EP1567664A2 - Fluoreszenz-quenchen zur detektion von nukleinsäure-oligomer-hybridisierungsereignissen bei hohen salz-konzentrationen - Google Patents

Fluoreszenz-quenchen zur detektion von nukleinsäure-oligomer-hybridisierungsereignissen bei hohen salz-konzentrationen

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EP1567664A2
EP1567664A2 EP02802612A EP02802612A EP1567664A2 EP 1567664 A2 EP1567664 A2 EP 1567664A2 EP 02802612 A EP02802612 A EP 02802612A EP 02802612 A EP02802612 A EP 02802612A EP 1567664 A2 EP1567664 A2 EP 1567664A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
modified
fluorescence
acid oligomers
oligomer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02802612A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gerhard Hartwich
Thomas KRATZMÜLLER
Herbert Wieder
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH
Original Assignee
Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH filed Critical Friz Biochem Gesellschaft fuer Bioanalytik mbH
Publication of EP1567664A2 publication Critical patent/EP1567664A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer

Definitions

  • the present invention relates to a method for the detection of nucleic acid-oligomer hybridization events by fluorescence quenching.
  • Immunoassays and increasingly sequence analysis of DNA and RNA are used in disease diagnosis, in toxicological test procedures, in genetic research and development, as well as in the agricultural and pharmaceutical sectors.
  • serial methods with autoradiographic or optical detection parallel detection methods using array technology, so-called DNA or protein chips, are increasingly being used. With these parallel methods, too, the detection is based on optical, radiographic, mass spectrometric or electrochemical methods.
  • probe oligonucleotides For gene analysis on a chip, a library of known DNA sequences ("probe oligonucleotides”) is fixed in an ordered grid on one surface, so that the probe oligonucleotides.
  • Target oligonucleotides present in the test solution, the sequences of which are complementary to certain probe oligonucleotides on the chip, can be identified by
  • Radio label e.g. 32 P
  • a fluorescent dye e.g. fluorescein, Cy3 TM or
  • Fluorescence scanners are increasingly using radio labels.
  • the fluorescence scanners currently available on the market enable the detection of
  • Fluorophore in the subattomole range Fluorophore in the subattomole range.
  • labeled targets to detect hybridization events has some drawbacks.
  • the marking must take place before the actual measurement, which means an additional synthesis step and thus additional work. It is also difficult to ensure homogeneous marking of the sample material.
  • stringent washing conditions are necessary in order to remove non-specific or non-specifically bound material following hybridization.
  • targets antibodies or antigen or DNA fragment
  • Probe molecules are labeled with appropriate fluorescent dyes.
  • the so-called molecular beacons work according to this principle. These single-stranded oligonucleotides have a hairpin structure (stem-and-loop) and carry a fluorophore (e.g. Fluorescein, TexasRed®) at one end of the sequence and a suitable one at the other end of the sequence
  • a fluorophore e.g. Fluorescein, TexasRed®
  • Fluorescence quencher e.g. DABCYL Due to the special geometric arrangement, the fluorescent group and the unit that are used to extinguish the
  • gold nanoparticles are also used as efficient quenchers (cf. Nature Biotech. Vol. 19, 2001, page 365).
  • the quenching of fluorescence by metals is based primarily on a radiationless energy transfer from the dye molecule to the metal. A greater sensitivity is observed when using gold nanoparticles than with organic quenchers.
  • dyes are efficiently quenched into the near infrared range.
  • one disadvantage of this method is that gold nanoparticles are no longer stable at temperatures above 50 ° C. Another disadvantage is that this method is limited to the investigation of solutions and therefore only a few sequences can be examined at the same time, the degree of parallelization of this approach is therefore low.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method for the detection of nucleic acid-oligomer hybrids which does not have the disadvantages of the prior art.
  • PNA Peptide nucleic acid synthetic DNA or RNA in which the
  • N (COCH 2 base) -CH 2 CO unit hybridizes PNA with DNA.
  • Nucleic acid at least two covalently linked nucleotides or at least two covalently linked pyrimidine (e.g. cytosine,
  • Thymine or uracil or purine bases (e.g. adenine or
  • nucleic acid refers to any one of nucleic acid.
  • Bases such as on the sugar-phosphate backbone of the DNA, cDNA or RNA, on a peptide backbone of the PNA or on analogous structures (e.g. phosphoramide, thio-phosphate or
  • Nucleic acid oligomer Nucleic acid of unspecified base length (e.g. Nucleic acid octamer: A nucleic acid with any backbone in which 8 pyrimidine or purine bases are covalently bound to each other). ns oligomer Nucleic acid oligomer
  • Oligomer equivalent to nucleic acid oligomer Oligomer equivalent to nucleic acid oligomer.
  • Oligonucleotide equivalent to oligomer or nucleic acid oligomer e.g. a DNA, PNA or RNA fragment of unspecified base length.
  • Fluorophore chemical compound that is able to emit a longer-wave (red-shifted) fluorescent light when excited with light.
  • Fluorophores fluorescent dyes
  • UV ultraviolet
  • VIS visible
  • IR infrared
  • the absorption and emission maxima are usually shifted by 15 to 40 nm (Stokes shift).
  • Fluorescein resorcin phthalein fluorescent dye
  • Rhodamine 6G Basic Red 1 fluorescent dye
  • Texas Red® fluorescent dye from Molecular Probes, Inc.
  • Quench surface conductive (metal) surface that can quench fluorescence through an energy transfer (especially gold, silver, copper surfaces etc.)
  • linkers are commercially available as alkyl, alkenyl, alkynyl, hetero-alkyl, hetero-alkenyl or hetero-alkynyl chains, the chain being derivatized at two points with (identical or different) reactive groups. These groups form a covalent chemical bond in simple / known chemical reactions with the corresponding reaction partner.
  • the reactive groups can also be photoactivatable, ie the reactive groups are only activated by light of certain or any wavelength.
  • Preferred linkers are those of chain length 1-60, in particular chain length ⁇ -40, the chain length here being the shortest continuous connection between the structures to be connected, i.e. between the two molecules or between a surface atom, a surface molecule or a surface molecule group and another Molecule.
  • Spacer linker which is covalently bonded via the reactive groups to one or both of the structures to be connected (see linker).
  • Preferred spacers are those of chain length 1-60, in particular chain length ⁇ -40, the chain length being the shortest continuous connection between the structures to be connected.
  • the terminal phosphate group of the oligonucleotide is esterified at the 3 'end with (HO- (CH 2 ) 2 -S) 2 to PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH, the SS bond being cleaved homolytically and each causes an Au-SR bond.
  • the probe oligonucleotide carries a covalently attached fluorophore (FP) such as Cy3 TM, Cy ⁇ TM, Texas Red®, Rhodamine 6G, fluorescein etc.
  • FP covalently attached fluorophore
  • Au-S- (CH 2 ) z-ds-oligo-Au-S-fCH ⁇ ⁇ ⁇ -ss-oligo-FP hybridizes with the oligonucleotide complementary to ss-oligo FP.
  • the present invention relates to a method for detecting nucleic acid-oligomer hybridization events by fluorescence quenching, which comprises providing a modified surface as a first step.
  • the modification of the surface consists in the attachment of at least one type of modified nucleic acid oligomer, the nucleic acid oligomers being modified by attachment of at least one type of fluorophore.
  • the further steps of the method according to the invention are providing a sample with nucleic acid oligomers, bringing the sample into contact with the modified surface, setting a defined salt concentration of greater than 0.5 mol / l in the solution surrounding the modified nucleic acid oligomers, detection of the fluorescence of the fluorophore and comparison of the fluorescence intensity determined in the detection with reference values.
  • a comparison of the detected fluorescence intensities with reference values is required in the method according to the invention. These reference values may already exist from previous measurements and therefore need most general case can not be detected in the course of the inventive method. However, since the reference values should ideally be determined under exactly the same external conditions as the actual measured values of the fluorescence intensities, according to a preferred embodiment of the present invention, a first detection of the fluorescence of the fluorophore is carried out before the targets (sample) come into contact with the modified surface , for this purpose, a defined salt concentration is set in the solution surrounding the modified nucleic acid oligomers, the same salt concentration being used as in the second detection of the fluorescence of the fluorophore, then the first detection of the fluorescence of the fluorophore takes place. Finally, stringency conditions for the hybridization are set and the sample is brought into contact with the modified surface. The values obtained in this first fluorescence detection are then used as reference values and compared with the values obtained in the second fluorescence detection.
  • the stringency conditions for the hybridization and the contacting of the sample with the modified surface can in principle be carried out in any time sequence.
  • the stringency conditions for the hybridization are preferably set simultaneously with the contacting of the sample with the modified surface, or the stringency conditions for the hybridization are set after the sample has been brought into contact with the modified surface.
  • a normalization measurement is also carried out.
  • sites are applied to the modified surface to which a very specific degree of association can be assigned after adding the sample.
  • the signal obtained during the detection is then characteristic of this particular degree of association and can be used to normalize the signals from the test sites.
  • the present invention namely also encompasses methods in which a modified surface is used which has been modified by binding at least two types of modified nucleic acid oligomers.
  • the various types of modified nucleic acid oligomers are bound to the surface in essentially spatially separated areas. Under "essentially separate areas” are understood to mean areas of the surface that are predominantly modified by binding a certain type of modified nucleic acid oligomers. Only in areas in which two such essentially separated areas adjoin one another can spatial mixing of different types of modified nucleic acid oligomers occur.
  • the nucleic acid oligomer is added to the sample before the sample is brought into contact with the modified surface, the nucleic acid oligomer being a binding partner with a high association constant with a particular type of modified nucleic acid oligomer which is bound to the surface in a certain area (Site T 10 o).
  • the nucleic acid oligomer is added to the sample in an amount that is greater than the amount of nucleic acid oligomers that is necessary to fully associate the modified nucleic acid oligomers of the T 10 o sites.
  • the last step of this method is the comparison of the values obtained in the detection of the fluorescence of the fluorophore with the value obtained for the region T 100 .
  • the value obtained for the area T 10 o thus corresponds to the value when the association is complete (100%).
  • a modified surface which has been modified by attaching at least three types of modified nucleic acid oligomers.
  • the various types of modified nucleic acid oligomers are bound to the surface in essentially spatially separated areas.
  • At least one type of modified nucleic acid oligomer is bound to the surface in a certain area (site T 0 ), which is known to contain no binding partner with a high association constant, i.e. the corresponding nucleic acid oligomer is not contained in the sample Sample occurs.
  • a nucleic acid oligomer is added to the sample before the sample is brought into contact with the modified surface, the nucleic acid oligomer being a binding partner with a high association constant with a specific type of modified nucleic acid oligomer, which in a certain area (Site T 100 ) is bound to the surface.
  • the nucleic acid oligomer is added to the sample in an amount that is greater than the amount of nucleic acid oligomers that is necessary to fully associate the modified nucleic acid oligomers of the T 10 o sites.
  • the last step of this method is the comparison of the values obtained in the detection of the fluorescence of the fluorophore with that for the area T 100 obtained value and with the value obtained for the area T 0 .
  • the value obtained for the area To corresponds to the value in the absence of association (0%).
  • At least one further type of nucleic acid oligomer is added to the sample, it being known that this nucleic acid oligomer is not in the original sample is included.
  • This further type of nucleic acid oligomer has an association constant> 0 to a type of modified nucleic acid oligomer which is present in a certain region (site T n ) bound to the surface.
  • the nucleic acid oligomer is added to the sample in such an amount that after contacting the sample with the modified surface, n% of the modified nucleic acid oligomers of the site T n are in an associated form.
  • the last step of this method is the comparison of the values obtained in the detection of the fluorescence of the ⁇ fluorophore with the value obtained for the area Tioo, with the value obtained for the area T 0 and with the values obtained for the areas T n .
  • the value obtained for a specific test site T n thus corresponds to the value in the presence of n% associates from modified nucleic acid oligomers and target nucleic acid oligomers based on the total number of modified nucleic acid oligomers of 0 in accordance with Art.
  • the amount of nucleic acid oligomers which has to be brought into contact with the modified surface in order to bring about an n% association at the site T n can be determined by the person skilled in the art by simple routine tests. For this purpose, for example after ⁇ detection of the values for T 0 and T 10 o, a calibrated measurement is carried out in which the signal intensity is determined by (different) detection labels with which the modified nucleic acid oligomers and the target nucleic acid oligomers are equipped. The ratio of the intensities of the target nucleic acid oligomer label signal to the modified nucleic acid oligomer label signal corresponds to n%. 0
  • a normalization curve can be recorded with high accuracy. Standardizing the measurements of the actual test sites using this standardization curve significantly improves the reproducibility of the analysis using chip technology. ⁇ It should be pointed out that finding a nucleic acid oligomer that is not contained in the sample presents no problems, since even the largest genomes still offer a sufficient selection of sequences that are not available. In the event that the non-existing sequence differs from a ⁇ sequence present only by a base, the hybridization step must be carried out under stringent conditions. However, preference is given to using sequences which differ significantly, that is to say in several bases, from the sequences present in the sample. Particularly good results are achieved if oligonucleotides with the same or at least a similar number of bases are used for the test sites and for the standardization sites.
  • the present invention also relates to a kit which comprises a modified surface, the modification consisting in the attachment of at least one type of modified nucleic acid oligomer and the nucleic acid oligomers being modified by ⁇ attachment of at least one type of fluorophore.
  • the detection of the fluorescence is carried out after setting a defined salt concentration of greater than 0.1 mol / l in the solution surrounding the modified nucleic acid oligomers.
  • Preferred salt concentrations are in the 0 ranges between 0, ⁇ and 10 mol / l, between 1 and 10 mol / l, between 0, ⁇ and 3 mol / l and in particular between 2 and 3 mol / l, because it was found in these ranges that there is a particularly large difference in the fluorescence intensity between the hybridized and the non-hybridized nucleic acid oligomer. This enables a particularly reliable detection of the hybridization events. ⁇
  • surface refers to any carrier material that is suitable for carrying 0 or after corresponding chemical modification fluorophore-derivatized nucleic acid oligomers that are covalently immobilized on the surface and whose fluorescence is close to the surface (in approx. 1 to ⁇ O A distance to the surface) is significantly reduced by fluorescence quenching (radiation-free energy transfer between the fluorophore as emitter and the surface as absorber) (> 10% of the expected ⁇ fluorescence intensity of the fluorophore in the absence of the surface under otherwise identical conditions).
  • fluorescence quenching radiation-free energy transfer between the fluorophore as emitter and the surface as absorber
  • gold and silver are quenched Suitable surface material.
  • the term surface is independent of the spatial dimensions of the surface and also includes nanoparticles (particles or clusters made up of a few individual to several hundred thousand surface atoms or molecules).
  • the surface can also be bound to a solid support such as glass, metal 5 or plastic.
  • Immobilization can e.g. covalently via amino, hydroxyl, epoxy or carboxy groups of the support material with thiol, hydroxyl, amino or carboxyl groups naturally present on the nucleic acid oligomer or by derivatization attached to the nucleic acid oligomer.
  • the ⁇ nucleic acid oligomer can be connected directly or via a linker / spacer to the surface atoms or molecules of a surface.
  • the nucleic acid oligomer can be anchored by the methods customary in immunoassays, e.g.
  • nucleic acid oligomers for non-covalent immobilization on avidin or streptavidin-modified surfaces.
  • the chemical modification of the probe nucleic acid oligomers with a surface anchor group can already be introduced in the course of automated solid phase synthesis or in separate reaction steps.
  • the nucleic acid oligomer is also linked directly or via a linker / spacer to the surface atoms or molecules of a surface of the type described above. This binding can be carried out in various ways known from the prior art (see e.g. Hartwich, G .: ELECTROCHEMICAL DETECTION OF SEQUENCE-SPECIFIC
  • nucleic acid oligomers When connecting the nucleic acid oligomers, care must be taken that they are either bound to the surface completely without additional co-adsorbate or, if a co-adsorbate appears necessary, that it forms a layer as thin as possible above the surface. Either a direct attachment of the nucleic acid oligomer to the surface must be carried out or it must be coated with short-chain co-adsorbates such as short-chain thiols. Co-adsorbates of chain length 1 to 30, preferably 1 to 20, particularly preferably 1 to 10, particularly preferably chain length 1 to 5 are preferred.
  • a particular disadvantage in this connection is the binding of the nucleic acid oligomers in the form of a surface-biotin-avidin-biotin-oligomer compound.
  • the fluorophore is always shielded from the surface by a very thick layer of biotin-avidin-biotin, which is associated with corresponding disadvantages in the detection of fluorescence.
  • fluorescent dyes such as e.g. Texas Red®, rhodamine dyes, cyanine dyes such as Cy3 TM, Cy ⁇ TM, Fluorescein etc (see Fluka, Amersham and Molecular Probes catalog) are used.
  • Fluorescence quenching is the deactivation of an electronically excited species via a radiationless process. Deactivation can take place by means of impacts or by radiation-free energy transfer to metals. The energy released is dissipated as thermal energy. Gold is an example of a metal that has the ability to quench fluorescence. The quenching has a strong dependence on the distance of the fluorophore from the surface functioning as a fluorescence quencher (inversely proportional to a higher (third to sixth) power of the distance). The effect of fluorescence quenching can therefore only be measured at distances of less than 100 to 200 ⁇ . In the range greater than approx. 200 A, further changes in distance no longer lead to a measurable increase in the fluorescence intensity. Brief description of the drawings
  • 1 shows a schematic illustration of the detection of nucleic acid-oligomer hybridization events by modulation of the fluorescence quenching on quench surfaces
  • oligomer probe 202 probe hybridizes with target 203: surface (e.g. gold) 204: distance from fluorophore to gold surface before hybridization 205: distance from fluorophore to gold surface after hybridization
  • target 203 surface (e.g. gold)
  • 204 distance from fluorophore to gold surface before hybridization
  • 205 distance from fluorophore to gold surface after hybridization
  • FIG. 1 shows a schematic illustration of the detection of nucleic acid-oligomer hybridization events by modulation of the fluorescence quenching on quench surfaces.
  • FIG. 1A shows the case in which the single-stranded probe nucleic acid oligomer 201 is present in a form before the hybridization, which is characterized by a large distance 204 from the fluorophore 102 and the quenching metal surface.
  • the distance 205 between the fluorescent dye molecule and the metal surface 203 functioning as a quencher. This leads to a reduction in the fluorescence intensity (bar chart in FIG. 1A).
  • FIG. 1A shows the case in which the single-stranded probe nucleic acid oligomer 201 is present in a form before the hybridization, which is characterized by a large distance 204 from the fluorophore 102 and the quenching metal surface.
  • the distance 205 between the fluorescent dye molecule and the metal surface 203 functioning as a quencher. This leads to a reduction in the
  • 1B shows the case in which the single-stranded probe nucleic acid oligomer 201 is present in a form prior to hybridization, which is characterized by a small distance 204 from fluorophore 102 and quenching metal surface 203.
  • the hybridization with the complementary nucleic acid oligomer strand 202 (target) increases the distance 20 ⁇ between the fluorescent dye molecule and the metal surface 203 functioning as quencher. This leads to an increase in the fluorescence intensity (bar chart 0 in FIG. 1B).
  • FIG. 2A shows a plot of the fluorescence intensities of a 20-mer and a 30-mer nucleic acid probe (single-stranded) as a function of the ionic strength (here salt concentration) of the solution above the surface.
  • the ⁇ fluorescence intensity of 200 ⁇ m spots of single-strand probe oligonucleotides (20 mer and 30 mer) immobilized on a 1 cm 2 gold plate was measured with Cy3 TM as the covalently bound fluorophore.
  • FIG. 2B shows the fluorescence intensity before and after the sequence-specific hybridization of a 30-mer nucleic acid probe with the complementary counter strand (target) as a function of 0 the salt concentration of the solution above the surface under otherwise the same conditions as in connection with FIG. 2A described. It is clear from FIG. 2B that at salt concentrations of more than 0.1 mol / l the fluorescence intensity increases by a factor of 5 after the hybridization. This allows a clear detection of the 5 hybridizations that have taken place, even in parallel methods.
  • nucleic acid-oligomer probes of different sequences are bound to a support using the immobilization techniques described above.
  • the hybridization event of any target Nucleic acid oligomers or a (fragmented) target DNA can be detected, for example, to detect mutations in the target and to detect them in a sequence-specific manner.
  • the surface atoms or molecules of a defined area are linked on a surface with DNA ⁇ / RNA / PNA nucleic acid oligomers of known but any sequence, as described above.
  • the DNA chip can also be derivatized with a single probe oligonucleotide.
  • Nucleic acid oligomers eg DNA, RNA or PNA fragments
  • base length 3 to 70 preferably length 5 to 60, particularly preferably length 10 to ⁇ O, particularly preferably 0 length 12 to, are used as probe nucleic acid oligomers 40 used.
  • the target oligonucleotides can also comprise a larger number of bases, ie they can be longer than the probe oligonucleotides.
  • the expression “ ⁇ nucleic acid oligomer complementary to the probe oligonucleotide” is understood to mean a nucleic acid oligomer which has a base sequence which is complementary to the probe oligonucleotide in a partial region. The remaining portion (s) of the nucleic acid oligomer then protrude at the end (s) of the probe oligonucleotide beyond its base chain.
  • a reference measurement e.g. with a fluorescence scanner
  • the fluorescence intensity of the fluorophore-labeled probe oligonucleotides in the single-stranded state is determined at a defined, previously set salt concentration in the surrounding solution.
  • the (as concentrated as possible) test solution with target oligonucleotide (s) is added to the surface with immobilized probe oligonucleotides under stringent conditions for the hybridization.
  • Hybridization only occurs in the case in which the solution contains target nucleic acid oligomer strands which are 0 complementary to the probe-nucleic acid oligomers bound to the surface, or at least in many areas complementary.
  • ⁇ fluorescence intensity in the hybridized, double-stranded state is determined in a second fluorescence measurement.
  • the difference between the reference measurement and the second measurement for each test site is proportional to the number of complementary (or in many areas complementary) target oligonucleotides originally present in the test solution for the respective test site.
  • the reference measurement can be omitted if the size of the reference signal is known beforehand (e.g. from previous measurements etc.).
  • ⁇ Due to the hybridization of probe-nucleic acid oligomer and the complementary nucleic acid-oligomer strand (target), the distance between the fluorescent dye molecule and the metal surface acting as quencher changes. Due to the changed distance, the extent of the quench process and thus the intensity of the fluorescence also undergoes a major change. Thus ⁇ can be a sequence specific hybridization event by fluorescence-based methods such as Fluorescence microscopy or measurements with fluorescence scanners can be detected.
  • the single-stranded probe nucleic acid oligomer 201 is in a form which is characterized by a large distance 204 from fluorophore 102 and ⁇ quenching metal surface 203 (high fluorescence intensity).
  • the distance 20 ⁇ between the fluorescent dye molecule 102 and the metal surface 203 functioning as a quencher changes in such a way that the reduction in the distance leads to an increase in quenching and 0 a lower intensity of fluorescence can be observed after hybridization (see FIG. 1A).
  • the single-stranded probe nucleic acid oligomer 201 is in a form which is characterized by a short distance 204 from fluorophore 102 and ⁇ quenching metal surface 203 (low fluorescence intensity).
  • the distance 20 ⁇ between the fluorescent dye molecule 102 and the metal surface 203 functioning as a quencher changes in such a way that the increase in the distance leads to a reduction in the quenching and a higher intensity of the fluorescence can be observed after the hybridization ⁇ ( see Figure 1 B).
  • the two geometric arrangements shown above can be achieved by varying the ionic strength, in particular the salt concentration. Any salts can be used, with the exception of bivalent salts (eg Mg 2+ ) or 0 chaotropic salts.
  • bivalent salts eg Mg 2+
  • 0 chaotropic salts eg Mg 2+
  • the surface-bound single-stranded probe is in a rather elongated conformation (see Figure 1A).
  • a decrease in the fluorescence intensity is observed as a result of the hybridization (see FIGS. 1A, 2B).
  • the surface-bound single-stranded probe With a high salt content, the surface-bound single-stranded probe is in a rather compressed conformation (see FIG. 1B).
  • FIGS. 1B, 2B As a result of ⁇ the hybridization, an increase in the fluorescence intensity is observed (see FIGS. 1B, 2B).
  • n nucleotide (nt) long nucleic acid probe (DNA, RNA or PNA, for example a 20 nucleotide long oligo) is near one of its ends (3 'or ⁇ ' end) directly or via (any) spacer a reactive group for covalent anchoring to ⁇ of the surface, e.g. as a 3'-thiol-modified probe oligonucleotide, in which the terminal thiol modification serves as a reactive group for binding to gold.
  • Other covalent anchoring options arise e.g. from amine-modified oligonucleotide, which is used for anchoring to surface-bonded carboxylic acid functions (e.g.
  • a fluorophore is covalently bound in the vicinity of the other terminus of the probe oligonucleotide (cf. Example 1).
  • the nucleic acid probe modified in this way is
  • Probe nucleic acid oligomers attached to the surface which may be correspondingly derivatized.
  • the surface modified in this way is then brought into contact with the corresponding monofunctional linker in solution (for example alkanethiols or ⁇ -hydroxyalkanethiols in phosphate buffer / EtOH mixtures 0 in the case of thiol-modified probe oligonucleotides), the monofunctional linker being attached via its reactive group which - if appropriate derivatized - binds the surface (see section "Binding of the nucleic acid oligomers to the surface").
  • the (residual) fluorescence of the fluorophore on the probe oligonucleotide is detected by a suitable method, for example by fluorescence measurement with a fluorescence scanner in the presence of different salt concentrations (cf. Example 7).
  • the fluorescence intensity of the single-stranded probe oligonucleotide shows a maximum at a salt concentration between 0.0 ⁇ and 0.2 ⁇ mol / l (see FIG. 2A).
  • potential hybridization events are made possible under suitable conditions known to the person skilled in the art (arbitrary, freely selectable stringency conditions of the parameters potential / temperature / salt / chaotropic salts etc.
  • the difference in the measurement signal is proportional to the number of hybridization events between probe nucleic acid oligomer on the surface and suitable target nucleic acid oligomer in the test solution (see example 8 ).
  • the method described can be for a target type (for example a specific target oligonucleotide type with a known sequence) on a surface or - if different probe types are used for each test site - for several target types (several different target oligonucleotide types) be applied.
  • a target type for example a specific target oligonucleotide type with a known sequence
  • the synthesis of the oligonucleotides takes place in an automatic oligonucleotide synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA / RNA synthesizer) according to the synthesis protocols recommended by the manufacturer for a 1.0 ⁇ mol synthesis.
  • the oxidation steps are carried out with a 0.02 M iodine solution in order to avoid oxidative cleavage of the disulfide bridge.
  • Modifications to the 5 'position of the oligonucleotides are carried out with a coupling step that is extended to ⁇ min.
  • the amino modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) is built into the sequences with the respective standard protocol ⁇ .
  • the coupling efficiencies are determined online during the synthesis via the DMT cation concentration photometrically or conductometrically.
  • the oligonucleotides are deprotected with concentrated ammonia (30%) at 37 ° C for 16 h.
  • the oligonucleotides are purified using RP-HPL chromatography 0 according to standard protocols (eluent: 0.1 M triethylammonium acetate buffer, acetonitrile), and the characterization is carried out using MALDI-TOF MS.
  • the amine-modified oligonucleotides are coupled to the correspondingly activated fluorophores (for example fluorescein isothiocyanate) in accordance with conditions known to the person skilled in the art. The coupling can take place both before and after the oligonucleotides have been bound to the surface.
  • fluorophores for example fluorescein isothiocyanate
  • oligonucleotide synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA / RNA synthesizer) according to the synthesis protocols recommended by the manufacturer for a 1.0 ⁇ mol synthesis.
  • the 0 oxidation steps are carried out with a 0.02 M iodine solution in order to avoid oxidative cleavage of the disulfide bridge.
  • Modifications to the ⁇ 'position of the oligonucleotides are carried out with a coupling step that is extended to ⁇ min.
  • the fluorophores are incorporated into the sequences as phosphoramidites (Glen Research 10-1037) in the sequences with the respective standard protocol.
  • the ⁇ coupling efficiencies are determined photometrically or conductometrically online via the DMT cation concentration during the synthesis.
  • the quench surface (here: gold plate) is treated with a double-modified 20 bp single-strand oligonucleotide of the sequence ⁇ '-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 ' ⁇ (modification 1: the phosphate group of the 3' end is marked with (HO - (CH 2 ) 2 -S) 2 esterified to PO- (CH 2 ) 2 - SS- (CH 2 ) 2 -OH; modification 2: at the ⁇ 'end is the fluorescein modifier fluorescein phosphoramidite (Proligo Biochemie GmbH ) built in according to the respective standard protocol) in ⁇ x10 "5 molar buffer solution (phosphate buffer, 0, ⁇ molar in water, pH 7) with addition of approx.
  • modification 1 the phosphate group of the 3' end is marked with (HO - (CH 2 ) 2 -S) 2 esterified to PO- (CH 2 ) 2 - SS- (CH 2 ) 2
  • the disulfide spacer PO- (CH 2 ) 2 -SS- (CH 2 ) 2 -OH of the oligonucleotide is cleaved homolytically, thereby forming the spacer with Au atoms on the surface to form a covalent Au S bond, which leads to coadsorption of the ss-oligonucleotide and the cleaved 2-hydroxy-mercaptoethanol s Free propanethiol which is simultaneously present in the ⁇ incubation solution is also adsorbed by forming an Au-S bond (incubation step).
  • this single strand can also be hybridized with its complementary strand.
  • the quench surface (here: gold plate) is coated with a double-modified 20 bp ⁇ single-strand oligonucleotide of the sequence ⁇ '-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '
  • this single strand ⁇ can also be hybridized with its complementary strand.
  • the gold surface modified in this way is completely wetted with an approx. 10 "5 to 10 ⁇ 1 molar solution of short-chain alkanethiols such as propanethiol (in water or buffer, pH 7 - 7. ⁇ or in ethanol) and 0.5 -
  • short-chain alkanethiols such as propanethiol (in water or buffer, pH 7 - 7. ⁇ or in ethanol) and 0.5 -
  • the free thiol occupies the free gold surface remaining after the incubation step by forming an Au-S bond, or alternatively other functional thiols or disulfides of suitable chain length with the same or different functional groups can be used.
  • the probe surface is produced analogously to Example 4.
  • a modified oligonucleotide of the sequence ⁇ '-fluorescein-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3 '[C 3 -S- SC 3 -OH] is immobilized on gold ( ⁇ O ⁇ mol oligonucleotide in phosphate buffer (K 2 HPO 4 / KH 2 PO ⁇ OO mM, pH 7, subsequent coating with propanethiol 1 mM in water) and in 0 in the form Au-S (CH 2 ) 2 -ss-oligo-fluorescein the fluorescence intensity of the surface with a fluorescence scanner from avision Biotech in To measure the fluorescence in the presence of liquid media, add 1 ⁇ 0 ⁇ l of the medium to the gold surface and then cover it with a cover glass, or alternatively use hybrid wells or imaging ⁇ chambers.
  • the probe surface is produced analogously to example 4 and measured analogously to example 5.
  • the geometric arrangement of the single-stranded 5 probe is modulated by varying the salt concentration (NaCl concentration) in a range between 1x10 "4 and 3 mol / liter.
  • the values obtained by measuring the fluorescence intensity as a function of the salt concentration are shown in FIG. 2A
  • the fluorescence intensity is highest in the concentration range between 0.01 and 0.5 mol / liter, but especially in the range between 0.0 ⁇ and 0.2 ⁇ mol / liter, ie the fluorophore is at the greatest distance from the gold surface
  • Fluorescence measurements performed with a fluorescence scanner After hybridization with complementary oligomers in phosphate buffer ( ⁇ OO mM, 1 mM EDTA, 1 M NaCI), fluorescence measurements are carried out according to Example 6 in the presence of NaCI solutions of 0 different concentrations using a fluorescence scanner. The values obtained by measuring the fluorescence intensity for the hybridized and the non-hybridized case as a function of the salt concentration are shown in FIG. 2B.

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen, das als ersten Schritt das Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche umfasst. Die Modifikation der Oberfläche besteht dabei in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren (201), wobei die Nukleinsäure-Oligomere (201) durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor (102) modifiziert sind. Die weiteren Schritte des erfindungsgemässen Verfahrens sind Bereitstellen einer Probe mit Nukleinsäure-Oligomeren, Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche, Einstellen einer definierten Salzkonzentration von grösser 0,5 mol/l in der die modifizierten Nukleinsäure-Oligomere umgebenden Lösung, Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors und Vergleich der detektierten Fluoreszenzintensität mit Referenzwerten.

Description

Fluoreszenz-Quenchen zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen bei hohen Salz-Konzentrationen
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen.
Stand der Technik
In der Krankheitsdiagnose, bei toxikologischen Testverfahren, in der genetischen Forschung und Entwicklung, sowie auf dem Agrar- und pharmazeutischen Sektor werden Immunoassays und zunehmend auch die Sequenzanalyse von DNA und RNA eingesetzt. Neben den bekannten seriellen Verfahren mit autoradiographischer oder optischer Detektion finden zunehmend parallele Detektionsverfahren mittels Array-Technologie, sogenannten DNA- oder Protein-Chips, Verwendung. Auch bei diesen parallelen Verfahren beruht die Detektion auf optischen, radiographischen, massenspektrometrischen oder elektrochemischen Methoden.
Zur Genanalyse auf einem Chip wird auf einer Oberfläche eine Bibliothek bekannter DNA- Sequenzen ("Sonden-Oligonukleotide") in einem geordneten Raster fixiert, so dass die
Position jeder individuellen DNA-Sequenz bekannt ist. In der Untersuchungslösung anwesende Fragmente aktiver Gene ("Target-Oligonukleotide"), deren Sequenzen zu bestimmten Sonden-Oligonukleotiden auf dem Chip komplementär sind, können durch
Nachweis der entsprechenden Hybridisierungsereignisse auf dem Chip identifiziert werden. Im Allgemeinen erfolgt die Analyse über optische (oder autoradiographische)
Detektionsverfahren unter Verwendung von Target-Oligonukleotiden, die mit einem
Radiolabel (z.B. 32P) oder einem Fluoreszenzfarbstoff (z.B. Fluorescein, Cy3™ oder
Cy5™) markiert sind. Die Verwendung von Fluoreszenzlabel und entsprechenden
Fluoreszenz-Scannern überwiegt dabei zunehmend die Anwendung von Radiolabel. Die zur Zeit auf dem Markt erhältlichen Fluoreszenz-Scanner ermöglichen den Nachweis von
Fluorophoren im Subattomol-Bereich. Die Verwendung von markierten Targets zum Nachweis von Hybridisierungsereignissen beinhaltet jedoch einige Nachteile. Zum einen muss die Markierung vor der eigentlichen Messung erfolgen, was einen zusätzlichen Syntheseschritt und damit zusätzlichen Arbeitsaufwand bedeutet. Zudem ist es schwierig, eine homogene Markierung des Probenmaterials zu gewährleisten. Außerdem sind stringente Waschbedingungen notwendig, um im Anschluss an eine Hybridisierung nicht oder unspezifisch gebundenes Material zu entfernen.
Sowohl für die Protein- als auch für die DNA-Analyse ist es daher wünschenswert und für den Anwender vorteilhaft, wenn die Targets (Antikörper bzw. Antigen oder DNA- Fragment) nicht mit einem Detektionslabel modifiziert werden müssten.
Die Nachteile der Markierung des Probenmaterials mit radioaktiven Elementen oder Fluoreszenzfarbstoffen können umgangen werden, wenn an Stelle der Targets die
Sondenmoleküle mit entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden. Nach diesem Prinzip funktionieren die sogenannten molekularen Leuchten (molecular beacons). Diese einsträngigen Oligonukleotide weisen eine Haarnadelstruktur (hairpin, stem-and-loop) auf und tragen am einen Ende der Sequenz einen Fluorophor (z.B. Fluorescein, TexasRed®) und am anderen Ende der Sequenz einen geeigneten
Fluoreszenzlöscher (z.B. DABCYL). Durch die spezielle geometrische Anordnung befinden sich die fluoreszierende Gruppe und die Einheit, die zur Löschung der
Fluoreszenz führt, in räumlicher Nähe zueinander. Daher zeigen die Sonden nur eine äußerst geringe Fluoreszenz. In Gegenwart der entsprechenden zur Sequenz der Schlinge (loop) komplementären Sequenz (Target) erfolgt die Hybridisierung in diesem
Bereich. Dies führt zu einer Änderung der Konformation und zur Trennung von Fluorophor und Quencher, was als starke Zunahme der Fluoreszenz beobachtet werden kann.
Neben organischen Molekülen (wie DABCYL) werden auch Gold-Nanopartikel als effiziente Quencher eingesetzt (vgl. Nature Biotech. Vol. 19, 2001 , Seite 365). Das Quenchen der Fluoreszenz durch Metalle beruht primär auf einem strahlungslosen Energietransfer vom Farbstoffmolekül zum Metall. Bei Verwendung von Gold- Nanopartikeln wird eine größere Sensitivität beobachtet als bei organischen Quenchern. Außerdem werden Farbstoffe bis in den nahen Infrarot-Bereich effizient gequencht. Ein Nachteil dieser Methode liegt allerdings darin, dass Gold-Nanopartikel bei Temperaturen über 50°C nicht mehr stabil sind. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass diese Methode auf die Untersuchung von Lösungen beschränkt ist und daher nur wenige Sequenzen zur gleichen Zeit untersucht werden können, der Parallelisierungsgrad dieses Ansatzes also gering ist.
Aus dem Stand der Technik sind auch Untersuchungen zur Detektion von Nukleinsäure- Oligomer-Hybridisierungsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen bekannt (T. Neumann, Dissertation "Strategies for Detecting DNA Hybridisation Using Surface Plasmon Fluorescence Spectroscopy", Mainz, Juni 2001). Aus dieser Arbeit geht hervor, dass die Salz-Konzentration in der die Nukleinsäure-Oligomere umgebenden Lösung einen Einfluss auf die Konformation der Nukleinsäure-Oligomere ausübt. Es wurde eine Zunahme der Fluoreszenzintensität nach Hybridisierung um einen Faktor 1 ,75 festgestellt, was zu einer unbefriedigenden Nachweisgrenze, insbesondere bei parallelen Verfahren, führt.
Obwohl es also viele Detektionsmöglichkeiten für Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignisse gibt, ist der Bedarf an einfachen, kostengünstigen, problemlos durchzuführenden und verlässlichen Detektionsprinzipien vor allem im Bereich der weniger dichten Array-Technologien (DNA- und Protein-Chips mit wenigen einzelnen bzw. bis zu mehreren hunderttausend Test-Sites pro cm2 z.B. für sogenannte POC (Point of Care)- Systeme bzw. für high throughput screening - HTS - Systeme) hoch.
Darstellung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybriden bereit zu stellen, welches die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren gemäß unabhängigem Patentanspruch 1 und durch den Kit gemäß unabhängigem Anspruch 11 gelöst.
Weitere vorteilhafte Details, Aspekte und Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, den Figuren und den Beispielen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und Begriffe benutzt:
Genetik
DNA Desoxyribonukleinsäure
RNA Ribonukleinsäure
PNA Peptidnukleinsäure (synthetische DNA oder RNA, bei der die
Zucker-Phosphat-Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei
Ersatz der Zucker-Phosphat-Einheit durch die -NH-(CH2)2-
N(COCH2-Base)-CH2CO- Einheit hybridisiert PNA mit DNA.)
A Adenin
G Guanin
C Cytosin
T Thymin
U Uracil
Base A, G, T, C oder U
Bp Basenpaar
Nukleinsäure wenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z.B. Cytosin,
Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z.B. Adenin oder
Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges
"Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-
Basen, wie z.B. auf das Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z.B. Phosphoramid-, Thio-Phosphat- oder
Dithio-Phosphat-Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer
Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die
Fähigkeit zur sequenzspezifischen Bindung natürlich vorkommender cDNA oder RNA. nt Nukleotid
Nukleinsäure-Oligomer Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z.B. Nukleinsäure-Oktamer: Eine Nukleinsäure mit beliebigem Rückgrat, bei der 8 Pyrimidin- oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind). ns-OIigomer Nukleinsäure-Oligomer
Oligomer Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer.
Oligonukleotid Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z.B. ein DNA-, PNA- oder RNA-Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge.
Oligo Abkürzung für Oligonukleotid. Mismatch Zur Ausbildung der Watson-Crick-Struktur doppelsträngiger Oligonukleotide hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, dass die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede andere Basenpaarung bildet keine Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die Struktur und wird als "Mismatch" bezeichnet. ss Single Strand (Einzelstrang) ds double Strand (Doppelstrang)
Substanzen
Fluorophor chemische Verbindung (chemische Substanz), die in der Lage ist, bei Anregung mit Licht ein längerwelliges (rotverschobenes) Fluoreszenzlicht abzugeben. Fluorophore (Fluoreszenzfarbstoffe) können Licht in einem Wellenlängenbereich vom ultravioletten (UV) über den sichtbaren (VIS) bis hin zum infraroten (IR) Bereich absorbieren. Die Absorptions- und Emissionsmaxima sind in der Regel um 15 bis 40 nm verschoben (Stokes-Shift).
FP Fluorophor Cy3™ δ.δ'-disulfo-l.rd -carbopenteny -S.S^S'-tetramethyl- indodicarbocyanin
(Fluoreszenzfarbstoff der Firma Amersham Life Science, Inc.) Cy5 TM δ,δ\7,7 etrasulfo-1 ,rdi(-carbopentenyl)-3,3,3\3 etramethyl- benzindodicarbocyanin
(Fluoreszenzfarbstoff der Firma Amersham Life Science, Inc.)
Fluorescein Resorcinphtalein (Fluoreszenzfarbstoff)
Rhodamin 6G Basic Red 1 (Fluoreszenzfarbstoff)
Texas Red® Fluoreszenzfarbstoff der Firma Molecular Probes, Inc.
DABCYL 4-((4'-(Dimethylamino)phenyl)azo)benzoesäure
Fluoreszenzlöschung strahlungsloser Energietransfer
Fluoreszenz-Quenchen Fluoreszenzlöschung
Quench-Oberfläche leitende (Metall)-Oberfläche, die durch einen Energietransfer Fluoreszenz löschen kann (insbesondere Gold-, Silber-, Kupfer- Oberflächen usw. )
EDTA Ethylendiamin-Tetraacetat (Natriumsalz) Linker molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül. In der Regel sind Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Hetero-Alkinylkette käuflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stellen mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reaktionen mit dem entsprechenden Reaktionspartner eine kovalente chemische Bindung aus. Die reaktiven Gruppen können auch photoaktivierbar sein, d. h. die reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge aktiviert. Bevorzugte Linker sind solche der Kettenlänge 1 - 60, insbesondere der Kettenlänge δ - 40, wobei die Kettenlänge hier die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen, also zwischen den zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, einem Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül, darstellt. Spacer Linker, der über die reaktiven Gruppen an eine oder beide der zu verbindenden Strukturen (siehe Linker) kovalent angebunden ist. Bevorzugte Spacer sind solche der Kettenlänge 1 - 60, insbesondere der Kettenlänge δ - 40, wobei die Kettenlänge die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen darstellt.
Modifizierte Oberflächen/Elektroden
Au-S-(CH2)2-ss-oligo- Gold-Oberfläche mit kovalent aufgebrachter Monolayer aus FP derivatisiertem Einzelstrang-Oligonukleotid. Hierbei ist die endständige Phosphatgruppe des Oligonukleotids am 3' Ende mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert, wobei die S-S Bindung homolytisch gespalten wird und je eine Au-S-R Bindung bewirkt. Am freien Ende trägt das Sonden- Oligonukleotid einen kovalent angebunden Fluorophor (FP) wie z.B. Cy3™, Cyδ™, Texas Red®, Rhodamin 6G, Fluorescein etc.
Au-S-(CH2)z-ds-oligo- Au-S-fCH∑ϊ∑-ss-oligo-FP hybridisiert mit dem zu ss-oligo FP komplementären Oligonukleotid.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen durch Fluoreszenz-Quenchen, das als ersten Schritt das Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche umfasst. Die Modifikation der Oberfläche besteht dabei in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Nukleinsaure- Oligomeren, wobei die Nukleinsäure-Oligomere durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor modifiziert sind. Die weiteren Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Bereitstellen einer Probe mit Nukleinsaure-Oligomeren, Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche, Einstellen einer definierten Salzkonzentration von größer 0,5 mol/l in der die modifizierten Nukleinsäure-Oligomere umgebenden Lösung, Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors und Vergleich der bei der Detektion bestimmten Fluoreszenzintensität mit Referenzwerten.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ein Vergleich der detektierten Fluoreszenzintensitäten mit Referenzwerten erforderlich. Diese Referenzwerte können aus vorangegangenen Messungen bereits vorliegen und brauchen daher im allgemeinsten Fall nicht im Laufe des erfindungsgemäßen Verfahrens detektiert werden. Da die Referenzwerte aber im Idealfall unter exakt den gleichen äußeren Bedingungen bestimmt werden sollen wie die eigentlichen Messwerte der Fluoreszenzintensitäten, wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vor dem Inkontaktbringen der Targets (Probe) mit der modifizierten Oberfläche eine erste Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors durchgeführt. Dazu wird eine definierte Salzkonzentration in der die modifizierten Nukleinsäure-Oligomere umgebenden Lösung eingestellt, wobei dieselbe Salzkonzentration wie bei der zweiten Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors verwendet wird, dann erfolgt die erste Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors. Anschließlich werden Stringenzbedingungen für die Hybridisierung eingestellt und die Probe mit der modifizierten Oberfläche in Kontakt gebracht. Die bei dieser ersten Fluoreszenzdetektion erhaltenen Werte werden dann als Referenzwerte verwendet und mit den bei der zweiten Fluoreszenzdetektion erhaltenen Werten verglichen.
Das Einstellen der Stringenzbedingungen für die Hybridisierung und das Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche kann grundsätzlich in jeder beliebigen zeitlichen Abfolge durchgeführt werden. Bevorzugt werden die Stringenzbedingungen für die Hybridisierung gleichzeitig mit dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche eingestellt oder das Einstellen der Stringenzbedingungen für die Hybridisierung erfolgt nach dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche.
Gemäß den nachfolgend geschilderten, besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird zusätzlich eine Normierungsmessung durchgeführt. Auf der modifizierten Oberfläche sind in diesen Fällen Sites aufgebracht, denen nach Zugabe der Probe ein ganz bestimmter Assoziationsgrad zugeordnet werden kann. Das bei der Detektion erhaltene Signal ist dann für diesen bestimmten Grad an Assoziation charakteristisch und kann zur Normierung der Signale der Test-Sites herangezogen werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst nämlich auch Verfahren, in denen eine modifizierte Oberfläche verwendet wird, die durch Anbindung von wenigstens zwei Arten von modifizierten Nukleinsaure-Oligomeren modifiziert wurde. Die verschiedenen Arten von modifizierten Nukleinsaure-Oligomeren sind in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden. Unter "im wesentlichen abgetrennten Bereichen" werden Bereiche der Oberfläche verstanden, die ganz überwiegend durch Anbindung einer bestimmten Art von modifizierten Nukleinsaure-Oligomeren modifiziert sind. Lediglich in Gebieten, in denen zwei solche im wesentlichen abgetrennte Bereiche aneinander grenzen, kann es zu einer räumlichen Vermischung von verschiedenen Arten von modifizierten Nukleinsaure-Oligomeren kommen. In dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugten Verfahren erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von einem Nukleinsäure-Oligomer zu der Probe, wobei das Nukleinsäure-Oligomer ein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante zu einer bestimmten Art von modifizierten Nukleinsäure- Oligomeren ist, die in einem bestimmten Bereich (Site T10o) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Das Nukleinsäure-Oligomer wird dabei in einer Menge zu der Probe zugegeben, die größer ist als die Menge an Nukleinsaure-Oligomeren, die notwendig ist, um die modifizierten Nukleinsaure-Oligomeren der T10o-Sites vollständig zu assoziieren. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T100 erhaltenen Wert. Der für den Bereich T10o erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei vollständiger Assoziation (100%).
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine modifizierte Oberfläche verwendet, die durch Anbindung von wenigstens drei Arten von modifizierten Nukleinsaure-Oligomeren modifiziert wurde. Die verschiedenen Arten von modifizierten Nukleinsaure-Oligomeren sind in räumlich im wesentlichen abgetrennten Bereichen an die Oberfläche gebunden. Dabei ist wenigstens eine Art von modifizierten Nukleinsäure- Oligomer in einem bestimmten Bereich (Site T0) an die Oberfläche gebunden, von dem bekannt ist, dass in der Probe kein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante enthalten ist, also das entsprechende Nukleinsäure-Oligomer nicht in der Probe vorkommt. Auch in diesem besonders bevorzugten Verfahren erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von einem Nukleinsäure-Oligomer zu der Probe, wobei das Nukleinsäure-Oligomer ein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante zu einer bestimmten Art von modifizierten Nukleinsaure-Oligomeren ist, die in einem bestimmten Bereich (Site T100) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Das Nukleinsäure-Oligomer wird dabei in einer Menge zu der Probe zugegeben, die größer ist als die Menge an Nukleinsaure-Oligomeren, die notwendig ist, um die modifizierten Nukleinsaure-Oligomeren der T10o-Sites vollständig zu assoziieren. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors erhaltenen Werte mit dem für den Bereich T100 erhaltenen Wert und mit dem für den Bereich T0 erhaltenen Wert. Der für den Bereich To erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei fehlender Assoziation (0%).
Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der oben geschilderten 5 Verfahren erfolgt vor dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche der Zusatz von wenigstens einer weiteren Art von Nukleinsäure-Oligomer zu der Probe, wobei bekannt ist, dass dieses Nukleinsäure-Oligomer in der ursprünglichen Probe nicht enthalten ist. Diese weitere Art von Nukleinsäure-Oligomer weist eine Assoziationskonstante >0 zu einer Art von modifizierten Nukleinsaure-Oligomeren auf, die 0 in einem bestimmten Bereich (Site Tn) an die Oberfläche gebunden vorliegt. Das Nukleinsäure-Oligomer wird in einer solchen Menge zu der Probe gegeben, dass nach dem Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche n% der modifizierten Nukleinsäure-Oligomere des Sites Tn in assoziierter Form vorliegen. Den letzten Schritt dieses Verfahrens bildet der Vergleich der bei der Detektion der Fluoreszenz des δ Fluorophors erhaltenen Werte mit dem für den Bereich Tioo erhaltenen Wert, mit dem für den Bereich T0 erhaltenen Wert und mit den für die Bereiche Tn erhaltenen Werten. Der für ein bestimmtes Test-Site Tn erhaltene Wert entspricht somit dem Wert bei Vorliegen von n% Assoziaten aus modifizierten Nukleinsaure-Oligomeren und Target-Nukleinsäure- Oligomeren bezogen auf die Gesamtzahl an modifizierten Nukleinsaure-Oligomeren der 0 entsprechend Art.
Die Menge an Nukleinsaure-Oligomeren, die mit der modifizierten Oberfläche in Kontakt gebracht werden muss, um eine n%ige Assoziation am Site Tn zu bewirken, kann vom Fachmann durch einfache Routineuntersuchungen bestimmt werden. Dazu wird z.B. nach δ Detektion der Werte für T0 und T10o eine kalibrierte Messung durchgeführt, bei der die Signalintensität von (unterschiedlichen) Detektionslabel bestimmt wird, mit denen die modifizierten Nukleinsäure-Oligomere und die Target-Nukleinsäure-Oligomere ausgestattet sind. Das Verhältnis der Intensitäten von Target-Nukleinsäure-Oligomer- Label-Signal zu modifiziertem Nukleinsäure-Oligomer -Label-Signal entspricht n%. 0
Wird eine genügende Anzahl an Sites Tn auf der modifizierten Oberfläche aufgebracht, so kann eine Normierungskurve mit hoher Genauigkeit aufgenommen werden. Die Normierung der Messungen der eigentlichen Test-Sites mit Hilfe dieser Normierungskurve verbessert die Reproduzierbarkeit der Analytik mit Hilfe der Chip-Technologie deutlich. δ Es soll darauf hingewiesen werden, dass das Auffinden eines Nukleinsäure-Oligomers, das nicht in der Probe enthalten ist, keinerlei Probleme bereitet, da auch die umfangreichsten Genome immer noch eine genügende Auswahl an nicht vorhandenen Sequenzen bieten. Für den Fall, dass sich die nicht vorhandene Sequenz von einer δ anwesenden Sequenz nur durch eine Base unterscheidet, muss der Hybridisierungsschritt unter stringenten Bedingungen durchgeführt werden. Bevorzugt werden aber Sequenzen verwendet, die sich deutlich, also in mehreren Basen, von den in der Probe anwesenden Sequenzen unterscheiden. Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn für die Test- Sites und für die Normierungssites Oligonukleotide mit der gleichen oder zumindest einer 0 ähnlichen Zahl an Basen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem einen Kit, der eine modifizierte Oberfläche umfasst, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Nukleinsaure-Oligomeren besteht und wobei die Nukleinsäure-Oligomere durch δ Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor modifiziert sind.
Erfindungsgemäß wird die Detektion der Fluoreszenz nach Einstellen einer definierten Salzkonzentration von größer 0,δ mol/l in der die modifizierten Nukleinsäure-Oligomere umgebenden Lösung durchgeführt. Bevorzugte Salzkonzentrationen liegen in den 0 Bereichen zwischen 0,δ und 10 mol/l, zwischen 1 und 10 mol/l, zwischen 0,δ und 3 mol/l und insbesondere zwischen 2 und 3 mol/l, weil in diesen Bereichen gefunden wurde, dass eine besonders große Differenz in der Fluoreszenzintensität zwischen dem hybridisierten und dem nicht-hybridisierten Nukleinsäure-Oligomer besteht. Dadurch wird eine besonders sichere Detektion der Hybridisierungsereignisse ermöglicht. δ
Die Quench-Oberf lache
Mit dem Begriff "Oberfläche" wird jedes Trägermaterial bezeichnet, das geeignet ist, direkt 0 oder nach entsprechender chemischer Modifizierung Fluorophor-derivatisierte Nukleinsäure-Oligomere zu tragen, die kovalent an der Oberfläche immobilisiert sind und deren Fluoreszenz nahe an der Oberfläche (in ca. 1 bis δO A Abstand zur Oberfläche) durch Fluoreszenzlöschung (strahlungsloser Energietransfer zwischen dem Fluorophor als Emitter und der Oberfläche als Absorber) signifikant (>10% der erwarteten δ Fluoreszenzintensität des Fluorophors in Abwesenheit der Oberfläche bei ansonsten gleichen Bedingungen) reduziert wird. Insbesondere sind Gold und Silber als Quench- Oberflächenmaterial geeignet. Die Bezeichnung Oberfläche ist unabhängig von den räumlichen Dimensionen der Oberfläche und beinhaltet auch Nanopartikel (Partikel oder Cluster aus wenigen einzelnen bis mehreren hunderttausend Oberflächen-Atomen oder - Molekülen). Die Oberfläche kann zusätzlich an einen festen Träger wie z.B. Glas, Metall 5 oder Plastik gebunden vorliegen.
Bindung der Nukleinsäure-Oligomere an die Oberfläche
0 Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsaure-Oligomeren an einer Oberfläche sind dem Fachmann bekannt. Die Immobilisierung kann z.B. kovalent über Amino-, Hydroxyl-, Epoxid- oder Carboxygruppen des Trägermaterials mit natürlicherweise am Nukleinsäure- Oligomer vorhandenen oder durch Derivatisierung am Nukleinsäure-Oligomer angebrachten Thiol-, Hydroxy-, Amino- oder Carboxylgruppen erfolgen. Das δ Nukleinsäure-Oligomer kann direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder -molekülen einer Oberfläche verbunden werden. Daneben kann das Nukleinsäure-Oligomer durch die bei Immunoassays üblichen Methoden verankert werden wie z.B. durch Verwendung von biotinylierten Nukleinsaure-Oligomeren zur nicht- kovalenten Immobilisierung an Avidin oder Streptavidin-modifizierten Oberflächen. Die 0 chemische Modifikation der Sonden-Nukleinsäure-Oligomeren mit einer Oberflächen- Ankergruppe kann bereits im Verlauf der automatisierten Festphasensynthese oder aber in gesonderten Reaktionsschritten eingeführt werden. Dabei wird auch das Nukleinsäure- Oligomer direkt oder über einen Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder - molekülen einer Oberfläche der oben beschriebenen Art verknüpft. Diese Bindung kann 5 auf verschiedene, aus dem Stand der Technik bekannten Arten durchgeführt werden (vgl. z.B. Hartwich, G.: ELEKTROCHEMISCHE DETEKTION VON SEQUENZSPEZIFISCHEN
NUKLEINSÄUREOLIGOMERHYBRIDISIERUNGSEREIGNISSEN (1999), WO 00/42217).
Bei der Anbindung der Nukleinsäure-Oligomere an die Oberflächen ist auf einen 0 besonders wichtigen Punkt zu achten. Grundsätzlich herrschen zur Detektion der Differenz der Fluoreszenzintensität von hybridisierten Nukleinsaure-Oligomeren und einsträngigen Nukleinsaure-Oligomeren dann besonders günstige Bedingungen, wenn der Fluorophor sich in nur einem der Zustände "hybridisiert" oder "nicht hybridisiert" möglichst nahe an der modifizierten Oberfläche befindet. Das Ausmaß des Quench- δ Vorgangs verändert sich ja bekanntermaßen mit einer höheren (dritte bis sechste) Potenz des Abstandes zwischen Quench-Oberfläche und Fluorophor. Solche besonders günstigen Bedingungen können nur mit speziellen Anbindungstechniken erreicht werden. Es muss bei der Anbindung der Nukleinsäure-Oligomere darauf geachtet werden, dass diese entweder völlig ohne weiteres Co-Adsorbat an die Oberfläche gebunden werden oder, falls ein Co-Adsorbat notwendig erscheint, dass dieses eine möglichst dünne Schicht über der Oberfläche ausbildet. Es muss also entweder eine direkte Anbindung des Nukleinsäure-Oligomers an die Oberfläche erfolgen oder eine Belegung zusammen mit möglichst kurzkettigen Co-Adsorbaten wie z.B. kurzkettigen Thiolen. Bevorzugt werden Co-Adsorbate der Kettenlänge 1 bis 30, bevorzugt 1 bis 20, besonders bevorzugt 1 bis 10, insbesondere bevorzugt der Kettenlänge 1 bis 5.
Insbesondere nachteilig ist in diesem Zusammenhang eine Anbindung der Nukleinsäure- Oligomere in Form einer Verbindung Oberfläche-Biotin-Avidin-Biotin-Oligomer. Bei einer solchen Anbindung ist der Fluorophor immer durch eine sehr dicke Schicht aus Biotin- Avidin-Biotin von der Oberfläche abgeschirmt, was mit entsprechenden Nachteilen in der Detektion der Fluoreszenz einhergeht.
Fluorophore
Als Fluorophore werden kommerziell erhältliche Fluoreszenzfarbstoffe wie z.B. Texas Red®, Rhodamin-Farbstoffe, Cyaninfarbstoffe wie z.B. Cy3™, Cyδ™, Fluorescein etc (vgl. Fluka, Amersham und Molecular Probes Katalog) verwendet.
Fluoreszenzlöschung
Mit Fluoreszenzlöschung wird die Deaktivierung einer elektronisch angeregten Spezies über einen strahlungslosen Prozess bezeichnet. Die Deaktivierung kann durch Stöße oder auch durch strahlungslose Energieübertragung auf Metalle erfolgen. Die freiwerdende Energie wird als thermische Energie dissipiert. Gold ist ein Beispiel für ein Metall, das die Fähigkeit zur Fluoreszenzlöschung besitzt. Die Löschung weist eine starke Abhängigkeit vom Abstand des Fluorophors von der als Fluoreszenzlöscher fungierenden Oberfläche auf (umgekehrt proportional zu einer höheren (dritte bis sechste) Potenz des Abstands). Der Effekt der Fluoreszenzlöschung ist daher nur bei Abständen kleiner 100 bis 200 Ä messbar. Im Bereich größer als ca. 200 A führen weitere Abstandsänderungen nicht mehr zu einer messbaren Erhöhung der Fluoreszenzintensität. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigen
Fig. 1 eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen durch Modulation der Fluoreszenzlöschung an Quench- Oberf lachen;
Fig. 2 A: Messung der Fluoreszenz-Intensitätsänderung einer 20mer und einer 30mer- Nukleinsäure-Sonde (einsträngig) in Abhängigkeit von der lonenstärke (hier Salzkonzentration) der Lösung über der Oberfläche;
B: Messung der Fluoreszenz-Intensitätsänderung vor und nach der sequenzspezifischen Hybridisierung einer 30mer-Nukleinsäure-Sonde mit dem komplementären Gegenstrang (Target) in Abhängigkeit von der lonenstärke (hier Salzkonzentration) der Lösung über der Oberfläche.
Bezugszeichenliste
102: Fluorophor
201: einsträngige Oligomer-Sonde 202: Sonde hybridisiert mit Target 203: Oberfläche (z.B. Gold) 204: Abstand des Fluorophor zur Goldoberfläche vor der Hybridisierung 205: Abstand des Fluorophor zur Goldoberfläche nach der Hybridisierung
Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung der Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybridisierungsereignissen durch Modulation der Fluoreszenzlöschung an Quench- Oberflächen. In Figur 1A ist der Fall dargestellt, dass das einsträngige Sonden- Nukleinsäure-Oligomer 201 vor der Hybridisierung in einer Form vorliegt, die durch einen großen Abstand 204 von Fluorophor 102 und quenchender Metalloberfläche charakterisiert ist. Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure- Oligomer-Strang 202 (Target) verringert sich der Abstand 205 zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche 203. Dadurch kommt es zu einer Verringerung der Fluoreszenzintensität (Balkendiagramm der Figur 1A). Figur 1 B zeigt den Fall, dass das einsträngige Sonden- Nukleinsäure-OIigomer 201 vor der Hybridisierung in einer Form vorliegt, die durch einen 5 geringen Abstand 204 von Fluorophor 102 und quenchender Metalloberfläche 203 charakterisiert ist. Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure- Oligomer-Strang 202 (Target) vergrößert sich der Abstand 20δ zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche 203. Dadurch kommt es zu einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität (Balkendiagramm 0 der Figur 1B).
Figur 2A zeigt eine Auftragung der Fluoreszenz-Intensitäten einer 20mer und einer 30mer-Nukleinsäure-Sonde (einsträngig) in Abhängigkeit von der lonenstärke (hier Salzkonzentration) der Lösung über der Oberfläche. Gemessen wurde die δ Fluoreszenzintensität von 200 μm-Spots von auf einer 1 cm2 großen Gold-Platte immobilisierten Einzelstrang-Sondenoligonukleotiden (20 mer und 30 mer) mit Cy3™ als kovalent angebundenem Fluorophor. Die Auftragung gemäß Figur 2B zeigt die Fluoreszenz-Intensität vor und nach der sequenzspezifischen Hybridisierung einer 30mer- Nukleinsäure-Sonde mit dem komplementären Gegenstrang (Target) in Abhängigkeit von 0 der Salzkonzentration der Lösung über der Oberfläche unter ansonsten gleichen Bedingungen wie in Zusammenhang mit Figur 2A beschrieben. Aus der Figur 2B geht deutlich hervor, dass sich bei Salzkonzentrationen von mehr als 0,δ mol/l die Fluoreszenzintensität nach der Hybridisierung um bis zu einem Faktor 5 erhöht. Dies erlaubt auch bei parallelen Verfahren eine eindeutige Detektion der erfolgten 5 Hybridisierungen.
Wege zur Ausführung der Erfindung 0
Um die Vorteile der DNA-Chip-Technologie auf die Detektion von Nukleinsäure-Oligomer- Hybriden durch Modulation des Fluoreszenzquenchens anzuwenden, werden verschiedene modifizierte Nukleinsäure-Oligomer-Sonden unterschiedlicher Sequenz mit den oben beschriebenen Immobilisierungstechniken an einen Träger gebunden. Mit der 5 Anordnung der Nukleinsäure-Oligomer-Sonden bekannter Sequenz an jeder Position der Oberfläche, einem DNA-Array, soll das Hybridisierungsereignis eines beliebigen Target- Nukleinsäure-Oligomers oder einer (fragmentierten) Target-DNA detektiert werden, um z.B. Mutationen im Target aufzuspüren und sequenzspezifisch nachzuweisen. Dazu werden auf einer Oberfläche die Oberflächenatome oder -moleküle eines definierten Bereichs (einer Test-Site) mit DNA~/RNA-/PNA-Nukleinsäure-Oligomeren bekannter, aber 5 beliebiger Sequenz, wie oben beschrieben, verknüpft. In einer allgemeinsten Ausführungsform kann der DNA-Chip auch mit einem einzigen Sonden-Oligonukleotid derivatisiert werden. Als Sonden-Nukleinsäure-Oligomere werden Nukleinsäure- Oligomere (z.B. DNA-, RNA- oder PNA-Fragmente) der Basenlänge 3 bis 70, bevorzugt der Länge 5 bis 60, besonders bevorzugt der Länge 10 bis δO, insbesondere bevorzugt 0 der Länge 12 bis 40 verwendet.
An dieser Stelle sei erwähnt, dass die Target-Oligonukleotide auch eine größere Anzahl an Basen umfassen können, also länger sein können, als die Sonden-Oligonukleotide. In diesem Fall wird unter dem Ausdruck "zum Sonden-Oligonukleotid komplementäres δ Nukleinsäure-Oligomer" ein Nukleinsäure-Oligomer verstanden, das eine Basensequenz aufweist, die in einem Teilbereich zu dem Sonden-Oligonukleotid komplementär ist. Der/die restlichen Abschnitte des Nukleinsäure-Oligomers ragen dann an dem/den Enden des Sonden-Oligonukleotids über dessen Basenkette hinaus.
0 An den so bereitgestellten Oberflächen mit immobilisierten und Fluorophor-markierten Sonden-Oligonukleotiden wird in einer Referenzmessung, z.B. mit einem Fluoreszenz- Scanner, die Fluoreszenzintensität der Fluorophor-markierten Sonden-Oligonukleotide im einsträngigen Zustand bei einer definierten, zuvor eingestellten Salzkonzentration in der umgebenden Lösung bestimmt. δ
Im nächsten Schritt wird die (möglichst konzentrierte) Untersuchungslösung mit Target- Oligonukleotid(en) unter für die Hybridisierung stringenten Bedingungen zur Oberfläche mit immobilisierten Sonden-Oligonukleotiden gegeben. Dabei kommt es nur in dem Fall zur Hybridisierung, in dem die Lösung Target-Nukleinsäure-Oligomer-Stränge enthält, die 0 zu den an die Oberfläche gebundenen Sonden-Nukleinsäure-Oligomeren komplementär, oder zumindest in weiten Bereichen komplementär sind.
Nach der Hybridisierung zwischen Sonde und Target wird wiederum eine definierte Salzkonzentration eingestellt und dann in einer zweiten Fluoreszenzmessung die δ Fluoreszenzintensität im hybridisierten, doppelsträngigen Zustand bestimmt. Die Differenz aus Referenzmessung und zweiter Messung je Test-Site ist proportional zur Anzahl der ursprünglich in der Untersuchungslösung für das jeweilige Test-Site vorhandenen komplementären (bzw. in weiten Bereichen komplementären) Target- Oligonukleotide. δ
Gemäß einem alternativen Verfahren kann die Referenzmessung weggelassen werden, wenn die Größe des Referenzsignals vorher (z.B. durch vorausgegangene Messungen etc.) hinlänglich genau bekannt ist.
0 Aufgrund der Hybridisierung von Sonden-Nukleinsäure-Oligomer und dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang (Target) verändert sich der Abstand zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche. Aufgrund des veränderten Abstandes erfährt auch das Ausmaß des Quench-Vorgangs und damit die Intensität der Fluoreszenz eine starke Änderung. Somit δ kann ein sequenzspezifisches Hybridisierungsereignis durch fluoreszenzbasierte Verfahren wie z.B. Fluoreszenzmikroskopie oder Messungen mit Fluoreszenz-Scanner detektiert werden.
Durch eine gezielte Beeinflussung des Salzgehalts der Lösung lassen sich für das 0 einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer verschiedene räumliche Anordnungen realisieren:
a) Vor der Hybridisierung liegt das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer 201 in einer Form vor, die durch einen großen Abstand 204 von Fluorophor 102 und δ quenchender Metalloberfläche 203 charakterisiert ist (hohe Fluoreszenzintensität). Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang 202 (Target) verändert sich der Abstand 20δ zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül 102 und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche 203 dahingehend, dass es durch die Verringerung des Abstands zu einer Vermehrung des Quenchens kommt und 0 eine geringere Intensität der Fluoreszenz nach der Hybridisierung beobachtet werden kann (siehe Figur 1A).
b) Vor der Hybridisierung liegt das einsträngige Sonden-Nukleinsäure-Oligomer 201 in einer Form vor, die durch einen geringen Abstand 204 von Fluorophor 102 und δ quenchender Metalloberfläche 203 charakterisiert ist (geringe Fluoreszenzintensität). Durch die Hybridisierung mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang 202 (Target) verändert sich der Abstand 20δ zwischen dem fluoreszierenden Farbstoffmolekül 102 und der als Quencher fungierenden Metalloberfläche 203 dahingehend, dass es durch die Vergrößerung des Abstands zu einer Verringerung des Quenchens kommt und eine höhere Intensität der Fluoreszenz nach der Hybridisierung δ beobachtet werden kann (siehe Figur 1 B).
Die beiden oben dargestellten geometrischen Anordnungen können durch die Variation der lonenstärke, insbesondere der Salzkonzentration erreicht werden. Dabei können beliebige Salze verwendet werden mit Ausnahme von bivalenten Salzen (z.B. Mg2+) oder 0 chaotropen Salzen. Bei niedrigem bis mittlerem Salzgehalt liegt die oberflächengebundene einsträngige Sonde in einer eher gestreckten Konformation vor (siehe Figur 1A). Durch die Hybridisierung wird eine Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachtet (siehe Figur 1A, 2B). Bei hohem Salzgehalt liegt die oberflächengebundene einsträngige Sonde in einer eher komprimierten Konformation vor (siehe Figur 1 B). Durch δ die Hybridisierung wird eine Zunahme der Fluoreszenzintensität beobachtet (siehe Figur 1B, 2B).
0 Ausführungsformen
Die n Nukleotide (nt) lange Nukleinsäure-Sonde (DNA, RNA oder PNA, z.B. ein 20 Nukleotide langes Oligo) ist in der Nähe eines ihrer Enden (3'- oder δ'-Ende) direkt oder über einen (beliebigen) Spacer mit einer reaktiven Gruppe zur kovalenten Verankerung an δ der Oberfläche versehen, z.B. als 3'-Thiol-modifiziertes Sonden-Oligonukleotid, bei dem die endständige Thiolmodifikation als reaktive Gruppe zur Anbindung an Gold dient. Weitere kovalente Verankerungsmöglichkeiten ergeben sich z.B. aus aminmodifiziertem Oligonukleotid, das zur Verankerung an oberflächlich gebundene Carbonsäurefunktionen (z.B. über säurefunktionalisierte Thiole wie Mercaptopropionsäure und eine Aktivierung 0 z.B. als Aktivester) verwendet wird. In der Nähe des anderen Terminus des Sondenoligonukleotids ist ein Fluorophor kovalent angebunden (vgl. Beispiel 1). Die so modifizierte Nukleinsäure-Sonde wird
(i) in Puffer (z.B. 10 - 500 mM Phosphat-Puffer, pH = 7, 1 mM EDTA) gelöst mit 5 der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden-Nukleinsäureoligomers an die - gegebenenfalls entsprechend derivatisierte - Oberfläche angebunden oder
(ii) in Gegenwart eines monofunktionalen Linkers in Puffer (z.B. 100 mM δ Phosphat-Puffer, pH = 7, 1mM EDTA, 0,1 - 1 M NaCI) gelöst mit der
Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des Sonden- Nukleinsäureoligomers gemeinsam mit dem monofunktionalen Linker an die - gegebenenfalls entsprechend derivatisierte - Oberfläche angebunden, wobei darauf geachtet wird, dass genügend monofunktionaler Linker geeigneter 0 Kettenlänge zugesetzt wird (etwa 0.1 bis 10 facher Überschuss), um zwischen den einzelnen Sonden-Oligonukleotiden genügend Freiraum für eine Hybridisierung mit den Target-Oligonukleotid zur Verfügung zu stellen oder
(iii) in Puffer (z.B. 10 - 3δ0 mM Phosphat-Puffer, pH = 7, 1mM EDTA) gelöst mit 5 der Oberfläche in Kontakt gebracht und dort über die reaktive Gruppe des
Sonden-Nukleinsäureoligomers an die - gegebenenfalls entsprechend derivatisierte - Oberfläche angebunden. Anschließend wird die so modifizierte Oberfläche mit dem entsprechenden monofunktionalen Linker in Lösung (z.B. Alkanthiole oder ω-Hydroxy-Alkanthiole in Phosphat-Puffer/EtOH-Mischungen 0 bei Thiol-modifizierten Sondenoligonukleotiden) in Kontakt gebracht, wobei der monofunktionale Linker über seine reaktive Gruppe an die - gegebenenfalls entsprechend derivatisierte - Oberfläche anbindet (vgl. Abschnitt "Bindung der Nukleinsäure-Oligomere an die Oberfläche").
5 Die (Rest-) Fluoreszenz des Fluorophors am Sonden-Oligonukleotid wird durch ein geeignetes Verfahren detektiert, z.B. durch Fluoreszenzmessung mit einem Fluoreszenz- Scanner in Gegenwart verschiedener Salzkonzentrationen (vgl. Beispiel 7). Die Fluoreszenzintensität des einsträngigen Sonden-Oligonukleotids zeigt ein Maximum bei einer Salzkonzentration zwischen 0,0δ und 0,2δ mol/l (siehe Figur 2A). Anschließend wird 0 das gelöste Target zugegeben, potentielle Hybridisierungsereignisse werden unter geeigneten, dem Fachmann bekannten Bedingungen ermöglicht (beliebige, frei wählbare Stringenzbedingungen der Parameter Potential/Temperatur/Salz/chaotrope Salze etc. für die Hybridisierung) und die Messung zur Detektion des Fluorophors bei einer der Salzkonzentration der ersten Detektion entsprechenden Salzkonzentration wiederholt. δ Der Unterschied im Messsignal (Ab- bzw. Zunahme, je nach Salzkonzentration, vgl. Fig. 1) ist proportional zur Anzahl der Hybridisierungsereignisse zwischen Sonden- Nukleinsäureoligomer auf der Oberfläche und passendem Target-Nukleinsäure-Oligomer in der Untersuchungslösung (vgl. Bsp. 8).
Das beschriebene Verfahren kann für eine Targetart (z.B. eine bestimmte Targetoligonukleotid-Art mit bekannter Sequenz) an einer Oberfläche oder - bei Verwendung jeweils verschiedener Sonden-Arten für jedes Test-Site - für mehrere Target- Arten (mehrere verschiedene Target-Oligonukleotid-Arten) angewendet werden. 0
Beispiel 1
Darstellung der aminomodifizierten Oligonukleotide zur Verankerung auf modifizierten 5 Goldoberflächen als Sondenoligonukleotide
Die Synthese der Oligonukleotide erfolgt in einem automatischen Oligonukleotid- Synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA/RNA-Synthesizer) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Syntheseprotokolle für eine 1.0 μmol Synthese. Bei den Synthesen mit dem 0 1-O-Dimethoxytrityl-propyl-disulfid-CPG-Träger (Glen Research 20-2933) werden die Oxidationsschritte mit einer 0.02 M lodlösung durchgeführt, um eine oxidative Spaltung der Disulfidbrücke zu vermeiden. Modifikationen an der 5'-Position der Oligonukleotide erfolgen mit einem auf δ min verlängerten Kopplungsschritt. Der Amino-Modifier C2 dT (Glen Research 10-1037) wird in die Sequenzen mit den jeweiligen Standardprotokoll δ eingebaut. Die Kopplungseffizienzen werden während der Synthese online über die DMT- Kationen-Konzentration photometrisch bzw. konduktometrisch bestimmt.
Die Oligonukleotide werden mit konzentriertem Ammoniak (30%) bei 37 °C 16 h entschützt. Die Reinigung der Oligonukleotide erfolgt mittels RP-HPL Chromatographie 0 nach Standardprotokollen (Laufmittel: 0,1 M Triethylammoniumacetat-Puffer, Acetonitril), die Charakterisierung mittels MALDI-TOF MS. Die aminmodifizierten Oligonukleotide werden an die entsprechend aktivierten Fluorophore (z.B. Fluoresceinisothiocyanat) gemäß dem Fachmann bekannten Bedingungen gekoppelt. Die Kopplung kann sowohl vor als auch nach der Anbindung der Oligonukleotide an die Oberfläche erfolgen. δ Beispiel 2
Darstellung der fluorophormodifizierten Oligonukleotide zur Verankerung auf modifizierten Goldoberflächen als Sondenoligonukleotide δ
Die Synthese der Oligonukleotide erfolgt in einem automatischen Oligonukleotid- Synthesizer (Expedite 8909; ABI 384 DNA/RNA-Synthesizer) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Syntheseprotokolle für eine 1.0 μmol Synthese. Bei den Synthesen mit dem 1-O-Dimethoxytrityl-propyl-disulfid-CPG-Träger (Glen Research 20-2933) werden die 0 Oxidationsschritte mit einer 0.02 M lodlösung durchgeführt, um eine oxidative Spaltung der Disulfidbrücke zu vermeiden. Modifikationen an der δ'-Position der Oligonukleotide erfolgen mit einem auf δ min verlängerten Kopplungsschritt. Die Fluorophore werden am Synthesizer beim letzten Kopplungsschritt als Phosphoramidite (Glen Research 10-1037) in die Sequenzen mit dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut. Die δ Kopplungseffizienzen werden während der Synthese online über die DMT-Kationen- Konzentration photometrisch bzw. konduktometrisch bestimmt.
Beispiel 3 0
Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S(CH2)2-ss-oligo-FP
Die Quench-Oberfläche (hier: Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz δ'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' δ (Modifikation 1 : die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2- S-S-(CH2)2-OH verestert; Modifikation 2: an das δ' Ende ist der Fluorescein-Modifier Fluorescein-Phosphoramidite (Proligo Biochemie GmbH) nach dem jeweiligen Standardprotokoll eingebaut) in δx10"5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,δ molar in Wasser, pH 7) mit Zusatz von ca. 10"5 bis 10"1 molarem Propanthiol (oder anderen Thiolen 0 oder Disulfiden geeigneter Kettenlänge) 0,δ - 24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy-mercaptoethanols kommt. Das in der δ Inkubationslösung gleichzeitig anwesende, freie Propanthiol wird ebenfalls durch Ausbildung einer Au-S Bindung koadsorbiert (Inkubationsschritt). Statt des Einzelstrang- Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.
δ Beispiel 4
Alternative Herstellung der Oligonukleotid-Elektrode Au-S(CH2)2-ss-oligo-FP
Die alternative Herstellung von Au-S(CH2)2-ss-oligo-FP gliedert sich in 2 Teilabschnitte, 0 nämlich der Derivatisierung der Gold-Oberfläche mit dem Sonden-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) und der Nachbelegung der so modifizierten Elektrode mit einem geeigneten bifunktionalen Linker (Nachbelegungsschritt).
Die Quench-Oberfläche (hier: Gold-Plättchen) wird mit doppelt modifiziertem 20 bp δ Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz δ'-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3'
(Modifikation 1 : die Phosphatgruppe des 3' Endes ist mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-
S-S-(CH2)2-OH verestert; Modifikation 2: an das δ' Ende ist Fluorescein-Modifier
Fluorescein-Phosphoramidite (Proligo Biochemie GmbH) nach dem jeweiligen
Standardprotokoll eingebaut) in δx10"5 molarer Pufferlösung (Phosphatpuffer, 0,δ molar in 0 Wasser, pH 7) 0,δ - 24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer
P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der
Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy- mercaptoethanols kommt. Statt des Einzelstrang-Oligonukleotids kann dieser Einzelstrang δ auch mit seinem Komplementärstrang hybridisiert sein.
Anschließend wird die so modifizierte Gold-Oberfläche mit einer ca. 10"5 bis 10~1 molaren Lösung von kurzkettigen Alkanthiolen wie z.B. Propanthiol (in Wasser oder Puffer, pH 7 - 7.δ oder in Ethanol) komplett benetzt und 0,5 - 24 h inkubiert. Das freie Thiol belegt die 0 nach dem Inkubationsschritt verbleibende freie Gold-Oberfläche durch Ausbildung einer Au-S Bindung. Alternativ können auch andere funktionale Thiole oder Disulfide geeigneter Kettenlänge mit den gleichen oder anderen funktionellen Gruppen verwendet werden.
5 Beispiel 5
Fluoreszenz-Intensitätsmessungen am System Au-ss-oligo-Fluorescein bzw. am System Au-ds-oligo-Fluorescein in Gegenwart von flüssigen Medien 5
Die Sonden-Oberfläche wird analog zu Bsp. 4 hergestellt. Dazu wird ein modifiziertes Oligonukleotid der Sequenz δ'-Fluorescein-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' [C3-S- S-C3-OH] auf Gold immobilisiert (δO μmol Oligonukleotid in Phosphat-Puffer (K2HPO4/KH2PO δOO mM, pH 7, Nachbelegung mit Propanthiol 1 mM in Wasser) und in 0 der Form Au-S(CH2)2-ss-oligo-Fluorescein die Fluoreszenzintensität der Oberfläche mit einem Fluoreszenz-Scanner der Firma avision Biotech in Gegenwart von verschiedenen Salzkonzentrationen bestimmt. Zur Messung der Fluoreszenz in Gegenwart von flüssigen Medien werden 1δ0 μl des Mediums auf die Goldoberfläche gegeben und anschließend mit einem Deckglas abgedeckt. Alternativ können auch Hybriwells oder Imaging δ Chambers verwendet werden.
Beispiel 6
0 Modulation des Abstands über die lonenstärke/Salzkonzentration
Die Sonden-Oberfläche wird analog zu Beispiel 4 hergestellt und analog Beispiel 5 vermessen. Durch Variation der Salzkonzentration (NaCl-Konzentration) in einem Bereich zwischen 1x10"4 und 3 Mol/Liter wird die geometrische Anordnung der einsträngigen 5 Sonde moduliert. Die durch die Messung der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Salzkonzentration erhaltenen Werte sind in der Figur 2A dargestellt. Im Konzentrationsbereich zwischen 0,01 und 0,5 Mol/Liter, besonders aber im Bereich zwischen 0,0δ und 0,2δ Mol/Liter ist die Fluoreszenzintensität am höchsten, d. h. der Fluorophor hat den größten Abstand zur Goldoberfläche. 0
Beispiel 7
Fluoreszenzmessung am System Au-ss-oligo/Farbstoff-modifizierte Nukleinsäure- δ Oligomere in Abwesenheit und in Gegenwart von Target-Oligonukleotid (komplementär zu ss-oligo in Au-ss-oligo) Gemäß Bsp. 4 wird eine Sonden-Elektrode hergestellt. Dazu wird ein modifiziertes Oligonukleotid der Sequenz δ'-Fluorescein-AGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' [C3-S- S-C3-OH] auf Gold immobilisiert (60 μmol Oligonukleotid in Phosphat-Puffer δ (K2HPO4/KH2PO4 δOO mM, pH 7). Anschließend werden analog zu Beispiel 6 in Gegenwart von NaCI-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen
Fluoreszenzmessungen mit einem Fluoreszenz-Scanner durchgeführt. Nach Hybridisierung mit komplementären Oligomeren in Phosphat-Puffer (δOO mM, 1 mM EDTA, 1 M NaCI) werden gemäß Beispiel 6 in Gegenwart von NaCI-Lösungen 0 unterschiedlicher Konzentrationen Fluoreszenzmessungen mit einem Fluoreszenz- Scanner durchgeführt. Die durch die Messung der Fluoreszenzintensität für den hybridisierten und den nichthybridisierten Fall in Abhängigkeit von der Salzkonzentration erhaltenen Werte sind in der Figur 2B dargestellt.
δ Im Bereich oberhalb einer Salzkonzentration von 0,5 Mol/Liter ist die Fluoreszenz nach der Hybridsierung deutlich höher als vor der Hybridisierung. Dieses Ergebnis überrascht, da die Fluoreszenz des Einzelstrangs in einem Bereich zwischen 0,05 und 0,25 mol/l Salzkonzentration ein Maximum aufweist. Die deutlichste Differenz der Fluoreszenzintensität vor bzw. nach Hybridisierung zeigt sich jedoch in einem Bereich der 0 Salzkonzentration, in dem die Fluoreszenz des Einzelstrangs deutlich abnimmt (Figur 2B).

Claims

26Patentansprüche
1. Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen δ durch Fluoreszenz-Quenchen umfassend die Schritte
a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Nukleinsaure-Oligomeren besteht und wobei die Nukleinsäure-Oligomere (201) durch Anbindung 0 wenigstens einer Art von Fluorophor (102) modifiziert sind, b) Bereitstellen einer Probe mit Nukleinsaure-Oligomeren, c) Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche, d) Einstellen einer definierten Salzkonzentration in der die modifizierten Nukleinsäure-Oligomere umgebenden Lösung, wobei eine Salzkonzentration δ größer 0,δ mol/l eingestellt wird, e) Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors (102), f) Vergleich der in Schritt e) detektierten Fluoreszenzintensität mit Referenzwerten.
0 2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei nach Schritt a) und vor Schritt c) die Schritte
b3) Einstellen einer definierten Salzkonzentration in der die modifizierten Nukleinsäure-Oligomere umgebenden Lösung, wobei dieselbe Salzkonzentration wie in Schritt d) verwendet wird und δ b4) erste Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors (102)
durchgeführt werden und als Schritt c) der Schritt
0 c) Einstellen von Stringenzbedingungen für die Hybridisierung und
Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche
durchgeführt wird und in Schritt f) die in Schritt e) erhaltenen Werte mit den in Schritt b4) erhaltenen Referenzwerten verglichen werden. δ
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, wobei als Schritt a) der Schritt a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von wenigstens zwei Arten von modifizierten Nukleinsaure- Oligomeren (201) besteht und die verschiedenen Arten von modifizierten 5 Nukleinsaure-Oligomeren (201) in räumlich im wesentlichen abgetrennten
Bereichen an die Oberfläche gebunden sind und wobei die Nukleinsäure- Oligomere (201) durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor modifiziert sind,
0 durchgeführt wird und vor Schritt c) die Schritte
b.) Zusatz von einer Art von Nukleinsäure-Oligomer zu der Probe, wobei die Art von Nukleinsäure-Oligomer ein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante einer in einem bestimmten Bereich T10o an die 5 Oberfläche gebundenen Art von modifiziertem Nukleinsäure-Oligomer (201) ist, wobei das Nukleinsäure-Oligomer in einer Menge zugegeben wird, die größer ist als die Menge an Nukleinsaure-Oligomeren, die notwendig ist, um die modifizierten Nukleinsäure-Oligomere (201) der T100-Sites vollständig zu assoziieren, 0 b3) Einstellen einer definierten Salzkonzentration in der die modifizierten Nukleinsäure-Oligomere umgebenden Lösung, wobei dieselbe Salzkonzentration wie in Schritt d) verwendet wird,
δ b4) erste Detektion der Fluoreszenz des Fluorophors (102) und
durchgeführt werden und als Schritt c) der Schritt
c) Einstellen von Stringenzbedingungen für die Hybridisierung und 0 Inkontaktbringen der Probe mit der modifizierten Oberfläche
durchgeführt wird und in Schritt f) die in Schritt e) erhaltenen Werte mit dem in Schritt b4) für den Bereich T100 erhaltenen Wert und den in Schritt b ) erhaltenen Referenzwerten verglichen werden. δ
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei als Schritt a) der Schritt a) Bereitstellen einer modifizierten Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung von wenigstens drei Arten von modifizierten Nukleinsaure- Oligomeren (201) besteht und die verschiedenen Arten von modifizierten Nukleinsaure-Oligomeren in räumlich im wesentlichen abgetrennten
Bereichen an die Oberfläche gebunden sind, wobei wenigstens eine Art von modifiziertem Nukleinsäure-Oligomer (201) in einem bestimmten Bereich T0 an die Oberfläche angebunden ist, und wobei in der Probe kein Bindungspartner mit hoher Assoziationskonstante zu diesem modifizierten Nukleinsäure-Oligomer enthalten ist und wobei die Nukleinsäure-Oligomere durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor (102) modifiziert sind,
durchgeführt wird und in Schritt f) die in Schritt e) erhaltenen Werte mit dem in Schritt b4) für den Bereich Tι00 erhaltenen Wert, mit dem in Schritt b4) für den Bereich T0 erhaltenen Wert und mit den in Schritt b4) erhaltenen Referenzwerten verglichen werden.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei vor Schritt c) der Schritt
b2) Zusatz von wenigstens einer weiteren Art von Nukleinsäure-Oligomer zu der
Probe, wobei diese Art von Nukleinsäure-Oligomer in der in Schritt b) bereitgestellten Probe nicht enthalten ist und das Nukleinsäure-Oligomer eine Assoziationskonstante >0 zu einer in einem bestimmten Bereich Tn an die Oberfläche gebundenen Art von modifizierten Nukleinsaure-Oligomeren aufweist, wobei das Nukleinsäure-Oligomer in einer Menge zugegeben wird, dass nach Schritt c) n% der modifizierten Nukleinsaure-Oligomeren in dem Bereich Tn in assoziierter Form vorliegen
durchgeführt wird und in Schritt f) die in Schritt e) erhaltenen Werte mit dem in Schritt b4) für den Bereich T100 erhaltenen Wert, mit dem in Schritt b4) für den Bereich T0 erhaltenen Wert, mit den in Schritt b4) für die Bereiche Tn erhaltenen Werten und mit den in Schritt b ) erhaltenen Referenzwerten verglichen werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt d) eine Salzkonzentration zwischen 0,δ und 10 mol/l, insbesondere zwischen 1 und 10 mol/l eingestellt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei in Schritt d) eine Salzkonzentration zwischen 0,δ und 3 mol/l, insbesondere zwischen 2 und 3 mol/l eingestellt wird.
δ 8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die modifizierten Nukleinsäure-Oligomere 3 bis 70 Basen, bevorzugt δ bis 60 Basen, besonders bevorzugt 10 bis δO Basen, insbesondere bevorzugt 12 bis 40 Basen umfassen.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Modifikation der 0 Oberfläche in der Anbindung von ausschließlich Nukleinsaure-Oligomeren besteht.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Oberfläche zusätzlich durch Anbindung eines kurzkettigen Co-Adsorbats modifiziert ist, insbesondere eines Co- Adsorbats der Kettenlänge 1 bis 30, bevorzugt der Kettenlänge 1 bis 20, besonders δ bevorzugt der Kettenlänge 1 bis 10, insbesondere bevorzugt der Kettenlänge 1 bis δ.
11. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 10 umfassend eine modifizierte Oberfläche, wobei die Modifikation in der Anbindung wenigstens einer Art von modifizierten Nukleinsaure-Oligomeren besteht und wobei die 0 Nukleinsäure-Oligomere durch Anbindung wenigstens einer Art von Fluorophor modifiziert sind.
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