DE60208801T2

DE60208801T2 - Nachweisverfahren der nukleinsäurehybridisierung

Info

Publication number: DE60208801T2
Application number: DE60208801T
Authority: DE
Inventors: Jong-Hoon 790-751 Pohang-city HAHN; Postech Found. Dormitory NoKyoung 19-202 790-330 Pohang-city PARK
Original assignee: Posco Co Ltd; Pohang University of Science and Technology Foundation POSTECH
Current assignee: Pohang University of Science and Technology Foundation POSTECH; Posco Holdings Inc
Priority date: 2001-07-25
Filing date: 2002-07-25
Publication date: 2006-08-31
Also published as: ES2253551T3; JP2004537050A; EP1409741A1; DE60208801T8; JP4098715B2; CN1558957A; CN1254550C; ATE316154T1; EP1409741B1; DE60208801D1; WO2003010338A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
(a) Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung von Nukleinsäuren, und insbesondere ein elektrochemisches Verfahren zum Nachweis der Änderung des Ladungszustands von Nukleinsäuren unter Verwendung eines nukleinsäurebindenden Materials, das für einzelsträngige Nukleinsäure oder doppelsträngige Nukleinsäure spezifisch ist.
(b) Beschreibung des Standes der Technik
Der Nachweis der Hybridisierung von Nukleinsäuren ist die auf dem Gebiet der Nukleinsäurechips wichtigste Methode. Das gängige Nachweisverfahren ist ein laserinduziertes fluoreszenzspektroskopisches Verfahren, bei dem Licht nachgewiesen wird, das durch Bestrahlen einer fluoreszenzmarkierten Nukleinsäure mit einem Laser stimuliert wird. Affymetrix und Nanogen bieten DNA-Chips an, die auf Basis des laserinduzierten fluoreszenzspektroskopischen Verfahrens getestet wurden. Dies wirft jedoch mehrere Probleme auf: (a) es ist aufwendig, Nukleinsäure mit fluoreszierenden Molekülen zu markieren; (b) das Verfahren ist komplex; und (c) fluoreszierende Moleküle sind teuer.
In jüngerer Zeit wurden Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung von Nukleinsäuren ohne Fluoreszenz untersucht, und es wurden Verfahren mit Oberflächenplasmonen-Resonanz, Quarzmikrowaage, Massenspektrometrie und Elektrochemie entwickelt.
Mit Ausnahme des elektrochemischen Verfahrens weisen diese Verfahren jedoch immer noch Probleme wie hohe Kosten und arbeitsaufwendige Prozesse auf, während das elektrochemische Verfahren so einfach ist, dass es von jedem auch ohne fachliche Kenntnisse durchgeführt werden kann, und der größte Teil der verwendeten Geräte findet sich zu niedrigen Preisen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein elektrochemisches Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung von Nukleinsäuren bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung von Nukleinsäuren bereitzustellen, das einfach und mit geringen Kosten angewandt werden kann.
Zur Lösung dieser Aufgaben stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung von Nukleinsäuren bereit, das umfasst:

(a) Herstellen einer Oligo-Schicht durch Fixieren einer Capture-Sonde auf der Oberfläche einer Arbeitselektrode;
(b) Hybridisieren der Capture-Sonde mit einer Target-Sonde;
(c) Reagierenlassen eines nukleinsäurebindenden Materials, das für einzelsträngige Nukleinsäure oder doppelsträngige Nukleinsäure spezifisch ist; und
(d) Messen der Änderung des Ladungszustands auf der Oberfläche der Arbeitselektrode mit einem elektrochemischen Verfahren in elektroaktivem Elektrolyten.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt schematisch ein Schema zur Herstellung einer Oligo-Schicht.
2 und 3 zeigen einen Multiarray.
4a zeigt eine Oligo-Schicht mit hybridisierter Nukleinsäure.
4b zeigt die neutralisierende Wirkung für negative Ladungen durch Interkalation auf einer Elektrodenoberfläche.
5a zeigt eine Oxidations/Reduktionsreaktion auf einer Elektrodenoberfläche, wobei die negative Ladung durch Interkalation neutralisiert ist.
5b zeigt die elektrostatische Abstoßung einer negativ geladenen Elektrodenoberfläche gegenüber [Fe(CN)₆)^3–.
6a ist das cyclische Voltammogramm einer Arbeitselektrode vor Interkalation.
6b ist das cyclische Voltammogramm einer Arbeitselektrode, auf der eine einzelsträngige DNA fixiert ist, nach Interkalation.
6c ist das cyclische Voltammogramm einer Arbeitselektrode, auf der ein DNA-Hybrid fixiert ist, nach Interkalation.
7 ist das cyclische Voltammogramm einer Arbeitselektrode nach Interkalation einer Acridinverbindung.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung von Nukleinsäuren, das das Interkalieren eines spezifischen nukleinsäurebindenden Materials in auf der Oberfläche einer Arbeitselektrode fixierte einzelsträngige Nukleinsäure oder doppelsträngige Nukleinsäure und das Messen der Änderung der negativen Ladung der einzelsträngigen Nukleinsäure oder der doppelsträngigen Nukleinsäure umfasst.
Die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung ist DNA oder RNA.
Der Begriff "Hybrid" bezeichnet eine doppelsträngige Nukleinsäure mit komplementärer Bindung.
Das nukleinsäurebindende Material der vorliegenden Erfindung ist eine chemische Verbindung, die kovalent oder nicht-kovalent an eine doppelsträngige Nukleinsäure oder eine einzelsträngige Nukleinsäure gebunden werden kann. Das nukleinsäurebindende Material kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus chemischen Substanzen, die in die Furchen einer DNA-Duplex eingeschoben werden können, chemischen Substanzen, die zwischen gestapelte Basenpaaren interkalieren können, spezifisch einzelsträngige Nukleinsäure bindenden chemischen Substanzen, spezifisch doppelsträngige Nukleinsäure bindenden chemischen Substanzen, und spezifisch an der großen oder kleinen Furche einer DNA-Duplex bindenden chemischen Substanzen. Die nukleinsäurebindenden Materialien sind geladene Moleküle, so dass ihre Bindung an Nukleinsäuren den Ladungszustand der Oberfläche der Arbeitselektrode ändert, und besonders bevorzugt ist das nukleinsäurebindende Material eine chemische Substanz, die eine positive Ladung besitzt und für doppelsträngige Nukleinsäure oder einzelsträngige Nukleinsäure spezifisch ist.
Beispiele für nukleinsäurebindende Materialien sind Interkalatoren, interkalierende Fluoreszenzfarbstoffe, Acridinverbindungen, Chloroquin, Chinin, Novanatron, Doxorubicin, einzelstrangbindende Proteine und Rec A-Protein.
Der Interkalator ist für doppelsträngige Nukleinsäure spezifisch und umfasst interkalierende Fluoreszenzfarbstoffe, Acridinverbindungen, Chloroquin, Chinin, Novanatron und Doxorubicin.
Der interkalierende Fluoreszenzfarbstoff kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus:
1,1'-[1,3-Propandiylbis[(dimethyliminio)-3,1-propandiyl]]bis[4-[(3-methyl-2(3H)-benzoxazolyliden)methyl]]-,tetradiodid (YOYO-1),
1,1'-[1,3-Propandiylbis[(dimethyliminio)-3,1-propandiyl]]bis[4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzoxazolyliden)-1-propenyl]]-,tetradiodid (YOYO-3),
4-[(3-Methyl-2(3H)-benzoxazolyliden)methyl]-1-[3-(trimethylammonio)propyl]-,diiodid (YO-PRO-1),
4-[3-(3-Methyl-2(3H)-benzoxazolyliden)-1-propenyl]-1-[3-(trimethylammonio)-propyl]-,diiodid (YO-PRO-3),
2,2'-[1,3-Propandiylbis[(dimethyliminio)-3,1-propandiyl-1(4H)-pyridinyl-4-ylidenmethylidin]]bis[3-methyl]-,tetradiodid (POPOTM-1),
2,2'-[1,3-Propandiylbis[(dimethyliminio)-3,1-propandiyl-1(4H)-pyridinyl-4-yliden-1-propen-1-yl-3-yliden]]bis[3-methyl]-,tetradiodid (POPOTM-3),
EtBr (3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenylbromid),
3-Methyl-2-[[1-[3-(trimethylammonio)propyl]-4(1H)-pyridinyliden]methyl]-,diiodid (PO-PRO^TM-1),
3-Methyl-2-[3-[1-[3-(trimethylammonio)propyl]-4(1H)-pyridinyliden]-1-propenyl]-,diiodid (PO-PRO^TM-3), und
SYBR-Grün (Molekularsonden).
Die Acridinverbindung kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus 3,6-Diaminoacridin, 3,6-Diamino-10-methylacridiniumchlorid, Acridinorange und Acridingelb.
Ein bevorzugtes Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Nachweis der Hybridisierung von Nukleinsäuren umfasst (a) Herstellen einer Oligo-Schicht durch Fixieren von Capture-Sonden auf der Oberfläche einer Arbeitselektrode, (b) Hybridisieren der Capture-Sonden mit Target-Sonden, (c) Reagierenlassen eines für einzelsträngige Nukleinsäure oder doppelsträngige Nukleinsäure spezifischen nukleinsäurebindenden Materials, und (d) Messen einer Änderung des Ladungszustands auf der Oberfläche der Arbeitselektrode mit einem elektrochemischen Verfahren in elektroaktivem Elektrolyten.
Das Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung von Nukleinsäuren umfasst ferner vor Schritt (c) einen Schritt des Reagierenlassens der Oligo-Schicht mit einem Tensid. Das Tensid kann als Flüssigkeit eingesetzt werden, gelöst im gleichen Puffer, der für die Interkalationslösung verwendet wird. Die Konzentration des Tensids unterliegt keiner Einschränkung, beträgt aber vorzugsweise etwa 10 mM. Das verwendete Tensid kann ein übliches Tensid ein, beispielsweise Natriumdodecylsulfat oder Triton-X.
Die Oligo-Olatte wird unter Bezug auf das Beispiel der 1 ausführlicher erläutert. Die Oligo-Schicht kann hergestellt werden, indem man Capture-Sonden (➁) auf der Oberfläche der Arbeitselektrode (➀) fixiert, oder durch chemische Bindung zwischen der Elektrodenoberfläche und einer Thiolgruppe (➂) oder Aminogruppe, die an den 5'- oder 3'-Terminus der Capture-Sonden gebunden sind. Um außerdem einen direkten Kontakt zwischen der Capture-Sonde und der Oberfläche der Arbeitselektrode zu verhindern, wird dazwischen noch ein Kohlenwasserstofflinker (➃) eingebaut. Die Anzahl der Kohlenstoffe des Kohlenwasserstofflinkers unterliegt keiner Einschränkung, beträgt aber vorzugsweise 6 bis 12.
Die Capture-Sonde und die Target-Sonde sind DNA oder RNA, und die Arbeitselektrode ist ein leitfähiges Metall, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gold, Platin, Silber, Kohle, Kupfer, Nickel, Chrom und Palladium. Die Arbeitselektrode kann ein dünner Film oder ein Stab sein, und sie kann durch elektrochemisches Beschichten einer für einen Biochip üblichen Matrix mit dem Metall hergestellt werden.
Auf der Arbeitselektrode der vorliegenden Erfindung kann pro Elektrode eine Capture-Sonde fixiert sein. Zur Fixierung mehrerer Capture-Sonden kann daher ein Multiarray (2 und 3) mit mehreren Schichten hergestellt werden. Der Multiarray kann in regelmäßigen Abständen Hilfselektroden (➄) aufweisen. Die Hilfselektrode ist auch als Gegenelektrode bekannt und ist eine Blindelektrode ohne daran fixierte Capture-Sonde, und als Matrix kann Gold oder Platin verwendet werden. Die Hilfselektrode verhindert einen Spannungsabfall zwischen der Referenzelektrode und der Arbeitselektrode während einer chemischen Reaktion, und sie dient dazu, an der Arbeitselektrode für eine genaue und konstante Spannung zu sorgen. Die Referenzelektrode liefert einen Standard, um die Größe der Spannung steuern zu können, und besteht üblicherweise aus Silber/Silberchlorid (Ag/AgCl), das durch Dotieren von Silber mit AgCl hergestellt wird. Die Referenzelektrode kann sich an anderen Stellen in der Lösung befinden. Die Referenzelektrode hält ungeachtet dessen, dass eine Elektroreaktion abläuft, eine konstante Spannung aufrecht.
Bei der Hybridisierung von Schritt (b) des Verfahrens zum Nachweis der Hybridisierung von Nukleinsäuren führt eine zu einer Target-Sonde komplementäre Capture-Sonde zu einem Nukleinsäurehybrid, wenn man die Target-Sonde mit einer Capture-Sonde, die auf der Oberfläche der Arbeitselektrode fixiert ist, reagieren lässt (4a), eine nicht-komplementäre Capture-Sonde bindet jedoch nicht an die Target-Sonde, so dass diese eine einzelsträngige Nukleinsäure bleibt.
Die Hybridisierungsreaktion kann entsprechend der Art der Sonde, ihrer Größe usw. erfolgen, und besonders bevorzugt wird die Hybridisierungsreaktion nach einem gängigen Protokoll durchgeführt. Um das Nukleinsäurehybrid aus der Capture-Sonde und der Target-Sonde zu stabilisieren, kann ein Puffer verwendet werden, der Natriumchlorid enthält. Nach der Hybridisierung werden restliche unspezifisch bindende Target-Sonde und Target-Sonde abgetrennt.
Bei der Reaktion von Schritt (c) reagiert ein für einzelsträngige Nukleinsäure spezifisches oder für doppelsträngige Nukleinsäure spezifisches nukleinsäurebindendes Material mit der Capture-Sonde oder dem Nukleinsäurehybrid auf der Oberfläche der Arbeitselektrode. Daher wird das positiv geladene nukleinsäurebindende Material spezifisch an das Nukleinsäurehybrid oder die einzelsträngige Nukleinsäure gebunden und vermindert so die negativen Ladungen (4b).
Währenddessen werden Tenside, Wärme, Spannung oder Schallwellen angewandt, um die unspezifische Bindung nach Schritt (c) zu minimieren. Wenn beispielsweise ein für doppelsträngige Nukleinsäure spezifischer Interkalator zwischen gestapelte Basenpaare eingeschoben wird, neigt dieser auch dazu, mit einzelsträngiger Nukleinsäure ionische Wechselwirkungen einzugehen. Diese unspezifische Bindung lässt sich durch Zufuhr von Tensiden, Wärme, Schallwellen oder Spannung zu der Elektrodenoberfläche beseitigen. Die Temperatur beim Erhitzen beträgt vorzugsweise 65 bis 95°C, die Behandlung mit Schallwellen kann nach gängigen Verfahren oder durch Beschallung erfolgen, und es kann eine Spannung an der Elektrode angelegt werden.
In Schritt (d) wird die Oligo-Schicht in einen Elektrolyten eingetaucht, um mit einem elektrochemischen Verfahren eine Änderung des Ladungszustands auf der Oberfläche der Arbeitselektrode zu messen. Wenn dann eine negative Ladung der auf der Elektrodenoberfläche vorliegenden Nukleotide durch nukleinsäurebindendes Material verringert oder neutralisiert wird, kann ein negativ geladener Elektrolyt in die Nähe der Elektrodenoberfläche gelangen, so dass die Oberflächenkonzentration an negativ geladenem Elektrolyt zunimmt und eine Oxidation/Reduktion erfolgt. Wenn die negative Ladung der Nukleotide jedoch nicht verringert oder neutralisiert wurde, wird der negativ geladene Elektrolyt durch elektrostatische Abstoßung von der Elektrodenoberfläche abgestoßen und es erfolgt keine Oxidation/Reduktion (5b).
Der Elektrolyt ist eine negative Verbindung, und vorzugsweise handelt es sich um eine Lösung, die [Fe(CN)₆]^3– enthält. Ein Beispiel für einen Elektrolyten ist ein Puffer, der 50 mM NaCl, 10 mM Phosphat (pH 7,0) und 3 mM K₃Fe(CN)₆ enthält.
Beispiele für das elektrochemische Verfahren sind cyclische Voltammetrie, Amperometrie oder Chronocoulometrie. Cyclische Voltammetrie ist eine elektrochemische Methode zur Untersuchung der Potentialänderung an einer Elektrode und beinhaltet einen Potentialdurchlauf mit anschließendem Rücklauf durch die gerade abgedeckte Potentialregion, was eine Dreieckswellenform liefert. Amperometrie verwendet Methoden, die die Messung elektrischer Ströme beinhalten, und Chronocoulometrie ist eine Elektroanalyse, die durch Messen der Geschwindigkeit der Änderung des Stroms mit der Zeit an einer Arbeitselektrode erfolgt.
Wenn beispielsweise eine Stromänderung an einer Arbeitselektrode durch cyclische Voltammetrie gemessen wird, ergibt sich an einer Arbeitselektrode vor der Interkalation ein cyclisches Voltammogramm wie in 6a, an einer Arbeitselektrode, auf der ein nicht-interkalierter DNA-Strang fixiert ist, ergibt sich nach Interkalation ein cyclisches Voltammogramm wie in 6b, und an einer Arbeitselektrode, auf der ein interkalierter DNA-Strang fixiert ist, ergibt sich ein cylisches Voltammogramm wie in 6c. Bei einer interkalierten Capture-Sonde ist die negative Ladung an der Elektrodenoberfläche nämlich neutralisiert oder verringert, so dass sich der negativ geladene Elektrolyt leicht der Elektrodenoberfläche annähern kann und leicht eine Reduktion/Oxidation erfolgt.
Wenn man also ein cyclisches Voltammogramm wie in 6b erhält, wenn man einen für doppelsträngige Nukleinsäure spezifischen Interkalator mit einer Capture-Sonde reagieren lässt, bedeutet dies, dass die Capture-Sonde zur Target-Sonde nicht komplementär ist. Wenn man aber ein cyclisches Voltammogramm wie in 6c erhält, bedeutet dies, dass die Capture-Sonde zur Target-Sonde komplementär ist.
Wie oben erwähnt, stellt das Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Nachweis der Hybridisierung von Nukleinsäuren ein elektrochemisches Verfahren zum Nachweisen der Hybridisierung von Nukleinsäure bereit, und diese Methode kann mit geringen Kosten und einem einfachen Verfahren bei DNA-Chips oder Biochips verwedet werden.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern. Diese Beispiele dienen jedoch lediglich dem besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung und schränken deren Umfang nicht ein.
BEISPIEL 1. HERSTELLUNG EINER OLIGO-SCHICHT
Als Arbeitselektrode wurde ein Goldstab verwendet.
Der Goldstab wurde zuerst mit Sandpapier Nr. 1500 und 2000 poliert und anschließend nacheinander mit Aluminiumoxidpasten mit 5 μm, 1 μm und 0,05 μm Teilchendurchmesser poliert und dann 5 min in deionisiertem Wasser schallbehandelt.
Die Elektrodenoberfläche wurde in einer gesättigten Kaliumhydroxidlösung 1 Stunde lang gekocht, 24 Stunden in Schwefelsäure getaucht und gründlich mit deionisiertem Wasser gewaschen. Anstatt in Schwefelsäure zu tauchen, kann die Elektrodenoberfläche 3–4 Stunden in Piranhalösung getaucht werden.
Oligonukleotide für die Capture-Sonden mit einer an den 5'-Terminus gebundenen Thiolgruppe wurden von Sigma-Aldrich gekauft, wobei deren Sequenz in SEQ ID NO: 1 angegeben ist.
10 ng/ml der Capture-Sonde wurden in destilliertem Wasser oder einer 10 mM Phosphatlösung (pH 7,0) mit 50 mM NaCl gelöst. Die Mischung wurde auf die Oberfläche der Goldelektrode getröpfelt, und dann wurde mehr als 8 Stunden inkubiert und anschließend mit destilliertem Wasser gespült. Dann wurde die Goldelektrode in eine 10 mM Phosphatlösung (pH 7,0) mit 50 mM NaCl getaucht, und nach 24 Stunden wurde mit der gleichen Lösung gewaschen und so die Oligo-Schicht hergestellt.
BEISPIEL 2. HYBRIDISIERUNG
Zu einer Capture-Sonde komplementäre Oligonukleotide wurden als Target-Sonde verwendet, und die Target-Sonde besaß die in SEQ ID NO: 2 angegebene Sequenz.
Zur Herstellung der Lösung der Target-Sonde wurden 10 μg/ml Target-Sonde zu einem Puffer (1 × TE, 400 mM NaCl, pH 7,0) gegeben. Die in BEISPIEL 1 hergestellte Oligo-Schicht wurde 15 Stunden bei 45°C in die Lösung der Target-Sonde getaucht. Nach Senken der Temperatur wurde die Oligo-Schicht mit einem 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) mit 50 mM NaCl gewaschen, und nachdem die Oligo-Schicht in 1 × TBE (pH 7,0) mit 7 mM SDS oder in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) mit 50 mM NaCl und 7 mM SDS getränkt worden war, wurde sie mit 1 × TBE (pH 7,0) gewaschen.
Die Oligo-Schicht wurde 10 min in 1 × TBE (pH 7,0) mit 10^–7 M SYBR-Grün getränktt und mit 10 mM Phosphat (pH 7,0) mit 50 mM NaCl gewaschen.
BEISPIEL 3.
Zu einer Capture-Sonde nicht-komplementäre Oligonukleotide wurden als Target-Sonde verwendet, und die Target-Sonde besaß die in SEQ ID NO: 3 angebene Sequenz. Die Target-Sonde der SEQ ID NO: 3 wurde mit der Oligo-Schicht von BEISPIEL 1 wie in Beispiel 2 beschrieben reagieren gelassen.
BEISPIEL 4.
Cyclische Voltammetrie erfolgte bei Raumtemperatur an den Elektroden von BEISPIEL 2 und BEISPIEL 3 mit einem EG & G Potentiostat/Galvanostat Model 273A (Princeton Applied Research). Zur Messung mittels cyclischer Voltammetrie wurden eine Ag/AgCl [3 M NaCl]-Referenzelektrode (BAS) und Platindraht-Hilfselektroden verwendet, und als Pufferlösung wurde eine [Fe(CN)₆]^3–-Lösung mit 50 mM NaCl, 10 mM Phosphat (pH 7,0) und 3 mM K₃Fe(CN)₆) verwendet. Der Abtastbereich für die Spannung war 0,6 V~–0,5 V (gegen eine Ag/AgCl-Referenzelektrode), und die Abtastgeschwindigkeit betrug 100 mV/sec. Sauerstoff wurde aus der [Fe(CN)₆]^3–-Lösung eliminiert, indem 5 Minuten vor dem Versuch Stickstoff durchgeleitet wurde.
6a–6c zeigen cyclische Voltammogramme, wobei 6a das cyclische Voltammogramm einer blanken Goldelektrode ist, 6b das cyclische Voltammogramm der Elektrode von BEISPIEL 3 ist und 6c das cyclische Voltammogramm der Elektrode von BEISPIEL 2 ist.
In 6a–6c ist gezeigt, dass die Capture-Sonde mit der Target-Sonde von BEISPIEL 2 hybridisiert, die Capture-Sonde aber nicht mit der nicht-komplementären Target-Sonde von BEISPIEL 3 hybridisieren konnte und die Capture-Sonde eine einzelsträngige DNA blieb. Diese Ergebnisse sind wie vorhergesagt.
BEISPIEL 5.
HYBRIDISIERUNGSNACHWEIS DURCH EINE ACRIDINVERBINDUNG
Eine Oligo-Schicht wurde wie in BEISPIEL 1 beschrieben präpariert und die Hybridisierungsreaktion durchgeführt. Die Oligo-Schicht wurde 10 min in einen Puffer getaucht, der 0,5~5 mM SDS, 50 mM NaCl und 10 mM Phosphat (pH 7,0) enthielt. Nach Waschen mit 50 mM NaCl und 10 mM Phosphat (pH 7,0) wurde die Oligo-Schicht 10 min in 1 mg/ml 3,6-Diaminoacridin, 50 mM NaCl und 10 mM Phosphat (pH 7,0) getaucht, und als sie sauber war, erfolgte die Messung mit cyclischer Voltammetrie.
7 ist ein cyclisches Voltammogramm einer Arbeitselektrode nach Interkalation mit einer Acridinverbindung. Im Falle einer Arbeitselektrode, auf der eine Capture-Sonde fixiert war, die ein DNA-Hybrid bildete, wurde ein wie in ➀ beschriebenes Voltammogramm gemessen, und bei einer Arbeitselektrode, auf der nur eine einzelsträngige DNA fixiert war, wurde ein wie in ❸ beschriebenes cyclisches Voltammogramm gemessen.
Sequenzprotokoll

Claims

Elektrochemisches Verfahren zum Nachweisen von Hybridisierung zwischen einer auf einer Elektrodenoberfläche fixierten Nukleinsäure (Capture-Sonde) und einer hierzu komplementären Nukleinsäure, die aus einer Probe stammt, indem man eine doppelsträngige Nukleinsäure oder eine einzelsträngige Nukleinsäure mit einem nukleinsäurebindenden Material elektrisch neutralisiert, wobei das Nachweisverfahren umfasst: (a) Fixieren der Capture-Sonde auf einer Elektrodenoberfläche, um eine Nukleinsäureschicht zu erhalten; (b) In-Kontakt-Bringen der auf der Elektrodenoberfläche fixierten Capture-Sonde mit der aus der Probe stammenden Nukleinsäure, um eine Hybridisierung zu induzieren; (c) Reagierenlassen einer hybridisierten oder nicht-hybridisierten Capture-Sonde, gleichzeitig oder nacheinander, mit einem Tensid und einem nukleinsäurebindenden Material, wobei das nukleinsäurebindende Material eine positive Ladung hat, um Ladungsmenge oder Ladungszustand der hybridisierten oder nicht-hybridisierten Capture-Sonde durch Binden daran zu ändern; und (d) Monitoring eines elektrischen Stroms oder einer elektrischen Ladungsmenge der Elektrodenoberfläche in elektroaktiver Elektrolytlösung, um festzustellen, ob die Capture-Sonde hybridisiert ist oder nicht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure DNA oder RNA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Capture-Sonde mit einer Thiolgruppe am Terminus der Capture-Sonde auf der Elektrodenoberfläche fixiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Capture-Sonde mit einer Aminogruppe am Terminus der Capture-Sonde auf der Elektrodenoberfläche fixiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Elektrode aus einem Material hergestellt ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gold, Platin, Silber, Kohle, Kupfer, Nickel, Chrom und Palladium.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das nukleinsäurebindende Material ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Interkalator, einem interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff, einer Acridinverbindung, Chloroquin, Chinin, Novanatron, Doxorubicin, einem einzelsträngige DNA bindenden Protein und Rec A-Protein.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der interkalierende Fluoreszenzfarbstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 1,1'-[1,3-Propandiylbis[(dimethyliminio)-3,1-propandiyl]]bis[4-[(3-methyl-2(3H)-benzoxazolyliden)methyl]]-,tetradiodid, 1,1'-[1,3-Propandiylbis[(dimethyliminio)-3,1-propandiyl]]bis[4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzoxazolyliden)-1-propenyl]]-,tetradiodid, 4-[(3-Methyl-2(3H)-benzoxazolyliden)methyl]-1-[3-(trimethylammonio)propyl]-,diiodid, 4-[3-(3-Methyl-2(3H)-benzoxazolyliden)-1-propenyl]-1-[3-(trimethylammonio)propyl]-,diiodid, 2,2'-[1,3-Propandiylbis[(dimethyliminio)-3,1-propandiyl-1(4H)-pyridinyl-4-ylidenmethylidin]]bis[3-methyl]-,tetradiodid, 2,2'-[1,3-Propandiylbis[(dimethyliminio)-3,1-propandiyl-1(4H)-pyridinyl-4-yliden-1-propen-1-yl-3-yliden]]bis[3-methyl]-,tetradiodid, EtBr (3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenylbromid), 3-Methyl-2-[[1-[3-(trimethylammonio)propyl]-4(1H)-pyridinyliden]methyl]-,diiodid, 3-Methyl-2-[3-[1-[3-(trimethylammonio)propyl]-4(1H)-pyridinyliden]-1-propenyl]-,diiodid, und SYBR-Grün.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Acridinverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3,6-Diaminoacridin, 3,6-Diamino-10-methylacridiniumchlorid, Acridinorange und Acridingelb.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Tensid Natriumdodecylsulfat oder Triton-X ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Nachweisverfahren nach Schritt (c) ferner den Schritt des Zuführens von Wärme, Spannung oder Schallwellen auf die Nukleinsäureschicht umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das elektrochemische Verfahren cyclische Voltammetrie, Amperometrie oder Chronocoulometrie ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Capture-Sonde durch chemische Bindung auf der Elektrodenoberfläche fixiert wird.