen Terminus des Sondenoligonukleotids ist ein Fluorophor kovalent angebunden (vgl. Beispiel 1). Die so modifizierte Nukleinsäure-Sonde wird
(i) in Gegenwart eines bifunktionalen Linkers zur Erzeugung von immobilisierten Ionen (z.B. ω-Carboxy-, Amin- oder Sulfonsäure-Alkanthiole) in Puffer (z.B. 100 mM Phosphat-Puffer, pH = 7, 1mM EDTA, 0,1 - 1 M NaCI) gelöst mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden-
Nukleinsäureoligomers gemeinsam mit dem bifunktionalen Linker an die - gegebenenfalls entsprechend derivatisierte - Oberfläche angebunden, wobei darauf geachtet wird, dass genügend bifunktionaler Linker geeigneter Kettenlänge zugesetzt wird (etwa 0.1 bis 10 facher Überschuss), um zwischen den einzelnen Sonden-Oligonukleotiden genügend Freiraum für eine
Hybridisierung mit dem Target-Oligonukleotid zur Verfügung zu stellen oder
(ii) in Puffer (z.B. 10 - 350 mM Phosphat-Puffer, pH = 7, 1mM EDTA) gelöst mit der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden-Nukleinsäureoligomers an die - gegebenenfalls entsprechend derivatisierte - Oberfläche angebunden und anschließend wird die so modifizierte Oberfläche zur Erzeugung von immobilisierten Ionen mit dem entsprechenden bifunktionalem Linker in Lösung (z.B. ω-Carboxy-, Amin- oder Sulfonsäure-Alkanthiole in Phosphat-Puffer/EtOH-Mischungen bei Thiol- modifizierten Sondenoligonukleotiden) in Kontakt gebracht, wobei der monofunktionale Linker über seine reaktive Gruppe an die - gegebenenfalls entsprechend derivatisierte - Oberfläche anbindet (vgl. Abschnitt "Bindung des Ligaten an die Oberfläche").
Die (Rest-) Fluoreszenz des Fluorophors am Sonden-Oligonukleotid wird durch ein geeignetes Verfahren detektiert, z.B. durch Fluoreszenzmessung mit einem Fluoreszenz- Scanner. Anschließend wird das gelöste Target zugegeben, potentielle Hybridisierungsereignisse werden unter geeigneten, dem Fachmann bekannten Bedingungen ermöglicht (beliebige, frei wählbare Stringenzbedingungen der Parameter Potential/Temperatur/Salz/chaotrope Salze etc. für die Hybridisierung) und die Messung zur Detektion des Fluorophors wiederholt.
Der Unterschied im Messsignal (Ab- bzw. Zunahme, ja nach Messverfahren, vgl. Fig. 3) ist proportional zur Anzahl der Hybridisierungsereignisse zwischen Sonden- Nukleinsäureoligomer auf der Oberfläche und passendem Target-Nukleinsäure-Oligomer in der Untersuchungslösung.
Die oben beschriebenen Ausführungsformen können für eine Targetart (z.B. eine bestimmte Targetoligonukleotid-Art mit bekannter Sequenz) an einer Oberfläche oder - bei Verwendung jeweils verschiedener Sonden-Arten für jedes Test-Site - für mehrere Target-Arten (gleiche Ligandengruppen wie z.B. mehrere verschiedene Target- Oligonukleotid-Arten oder verschiedene Antikörper-Arten, Antigen-Arten etc., aber auch Mischungen davon) angewendet werden.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1
Darstellung der aminomodifizierten Oligonukleotide zur Verankerung auf modifizierten Goldoberflächen als Ligat- bzw. Sondenoligonukleotide
Die Synthese der Oligonukleotide erfolgt in einem automatischen Oligonukleotid- Synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA/RNA-Synthesizer) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Syntheseprotokolle für eine 1.0 μmol Synthese. Bei den Synthesen mit dem 1-O-Dimethoxytrityl-propyl-disulfid-CPG-Träger (Glen Research 20-2933) werden die Oxidationsschritte mit einer 0.02 M lodlösung durchgeführt, um eine oxidative Spaltung der Disulfidbrücke zu vermeiden. Modifikationen an der 5'-Position der Oligonukleotide erfolgen mit einem auf 5 min verlängerten Kopplungsschritt. Der Amino-Modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) wird in die Sequenzen mit den jeweiligen Standardprotokoll eingebaut. Die Kopplungseffizienzen werden während der Synthese online über die DMT- Kationen-Konzentration photometrisch bzw. konduktometrisch bestimmt.
Die Oligonukleotide werden mit konzentriertem Ammoniak (30%) bei 37 °C 16 h entschützt. Die Reinigung der Oligonukleotide erfolgt mittels RP-HPL Chromatographie nach Standardprotokollen (Laufmittel: 0,1 M Triethylammoniumacetat-Puffer, Acetonitril), die Charakterisierung mittels MALDI-TOF MS. Die aminmodifizierten Oligonukleotide werden an die entsprechend aktivierten Fluorophore (z.B. Fluoresceinisothiocyanat) gemäß dem Fachmann bekannten Bedingungen gekoppelt. Die Kopplung kann sowohl vor als auch nach der Anbindung der Oligonukleotide an die Oberfläche erfolgen.
Beispiel 2
Darstellung der fluorophormodifizierten Oligonukleotide zur Verankerung auf modifizierten Goldoberflächen als Ligat- bzw. Sondenoligonukleotide
Die Synthese der Oligonukleotide erfolgt in einem automatischen Oligonukleotid- Synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA/RNA-Synthesizer) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Syntheseprotokolle für eine 1.0 μmol Synthese. Bei den Synthesen mit dem 1-O-Dimethoxytrityl-propyl-disulfid-CPG-Träger (Glen Research 20-2933) werden die Oxidationsschritte mit einer 0.02 M lodlösung durchgeführt, um eine oxidative Spaltung der Disulfidbrücke zu vermeiden. Modifikationen an der 5'-Position der Oligonukleotide erfolgen mit einem auf 5 min verlängerten Kopplungsschritt. Die Fluorophore werden am Synthesizer beim letzten Kopplungsschritt als Phosphoramidite (Glen Research 10-1037) in die Sequenzen mit dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut. Die Kopplungseffizienzen werden während der Synthese online über die DMT-Kationen- Konzentration photometrisch bzw. konduktometrisch bestimmt.
Beispiel 3
Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S(CH2)2-ss-oligo-FP
Die Quench-Oberfläche (hier: Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1 : die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-0-(CH2)2- S-S-(CH2)2-OH verestert; Modifikation 2: an das 5' Ende ist der Fluorescein-Modifier Fluorescein-Phosphoramidite (Proligo Biochemie GmbH) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) in 5x10"5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) mit Zusatz von ca. 10"5 bis 10"1 molarem Propanthiol (oder anderen Thiolen oder Disulfiden geeigneter Kettenlänge) 0,5 - 24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-0-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy-mercaptoethanols kommt. Das in der Inkubationslösung gleichzeitig anwesende, freie Propanthiol wird ebenfalls durch Ausbildung einer Au-S Bindung koadsorbiert (Inkubationsschritt). Statt des Einzelstrang- Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein. Beispiel 4
Alternative Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-SfCH∑j∑-ss-oligo-FP
Die alternative Herstellung von Au-S(CH2)2-ss-oligo-FP gliedert sich in 2 Teilabschnitte, nämlich der Derivatisierung der Gold-Oberfläche mit dem Sonden-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) und der Nachbelegung der so modifizierten Elektrode mit einem geeigneten monofunktionalen Linker (Nachbelegungsschritt).
Die Quench-Oberfläche (hier: Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1 : die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-0-(CH2)2- S-S-(CH2)2-OH verestert; Modifikation 2: an das 5' Ende ist der Fluorescein-Modifier Fluorescein-Phosphoramidite (Proligo Biochemie GmbH) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) in 5x10"5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) 0,5 - 24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-0-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy- mercaptoethanols kommt. Statt des Einzelstrang-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.
Anschließend wird die so modifizierte Gold-Oberfläche mit einer ca. 10"5 bis 10"1 molaren Propanthiol-Lösung (in Wasser oder Puffer, pH 7 - 7.5) komplett benetzt und 0,5 - 24 h inkubiert. Das freie Propanthiol belegt die nach dem Inkubationsschritt verbleibende freie Gold-Oberfläche durch Ausbildung einer Au-S Bindung. Alternativ zu Propanthiol kann auch ein anderes Thiol oder Disulfid geeigneter Kettenlänge verwendet werden.
Beispiel 5
Alternative Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-SfCH^∑-ss-oligo-FP
Die alternative Herstellung von Au-S(CH2)2-ss-oligo-FP gliedert sich in 2 Teilabschnitte, nämlich der Derivatisierung der Gold-Oberfläche mit dem Sonden-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) und der Nachbelegung der so modifizierten Elektrode mit einem geeigneten bifunktionalen Linker (Nachbelegungsschritt).
Die Quench-Oberfläche (hier: Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' (Modifikation 1 : die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-0-(CH2)2- S-S-(CH2)2-OH verestert; Modifikation 2: an das 5' Ende ist Fluorescein-Modifier Fluorescein-Phosphoramidite (Proligo Biochemie GmbH) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) in 5x10"5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,5 molar in Wasser, pH 7) 0,5 - 24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-0-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy- mercaptoethanols kommt. Statt des Einzelstrang-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.
Anschließend wird die so modifizierte Gold-Oberfläche mit einer ca. 10"5 bis 10"1 molaren Lösung von z.B. Mercaptopropionsäure, Mercaptoethansulfonsäure oder Cysteamin (in Wasser oder Puffer, pH 7 - 7.5 oder in Ethanol) komplett benetzt und 0,5 - 24h inkubiert. Das freie Thiol (Mercaptopropionsäure, Mercaptoethansulfonsäure, Cysteamin) belegt die nach dem Inkubationsschritt verbleibende freie Gold-Oberfläche durch Ausbildung einer Au-S Bindung. Alternativ können auch andere funktionale Thiole oder Disulfide geeigneter Kettenlänge mit den gleichen oder anderen funktionellen Gruppen verwendet werden.
Beispiel 6
Fluoreszenz-Intensitätsmessungen am System Au-ss-oligo-Fluorescein bzw. am System Au-ds-oligo-Fluorescein in Gegenwart von flüssigen Medien
Die Sonden-Oberfläche wird analog zu Bsp. 4 hergestellt. Dazu wird ein modifiziertes Oligonukleotid der Sequenz 5'-Fluorescein-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' [C3-S- S-C3-OH] auf Gold immobilisiert (50 μmol Oligonukleotid in Phosphat-Puffer (K2HP04/KH2P04 500 mM, pH 7, Nachbelegung mit Propanthiol 1mM in Wasser) und in der Form Au-S(CH2)2-ss-oligo-Fluorescein die Fluoreszenzintensität der Oberfläche mit einem Fluoreszenz-Scanner der Firma Lavision Biotech bestimmt. Zur Messung der Fluoreszenz wird ein Potential von 0,3 V gegen Silberdraht angelegt. In Gegenwart von flüssigen Medien (100 mmol Chlorid) werden 150 μl des Mediums auf die Goldoberfläche gegeben und anschließend mit einem Deckglas abgedeckt. Alternativ können auch Hybriwells oder Imaging Chambers verwendet werden.
Beispiel 7
Fluoreszenz-Intensitätsmessungen am System Au-ss-oligo-Fluorescein bzw. am System Au-ds-oligo-Fluorescein in Gegenwart von oberflächenimmobilisierten Anionen und flüssigen Medien
Die Sonden-Oberfläche wird analog zu Bsp. 5 hergestellt. Dazu wird ein modifiziertes Oligonukleotid der Sequenz 5'-Fluorescein-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' [C3-S- S-C3-OH] auf Gold immobilisiert (50 μmol Oligonukleotid in Phosphat-Puffer (K2HP04/KH2P04 500 mM, pH 7 und anschließender Nachbelegung mit einer ca. 10"5 bis 10"1 molaren Lösung von z.B. Mercaptopropionsäure, die die verbleibende freie Gold- Oberfläche belegt) und in der Form Au-SfCH^z-ss-oligo-Fluorescein die Fluoreszenzintensität der Oberfläche mit einem Fluoreszenz-Scanner der Firma Lavision Biotech bestimmt. Zur Messung der Fluoreszenz in Gegenwart von flüssigen Medien werden 150 μl des Mediums auf die Goldoberfläche gegeben und anschließend mit einem Deckglas abgedeckt. Alternativ können auch Hybriwells oder Imaging Chambers verwendet werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Detektion von Ligat-Ligand-Assoziationsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen umfassend die Schritte
a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Ligaten besteht und wobei die Ligaten (201) durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor (102) modifiziert sind, b) Bereitstellen einer Probe mit Liganden, c) Anlegen eines elektrischen Feldes und Einstellen einer definierten Stärke des elektrischen Feldes am Ort der modifizierten Ligaten (201), d) Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche, e) Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors (102), f) Vergleich der in Schritt e) detektierten Fluoreszenzintensitäten mit
Referenzwerten.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei nach Schritt c) und vor Schritt d) der Schritt
c3) erste Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors (102)
durchgeführt wird und in Schritt f) die in Schritt e) erhaltenen Werte mit den in Schritt c3) erhaltenen Referenzwerten verglichen werden.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, wobei als Schritt a) der Schritt
a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von wenigstens zwei Arten von modifizierten Ligaten besteht und die verschiedenen Arten von modifizierten Ligaten in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden sind
durchgeführt wird, nach Schritt c) und vor Schritt d) die Schritte
Ci) Zusatz von einem Liganden zu der Probe, wobei der Ligand ein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante eines in einem bestimmten Bereich T10o an die Oberfläche gebundenen modifizierten Ligaten ist, wobei der Ligand in einer Menge zugegeben wird, die größer ist als die Menge an Liganden, die notwendig ist, um die modifizierten Ligaten der T100-Sites vollständig zu assoziieren
und
c3) erste Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors (102)
durchgeführt werden und in Schritt f) die in Schritt e) erhaltenen Werte mit dem in
Schritt c3) für den Bereich T100 erhaltenen Wert und den in Schritt c3) erhaltenen Referenzwerten verglichen werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei als Schritt a) der Schritt
a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von wenigstens drei Arten von modifizierten Ligaten besteht und die verschiedenen Arten von modifizierten Ligaten in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden sind, wobei wenigstens eine Art von modifiziertem Ligat in einem bestimmten Bereich T0 an die
Oberfläche angebunden ist, und wobei in der Probe kein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante zu diesem modifizierten Ligaten enthalten ist
durchgeführt wird und in Schritt f) die in Schritt e) erhaltenen Werte mit dem in Schritt c3) für den Bereich T100 erhaltenen Wert, mit dem in Schritt c3) für den Bereich T0 erhaltenen Wert und mit den in Schritt c3) erhaltenen Referenzwerten verglichen werden.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei vor Schritt d) der Schritt
c2) Zusatz von wenigstens einer weiteren Art von Ligand zu der Probe, wobei der Ligand in der in Schritt b) bereitgestellten Probe nicht enthalten ist und der Ligand eine Assoziationskonstante >0 zu einem in einem bestimmten Bereich Tn an die Oberfläche gebundenen modifizierten Ligaten aufweist, wobei der Ligand in einer Menge zugegeben wird, dass nach Schritt d) n% der modifizierten Ligaten in dem Bereich Tn in assoziierter Form vorliegen durchgeführt wird und in Schritt f) die in Schritt e) erhaltenen Werte mit dem in Schritt c3) für den Bereich T10o erhaltenen Wert, mit dem in Schritt c3) für den Bereich T0 erhaltenen Wert, mit den in Schritt c3) für die Bereiche Tn erhaltenen Werten und mit den in Schritt c3) erhaltenen Referenzwerten verglichen werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Einstellen einer definierten Stärke des elektrischen Feldes in Schritt c) durch Anlegen eines elektrischen Feldes an der modifizierten Oberfläche erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei ein Potential von E < 0,2 V (gemessen gegen Silberdraht) an die modifizierte Oberfläche angelegt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei ein Potential von 0,2 V < E < 0,4 V (gemessen gegen Silberdraht) an die modifizierte Oberfläche angelegt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Einstellen einer definierten Stärke des elektrischen Feldes in Schritt c) durch Immobilisierung von Ionen (401 , 402) an der modifizierten Oberfläche erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Einstellen einer definierten Stärke des elektrischen Feldes in Schritt c) durch Immobilisierung von bifunktionalen Molekülen mit Carbonsäure- oder Sulfonsäure-Funktionen an der modifizierten Oberfläche erfolgt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Einstellen einer definierten Stärke des elektrischen Feldes in Schritt c) durch Immobilisierung eines ω-Carboxy-Alkanthiols oder durch Immobilisierung eines Sulfonsäure-Alkanthiols erfolgt.
12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Einstellen einer definierten Stärke des elektrischen Feldes in Schritt c) durch Immobilisierung von bifunktionalen Molekülen mit Amin- oder Ammonium-Funktionen an der modifizierten Oberfläche erfolgt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Einstellen einer definierten Stärke des elektrischen Feldes in Schritt c) durch Immobilisierung eines Amin-Alkanthiols erfolgt.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Fluorophor (102) Texas Red, ein Rhodamin-Farbstoff, insbesondere Rhodamin G6 (Basic Red 1), Fluorescein (Resorcinphtalein), oder ein Cyaninfarbstoff, insbesondere 5,5'-disulfo- 1 ,1xdi(-carbopentenyI)-3,3,3\3Λ-tetramethyl-indodicarbocyanin (Cy3™) oder 5,5\7,7'- tetrasulfo-1 , di(-carbopentenyl)-3,3,3\3Λ-tetramethyl-benzindodicarbocyanin (Cy5™) verwendet wird.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der modifizierten Oberfläche um eine eine Modifikation tragende Oberfläche aus einem Metall oder einer Metalllegierung handelt, insbesondere aus einem Metall ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gold, Silber, Kupfer und deren Mischungen.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Liganden Substrate, Cofaktoren oder Coenzyme und als Ligaten Proteine oder Enzyme verwendet werden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei als Liganden Antikörper und als
Ligaten Antigene verwendet werden.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei als Liganden Antigene und als Ligaten Antikörper verwendet werden.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei als Liganden Rezeptoren und als Ligaten Hormone verwendet werden.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei als Liganden Hormone und als
Ligaten Rezeptoren verwendet werden.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei als Liganden Nukleinsäure- Oligomere und als Ligaten dazu komplementäre Nukleinsäure-Oligomere verwendet werden.
22. Verfahren nach Anspruch 21 , wobei die als Ligaten verwendeten Nukleinsäure- Oligomere 3 bis 70 Basen, insbesondere 5 bis 60 Basen, bevorzugt 10 bis 50 Basen, besonders bevorzugt 12 bis 40 Basen umfasst.
23. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 22 umfassend eine modifizierte Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Ligaten (201) besteht und wobei die Ligaten (201) durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor (102) modifiziert sind.
24. Kit nach Anspruch 23, wobei der Kit zusätzlich Referenzwerte zum Vergleich mit den bei der Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors (102) in einem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 22 erhaltenen Werten umfasst.
25. Kit nach den Ansprüchen 23 oder 24, wobei die modifizierte Oberfläche wenigstens einen Bereich T0 und wenigstens einen Bereich T10o umfasst.
26. Kit nach Anspruch 25, wobei die modifizierte Oberfläche zusätzlich wenigstens einen Bereich Tn umfasst.
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