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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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(a) Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung
von Nukleinsäuren, und
insbesondere ein elektrochemisches Verfahren zum Nachweis der Änderung
des Ladungszustands von Nukleinsäuren
unter Verwendung eines nukleinsäurebindenden
Materials, das für
einzelsträngige
Nukleinsäure
oder doppelsträngige
Nukleinsäure
spezifisch ist.
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(b) Beschreibung des Standes
der Technik
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Der
Nachweis der Hybridisierung von Nukleinsäuren ist die auf dem Gebiet
der Nukleinsäurechips wichtigste
Methode. Das gängige
Nachweisverfahren ist ein laserinduziertes fluoreszenzspektroskopisches Verfahren,
bei dem Licht nachgewiesen wird, das durch Bestrahlen einer fluoreszenzmarkierten
Nukleinsäure mit
einem Laser stimuliert wird. Affymetrix und Nanogen bieten DNA-Chips
an, die auf Basis des laserinduzierten fluoreszenzspektroskopischen
Verfahrens getestet wurden. Dies wirft jedoch mehrere Probleme auf:
(a) es ist aufwendig, Nukleinsäure
mit fluoreszierenden Molekülen
zu markieren; (b) das Verfahren ist komplex; und (c) fluoreszierende
Moleküle
sind teuer.
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In
jüngerer
Zeit wurden Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung von Nukleinsäuren ohne
Fluoreszenz untersucht, und es wurden Verfahren mit Oberflächenplasmonen-Resonanz,
Quarzmikrowaage, Massenspektrometrie und Elektrochemie entwickelt.
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Mit
Ausnahme des elektrochemischen Verfahrens weisen diese Verfahren
jedoch immer noch Probleme wie hohe Kosten und arbeitsaufwendige
Prozesse auf, während
das elektrochemische Verfahren so einfach ist, dass es von jedem
auch ohne fachliche Kenntnisse durchgeführt werden kann, und der größte Teil
der verwendeten Geräte
findet sich zu niedrigen Preisen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein elektrochemisches
Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung von Nukleinsäuren bereitzustellen.
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Eine
weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren
zum Nachweis der Hybridisierung von Nukleinsäuren bereitzustellen, das einfach
und mit geringen Kosten angewandt werden kann.
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Zur
Lösung
dieser Aufgaben stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis
der Hybridisierung von Nukleinsäuren
bereit, das umfasst:
- (a) Herstellen einer Oligo-Schicht
durch Fixieren einer Capture-Sonde auf der Oberfläche einer
Arbeitselektrode;
- (b) Hybridisieren der Capture-Sonde mit einer Target-Sonde;
- (c) Reagierenlassen eines nukleinsäurebindenden Materials, das
für einzelsträngige Nukleinsäure oder doppelsträngige Nukleinsäure spezifisch
ist; und
- (d) Messen der Änderung
des Ladungszustands auf der Oberfläche der Arbeitselektrode mit
einem elektrochemischen Verfahren in elektroaktivem Elektrolyten.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
schematisch ein Schema zur Herstellung einer Oligo-Schicht.
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2 und 3 zeigen
einen Multiarray.
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4a zeigt
eine Oligo-Schicht mit hybridisierter Nukleinsäure.
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4b zeigt
die neutralisierende Wirkung für
negative Ladungen durch Interkalation auf einer Elektrodenoberfläche.
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5a zeigt
eine Oxidations/Reduktionsreaktion auf einer Elektrodenoberfläche, wobei
die negative Ladung durch Interkalation neutralisiert ist.
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5b zeigt
die elektrostatische Abstoßung
einer negativ geladenen Elektrodenoberfläche gegenüber [Fe(CN)6)3–.
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6a ist
das cyclische Voltammogramm einer Arbeitselektrode vor Interkalation.
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6b ist
das cyclische Voltammogramm einer Arbeitselektrode, auf der eine
einzelsträngige
DNA fixiert ist, nach Interkalation.
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6c ist
das cyclische Voltammogramm einer Arbeitselektrode, auf der ein
DNA-Hybrid fixiert ist, nach Interkalation.
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7 ist
das cyclische Voltammogramm einer Arbeitselektrode nach Interkalation
einer Acridinverbindung.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung
von Nukleinsäuren, das
das Interkalieren eines spezifischen nukleinsäurebindenden Materials in auf
der Oberfläche
einer Arbeitselektrode fixierte einzelsträngige Nukleinsäure oder
doppelsträngige
Nukleinsäure
und das Messen der Änderung
der negativen Ladung der einzelsträngigen Nukleinsäure oder
der doppelsträngigen
Nukleinsäure
umfasst.
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Die
Nukleinsäure
der vorliegenden Erfindung ist DNA oder RNA.
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Der
Begriff "Hybrid" bezeichnet eine
doppelsträngige
Nukleinsäure
mit komplementärer
Bindung.
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Das
nukleinsäurebindende
Material der vorliegenden Erfindung ist eine chemische Verbindung,
die kovalent oder nicht-kovalent an eine doppelsträngige Nukleinsäure oder
eine einzelsträngige
Nukleinsäure
gebunden werden kann. Das nukleinsäurebindende Material kann ausgewählt sein
aus der Gruppe bestehend aus chemischen Substanzen, die in die Furchen
einer DNA-Duplex eingeschoben werden können, chemischen Substanzen,
die zwischen gestapelte Basenpaaren interkalieren können, spezifisch
einzelsträngige
Nukleinsäure
bindenden chemischen Substanzen, spezifisch doppelsträngige Nukleinsäure bindenden
chemischen Substanzen, und spezifisch an der großen oder kleinen Furche einer
DNA-Duplex bindenden chemischen Substanzen. Die nukleinsäurebindenden
Materialien sind geladene Moleküle,
so dass ihre Bindung an Nukleinsäuren
den Ladungszustand der Oberfläche
der Arbeitselektrode ändert,
und besonders bevorzugt ist das nukleinsäurebindende Material eine chemische
Substanz, die eine positive Ladung besitzt und für doppelsträngige Nukleinsäure oder
einzelsträngige
Nukleinsäure
spezifisch ist.
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Beispiele
für nukleinsäurebindende
Materialien sind Interkalatoren, interkalierende Fluoreszenzfarbstoffe,
Acridinverbindungen, Chloroquin, Chinin, Novanatron, Doxorubicin,
einzelstrangbindende Proteine und Rec A-Protein.
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Der
Interkalator ist für
doppelsträngige
Nukleinsäure
spezifisch und umfasst interkalierende Fluoreszenzfarbstoffe, Acridinverbindungen,
Chloroquin, Chinin, Novanatron und Doxorubicin.
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Der
interkalierende Fluoreszenzfarbstoff kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend
aus:
1,1'-[1,3-Propandiylbis[(dimethyliminio)-3,1-propandiyl]]bis[4-[(3-methyl-2(3H)-benzoxazolyliden)methyl]]-,tetradiodid
(YOYO-1),
1,1'-[1,3-Propandiylbis[(dimethyliminio)-3,1-propandiyl]]bis[4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzoxazolyliden)-1-propenyl]]-,tetradiodid
(YOYO-3),
4-[(3-Methyl-2(3H)-benzoxazolyliden)methyl]-1-[3-(trimethylammonio)propyl]-,diiodid
(YO-PRO-1),
4-[3-(3-Methyl-2(3H)-benzoxazolyliden)-1-propenyl]-1-[3-(trimethylammonio)-propyl]-,diiodid
(YO-PRO-3),
2,2'-[1,3-Propandiylbis[(dimethyliminio)-3,1-propandiyl-1(4H)-pyridinyl-4-ylidenmethylidin]]bis[3-methyl]-,tetradiodid
(POPOTM-1),
2,2'-[1,3-Propandiylbis[(dimethyliminio)-3,1-propandiyl-1(4H)-pyridinyl-4-yliden-1-propen-1-yl-3-yliden]]bis[3-methyl]-,tetradiodid
(POPOTM-3),
EtBr (3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenylbromid),
3-Methyl-2-[[1-[3-(trimethylammonio)propyl]-4(1H)-pyridinyliden]methyl]-,diiodid
(PO-PROTM-1),
3-Methyl-2-[3-[1-[3-(trimethylammonio)propyl]-4(1H)-pyridinyliden]-1-propenyl]-,diiodid
(PO-PROTM-3), und
SYBR-Grün (Molekularsonden).
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Die
Acridinverbindung kann ausgewählt
werden aus der Gruppe bestehend aus 3,6-Diaminoacridin, 3,6-Diamino-10-methylacridiniumchlorid,
Acridinorange und Acridingelb.
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Ein
bevorzugtes Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Nachweis der
Hybridisierung von Nukleinsäuren
umfasst (a) Herstellen einer Oligo-Schicht durch Fixieren von Capture-Sonden
auf der Oberfläche
einer Arbeitselektrode, (b) Hybridisieren der Capture-Sonden mit
Target-Sonden, (c) Reagierenlassen eines für einzelsträngige Nukleinsäure oder
doppelsträngige
Nukleinsäure
spezifischen nukleinsäurebindenden
Materials, und (d) Messen einer Änderung
des Ladungszustands auf der Oberfläche der Arbeitselektrode mit
einem elektrochemischen Verfahren in elektroaktivem Elektrolyten.
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Das
Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung von Nukleinsäuren umfasst
ferner vor Schritt (c) einen Schritt des Reagierenlassens der Oligo-Schicht
mit einem Tensid. Das Tensid kann als Flüssigkeit eingesetzt werden,
gelöst
im gleichen Puffer, der für
die Interkalationslösung
verwendet wird. Die Konzentration des Tensids unterliegt keiner
Einschränkung,
beträgt
aber vorzugsweise etwa 10 mM. Das verwendete Tensid kann ein übliches
Tensid ein, beispielsweise Natriumdodecylsulfat oder Triton-X.
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Die
Oligo-Olatte wird unter Bezug auf das Beispiel der 1 ausführlicher
erläutert.
Die Oligo-Schicht kann hergestellt werden, indem man Capture-Sonden (➁)
auf der Oberfläche
der Arbeitselektrode (➀) fixiert, oder durch chemische
Bindung zwischen der Elektrodenoberfläche und einer Thiolgruppe (➂)
oder Aminogruppe, die an den 5'-
oder 3'-Terminus
der Capture-Sonden gebunden sind. Um außerdem einen direkten Kontakt
zwischen der Capture-Sonde und der Oberfläche der Arbeitselektrode zu
verhindern, wird dazwischen noch ein Kohlenwasserstofflinker (➃)
eingebaut. Die Anzahl der Kohlenstoffe des Kohlenwasserstofflinkers
unterliegt keiner Einschränkung,
beträgt
aber vorzugsweise 6 bis 12.
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Die
Capture-Sonde und die Target-Sonde sind DNA oder RNA, und die Arbeitselektrode
ist ein leitfähiges
Metall, das ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Gold, Platin, Silber, Kohle, Kupfer,
Nickel, Chrom und Palladium. Die Arbeitselektrode kann ein dünner Film
oder ein Stab sein, und sie kann durch elektrochemisches Beschichten
einer für
einen Biochip üblichen
Matrix mit dem Metall hergestellt werden.
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Auf
der Arbeitselektrode der vorliegenden Erfindung kann pro Elektrode
eine Capture-Sonde fixiert sein. Zur Fixierung mehrerer Capture-Sonden
kann daher ein Multiarray (2 und 3)
mit mehreren Schichten hergestellt werden. Der Multiarray kann in
regelmäßigen Abständen Hilfselektroden
(➄) aufweisen. Die Hilfselektrode ist auch als Gegenelektrode
bekannt und ist eine Blindelektrode ohne daran fixierte Capture-Sonde,
und als Matrix kann Gold oder Platin verwendet werden. Die Hilfselektrode
verhindert einen Spannungsabfall zwischen der Referenzelektrode
und der Arbeitselektrode während
einer chemischen Reaktion, und sie dient dazu, an der Arbeitselektrode
für eine
genaue und konstante Spannung zu sorgen. Die Referenzelektrode liefert
einen Standard, um die Größe der Spannung
steuern zu können,
und besteht üblicherweise aus
Silber/Silberchlorid (Ag/AgCl), das durch Dotieren von Silber mit
AgCl hergestellt wird. Die Referenzelektrode kann sich an anderen
Stellen in der Lösung
befinden. Die Referenzelektrode hält ungeachtet dessen, dass
eine Elektroreaktion abläuft,
eine konstante Spannung aufrecht.
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Bei
der Hybridisierung von Schritt (b) des Verfahrens zum Nachweis der
Hybridisierung von Nukleinsäuren
führt eine
zu einer Target-Sonde komplementäre
Capture-Sonde zu einem Nukleinsäurehybrid,
wenn man die Target-Sonde mit einer Capture-Sonde, die auf der Oberfläche der
Arbeitselektrode fixiert ist, reagieren lässt (4a), eine
nicht-komplementäre
Capture-Sonde bindet jedoch nicht an die Target-Sonde, so dass diese
eine einzelsträngige
Nukleinsäure
bleibt.
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Die
Hybridisierungsreaktion kann entsprechend der Art der Sonde, ihrer
Größe usw.
erfolgen, und besonders bevorzugt wird die Hybridisierungsreaktion
nach einem gängigen
Protokoll durchgeführt.
Um das Nukleinsäurehybrid
aus der Capture-Sonde und der Target-Sonde zu stabilisieren, kann
ein Puffer verwendet werden, der Natriumchlorid enthält. Nach
der Hybridisierung werden restliche unspezifisch bindende Target-Sonde
und Target-Sonde abgetrennt.
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Bei
der Reaktion von Schritt (c) reagiert ein für einzelsträngige Nukleinsäure spezifisches
oder für
doppelsträngige
Nukleinsäure
spezifisches nukleinsäurebindendes
Material mit der Capture-Sonde oder dem Nukleinsäurehybrid auf der Oberfläche der
Arbeitselektrode. Daher wird das positiv geladene nukleinsäurebindende
Material spezifisch an das Nukleinsäurehybrid oder die einzelsträngige Nukleinsäure gebunden
und vermindert so die negativen Ladungen (4b).
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Währenddessen
werden Tenside, Wärme,
Spannung oder Schallwellen angewandt, um die unspezifische Bindung
nach Schritt (c) zu minimieren. Wenn beispielsweise ein für doppelsträngige Nukleinsäure spezifischer
Interkalator zwischen gestapelte Basenpaare eingeschoben wird, neigt
dieser auch dazu, mit einzelsträngiger
Nukleinsäure
ionische Wechselwirkungen einzugehen. Diese unspezifische Bindung
lässt sich durch
Zufuhr von Tensiden, Wärme,
Schallwellen oder Spannung zu der Elektrodenoberfläche beseitigen.
Die Temperatur beim Erhitzen beträgt vorzugsweise 65 bis 95°C, die Behandlung
mit Schallwellen kann nach gängigen
Verfahren oder durch Beschallung erfolgen, und es kann eine Spannung
an der Elektrode angelegt werden.
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In
Schritt (d) wird die Oligo-Schicht in einen Elektrolyten eingetaucht,
um mit einem elektrochemischen Verfahren eine Änderung des Ladungszustands
auf der Oberfläche
der Arbeitselektrode zu messen. Wenn dann eine negative Ladung der
auf der Elektrodenoberfläche
vorliegenden Nukleotide durch nukleinsäurebindendes Material verringert
oder neutralisiert wird, kann ein negativ geladener Elektrolyt in
die Nähe
der Elektrodenoberfläche
gelangen, so dass die Oberflächenkonzentration
an negativ geladenem Elektrolyt zunimmt und eine Oxidation/Reduktion
erfolgt. Wenn die negative Ladung der Nukleotide jedoch nicht verringert
oder neutralisiert wurde, wird der negativ geladene Elektrolyt durch
elektrostatische Abstoßung
von der Elektrodenoberfläche
abgestoßen
und es erfolgt keine Oxidation/Reduktion (5b).
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Der
Elektrolyt ist eine negative Verbindung, und vorzugsweise handelt
es sich um eine Lösung,
die [Fe(CN)6]3– enthält. Ein
Beispiel für
einen Elektrolyten ist ein Puffer, der 50 mM NaCl, 10 mM Phosphat
(pH 7,0) und 3 mM K3Fe(CN)6 enthält.
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Beispiele
für das
elektrochemische Verfahren sind cyclische Voltammetrie, Amperometrie
oder Chronocoulometrie. Cyclische Voltammetrie ist eine elektrochemische
Methode zur Untersuchung der Potentialänderung an einer Elektrode
und beinhaltet einen Potentialdurchlauf mit anschließendem Rücklauf durch
die gerade abgedeckte Potentialregion, was eine Dreieckswellenform
liefert. Amperometrie verwendet Methoden, die die Messung elektrischer
Ströme
beinhalten, und Chronocoulometrie ist eine Elektroanalyse, die durch Messen
der Geschwindigkeit der Änderung
des Stroms mit der Zeit an einer Arbeitselektrode erfolgt.
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Wenn
beispielsweise eine Stromänderung
an einer Arbeitselektrode durch cyclische Voltammetrie gemessen
wird, ergibt sich an einer Arbeitselektrode vor der Interkalation
ein cyclisches Voltammogramm wie in 6a, an
einer Arbeitselektrode, auf der ein nicht-interkalierter DNA-Strang
fixiert ist, ergibt sich nach Interkalation ein cyclisches Voltammogramm
wie in 6b, und an einer Arbeitselektrode,
auf der ein interkalierter DNA-Strang fixiert ist, ergibt sich ein
cylisches Voltammogramm wie in 6c. Bei
einer interkalierten Capture-Sonde ist die negative Ladung an der
Elektrodenoberfläche
nämlich
neutralisiert oder verringert, so dass sich der negativ geladene
Elektrolyt leicht der Elektrodenoberfläche annähern kann und leicht eine Reduktion/Oxidation
erfolgt.
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Wenn
man also ein cyclisches Voltammogramm wie in 6b erhält, wenn
man einen für
doppelsträngige
Nukleinsäure
spezifischen Interkalator mit einer Capture-Sonde reagieren lässt, bedeutet
dies, dass die Capture-Sonde zur Target-Sonde nicht komplementär ist. Wenn
man aber ein cyclisches Voltammogramm wie in 6c erhält, bedeutet
dies, dass die Capture-Sonde zur Target-Sonde komplementär ist.
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Wie
oben erwähnt,
stellt das Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Nachweis der
Hybridisierung von Nukleinsäuren
ein elektrochemisches Verfahren zum Nachweisen der Hybridisierung
von Nukleinsäure bereit,
und diese Methode kann mit geringen Kosten und einem einfachen Verfahren
bei DNA-Chips oder Biochips verwedet werden.
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Die
folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern. Diese
Beispiele dienen jedoch lediglich dem besseren Verständnis der
vorliegenden Erfindung und schränken
deren Umfang nicht ein.
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BEISPIEL 1. HERSTELLUNG
EINER OLIGO-SCHICHT
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Als
Arbeitselektrode wurde ein Goldstab verwendet.
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Der
Goldstab wurde zuerst mit Sandpapier Nr. 1500 und 2000 poliert und
anschließend
nacheinander mit Aluminiumoxidpasten mit 5 μm, 1 μm und 0,05 μm Teilchendurchmesser poliert
und dann 5 min in deionisiertem Wasser schallbehandelt.
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Die
Elektrodenoberfläche
wurde in einer gesättigten
Kaliumhydroxidlösung
1 Stunde lang gekocht, 24 Stunden in Schwefelsäure getaucht und gründlich mit
deionisiertem Wasser gewaschen. Anstatt in Schwefelsäure zu tauchen,
kann die Elektrodenoberfläche
3–4 Stunden
in Piranhalösung
getaucht werden.
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Oligonukleotide
für die
Capture-Sonden mit einer an den 5'-Terminus gebundenen Thiolgruppe wurden
von Sigma-Aldrich gekauft, wobei deren Sequenz in SEQ ID NO: 1 angegeben
ist.
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10
ng/ml der Capture-Sonde wurden in destilliertem Wasser oder einer
10 mM Phosphatlösung
(pH 7,0) mit 50 mM NaCl gelöst.
Die Mischung wurde auf die Oberfläche der Goldelektrode getröpfelt, und
dann wurde mehr als 8 Stunden inkubiert und anschließend mit
destilliertem Wasser gespült.
Dann wurde die Goldelektrode in eine 10 mM Phosphatlösung (pH
7,0) mit 50 mM NaCl getaucht, und nach 24 Stunden wurde mit der
gleichen Lösung
gewaschen und so die Oligo-Schicht
hergestellt.
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BEISPIEL 2. HYBRIDISIERUNG
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Zu
einer Capture-Sonde komplementäre
Oligonukleotide wurden als Target-Sonde verwendet, und die Target-Sonde
besaß die
in SEQ ID NO: 2 angegebene Sequenz.
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Zur
Herstellung der Lösung
der Target-Sonde wurden 10 μg/ml
Target-Sonde zu einem Puffer (1 × TE, 400 mM NaCl, pH 7,0)
gegeben. Die in BEISPIEL 1 hergestellte Oligo-Schicht wurde 15 Stunden
bei 45°C
in die Lösung
der Target-Sonde
getaucht. Nach Senken der Temperatur wurde die Oligo-Schicht mit
einem 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) mit 50 mM NaCl gewaschen, und
nachdem die Oligo-Schicht in 1 × TBE
(pH 7,0) mit 7 mM SDS oder in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) mit
50 mM NaCl und 7 mM SDS getränkt
worden war, wurde sie mit 1 × TBE
(pH 7,0) gewaschen.
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Die
Oligo-Schicht wurde 10 min in 1 × TBE (pH 7,0) mit 10–7 M
SYBR-Grün
getränktt
und mit 10 mM Phosphat (pH 7,0) mit 50 mM NaCl gewaschen.
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BEISPIEL 3.
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Zu
einer Capture-Sonde nicht-komplementäre Oligonukleotide wurden als
Target-Sonde verwendet, und die Target-Sonde besaß die in
SEQ ID NO: 3 angebene Sequenz. Die Target-Sonde der SEQ ID NO: 3 wurde
mit der Oligo-Schicht
von BEISPIEL 1 wie in Beispiel 2 beschrieben reagieren gelassen.
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BEISPIEL 4.
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Cyclische
Voltammetrie erfolgte bei Raumtemperatur an den Elektroden von BEISPIEL
2 und BEISPIEL 3 mit einem EG & G
Potentiostat/Galvanostat Model 273A (Princeton Applied Research).
Zur Messung mittels cyclischer Voltammetrie wurden eine Ag/AgCl
[3 M NaCl]-Referenzelektrode (BAS) und Platindraht-Hilfselektroden verwendet,
und als Pufferlösung
wurde eine [Fe(CN)6]3–-Lösung mit
50 mM NaCl, 10 mM Phosphat (pH 7,0) und 3 mM K3Fe(CN)6) verwendet. Der Abtastbereich für die Spannung
war 0,6 V~–0,5
V (gegen eine Ag/AgCl-Referenzelektrode),
und die Abtastgeschwindigkeit betrug 100 mV/sec. Sauerstoff wurde aus
der [Fe(CN)6]3–-Lösung eliminiert,
indem 5 Minuten vor dem Versuch Stickstoff durchgeleitet wurde.
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6a–6c zeigen
cyclische Voltammogramme, wobei 6a das
cyclische Voltammogramm einer blanken Goldelektrode ist, 6b das
cyclische Voltammogramm der Elektrode von BEISPIEL 3 ist und 6c das
cyclische Voltammogramm der Elektrode von BEISPIEL 2 ist.
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In 6a–6c ist
gezeigt, dass die Capture-Sonde mit der Target-Sonde von BEISPIEL
2 hybridisiert, die Capture-Sonde aber nicht mit der nicht-komplementären Target-Sonde
von BEISPIEL 3 hybridisieren konnte und die Capture-Sonde eine einzelsträngige DNA
blieb. Diese Ergebnisse sind wie vorhergesagt.
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BEISPIEL 5.
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HYBRIDISIERUNGSNACHWEIS
DURCH EINE ACRIDINVERBINDUNG
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Eine
Oligo-Schicht wurde wie in BEISPIEL 1 beschrieben präpariert
und die Hybridisierungsreaktion durchgeführt. Die Oligo-Schicht wurde
10 min in einen Puffer getaucht, der 0,5~5 mM SDS, 50 mM NaCl und 10
mM Phosphat (pH 7,0) enthielt. Nach Waschen mit 50 mM NaCl und 10
mM Phosphat (pH 7,0) wurde die Oligo-Schicht 10 min in 1 mg/ml 3,6-Diaminoacridin,
50 mM NaCl und 10 mM Phosphat (pH 7,0) getaucht, und als sie sauber
war, erfolgte die Messung mit cyclischer Voltammetrie.
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7 ist
ein cyclisches Voltammogramm einer Arbeitselektrode nach Interkalation
mit einer Acridinverbindung. Im Falle einer Arbeitselektrode, auf
der eine Capture-Sonde fixiert war, die ein DNA-Hybrid bildete, wurde
ein wie in ➀ beschriebenes Voltammogramm gemessen, und
bei einer Arbeitselektrode, auf der nur eine einzelsträngige DNA
fixiert war, wurde ein wie in ❸ beschriebenes cyclisches
Voltammogramm gemessen.
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