JP2002543408A - Ｄｎａ融解曲線分析に基づくアッセイ - Google Patents
Ｄｎａ融解曲線分析に基づくアッセイInfo
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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-
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-
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- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
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Abstract
(57)【要約】
特定の細菌に特有な配列などの標的ＤＮＡを検出する均一な方法が教示される。融解曲線が得られ、コンピュータ制御の分析が行われる。この場合、予測モデルが、既知のＤＮＡを用いた学習法に基づいて用いられる。
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、分子生物学の分野に関し、より具体的にはＤＮＡに基づく診断プロ
トコルに関する。
トコルに関する。
【０００２】 （発明の背景） 多くの方法を、光学的に複雑な溶液中の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の存在を
検出するために利用することができる。典型的には、これらは、ＤＮＡ増幅反応
などのアッセイの核酸産物を出発マトリクスから分離することを含む。分離方法
には、分析的遠心分離、平衡透析、融解温度プロフィルおよびポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動などが含まれる。そのような方法は、複雑であり、費用および時
間がかかる。
検出するために利用することができる。典型的には、これらは、ＤＮＡ増幅反応
などのアッセイの核酸産物を出発マトリクスから分離することを含む。分離方法
には、分析的遠心分離、平衡透析、融解温度プロフィルおよびポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動などが含まれる。そのような方法は、複雑であり、費用および時
間がかかる。
【０００３】 分離することなく、最初のマトリクス溶液または懸濁液中のｄｓＤＮＡを同定
することができる代替方法も知られている。これらの方法は「均一検出（ｈｏｍ
ｏｇｅｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」法と呼ばれている。例えば、欧州特
許第０４８７２１８号には、ｄｓＤＮＡを、ｄｓＤＮＡと接触または反応したと
きに変化する検出可能な特性を有する試薬と接触または反応させて、その変化を
検出することによって、試料中のｄｓＤＮＡ標的核酸増幅産物を検出するための
方法が教示されている。蛍光色素、特に、インターカレート蛍光色素が教示され
ている。カナダ国特許出願第２，０６７，９０９号（Ｈｉｇｕｃｈｉ）には、Ｄ
ＮＡ結合剤が結合していないときのシグナルとはシグナルを区別することができ
る、ｄｓＤＮＡに結合したときに検出可能なシグナルを付与するＤＮＡ結合剤が
開示されている。Ｈｉｇｕｃｈｉは、ｄｓＤＮＡを増幅時に標識し、続いて均一
検出するためのインターカレート蛍光色素（臭化エチジウム）を用いている。さ
らに、Ｙａｍａｍｏｔｏ他は、米国特許第５，６７０，３１５号において、ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）時に特異的な色素（ピリリウム）をＰＣＲ産物の定
量的指示薬として用いる蛍光測定を教示している。米国特許第４，６８３，１９
５号（Ｍｕｌｌｉｓ他）および米国特許第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓ
他）に示されているように、ＰＣＲは、極めて少量の遺伝物質が迅速に増幅され
る周知の方法である。
することができる代替方法も知られている。これらの方法は「均一検出（ｈｏｍ
ｏｇｅｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」法と呼ばれている。例えば、欧州特
許第０４８７２１８号には、ｄｓＤＮＡを、ｄｓＤＮＡと接触または反応したと
きに変化する検出可能な特性を有する試薬と接触または反応させて、その変化を
検出することによって、試料中のｄｓＤＮＡ標的核酸増幅産物を検出するための
方法が教示されている。蛍光色素、特に、インターカレート蛍光色素が教示され
ている。カナダ国特許出願第２，０６７，９０９号（Ｈｉｇｕｃｈｉ）には、Ｄ
ＮＡ結合剤が結合していないときのシグナルとはシグナルを区別することができ
る、ｄｓＤＮＡに結合したときに検出可能なシグナルを付与するＤＮＡ結合剤が
開示されている。Ｈｉｇｕｃｈｉは、ｄｓＤＮＡを増幅時に標識し、続いて均一
検出するためのインターカレート蛍光色素（臭化エチジウム）を用いている。さ
らに、Ｙａｍａｍｏｔｏ他は、米国特許第５，６７０，３１５号において、ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）時に特異的な色素（ピリリウム）をＰＣＲ産物の定
量的指示薬として用いる蛍光測定を教示している。米国特許第４，６８３，１９
５号（Ｍｕｌｌｉｓ他）および米国特許第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓ
他）に示されているように、ＰＣＲは、極めて少量の遺伝物質が迅速に増幅され
る周知の方法である。
【０００４】 上記に引用された方法は、増幅された標的ＤＮＡの検出および定量化に関して
有用である。しかし、それぞれ、ｄｓＤＮＡの増幅された標的と、試料中の他の
ｄｓＤＮＡとを区別することができない。さらに、これらの方法のいくつかは、
一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）をｄｓＤＮＡから十分に区別できない。これらの方
法はすべて、精製された均一なＤＮＡ試料が言及した増幅反応において用いられ
ており、いくつかの方法では高感度のＤＮＡインターカレート色素を用いた可変
温度分析が用いられている。しかし、高感度のＤＮＡインターカレート色素を用
いた可変温度分析を用いる方法はいずれも、本明細書中に記載される方法で蛍光
シグナルパターンを分析していない。すなわち、ＤＮＡ試料の温度を変性レベル
にまでゆっくり上昇させながら蛍光の変化をモニタし、分析していない。そうす
ることによって、生じたパターンの分析を用いて、特異的な標的ｄｓＤＮＡを他
の核酸物質（例えば、内部ポシティブコントロールＤＮＡフラグメント）から区
別することができる。
有用である。しかし、それぞれ、ｄｓＤＮＡの増幅された標的と、試料中の他の
ｄｓＤＮＡとを区別することができない。さらに、これらの方法のいくつかは、
一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）をｄｓＤＮＡから十分に区別できない。これらの方
法はすべて、精製された均一なＤＮＡ試料が言及した増幅反応において用いられ
ており、いくつかの方法では高感度のＤＮＡインターカレート色素を用いた可変
温度分析が用いられている。しかし、高感度のＤＮＡインターカレート色素を用
いた可変温度分析を用いる方法はいずれも、本明細書中に記載される方法で蛍光
シグナルパターンを分析していない。すなわち、ＤＮＡ試料の温度を変性レベル
にまでゆっくり上昇させながら蛍光の変化をモニタし、分析していない。そうす
ることによって、生じたパターンの分析を用いて、特異的な標的ｄｓＤＮＡを他
の核酸物質（例えば、内部ポシティブコントロールＤＮＡフラグメント）から区
別することができる。
【０００５】 したがって、ｄｓＤＮＡ標的増幅産物を、アッセイの標的ではなく、かつ複雑
な混合物中で区別しなければならないその他の核酸物質から区別することができ
る均一検出法が求められている。驚くべきことに、そして予想外にも、ＤＮＡイ
ンターカレート剤を用い、かつ試料の温度を変性レベルにまでゆっくり上昇させ
ながら生じた蛍光シグナルの変化を分析することによって、特異的な標的ｄｓＤ
ＮＡ産物を非標的核酸物質から区別できることを見出した。融解曲線分析時に得
られたデータを用いて、その結果を、コントロールｄｓＤＮＡの試料について行
われた分析のときに得られた（「調整された（ｔｒａｉｎｅｄ）」）モデルと比
較することによって特異的な標的ｄｓＤＮＡの存在を予測することができる。
な混合物中で区別しなければならないその他の核酸物質から区別することができ
る均一検出法が求められている。驚くべきことに、そして予想外にも、ＤＮＡイ
ンターカレート剤を用い、かつ試料の温度を変性レベルにまでゆっくり上昇させ
ながら生じた蛍光シグナルの変化を分析することによって、特異的な標的ｄｓＤ
ＮＡ産物を非標的核酸物質から区別できることを見出した。融解曲線分析時に得
られたデータを用いて、その結果を、コントロールｄｓＤＮＡの試料について行
われた分析のときに得られた（「調整された（ｔｒａｉｎｅｄ）」）モデルと比
較することによって特異的な標的ｄｓＤＮＡの存在を予測することができる。
【０００６】 出願人は、融解曲線データ分析用の異なったモデル化技術を用い、モデルの予
測値を比較することにより、アッセイから得られたデータの品質を改善するとい
う予想外で、驚くべき発見した。この方法は、非標的のその他の増幅物の存在下
で、特異的なｄｓＤＮＡフラグメントの存在を確実に検出することができる。さ
らに、本発明の方法は、特異的な標的ＤＮＡをその供給源に関わりなく検出する
ことに適用することができる。実際、ｄｓＤＮＡは、通常、プライマー特異的な
（ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）増幅プロトコルによって得られる。
測値を比較することにより、アッセイから得られたデータの品質を改善するとい
う予想外で、驚くべき発見した。この方法は、非標的のその他の増幅物の存在下
で、特異的なｄｓＤＮＡフラグメントの存在を確実に検出することができる。さ
らに、本発明の方法は、特異的な標的ＤＮＡをその供給源に関わりなく検出する
ことに適用することができる。実際、ｄｓＤＮＡは、通常、プライマー特異的な
（ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）増幅プロトコルによって得られる。
【０００７】 出願人は、特異的な標的ＤＮＡを同定するために必要とされる情報が融解曲線
の中に存在し、そして該情報を、ｉ）出発マトリクス（食品試料中に存在するも
のなど）から得られる外因性情報、ｉｉ）増幅されたバックグラウンド物質、お
よびｉｉｉ）ゲル電気泳動においてスメアを生じさせるものなどの妨害酵素反応
物にも関わらず、抽出できることを発見した。さらに、適切で予測可能なモデル
化技術をこれらの曲線から得られるデータに適用でき、該技術を用いてこれらの
困難を克服し、標的ＤＮＡが存在することを証明することができることを見出し
た。
の中に存在し、そして該情報を、ｉ）出発マトリクス（食品試料中に存在するも
のなど）から得られる外因性情報、ｉｉ）増幅されたバックグラウンド物質、お
よびｉｉｉ）ゲル電気泳動においてスメアを生じさせるものなどの妨害酵素反応
物にも関わらず、抽出できることを発見した。さらに、適切で予測可能なモデル
化技術をこれらの曲線から得られるデータに適用でき、該技術を用いてこれらの
困難を克服し、標的ＤＮＡが存在することを証明することができることを見出し
た。
【０００８】 したがって、本発明の重要な実施態様は、ｉ）標的ＤＮＡを同定するための、
またはｉｉ）生物に特有の特異的なＤＮＡ標的部分を同定することによって該生
物を同定するための、迅速かつ安価で、実施が容易な均一試験を提供することで
ある。該試験により、特にＤＮＡに基づく同定アッセイを通常妨害する出発マト
リクスの存在下で、信頼性の向上が提供される。別の実施態様は、温度依存性蛍
光（ＴＤＦ）よりも確実な結果をもたらす。ＴＤＦは、Ｗｉｔｔｗｅｒ他による
国際特許出願公開ＷＯ９７／４６７１２および４６７１４、または終点蛍光測定
（ｅｎｄｐｏｉｎｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）に
記載されている。本発明のさらに別の態様は、本発明がゲル検出法の感度と等し
いか、それよりも大きいということである。
またはｉｉ）生物に特有の特異的なＤＮＡ標的部分を同定することによって該生
物を同定するための、迅速かつ安価で、実施が容易な均一試験を提供することで
ある。該試験により、特にＤＮＡに基づく同定アッセイを通常妨害する出発マト
リクスの存在下で、信頼性の向上が提供される。別の実施態様は、温度依存性蛍
光（ＴＤＦ）よりも確実な結果をもたらす。ＴＤＦは、Ｗｉｔｔｗｅｒ他による
国際特許出願公開ＷＯ９７／４６７１２および４６７１４、または終点蛍光測定
（ｅｎｄｐｏｉｎｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）に
記載されている。本発明のさらに別の態様は、本発明がゲル検出法の感度と等し
いか、それよりも大きいということである。
【０００９】 （発明の概要） 本発明は、標的ＤＮＡ鎖の検出を達成するためのコンピュータ処理による融解
曲線分析の使用に関する。より具体的には、本発明は、任意の出発マトリクスを
含む未知配列の溶液中の特異的な標的ＤＮＡ配列を均一検出するためのコンピュ
ータ方法であって、 ｉ．特異的なＤＮＡ配列を有効濃度で含有する溶液を調製すること； ｉｉ．二本鎖ＤＮＡに結合したときに有意な蛍光シグナルを発し、一本鎖ＤＮ
Ａの存在下では有意でないシグナルを発するインターカレート色素を含む、特異
的なＤＮＡ配列を増幅するのに十分な、有効量の試薬を加えること； ｉｉｉ．前記反応物中の前記特異的な標的ＤＮＡを増幅するために連続した一
連の処理を施すこと； ｉｖ．選択された間隔で蛍光を励起し、該励起された蛍光をモニタしながら、
ステップｉｉの溶液にアニーリング状態から融解状態まで上昇させる１回の温度
サイクルを施して、前記溶液中のＤＮＡの融解曲線を表す一連のアナログ出力シ
グナルを得ること； ｖ．デジタル形式で前記曲線を分析するためにプログラム化されたコンピュー
タに前記出力シグナルを入力し、前記曲線のデータを平滑化および変換してスペ
クトルを作成し、既知のＤＮＡ配列でコンピュータプログラムを調整することに
よって予め決定された値に基づき、前記スペクトルを分析して前記スペクトルに
おける検索的予測値を決定すること；および ｖｉ．選択された閾値を超える予測値によって前記未知配列を同定すること、 を含むコンピュータ方法に関する。
曲線分析の使用に関する。より具体的には、本発明は、任意の出発マトリクスを
含む未知配列の溶液中の特異的な標的ＤＮＡ配列を均一検出するためのコンピュ
ータ方法であって、 ｉ．特異的なＤＮＡ配列を有効濃度で含有する溶液を調製すること； ｉｉ．二本鎖ＤＮＡに結合したときに有意な蛍光シグナルを発し、一本鎖ＤＮ
Ａの存在下では有意でないシグナルを発するインターカレート色素を含む、特異
的なＤＮＡ配列を増幅するのに十分な、有効量の試薬を加えること； ｉｉｉ．前記反応物中の前記特異的な標的ＤＮＡを増幅するために連続した一
連の処理を施すこと； ｉｖ．選択された間隔で蛍光を励起し、該励起された蛍光をモニタしながら、
ステップｉｉの溶液にアニーリング状態から融解状態まで上昇させる１回の温度
サイクルを施して、前記溶液中のＤＮＡの融解曲線を表す一連のアナログ出力シ
グナルを得ること； ｖ．デジタル形式で前記曲線を分析するためにプログラム化されたコンピュー
タに前記出力シグナルを入力し、前記曲線のデータを平滑化および変換してスペ
クトルを作成し、既知のＤＮＡ配列でコンピュータプログラムを調整することに
よって予め決定された値に基づき、前記スペクトルを分析して前記スペクトルに
おける検索的予測値を決定すること；および ｖｉ．選択された閾値を超える予測値によって前記未知配列を同定すること、 を含むコンピュータ方法に関する。
【００１０】 （配列表の簡単な説明） 配列番号１は、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ゲノムの一部分を増幅す
るために特異的なプライマーの合成オリゴヌクレオチド配列である。 配列番号２は、サルモネラゲノムの一部分を増幅するために特異的なプライマ
ーの合成オリゴヌクレオチド配列である。 配列番号３は、ＳＶ−４０ゲノムの一部分を増幅するために特異的なプライマ
ーの合成オリゴヌクレオチド配列である。 配列番号４は、ＳＶ−４０ゲノムの一部分を増幅するために特異的なプライマ
ーの合成オリゴヌクレオチド配列である。 配列番号５は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）０１５７：Ｈ７
ゲノムの一部分を増幅するために特異的なプライマーの合成オリゴヌクレオチド
配列である。 配列番号６は、大腸菌０１５７：Ｈ７ゲノムの一部分を増幅するために特異的
なプライマーの合成オリゴヌクレオチド配列である。 配列番号７は、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅ
ｓ）ゲノムの一部分を増幅するために特異的なプライマーの合成オリゴヌクレオ
チド配列である。 配列番号８は、リステリア菌ゲノムの一部分を増幅するために特異的なプライ
マーの合成オリゴヌクレオチド配列である。 配列番号９は、リステリアゲノムの一部分を増幅するために特異的なプライマ
ーの合成オリゴヌクレオチド配列である。 配列番号１０は、リステリアゲノムの一部分を増幅するために特異的なプライ
マーの合成オリゴヌクレオチド配列である。
るために特異的なプライマーの合成オリゴヌクレオチド配列である。 配列番号２は、サルモネラゲノムの一部分を増幅するために特異的なプライマ
ーの合成オリゴヌクレオチド配列である。 配列番号３は、ＳＶ−４０ゲノムの一部分を増幅するために特異的なプライマ
ーの合成オリゴヌクレオチド配列である。 配列番号４は、ＳＶ−４０ゲノムの一部分を増幅するために特異的なプライマ
ーの合成オリゴヌクレオチド配列である。 配列番号５は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）０１５７：Ｈ７
ゲノムの一部分を増幅するために特異的なプライマーの合成オリゴヌクレオチド
配列である。 配列番号６は、大腸菌０１５７：Ｈ７ゲノムの一部分を増幅するために特異的
なプライマーの合成オリゴヌクレオチド配列である。 配列番号７は、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅ
ｓ）ゲノムの一部分を増幅するために特異的なプライマーの合成オリゴヌクレオ
チド配列である。 配列番号８は、リステリア菌ゲノムの一部分を増幅するために特異的なプライ
マーの合成オリゴヌクレオチド配列である。 配列番号９は、リステリアゲノムの一部分を増幅するために特異的なプライマ
ーの合成オリゴヌクレオチド配列である。 配列番号１０は、リステリアゲノムの一部分を増幅するために特異的なプライ
マーの合成オリゴヌクレオチド配列である。
【００１１】 これらのプライマーは、種特異的なＤＮＡフラグメントを増幅する際に用いら
れる。これらはすべて、Ｑｕａｌｉｃｏｎ Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、
ＤＥ）によって製造されるスクリーニング用Ｑｕａｌｉｃｏｎ ＢＡＸ（登録商
標）キットの一部として含まれている。このキットは、リステリア（製品番号：
１７７１０６０３）、サルモネラ（製品番号：１７７１０６０４）、リステリア
菌（製品番号：１７７１０６０５）、大腸菌０１５７：Ｈ７（製品番号：１７７
１０６０６）の検出において有用である。ＳＶ−４０フラグメントはコントロー
ル反応物である。
れる。これらはすべて、Ｑｕａｌｉｃｏｎ Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、
ＤＥ）によって製造されるスクリーニング用Ｑｕａｌｉｃｏｎ ＢＡＸ（登録商
標）キットの一部として含まれている。このキットは、リステリア（製品番号：
１７７１０６０３）、サルモネラ（製品番号：１７７１０６０４）、リステリア
菌（製品番号：１７７１０６０５）、大腸菌０１５７：Ｈ７（製品番号：１７７
１０６０６）の検出において有用である。ＳＶ−４０フラグメントはコントロー
ル反応物である。
【００１２】 （発明の説明） 本発明は、下記の、標的ＤＮＡ鎖の検出を達成するためのコンピュータ化融解
曲線分析の使用に関する： 任意の出発マトリクスを含む未知配列の溶液中の特異的な標的ＤＮＡ配列を均
一検出するためのコンピュータ方法であって、 ｉ．特異的なＤＮＡ配列を有効濃度で含有する溶液を調製すること； ｉｉ．二本鎖ＤＮＡに結合したときに有意な蛍光シグナルを発し、一本鎖ＤＮ
Ａの存在下では有意でないシグナルを発するインターカレート色素を含む、特異
的なＤＮＡ配列を増幅するのに十分な、有効量の試薬を加えること； ｉｉｉ．前記反応物中の前記特異的な標的ＤＮＡを増幅するために連続した一
連の処理を施すこと； ｉｖ．選択された間隔で蛍光を励起し、該励起された蛍光をモニタしながら、
ステップｉｉの溶液にアニーリング状態から融解状態まで上昇させる１回の温度
サイクルを施して、前記溶液中のＤＮＡの融解曲線を表す一連のアナログ出力シ
グナルを得ること； ｖ．デジタル形式で前記曲線を分析するためにプログラム化されたコンピュー
タに前記出力シグナルを入力し、前記曲線のデータを平滑化および変換してスペ
クトルを作成し、既知のＤＮＡ配列でコンピュータプログラムを調整することに
よって予め決定された値に基づき、前記スペクトルを分析して前記スペクトルに
おける検索的予測値を決定すること；および ｖｉ．選択された閾値を超える予測値によって前記未知配列を同定すること、 を含むコンピュータ方法。
曲線分析の使用に関する： 任意の出発マトリクスを含む未知配列の溶液中の特異的な標的ＤＮＡ配列を均
一検出するためのコンピュータ方法であって、 ｉ．特異的なＤＮＡ配列を有効濃度で含有する溶液を調製すること； ｉｉ．二本鎖ＤＮＡに結合したときに有意な蛍光シグナルを発し、一本鎖ＤＮ
Ａの存在下では有意でないシグナルを発するインターカレート色素を含む、特異
的なＤＮＡ配列を増幅するのに十分な、有効量の試薬を加えること； ｉｉｉ．前記反応物中の前記特異的な標的ＤＮＡを増幅するために連続した一
連の処理を施すこと； ｉｖ．選択された間隔で蛍光を励起し、該励起された蛍光をモニタしながら、
ステップｉｉの溶液にアニーリング状態から融解状態まで上昇させる１回の温度
サイクルを施して、前記溶液中のＤＮＡの融解曲線を表す一連のアナログ出力シ
グナルを得ること； ｖ．デジタル形式で前記曲線を分析するためにプログラム化されたコンピュー
タに前記出力シグナルを入力し、前記曲線のデータを平滑化および変換してスペ
クトルを作成し、既知のＤＮＡ配列でコンピュータプログラムを調整することに
よって予め決定された値に基づき、前記スペクトルを分析して前記スペクトルに
おける検索的予測値を決定すること；および ｖｉ．選択された閾値を超える予測値によって前記未知配列を同定すること、 を含むコンピュータ方法。
【００１３】 「有意なＦＩＵ」は、試薬ブランクＦＩＵ値の平均よりも少なくとも１標準偏
差大きい任意ユニット蛍光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ａｒｂｉｔｒａ
ｒｙ Ｕｎｉｔｓ）（ＦＩＵ）シグナルのいずれをも意味する。
差大きい任意ユニット蛍光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ａｒｂｉｔｒａ
ｒｙ Ｕｎｉｔｓ）（ＦＩＵ）シグナルのいずれをも意味する。
【００１４】 「有意でないＦＩＵ」は、試薬ブランクＦＩＵ値の平均よりも小さいＦＩＵシ
グナルのいずれをも意味する。
グナルのいずれをも意味する。
【００１５】 「平滑化（ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ）」は、全体の傾向を通してデータポイントの
ランダムな散らばりを除くことを意味する。
ランダムな散らばりを除くことを意味する。
【００１６】 「調整（ｔｒａｉｎｉｎｇ）」は、最も一致する観測結果を与えるモデルの重
みまたはパラメータを決定することを意味する。
みまたはパラメータを決定することを意味する。
【００１７】 「予測値」は、０と１との間の値を有する、本発明のコンピュータ方法によっ
て得られる数字を意味する。この場合、０は、調整された正の値に対する相関が
ないとして定義され、１は、調整された正の値に対して１００％の相関を有する
として定義される。
て得られる数字を意味する。この場合、０は、調整された正の値に対する相関が
ないとして定義され、１は、調整された正の値に対して１００％の相関を有する
として定義される。
【００１８】 「閾値」は、予測値と比較するために用いられる任意の値を意味する。予測値
が閾値よりも大きい場合、その試料は陽性と見なされる：すなわち、試料は標的
ＤＮＡを含有する。閾値が１に近づくほど、試料を陽性であると評価する際の信
頼性が大きくなる。閾値は０．４よりも大きいことが好ましく、好ましくは０．
５よりも大きく、より好ましくは０．７よりも大きく、最も好ましくは０．９よ
りも大きい。
が閾値よりも大きい場合、その試料は陽性と見なされる：すなわち、試料は標的
ＤＮＡを含有する。閾値が１に近づくほど、試料を陽性であると評価する際の信
頼性が大きくなる。閾値は０．４よりも大きいことが好ましく、好ましくは０．
５よりも大きく、より好ましくは０．７よりも大きく、最も好ましくは０．９よ
りも大きい。
【００１９】 「有効量」は、本発明において概略されるプロトコルにおいて他の規定された
試薬と一緒に用いられたとき、生成物を得るためまたは生成物を検出するために
必要な試薬の最少濃度から最適濃度を意味する。
試薬と一緒に用いられたとき、生成物を得るためまたは生成物を検出するために
必要な試薬の最少濃度から最適濃度を意味する。
【００２０】 「有効濃度」は、検出可能な生成物を形成するために本発明の方法によって増
幅することができる溶液中のＤＮＡの最少濃度から最適濃度を意味する。該生成
物の「選択された長さ」は、標的ＤＮＡの配列により、および本発明において概
略されるプロトコルに従ったときに特異的なＤＮＡフラグメントを増幅するプラ
イマーの選択によって決められる。ＤＮＡの有効濃度は、試験試料により導入さ
れる成分によって影響を受ける。
幅することができる溶液中のＤＮＡの最少濃度から最適濃度を意味する。該生成
物の「選択された長さ」は、標的ＤＮＡの配列により、および本発明において概
略されるプロトコルに従ったときに特異的なＤＮＡフラグメントを増幅するプラ
イマーの選択によって決められる。ＤＮＡの有効濃度は、試験試料により導入さ
れる成分によって影響を受ける。
【００２１】 「出発マトリクス」は、試料溶液に含有されるすべての構成要素を意味し、Ｄ
ＮＡ、緩衝剤成分、食品成分および他の添加物が含まれる。
ＮＡ、緩衝剤成分、食品成分および他の添加物が含まれる。
【００２２】 好ましい方法では、十分に特徴付けられた任意の増幅プロトコルが用いられ、
該増幅プロトコルには、ＰＣＲ、鎖置換、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および
特に好ましい方法であるＰＣＲを伴う核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｆ
ｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ｆｒ
ｏｎｔｉｅｒｓ、１９９７年、Ｍ．Ｅ．Ｄｏｙｌｅ、Ｌ．Ｒ．Ｂｅｕｃｈａｔお
よびＴ．Ｊ．Ｍｏｎｔｖｉｌｌｅ、ＡＳＭ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、７２３頁
〜７２４頁）が含まれるが、これらに限定されない。臭化エチジウム、ＹｏＰｒ
ｏ（登録商標）およびＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐ
ｒｏｂｅｓによって製造）などのインターカレート色素がこの技術の実施におい
て有用である。ＹｏＰｒｏ（登録商標）（キノリニウム，４−［（３−メチル−
２（３Ｈ）−ベンゾオキサゾリデン）メチル］−１−［３−（トリメチルアンモ
ニオ）プロピル］−，二ヨウ化物）およびＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）は、５×１０ 5 （ｍｏｌａｒ-1）未満の結合定数でＤＮＡ分子にインターカレートすることが
できる。
該増幅プロトコルには、ＰＣＲ、鎖置換、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および
特に好ましい方法であるＰＣＲを伴う核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｆ
ｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ｆｒ
ｏｎｔｉｅｒｓ、１９９７年、Ｍ．Ｅ．Ｄｏｙｌｅ、Ｌ．Ｒ．Ｂｅｕｃｈａｔお
よびＴ．Ｊ．Ｍｏｎｔｖｉｌｌｅ、ＡＳＭ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、７２３頁
〜７２４頁）が含まれるが、これらに限定されない。臭化エチジウム、ＹｏＰｒ
ｏ（登録商標）およびＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐ
ｒｏｂｅｓによって製造）などのインターカレート色素がこの技術の実施におい
て有用である。ＹｏＰｒｏ（登録商標）（キノリニウム，４−［（３−メチル−
２（３Ｈ）−ベンゾオキサゾリデン）メチル］−１−［３−（トリメチルアンモ
ニオ）プロピル］−，二ヨウ化物）およびＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）は、５×１０ 5 （ｍｏｌａｒ-1）未満の結合定数でＤＮＡ分子にインターカレートすることが
できる。
【００２３】 融解曲線の性質を決定するための数学的基礎は、有意な特徴を視覚的に単離す
ることによって、または好ましくは情報マップをアルゴリズムにより作製するこ
とによって行うことができる、情報に富む領域の決定を含むことができる。平滑
化ステップは、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙアルゴリズムによって最も良好に
行われる。さらに、確実な比較のために融解曲線を確立するデータは、いくつか
の異なったモデル化手法の１以上によって分析される。これらには、ニューラル
ネット分析および「ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅ」分析が含まれる。あまり厳密でない
結果が適する場合（すなわち、８０％未満の精度で十分である場合）、多重線形
回帰（ＭＬＲ）、偏最小二乗回帰（ＰＬＳＲ）、およびロジスティック回帰（Ｌ
Ｒ）を用いて、予測モデルを確立することができる。２つ以上の数学的プロトコ
ルを用いて同じ試験データをモデル化し、これが好ましい場合、その結果は、予
測精度の性能を改善するためにポーリングされる。
ることによって、または好ましくは情報マップをアルゴリズムにより作製するこ
とによって行うことができる、情報に富む領域の決定を含むことができる。平滑
化ステップは、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙアルゴリズムによって最も良好に
行われる。さらに、確実な比較のために融解曲線を確立するデータは、いくつか
の異なったモデル化手法の１以上によって分析される。これらには、ニューラル
ネット分析および「ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅ」分析が含まれる。あまり厳密でない
結果が適する場合（すなわち、８０％未満の精度で十分である場合）、多重線形
回帰（ＭＬＲ）、偏最小二乗回帰（ＰＬＳＲ）、およびロジスティック回帰（Ｌ
Ｒ）を用いて、予測モデルを確立することができる。２つ以上の数学的プロトコ
ルを用いて同じ試験データをモデル化し、これが好ましい場合、その結果は、予
測精度の性能を改善するためにポーリングされる。
【００２４】 さらに、ピーク含有領域から離れた曲線の領域を最初に調べ、任意のベースラ
インの変化を検出することによって、「スメア」の存在を決定することができる
。「スメア」は、過剰な増幅された遺伝物が存在し、これにより多数のバンドが
電気泳動において生じ、予測できない試験が示される試験である。予測可能な方
法はスメアを生じさせる試料を再現性よく同定することができ、それによりこれ
らの試料をさらなる分析または検討から除くことが可能となる。さらに、本発明
の方法はポシティブコントロールの存在下で行うことができる。
インの変化を検出することによって、「スメア」の存在を決定することができる
。「スメア」は、過剰な増幅された遺伝物が存在し、これにより多数のバンドが
電気泳動において生じ、予測できない試験が示される試験である。予測可能な方
法はスメアを生じさせる試料を再現性よく同定することができ、それによりこれ
らの試料をさらなる分析または検討から除くことが可能となる。さらに、本発明
の方法はポシティブコントロールの存在下で行うことができる。
【００２５】 本明細書中に開示されたモデル化技術を用いる融解曲線のコンピュータ分析は
、ＴＤＦまたは終点蛍光測定よりも確実な結果をもたらすことが見出された。そ
の上、融解曲線分析のこの方法は、従来技術の電気泳動的なゲル検出法と同じか
、あるいはそれよりも高感度である。
、ＴＤＦまたは終点蛍光測定よりも確実な結果をもたらすことが見出された。そ
の上、融解曲線分析のこの方法は、従来技術の電気泳動的なゲル検出法と同じか
、あるいはそれよりも高感度である。
【００２６】 本発明は、十分なコピー数の標的ＤＮＡ配列を有する試料（核酸増幅技術から
得られる試料など）に標的ＤＮＡのアニーリング状態から変性状態にまで変化さ
せる１回の温度サイクルを施すこと、および温度および蛍光のデータを得ること
を含む。実際、このデータは、パーキン−エルマー社（Ｔｈｅ Ｐｅｒｋｉｎ−
Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手可能なＡＢＩ７７００などの、
蛍光検出手段を有する熱サイクル装置から得られる。データを分析の用意のため
にエクスポートし、種々の変換で処理される。次いで、処理されたデータは、初
期条件下で試験された既知の例から得られた融解曲線データを用いて調整されて
いる予測モデル化システムに送られる。
得られる試料など）に標的ＤＮＡのアニーリング状態から変性状態にまで変化さ
せる１回の温度サイクルを施すこと、および温度および蛍光のデータを得ること
を含む。実際、このデータは、パーキン−エルマー社（Ｔｈｅ Ｐｅｒｋｉｎ−
Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手可能なＡＢＩ７７００などの、
蛍光検出手段を有する熱サイクル装置から得られる。データを分析の用意のため
にエクスポートし、種々の変換で処理される。次いで、処理されたデータは、初
期条件下で試験された既知の例から得られた融解曲線データを用いて調整されて
いる予測モデル化システムに送られる。
【００２７】 好ましい手法は、（ａ）間隔が一様な温度データポイント（Ｔ）を得るために
データを補間すること、（ｂ）蛍光（Ｆ）の対数を取ること、および（ｃ）結果
を平滑化することである。数理統計学的分析の当業者に知られているＳａｖｉｔ
ｚｋｙ−Ｇｏｌａｙアルゴリズムは、平滑化するために好ましい。負の微分係数
、−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴが計算され、データは、１℃の好ましい間隔で７０℃
から９５℃の間の標的特異的な範囲を用いて１１個から１３個のデータポイント
に減ることが好ましい。図１ａ、図１ｂおよび図１ｃには、リステリア菌から得
られたデータを用いるこの推移が示されている。図１ａには、平滑化された任意
ユニット蛍光（ＦＩＵ）が示されている。図１ｂには、微分係数のプロットが示
され、図１ｃは変換されたデータを示している。標的ＤＮＡから得られるデータ
は、処理可能な数のデータポイントにまで減らすことによって、より低い分解能
にまで最も良く減らす。特異的な標的ＤＮＡに関するデータポイントの最も良い
数の例を、測定される温度範囲とともに表Ｉに記載する。
データを補間すること、（ｂ）蛍光（Ｆ）の対数を取ること、および（ｃ）結果
を平滑化することである。数理統計学的分析の当業者に知られているＳａｖｉｔ
ｚｋｙ−Ｇｏｌａｙアルゴリズムは、平滑化するために好ましい。負の微分係数
、−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴが計算され、データは、１℃の好ましい間隔で７０℃
から９５℃の間の標的特異的な範囲を用いて１１個から１３個のデータポイント
に減ることが好ましい。図１ａ、図１ｂおよび図１ｃには、リステリア菌から得
られたデータを用いるこの推移が示されている。図１ａには、平滑化された任意
ユニット蛍光（ＦＩＵ）が示されている。図１ｂには、微分係数のプロットが示
され、図１ｃは変換されたデータを示している。標的ＤＮＡから得られるデータ
は、処理可能な数のデータポイントにまで減らすことによって、より低い分解能
にまで最も良く減らす。特異的な標的ＤＮＡに関するデータポイントの最も良い
数の例を、測定される温度範囲とともに表Ｉに記載する。
【００２８】
【表１】
【００２９】 （結果） 試料に関する融解曲線を処理するときに生じた蛍光シグナルを分析することに
より、試料に関連する３つの異なるパターンがあることが示された。リステリア
菌に特異的なＤＮＡフラグメントを含有する試料、（サルモネラに基づく）ポシ
ティブコントロールＤＮＡフラグメント、および両方の産物を含有する試料にち
いての特有のパターンがあった（図２〜図５）。これらの試料に関連する特有の
融解曲線パターンがあるので、未知試料の内容物を正しく予測することができる
アルゴリズムを作製することができる。
より、試料に関連する３つの異なるパターンがあることが示された。リステリア
菌に特異的なＤＮＡフラグメントを含有する試料、（サルモネラに基づく）ポシ
ティブコントロールＤＮＡフラグメント、および両方の産物を含有する試料にち
いての特有のパターンがあった（図２〜図５）。これらの試料に関連する特有の
融解曲線パターンがあるので、未知試料の内容物を正しく予測することができる
アルゴリズムを作製することができる。
【００３０】 本発明のプロセスは、広範な標的核酸の存在を検出するために用いることがで
きる。一般に、これらには、細菌、酵母および真菌などの微生物、ならびにウイ
ルス、昆虫、植物、動物およびヒト由来のＤＮＡが含まれるが、これらに限定さ
れない。特に興味あるものは、食品を汚染することが知られている病原性微生物
である。これらには、注意が予防的対策に払われているにも関わらず、非常に多
くの人々を毎年病気にし、死亡させ、迅速で確実な同定が非常に重要となってい
る、大腸菌０１７：Ｈ５７、サルモネラ、リステリア菌、リステリア属、および
カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）が含まれるがこれらに限定す
るものではない。さらに、本発明のプロセスにより、試料が、スメアとして定義
される多サイズのＤＮＡ増幅産物を含有するかどうかを検出することができる。
きる。一般に、これらには、細菌、酵母および真菌などの微生物、ならびにウイ
ルス、昆虫、植物、動物およびヒト由来のＤＮＡが含まれるが、これらに限定さ
れない。特に興味あるものは、食品を汚染することが知られている病原性微生物
である。これらには、注意が予防的対策に払われているにも関わらず、非常に多
くの人々を毎年病気にし、死亡させ、迅速で確実な同定が非常に重要となってい
る、大腸菌０１７：Ｈ５７、サルモネラ、リステリア菌、リステリア属、および
カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）が含まれるがこれらに限定す
るものではない。さらに、本発明のプロセスにより、試料が、スメアとして定義
される多サイズのＤＮＡ増幅産物を含有するかどうかを検出することができる。
【００３１】 （分析プロトコルの詳細） データを分析するためのコンピュータのプログラム化用アルゴリズムを得るた
めに３通りの方法を用いた。これらは、ニューラルネットワーク、ＩｎｆｏＥｖ
ｏｌｖｅおよびＬｏｇｉｓｔｉｃ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎである。ニューラルネ
ットワーク法およびＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅ法が、本発明を実施するためには好ま
しい。当業者には明らかであるように、他のモデル化技術も良く用いることがで
きるであろう。さらに、該方法には、実際に好ましいハイブリッドモデルの使用
が含まれる。この場合、平滑化されたデータ集合は２つ以上の方法で分析され、
その結果は、データの偏りおよびモデルの偏りの両方を最少にするために重みを
加えてまたは重みを加えることなくポーリングされる。
めに３通りの方法を用いた。これらは、ニューラルネットワーク、ＩｎｆｏＥｖ
ｏｌｖｅおよびＬｏｇｉｓｔｉｃ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎである。ニューラルネ
ットワーク法およびＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅ法が、本発明を実施するためには好ま
しい。当業者には明らかであるように、他のモデル化技術も良く用いることがで
きるであろう。さらに、該方法には、実際に好ましいハイブリッドモデルの使用
が含まれる。この場合、平滑化されたデータ集合は２つ以上の方法で分析され、
その結果は、データの偏りおよびモデルの偏りの両方を最少にするために重みを
加えてまたは重みを加えることなくポーリングされる。
【００３２】 これらの方法を下記に概略する： （ニューラルネットの説明） ニューラルネットの方法論は広く普及している。これは、ヒトの脳が機能する
プロセスを複製しようとする試みから得られる。本発明において用いられる特定
の方法は米国特許第４，７７３，０２４号、同第５，０４６，０２０同および同
第５，１１９，４６８号に記載されている。これらの内容はすべて援用により本
明細書中に取り入れる。
プロセスを複製しようとする試みから得られる。本発明において用いられる特定
の方法は米国特許第４，７７３，０２４号、同第５，０４６，０２０同および同
第５，１１９，４６８号に記載されている。これらの内容はすべて援用により本
明細書中に取り入れる。
【００３３】 （ニューラルネットワークの説明） 人工的なニューラルネットワークまたは並列的に分布する処理ネットワークは
、相互に接続された処理エレメントの多層的な配置として実行されるコンピュー
タ回路である。逆伝搬ネットワーク（ｂａｃｋ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｎｅ
ｔｗｏｒｋ）として知られている並列的に分布するネットワークの典型的な配置
において、ネットワークアーキテクチャは、少なくとも３層の処理エレメントま
たは処理ユニットを含む：第１層または「入力」層；第２層、中間層、または「
隠れ（ｈｉｄｄｅｎ）」層；および第３層または「出力」層。別の隠れ層も存在
し得る。
、相互に接続された処理エレメントの多層的な配置として実行されるコンピュー
タ回路である。逆伝搬ネットワーク（ｂａｃｋ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｎｅ
ｔｗｏｒｋ）として知られている並列的に分布するネットワークの典型的な配置
において、ネットワークアーキテクチャは、少なくとも３層の処理エレメントま
たは処理ユニットを含む：第１層または「入力」層；第２層、中間層、または「
隠れ（ｈｉｄｄｅｎ）」層；および第３層または「出力」層。別の隠れ層も存在
し得る。
【００３４】 これらの層は、典型的には、重み（すなわち、それぞれの入力ユニットからそ
れぞれの隠れユニットまでの重み、それぞれの隠れユニットからそれぞれの出力
ユニットまでの重み）を伴って完全に接続され、隠れ層および出力層におけるそ
れぞれのユニットの出力が、先行する層から生じる接続の加重和、その後のシグ
モイドまたは双曲正接のような非線形伝達関数によってもたらされる。このネッ
トワークアーキテクチャは、ＲｕｍｅｌｈａｒｔおよびＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ（
１９８６）に記載されている。
れぞれの隠れユニットまでの重み、それぞれの隠れユニットからそれぞれの出力
ユニットまでの重み）を伴って完全に接続され、隠れ層および出力層におけるそ
れぞれのユニットの出力が、先行する層から生じる接続の加重和、その後のシグ
モイドまたは双曲正接のような非線形伝達関数によってもたらされる。このネッ
トワークアーキテクチャは、ＲｕｍｅｌｈａｒｔおよびＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ（
１９８６）に記載されている。
【００３５】 ネットワークの重みは、観測出力に対する予測出力の平方和を最少にするため
に接続加重を変化させることの繰り返し手順によって調整データ集合に関して得
られる。ネットワークを調整する方法には、デルタルール（Ｒｕｍｅｌｈａｒｔ
およびＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ、１９８６）、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａ
ｒｄｔ法、共役勾配、擬Ｎｅｗｔｏｎ法（ｑｕａｓｉ−Ｎｅｗｔｏｎ ｍｅｔｏ
ｄ）（Ｈｅｒｔｚ他、１９９１）、およびｓｔｉｆｆ逆伝搬法（Ｆｉｌｋｉｎ、
米国特許第５，０４６，０２０号）が含まれる。重みが調整データ集合から決定
されると、速いフィードフォワードコンピュータ処理により、新しいデータ試料
に対する出力予測値が得られる。
に接続加重を変化させることの繰り返し手順によって調整データ集合に関して得
られる。ネットワークを調整する方法には、デルタルール（Ｒｕｍｅｌｈａｒｔ
およびＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ、１９８６）、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａ
ｒｄｔ法、共役勾配、擬Ｎｅｗｔｏｎ法（ｑｕａｓｉ−Ｎｅｗｔｏｎ ｍｅｔｏ
ｄ）（Ｈｅｒｔｚ他、１９９１）、およびｓｔｉｆｆ逆伝搬法（Ｆｉｌｋｉｎ、
米国特許第５，０４６，０２０号）が含まれる。重みが調整データ集合から決定
されると、速いフィードフォワードコンピュータ処理により、新しいデータ試料
に対する出力予測値が得られる。
【００３６】 （融解曲線データ分析に関するニューラルネット方法論の詳細な説明） データ分析法の目的は、温度（Ｔ）の関数として光子（Ｆ）の割合を計数して
観測された融解曲線を取得すること、およびその情報をコンピュータに入力する
ことである。コンピュータは、対応する試料が病原体の特異的なＤＮＡで汚染さ
れていたか否かを予測するためにプログラム化されている。図７には、本発明の
データ分析法が記載されている。
観測された融解曲線を取得すること、およびその情報をコンピュータに入力する
ことである。コンピュータは、対応する試料が病原体の特異的なＤＮＡで汚染さ
れていたか否かを予測するためにプログラム化されている。図７には、本発明の
データ分析法が記載されている。
【００３７】 生の融解曲線データととも開始される：蛍光の変化Ｆ（ｔ）（ただし、Ｆ＝蛍
光、ｔ＝時間）がブロックＡのように１組の温度Ｔ（ｔ）において測定される。
サルモネラ含有試料に関する融解曲線の例については図８を参照のこと。最初に
、図７のブロックＢに示されているように、融解曲線スペクトルを作成するため
にデータに対する前処理が行われる。熱サイクル装置（パーキンエルマー７７０
０）による温度Ｔ（ｔ）出力は必ずしも等間隔になっていないので、線形的な補
間を用いて、等間隔の温度Ｔ（ｔ’）とその対応する蛍光Ｆ（ｔ’）との配列を
作製する。好ましい実施では、等間隔の温度幅は０．１℃である。
光、ｔ＝時間）がブロックＡのように１組の温度Ｔ（ｔ）において測定される。
サルモネラ含有試料に関する融解曲線の例については図８を参照のこと。最初に
、図７のブロックＢに示されているように、融解曲線スペクトルを作成するため
にデータに対する前処理が行われる。熱サイクル装置（パーキンエルマー７７０
０）による温度Ｔ（ｔ）出力は必ずしも等間隔になっていないので、線形的な補
間を用いて、等間隔の温度Ｔ（ｔ’）とその対応する蛍光Ｆ（ｔ’）との配列を
作製する。好ましい実施では、等間隔の温度幅は０．１℃である。
【００３８】 次に、蛍光の等間隔の観測値は、スペクトルのように見えるシグナルを得るた
めに変換される。スペクトルは、１つまたは２つ以上のスペクトルピークを有す
る正の定符号の曲線である。統計界でランダム変数に一般に適用される変換には
、指数関数、対数関数、べき乗則などが含まれる（ＶｅｌｌｅｍａｎおよびＶｅ
ｌｌｅｍａｎ、１９８８）。スペクトルに関して、変換には、多くの場合、平滑
化、微分、規格化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）、反射から吸収、および乗法
散乱補正（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｓｃａｔｔｅｒ ｃｏｒｒｅｃｔｉ
ｏｎ）などが含まれる（Ｃａｍｏ ＡＳ、１９９６）。好ましい実施において、
変換では、蛍光の対数（ｌｏｇ）をとり、続いて一次微分係数に負号をつける：
めに変換される。スペクトルは、１つまたは２つ以上のスペクトルピークを有す
る正の定符号の曲線である。統計界でランダム変数に一般に適用される変換には
、指数関数、対数関数、べき乗則などが含まれる（ＶｅｌｌｅｍａｎおよびＶｅ
ｌｌｅｍａｎ、１９８８）。スペクトルに関して、変換には、多くの場合、平滑
化、微分、規格化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）、反射から吸収、および乗法
散乱補正（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｓｃａｔｔｅｒ ｃｏｒｒｅｃｔｉ
ｏｎ）などが含まれる（Ｃａｍｏ ＡＳ、１９９６）。好ましい実施において、
変換では、蛍光の対数（ｌｏｇ）をとり、続いて一次微分係数に負号をつける：
【００３９】 スペクトル＝−ｄｌｏｇ（Ｆ）／ｄＴ
【００４０】 その後の分析のために、ブロックＡとブロックＢとの間の前処理ステップによ
り、測定における変動またはノイズも減少するはずである。これは、シグナルｌ
ｏｇ（Ｆ（ｔ’））の平均化、積分化または平滑化を行うことによって行われる
。好ましい実施では、平滑化および微分係数の両方が、２．５℃の平滑化間隔で
Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴリズム（ＰＬＳ Ｔｏｏｌｂｏｘ
ｆｏｒ Ｍｅｔｌａｂ、ＥｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）
を用いて行われる。図８における生の融解曲線データに対応する融解曲線スペク
トル（ブロックＢ）が図９に示されている。スペクトルは滑らかで、正であり、
十分に区別されるピークを有することに留意されたい。次いで、融解曲線スペク
トル（ブロックＢ）を、図７に示されているように２つの並列した方法によって
分析する。左側の代替法であるブロックＣにおいて、スペクトルを平均化または
部分サンプリング（ｓｕｂｓｕｍｐｌｅｄ）し、より少ない点を有するスペクト
ルが作製される。これは、より少ない特徴について調整したときに経験的なモデ
ルが一般的に一層ロバストになるために行われる。温度の間隔は、１０個の連続
したデータポイントを平均化することにより、または１０番目のデータポイント
をそれぞれ用いること（部分サンプリング）によって、０．１℃から１．０℃に
増加する。
り、測定における変動またはノイズも減少するはずである。これは、シグナルｌ
ｏｇ（Ｆ（ｔ’））の平均化、積分化または平滑化を行うことによって行われる
。好ましい実施では、平滑化および微分係数の両方が、２．５℃の平滑化間隔で
Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴリズム（ＰＬＳ Ｔｏｏｌｂｏｘ
ｆｏｒ Ｍｅｔｌａｂ、ＥｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）
を用いて行われる。図８における生の融解曲線データに対応する融解曲線スペク
トル（ブロックＢ）が図９に示されている。スペクトルは滑らかで、正であり、
十分に区別されるピークを有することに留意されたい。次いで、融解曲線スペク
トル（ブロックＢ）を、図７に示されているように２つの並列した方法によって
分析する。左側の代替法であるブロックＣにおいて、スペクトルを平均化または
部分サンプリング（ｓｕｂｓｕｍｐｌｅｄ）し、より少ない点を有するスペクト
ルが作製される。これは、より少ない特徴について調整したときに経験的なモデ
ルが一般的に一層ロバストになるために行われる。温度の間隔は、１０個の連続
したデータポイントを平均化することにより、または１０番目のデータポイント
をそれぞれ用いること（部分サンプリング）によって、０．１℃から１．０℃に
増加する。
【００４１】 次いで、１０個から１４個の間の点からなるブロックＣでの部分サンプリング
された融解曲線スペクトルは、ニューラルネットワークモデル（ブロックＥ）ま
たはＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅモデル（ブロックＦ）のいずれかとともに用いること
ができる。図７の右側の枝のブロックＤにおいて、融解曲線スペクトルをＩｎｆ
ｏＥｖｏｌｖｅモデルとともに用いて、情報に富む温度の組を選択することがで
きる。（下記のＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅの議論を参照のこと）。次いで、これらの
温度に対応する融解曲線スペクトル（その数は分析者によって選択することがで
きる）は、ニューラルネットワークモデル（ブロックＥ）またはＩｎｆｏＥｖｏ
ｌｖｅモデル（ブロックＦ）のいずれかとともに用いることができる。
された融解曲線スペクトルは、ニューラルネットワークモデル（ブロックＥ）ま
たはＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅモデル（ブロックＦ）のいずれかとともに用いること
ができる。図７の右側の枝のブロックＤにおいて、融解曲線スペクトルをＩｎｆ
ｏＥｖｏｌｖｅモデルとともに用いて、情報に富む温度の組を選択することがで
きる。（下記のＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅの議論を参照のこと）。次いで、これらの
温度に対応する融解曲線スペクトル（その数は分析者によって選択することがで
きる）は、ニューラルネットワークモデル（ブロックＥ）またはＩｎｆｏＥｖｏ
ｌｖｅモデル（ブロックＦ）のいずれかとともに用いることができる。
【００４２】 部分サンプリング（ブロックＣ）された、あるいは少数の情報に富む温度が選
択された、融解曲線スペクトルが与えられると、混入または非混入として試料の
分類を決定するためにモデルが作製される。混入サルモネラの試料を図９に示す
。分類を決定するために用いることができる多くの可能な経験的なモデルが存在
する。これには、多重線形回帰、偏最小二乗（ＰＬＳ（Ｐａｒｔｉａｌ Ｌｅａ
ｓｔ Ｓｑｕａｒｅｓ））、クラスアナロジーの柔軟反復モデル化（ＳＩＭＣＡ
（ｓｏｆｔ ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｃｌａｓｓ ａｎ
ａｌｏｇｙ））、ロジスティック回帰、フィードフォワードニューラルネットワ
ーク、ならびにＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅが含まれる。最初の４つの方法は線形的な
方法であり、ＰＬＳ Ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ Ｍｅｔｌａｂ（Ｅｉｇｅｎｖｅ
ｃｔｏｒＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）に記載されている。ニューラルネットワ
ークおよびＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅは非線形的な方法である。これらの方法の６つ
すべてを検討した。融解曲線分析の場合、試料毎にピーク位置は少し変化してい
た。したがって、非線形的な方法は、線形的な方法よりも良好な分類精度を提供
する。しかし、それぞれの方法の長所および短所は明らかに異なっていた。この
ことは、ニューラルネットの不正確度は、ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅの不正確度と完
全に重ならなかったことを意味する。同様に、線形的な方法はそれぞれ、いくら
かの重複しない不正確度を示した。したがって、複数の方法を同時に用いること
によって、分析の全体的な精度を増大させることが可能である。
択された、融解曲線スペクトルが与えられると、混入または非混入として試料の
分類を決定するためにモデルが作製される。混入サルモネラの試料を図９に示す
。分類を決定するために用いることができる多くの可能な経験的なモデルが存在
する。これには、多重線形回帰、偏最小二乗（ＰＬＳ（Ｐａｒｔｉａｌ Ｌｅａ
ｓｔ Ｓｑｕａｒｅｓ））、クラスアナロジーの柔軟反復モデル化（ＳＩＭＣＡ
（ｓｏｆｔ ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｃｌａｓｓ ａｎ
ａｌｏｇｙ））、ロジスティック回帰、フィードフォワードニューラルネットワ
ーク、ならびにＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅが含まれる。最初の４つの方法は線形的な
方法であり、ＰＬＳ Ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ Ｍｅｔｌａｂ（Ｅｉｇｅｎｖｅ
ｃｔｏｒＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）に記載されている。ニューラルネットワ
ークおよびＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅは非線形的な方法である。これらの方法の６つ
すべてを検討した。融解曲線分析の場合、試料毎にピーク位置は少し変化してい
た。したがって、非線形的な方法は、線形的な方法よりも良好な分類精度を提供
する。しかし、それぞれの方法の長所および短所は明らかに異なっていた。この
ことは、ニューラルネットの不正確度は、ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅの不正確度と完
全に重ならなかったことを意味する。同様に、線形的な方法はそれぞれ、いくら
かの重複しない不正確度を示した。したがって、複数の方法を同時に用いること
によって、分析の全体的な精度を増大させることが可能である。
【００４３】 この特定の適用におけるモデル化の使用を議論する前に、背景を概略すること
が良いと考えられる。
が良いと考えられる。
【００４４】 （スペクトルデータの分析） 化学測定学の分野では、スペクトルを分析して、該スペクトルを生じる化学物
質の性質に該スペクトルを関連づけることが一般的である。一次元のスペクトル
の場合、実際値の出力を予測するために最も用いられている方法は、偏最小二乗
（ＰＬＳ）である（Ｃａｍｏ ＡＳ、１９９６、Ｅｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ、１９９８）。分類出力を予測する場合、ＰＬＳが、クラスアナロ
ジーの柔軟推定モデル化（ＳＩＭＣＡ）と同様に用いられている。本発明におい
て実施される線形的な方法はロジスティック回帰としたが、前記に言及された線
形的な方法の任意の１つまたは群を記載された方法において利用できることが考
えられる。さらに、線形的な方法を組み合せることにより、単一の方法で行われ
たときの分析の精度が改善することができることが考えられる。入力と出力との
間に線形的な関係が得られるこれらの方法は、主成分分析［ＰＣＡ］の次元減少
技術に密接に関連している。通常、完全な分解能ではなくむしろ、より少ない数
の部分サンプリングまたは平滑化した値を有するスペクトルを分析するために、
ときどきニューラルネットワークも用いられる（Ｏｗｅｎｓ、１９９８）。
質の性質に該スペクトルを関連づけることが一般的である。一次元のスペクトル
の場合、実際値の出力を予測するために最も用いられている方法は、偏最小二乗
（ＰＬＳ）である（Ｃａｍｏ ＡＳ、１９９６、Ｅｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ、１９９８）。分類出力を予測する場合、ＰＬＳが、クラスアナロ
ジーの柔軟推定モデル化（ＳＩＭＣＡ）と同様に用いられている。本発明におい
て実施される線形的な方法はロジスティック回帰としたが、前記に言及された線
形的な方法の任意の１つまたは群を記載された方法において利用できることが考
えられる。さらに、線形的な方法を組み合せることにより、単一の方法で行われ
たときの分析の精度が改善することができることが考えられる。入力と出力との
間に線形的な関係が得られるこれらの方法は、主成分分析［ＰＣＡ］の次元減少
技術に密接に関連している。通常、完全な分解能ではなくむしろ、より少ない数
の部分サンプリングまたは平滑化した値を有するスペクトルを分析するために、
ときどきニューラルネットワークも用いられる（Ｏｗｅｎｓ、１９９８）。
【００４５】 （融解曲線分析に対するニューラルネットワークの適用） 好ましい実施態様において用いられるニューラルネットワーク（ブロックＥ）
は、融解曲線スペクトル（−ｄｌｏｇ（Ｆ）／ｄＴ）上の１０個から１４個の部
分サンプリングされた点の各々のための１つの入力ユニット、数Ｍの隠れユニッ
ト、および非混入試料に対応する０の目標および混入試料に対応する１の目標を
有する１つの出力ユニットを有する、フィードフォワード多層パーセプトロンで
ある（ＲｕｍｅｌｈａｒｔおよびＭａＣｌｅｌｌａｎｄ、１９８６）。好ましい
実施態様において、このネットワークは、「Ｔｈｅ Ｎｅｕｒａｌ Ｗｅｂｋｉ
ｔ」（ｖａｎ Ｓｔｅｋｅｎｌｅｎｂｏｒｇ、１９９７）と呼ばれる、デュポン
が権利を有するソフトウエアパッケージで、スティフ逆伝搬法（Ｆｉｌｋｉｎ、
米国特許第５，０４６，０２０号）を用いて調整される。入力エレメントを一緒
にスケーリングし、これはスペクトルに適切である。隠れユニットの数Ｍは、特
定の試験データ集合に対して最も良い分類精度をもたらすその数として選ばれる
。典型的には、本研究における病原体についてはＭ＝２または３である。
は、融解曲線スペクトル（−ｄｌｏｇ（Ｆ）／ｄＴ）上の１０個から１４個の部
分サンプリングされた点の各々のための１つの入力ユニット、数Ｍの隠れユニッ
ト、および非混入試料に対応する０の目標および混入試料に対応する１の目標を
有する１つの出力ユニットを有する、フィードフォワード多層パーセプトロンで
ある（ＲｕｍｅｌｈａｒｔおよびＭａＣｌｅｌｌａｎｄ、１９８６）。好ましい
実施態様において、このネットワークは、「Ｔｈｅ Ｎｅｕｒａｌ Ｗｅｂｋｉ
ｔ」（ｖａｎ Ｓｔｅｋｅｎｌｅｎｂｏｒｇ、１９９７）と呼ばれる、デュポン
が権利を有するソフトウエアパッケージで、スティフ逆伝搬法（Ｆｉｌｋｉｎ、
米国特許第５，０４６，０２０号）を用いて調整される。入力エレメントを一緒
にスケーリングし、これはスペクトルに適切である。隠れユニットの数Ｍは、特
定の試験データ集合に対して最も良い分類精度をもたらすその数として選ばれる
。典型的には、本研究における病原体についてはＭ＝２または３である。
【００４６】 ２つ（またはそれ以上）の同時分析が同じ反応物において行われる場合がある
（実施例７を参照のこと）。これらの反応物において、標的生物（標的）由来の
増幅ＤＮＡが、内部ポシティブコントロールＤＮＡ（ＩＮＰＣ）由来の増幅産物
と同時に検出される。標的およびＩＮＰＣフラグメントは同じ基質プールから作
製されるので、融解曲線スペクトルにおけるそのピーク高さは関連している。ニ
ューラルネットワークは、標的およびＩＮＰＣのような２つの関連する同時出力
をモデル化することができる。融解曲線スペクトルの温度範囲は、標的およびＩ
ＮＰＣに対する両方のピーク温度を含まなければならない。
（実施例７を参照のこと）。これらの反応物において、標的生物（標的）由来の
増幅ＤＮＡが、内部ポシティブコントロールＤＮＡ（ＩＮＰＣ）由来の増幅産物
と同時に検出される。標的およびＩＮＰＣフラグメントは同じ基質プールから作
製されるので、融解曲線スペクトルにおけるそのピーク高さは関連している。ニ
ューラルネットワークは、標的およびＩＮＰＣのような２つの関連する同時出力
をモデル化することができる。融解曲線スペクトルの温度範囲は、標的およびＩ
ＮＰＣに対する両方のピーク温度を含まなければならない。
【００４７】 ニューラルネットワークは、ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅ（ブロックＤ）によって作
製された情報に富む領域に対するデータを用いて調整することもできる。これに
より別のニューラルネットワークモデルがもたらされる。それも、ブロックＣま
たはブロックＤからの入力を用いて多数のデータ集合について調整され、それぞ
れが非混入対混入の分類予測を行うことができるいくつかの並列ニューラルネッ
トワークモデルを作製することができる。
製された情報に富む領域に対するデータを用いて調整することもできる。これに
より別のニューラルネットワークモデルがもたらされる。それも、ブロックＣま
たはブロックＤからの入力を用いて多数のデータ集合について調整され、それぞ
れが非混入対混入の分類予測を行うことができるいくつかの並列ニューラルネッ
トワークモデルを作製することができる。
【００４８】 （ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅの説明） 別の好ましい予測モデルであるＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅ（図７のブロックＦ）は
、進化原理を情報理論に適用する方法論である。それは、１９９９年４月３０日
に出願され、そして本出願と共有であり、かつ本出願と同日に出願された米国仮
特許出願第６０／１３１，８０４号の主題である。その内容は援用により本明細
書中に取り入れる。
、進化原理を情報理論に適用する方法論である。それは、１９９９年４月３０日
に出願され、そして本出願と共有であり、かつ本出願と同日に出願された米国仮
特許出願第６０／１３１，８０４号の主題である。その内容は援用により本明細
書中に取り入れる。
【００４９】 この方法は、アーキテクチャにおいて、非線形で、ロバストで、かつ固有的に
並列で（ｐａｒａｌｌｅｌ）、複雑な多次元処理のモデル化に適している。さら
に、これは、自然の結果として、データのインバースプロブレムまたはプロセス
制御に対する解を同時に作製する。重要な利点は、手動でのモデル化作業のため
に、最も情報に富む入力または入力の組合せが同定されることである。これによ
り、決定を行うための最適な方針を開発することが助けられる。例えば、ＤＮＡ
を同定する際、融解曲線温度スペクトルの最も情報に富む部分の位置を特定でき
ることにより、最もロバストな予測経験的モデルの開発が可能になる。画像分析
から得られる概念を用いた関連データの可視化ツールも概念化の一部である。こ
れにより、多次元データ空間における情報に富む域の容易な可視化が可能になり
、プロセス空間における出発点から目標の終点までの最も情報に富む経路を同定
するための方法が導かれる。
並列で（ｐａｒａｌｌｅｌ）、複雑な多次元処理のモデル化に適している。さら
に、これは、自然の結果として、データのインバースプロブレムまたはプロセス
制御に対する解を同時に作製する。重要な利点は、手動でのモデル化作業のため
に、最も情報に富む入力または入力の組合せが同定されることである。これによ
り、決定を行うための最適な方針を開発することが助けられる。例えば、ＤＮＡ
を同定する際、融解曲線温度スペクトルの最も情報に富む部分の位置を特定でき
ることにより、最もロバストな予測経験的モデルの開発が可能になる。画像分析
から得られる概念を用いた関連データの可視化ツールも概念化の一部である。こ
れにより、多次元データ空間における情報に富む域の容易な可視化が可能になり
、プロセス空間における出発点から目標の終点までの最も情報に富む経路を同定
するための方法が導かれる。
【００５０】 この方法の基本的な仮定は、多くの明らかに無秩序な系に基礎をなす秩序があ
り、データ集合の最適な（最も情報に富む）提示を進化させることによって、基
礎をなす構造が解明することができるということである。この方法では、局所的
な情報測定および全体的な情報測定の両方が、多次元的な特徴空間の情報内容を
特徴付ける際に用いられる。経験的な結果は、局所的な情報によってモデルの予
測能が支配されていることを示している。したがって、この方法は、１つの解に
収束する主要な機構として全データ集合に対する全体的な最適化を用いる多くの
他の方法とは対照的に、全体に影響を及ぼす（ｇｌｏｂａｌｌｙ−ｉｎｆｌｕｅ
ｎｃｅｄ）局所的な技術である。
り、データ集合の最適な（最も情報に富む）提示を進化させることによって、基
礎をなす構造が解明することができるということである。この方法では、局所的
な情報測定および全体的な情報測定の両方が、多次元的な特徴空間の情報内容を
特徴付ける際に用いられる。経験的な結果は、局所的な情報によってモデルの予
測能が支配されていることを示している。したがって、この方法は、１つの解に
収束する主要な機構として全データ集合に対する全体的な最適化を用いる多くの
他の方法とは対照的に、全体に影響を及ぼす（ｇｌｏｂａｌｌｙ−ｉｎｆｌｕｅ
ｎｃｅｄ）局所的な技術である。
【００５１】 ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅモデル化／発見の枠組みは大きく２つの段階に分割され
る。第１段階は、特定のモデル化問題に対する入力特徴の最も情報に富む組合せ
を進化させる「特徴同定」のプロセスを示す（図７のボックスＢからボックスＤ
に至る）。第２段階は、最も良い予測モデルを第１段階で発見された情報に富む
特徴を用いて進化させた「モデル進化（Ｍｏｄｅｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）」の
プロセスを示す（図７のボックスＤからボックスＦに至る）。
る。第１段階は、特定のモデル化問題に対する入力特徴の最も情報に富む組合せ
を進化させる「特徴同定」のプロセスを示す（図７のボックスＢからボックスＤ
に至る）。第２段階は、最も良い予測モデルを第１段階で発見された情報に富む
特徴を用いて進化させた「モデル進化（Ｍｏｄｅｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）」の
プロセスを示す（図７のボックスＤからボックスＦに至る）。
【００５２】 特徴同定の段階において、潜在的に多くの入力特徴リストが提供され、該入力
特徴リストの多くは手によるモデル化問題に関連しないであろう。モデル化問題
の次元数が減少するように、遺伝的枠組みを用いて、入力特徴の最も情報に富む
部分集合（ｓｕｂｓｅｔ）を進化させる。これは、よりロバストな予測モデルを
開発するために非常に重要である。最初に、ランダムに選択された特徴組合せの
一群から開始する。調整データ集合が、それぞれの特徴組合せに対応する定量化
された部分空間（ｓｕｂｓｐａｃｅ）に射影される。それぞれの部分空間は、異
なる過剰なセルからなる過剰体積としてみなすことができる。データ射影処理の
際に、体積中のこれらのセルの多くは、セルに射影される個々のデータポイント
によって占められる。
特徴リストの多くは手によるモデル化問題に関連しないであろう。モデル化問題
の次元数が減少するように、遺伝的枠組みを用いて、入力特徴の最も情報に富む
部分集合（ｓｕｂｓｅｔ）を進化させる。これは、よりロバストな予測モデルを
開発するために非常に重要である。最初に、ランダムに選択された特徴組合せの
一群から開始する。調整データ集合が、それぞれの特徴組合せに対応する定量化
された部分空間（ｓｕｂｓｐａｃｅ）に射影される。それぞれの部分空間は、異
なる過剰なセルからなる過剰体積としてみなすことができる。データ射影処理の
際に、体積中のこれらのセルの多くは、セルに射影される個々のデータポイント
によって占められる。
【００５３】 データのすべてが部分空間に射影された後、部分空間の情報内容が、情報理論
から得られるエントロピー尺度を用いて測定することができる（Ｓｈａｎｎｏｎ
、１９９７）。セルの局所的な情報内容は、そのセルに存在する出力状態の相対
的な分布によって表すことができる。例えば、セルに射影されるすべてのデータ
ポイントが１つの出力状態を表す場合、そのセルは相対的に情報に富むと見なさ
れる。逆に、多数の出力状態が特定のセルにおけるデータポイントの集合におい
て示される場合、そのセルは相対的に情報に乏しいと見なされる。図１０には、
代表的な特徴部分空間における情報に富むセルおよび情報に乏しいセルの両方が
例示されている。図において、丸い点は出力状態１を表し、四角の点は出力状態
２を表している。セル内における出力状態の分布に基づいて特徴部分空間内の各
セルの情報内容を測定するために、局所的なエントロピーとして知られている尺
度を定義することができる（Ｓｈａｎｏｎ、１９９７；Ｈａｙａｓｈｉ他、１９
９１；Ｈａｙａｓｈｉ他、１９９２）。部分空間の全体的なエントロピーは、部
分空間体積を含むセルのすべてにわたる局所的なセルエントロピーの数加重和と
して計算することができる。
から得られるエントロピー尺度を用いて測定することができる（Ｓｈａｎｎｏｎ
、１９９７）。セルの局所的な情報内容は、そのセルに存在する出力状態の相対
的な分布によって表すことができる。例えば、セルに射影されるすべてのデータ
ポイントが１つの出力状態を表す場合、そのセルは相対的に情報に富むと見なさ
れる。逆に、多数の出力状態が特定のセルにおけるデータポイントの集合におい
て示される場合、そのセルは相対的に情報に乏しいと見なされる。図１０には、
代表的な特徴部分空間における情報に富むセルおよび情報に乏しいセルの両方が
例示されている。図において、丸い点は出力状態１を表し、四角の点は出力状態
２を表している。セル内における出力状態の分布に基づいて特徴部分空間内の各
セルの情報内容を測定するために、局所的なエントロピーとして知られている尺
度を定義することができる（Ｓｈａｎｏｎ、１９９７；Ｈａｙａｓｈｉ他、１９
９１；Ｈａｙａｓｈｉ他、１９９２）。部分空間の全体的なエントロピーは、部
分空間体積を含むセルのすべてにわたる局所的なセルエントロピーの数加重和と
して計算することができる。
【００５４】 特徴部分空間を定量化する方法は局所的なエントロピーを決定する際に重要で
あることに注意している。細かすぎる定量化分解能の極限的な制限において、そ
れぞれのセルは１または０のいずれかのデータポイントをセル内に有し、その結
果、人工的に高度な情報内容をもたらすことができる。逆に、粗すぎる定量化は
、それぞれのセルに多すぎる出力状態を含むことによって情報内容を人工的に低
下させることができる。したがって、ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅ枠組みの一部は、最
も良い予測モデルを進化させるために最適な定量化レベルを同定するという問題
を取り扱う。
あることに注意している。細かすぎる定量化分解能の極限的な制限において、そ
れぞれのセルは１または０のいずれかのデータポイントをセル内に有し、その結
果、人工的に高度な情報内容をもたらすことができる。逆に、粗すぎる定量化は
、それぞれのセルに多すぎる出力状態を含むことによって情報内容を人工的に低
下させることができる。したがって、ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅ枠組みの一部は、最
も良い予測モデルを進化させるために最適な定量化レベルを同定するという問題
を取り扱う。
【００５５】 次いで、最初のランダムプールの部分空間における各部分空間の全体的なエン
トロピーを、最も情報に富む部分空間を進化させるための進化プロセスを働かせ
る適合関数（ｆｉｔｎｅｓｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）として用いる。標準的な遺伝
的アルゴリズムを、この課題を行うために採用した（Ｈｏｌｌａｎｄ、１９７５
；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、１９８９；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、１９９７）。情報に富む入
力特徴組合せの最終的なプールを、ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅのモデル進化期に対す
る入力として直接的に用いることができる。あるいは、最終的なプールから得ら
れる入力特徴頻度のヒストグラムを作製することによって、このプールを統計的
に分析し、最も高頻度に存在する入力を単離することができる。このヒストグラ
ムを情報マップと呼ぶ。入力特徴の部分集合が情報マップから単離されると（図
１１および図１２を参照）、この部分集合のすべての部分次元（ｓｕｂ ｄｉｍ
ｅｎｓｉｏｎｓ）にわたる徹底的な検討を行なって、この特徴部分集合を含む最
適なモデル化アーキテクチャを決定することができる。例えば、１２個の入力特
徴が情報マップから選択された場合、試験集合（ｔｅｓｔ ｓｅｔ）に対してこ
れらの１２個の特徴の一次元射影のすべてを試験して、試験誤差率を決定するこ
とができる。試験誤差率が特徴部分空間の特定の部分集合についてどのように測
定されるかを次の段落で説明する。二次元的、三次元的および高次元の射影のす
べてを、試験集合に対するモデル化精度に関してそれぞれ検討することによって
、このプロセスを繰り返すことができる。最適な次元数が決定されると、最適な
次元性（ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌｉｔｙ）と一致する特徴部分空間組合せのすべ
てをコンピュータ処理することができ、この部分空間集合をモデル進化期への入
力として用いることができる。
トロピーを、最も情報に富む部分空間を進化させるための進化プロセスを働かせ
る適合関数（ｆｉｔｎｅｓｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）として用いる。標準的な遺伝
的アルゴリズムを、この課題を行うために採用した（Ｈｏｌｌａｎｄ、１９７５
；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、１９８９；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、１９９７）。情報に富む入
力特徴組合せの最終的なプールを、ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅのモデル進化期に対す
る入力として直接的に用いることができる。あるいは、最終的なプールから得ら
れる入力特徴頻度のヒストグラムを作製することによって、このプールを統計的
に分析し、最も高頻度に存在する入力を単離することができる。このヒストグラ
ムを情報マップと呼ぶ。入力特徴の部分集合が情報マップから単離されると（図
１１および図１２を参照）、この部分集合のすべての部分次元（ｓｕｂ ｄｉｍ
ｅｎｓｉｏｎｓ）にわたる徹底的な検討を行なって、この特徴部分集合を含む最
適なモデル化アーキテクチャを決定することができる。例えば、１２個の入力特
徴が情報マップから選択された場合、試験集合（ｔｅｓｔ ｓｅｔ）に対してこ
れらの１２個の特徴の一次元射影のすべてを試験して、試験誤差率を決定するこ
とができる。試験誤差率が特徴部分空間の特定の部分集合についてどのように測
定されるかを次の段落で説明する。二次元的、三次元的および高次元の射影のす
べてを、試験集合に対するモデル化精度に関してそれぞれ検討することによって
、このプロセスを繰り返すことができる。最適な次元数が決定されると、最適な
次元性（ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌｉｔｙ）と一致する特徴部分空間組合せのすべ
てをコンピュータ処理することができ、この部分空間集合をモデル進化期への入
力として用いることができる。
【００５６】 ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅの第２期において、上記に記載された方法によって決定
された特徴部分空間のプールを、最少の試験誤差をもたらす特徴部分空間の最適
な部分集合を進化させるための入力として用いる。遺伝的枠組みもこの段階にお
いて用いられるが、第２の進化段階を働かせる適合関数は、経験的なモデルを開
発するために用いる試験データ集合の予測誤差に基づく。この場合、特徴部分空
間の入力プールから得られる特徴部分空間の部分集合のランダムに選択されたプ
ールから開始する。特徴部分空間の特定の部分集合について、調整用データが上
記のそれぞれの特徴部分空間に射影され、全体的なエントロピーの大きさが、興
味ある部分集合におけるそれぞれの部分空間について計算される。次いで、それ
ぞれの試験データポイントがそれぞの特徴部分空間に射影され、エントロピーに
より重み付けした確率ベクターを部分集合に存在するすべての部分空間に対して
計算し、その試験ポイントがそれぞれの可能な出力状態にある可能性を予測する
。次いで、最も高い確率値を有する状態を選択することによって、試験ポイント
の出力状態を予測する。すべての試験データポイントについてこのプロセスを繰
り返し、全体的な試験誤差率を、実際の出力状態と予想された出力状態との差に
基づいて計算する。この試験誤差は、第２の進化段階における適合関数として用
いられる。
された特徴部分空間のプールを、最少の試験誤差をもたらす特徴部分空間の最適
な部分集合を進化させるための入力として用いる。遺伝的枠組みもこの段階にお
いて用いられるが、第２の進化段階を働かせる適合関数は、経験的なモデルを開
発するために用いる試験データ集合の予測誤差に基づく。この場合、特徴部分空
間の入力プールから得られる特徴部分空間の部分集合のランダムに選択されたプ
ールから開始する。特徴部分空間の特定の部分集合について、調整用データが上
記のそれぞれの特徴部分空間に射影され、全体的なエントロピーの大きさが、興
味ある部分集合におけるそれぞれの部分空間について計算される。次いで、それ
ぞれの試験データポイントがそれぞの特徴部分空間に射影され、エントロピーに
より重み付けした確率ベクターを部分集合に存在するすべての部分空間に対して
計算し、その試験ポイントがそれぞれの可能な出力状態にある可能性を予測する
。次いで、最も高い確率値を有する状態を選択することによって、試験ポイント
の出力状態を予測する。すべての試験データポイントについてこのプロセスを繰
り返し、全体的な試験誤差率を、実際の出力状態と予想された出力状態との差に
基づいて計算する。この試験誤差は、第２の進化段階における適合関数として用
いられる。
【００５７】 最初のランダムプールにおける特徴部分空間の部分集合の各々について試験誤
差を計算し、該試験誤差を用いて、最少誤差をもたらす特徴部分空間の部分集合
を進化させる進化プロセスを働かせる。情報に富む特徴または特徴組合せから得
られる特徴部分空間の最終的な部分集合は、ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅによって進化
させられる経験的なモデルを構成する。新しいデータポイントを特徴部分空間の
この部分集合に射影することができ、出力状態を予測するために、上記のように
確率ベクターを計算することができる。
差を計算し、該試験誤差を用いて、最少誤差をもたらす特徴部分空間の部分集合
を進化させる進化プロセスを働かせる。情報に富む特徴または特徴組合せから得
られる特徴部分空間の最終的な部分集合は、ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅによって進化
させられる経験的なモデルを構成する。新しいデータポイントを特徴部分空間の
この部分集合に射影することができ、出力状態を予測するために、上記のように
確率ベクターを計算することができる。
【００５８】 （階層的なＤＮＡ同定方法およびハイブリッドモデル化） 上記に概略された２つのモデル化スキームを逆並列的な連続様式で用いること
によって強力なＤＮＡフラグメント同定方法を開発することができる。同定の第
１レベルは、スメア化した試料から非スメアを分離することである。これに続き
、非スメア化試料に対する興味ある特異的なＤＮＡフラグメントを同定する。実
際、この階層的な方法は、可能な出力カテゴリーを表す陽性、陰性および他の核
酸物質を有する単一の３状態モデルを用いるよりも正確であることが証明されて
いる。
によって強力なＤＮＡフラグメント同定方法を開発することができる。同定の第
１レベルは、スメア化した試料から非スメアを分離することである。これに続き
、非スメア化試料に対する興味ある特異的なＤＮＡフラグメントを同定する。実
際、この階層的な方法は、可能な出力カテゴリーを表す陽性、陰性および他の核
酸物質を有する単一の３状態モデルを用いるよりも正確であることが証明されて
いる。
【００５９】 （ハイブリッドモデル化） 同じデータについて調整された多数のモデルを経験的なモデル化のために用い
ることができる。ニューラルネットワークコミティにおける「専門家コミティ」
と呼ばれるそのようなモデルの使用は１９９０年代に著しく増大した（例えば、
Ｂｉｓｈｏｐ、１９９５）。ラジアル基本機能（ｒａｄｉａｌ ｂａｓｉｓ ｆ
ｕｎｃｔｉｏｎ、ＲＢＦ）のネットワークは、実際に、それぞれのモデルが１つ
の放射式基本機能である専門家コミティとして考えることができる。通常、コミ
ティにおける異なるモデルは、異なる数の隠れ層を有するＲＢＦおよびフィード
フォワードのニューラルネットワークと同様に密接に関連している。非常に異な
るモデルの結果を組み合わせることによって、予測精度を向上できることも知ら
れている。これは、好ましい、ニューラルネットワークおよびＩｎｆｏＥｖｏｌ
ｖｅの並列使用によって図７に例示されている。それぞれのモデルが分類につい
て「投票」する最終的な組合せ段階（ブロックＧ）では、両方のモデルからの情
報が用いられる。これは、「ポーリング」と呼ばれる。ニューラルネットワーク
およびＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅの場合、予測された分類は確実性の暗黙的なステー
トメントに関連している。両方のモデルにより、０（非混入）と１（混入）との
間に存在する連続的な値の出力予測が得られる。０．９９の値は大きな信頼度で
「混入」の予測を示し、一方、０．５５の値は低い信頼度を有する。異なる種類
のモデル（ニューラルネットワーク、ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅ）を用いることによ
って、さらに調整用データの異なる選択について調整されたそれぞれのタイプの
いくつかのモデルを用いることによっても、高い精度がブロックＧにおいて得ら
れる。
ることができる。ニューラルネットワークコミティにおける「専門家コミティ」
と呼ばれるそのようなモデルの使用は１９９０年代に著しく増大した（例えば、
Ｂｉｓｈｏｐ、１９９５）。ラジアル基本機能（ｒａｄｉａｌ ｂａｓｉｓ ｆ
ｕｎｃｔｉｏｎ、ＲＢＦ）のネットワークは、実際に、それぞれのモデルが１つ
の放射式基本機能である専門家コミティとして考えることができる。通常、コミ
ティにおける異なるモデルは、異なる数の隠れ層を有するＲＢＦおよびフィード
フォワードのニューラルネットワークと同様に密接に関連している。非常に異な
るモデルの結果を組み合わせることによって、予測精度を向上できることも知ら
れている。これは、好ましい、ニューラルネットワークおよびＩｎｆｏＥｖｏｌ
ｖｅの並列使用によって図７に例示されている。それぞれのモデルが分類につい
て「投票」する最終的な組合せ段階（ブロックＧ）では、両方のモデルからの情
報が用いられる。これは、「ポーリング」と呼ばれる。ニューラルネットワーク
およびＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅの場合、予測された分類は確実性の暗黙的なステー
トメントに関連している。両方のモデルにより、０（非混入）と１（混入）との
間に存在する連続的な値の出力予測が得られる。０．９９の値は大きな信頼度で
「混入」の予測を示し、一方、０．５５の値は低い信頼度を有する。異なる種類
のモデル（ニューラルネットワーク、ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅ）を用いることによ
って、さらに調整用データの異なる選択について調整されたそれぞれのタイプの
いくつかのモデルを用いることによっても、高い精度がブロックＧにおいて得ら
れる。
【００６０】 本発明は下記の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、本発明
の好ましい実施形態を示していると同時に、単なる例示として提供されているこ
とを理解しなければならない。上記の議論およびこれらの実施例から、当業者は
、本発明の本質的な特徴を確認することができ、そして本発明の精神および範囲
から逸脱することなく、本発明の種々の変化および改変を行い、種々の使用法お
よび条件に適合させることができる。
の好ましい実施形態を示していると同時に、単なる例示として提供されているこ
とを理解しなければならない。上記の議論およびこれらの実施例から、当業者は
、本発明の本質的な特徴を確認することができ、そして本発明の精神および範囲
から逸脱することなく、本発明の種々の変化および改変を行い、種々の使用法お
よび条件に適合させることができる。
【００６１】 （実施例１） （混入食品試料における融解曲線分析を用いるＰＣＲフラグメントの均一検
出の評価） （混入食品試料の調製） 本研究において用いられた食品および細菌株は下記の理由から選択された。牛
ひき肉（ｇｒｏｕｎｄ ｂｅｅｅｆ）および七面鳥ひき肉は、これらの食品が広
く試験され、高レベルの動物片利共生物（ａｎｉｍａｌ ｃｏｍｍｅｎｓａｌｓ
）で、高脂肪含有量を有し、あるいは一様な物理的特性を何も有していないため
に選択された。ソフトチーズは、高脂肪含有量を有しかつ高レベルソフトチーズ
の生物のために選択され、機構的に厄介である。モッツァレラチーズは、高バッ
クグラウンドのハードチーズ生物を含有する。ミルクは、高い乳酸菌バックグラ
ウンドのために試験パネルに含められ、強い光散乱性を有する光学的高密度であ
る。ココアは、この食品が高レベルのポリフェノール性化合物（ＰＣＲ阻害剤）
を含有し、強い光吸収性を有する光学的高密度であるために試験された。最後に
、コールスローは、この食品に関連する低いｐＨゆえに選ばれた。選ばれた細菌
株は、試験される食品の一般的な汚染物であるか、あるいは種々のリボタイプの
ＢＡＸ（登録商標）標的生物を表す。
出の評価） （混入食品試料の調製） 本研究において用いられた食品および細菌株は下記の理由から選択された。牛
ひき肉（ｇｒｏｕｎｄ ｂｅｅｅｆ）および七面鳥ひき肉は、これらの食品が広
く試験され、高レベルの動物片利共生物（ａｎｉｍａｌ ｃｏｍｍｅｎｓａｌｓ
）で、高脂肪含有量を有し、あるいは一様な物理的特性を何も有していないため
に選択された。ソフトチーズは、高脂肪含有量を有しかつ高レベルソフトチーズ
の生物のために選択され、機構的に厄介である。モッツァレラチーズは、高バッ
クグラウンドのハードチーズ生物を含有する。ミルクは、高い乳酸菌バックグラ
ウンドのために試験パネルに含められ、強い光散乱性を有する光学的高密度であ
る。ココアは、この食品が高レベルのポリフェノール性化合物（ＰＣＲ阻害剤）
を含有し、強い光吸収性を有する光学的高密度であるために試験された。最後に
、コールスローは、この食品に関連する低いｐＨゆえに選ばれた。選ばれた細菌
株は、試験される食品の一般的な汚染物であるか、あるいは種々のリボタイプの
ＢＡＸ（登録商標）標的生物を表す。
【００６２】
【表２】
【００６３】 すべての食品を、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｓにより１９９５年に出版されたＢａｃｔｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（ＢＡＭ）に記載される手法に従って予め強化した（
ｐｒｅ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ）。規定の強化を行った後、試料は、標的生物を用い
て１０8／ｍｌ、１０5／ｍｌ、１０4／ｍｌのレベルに混入されたか、あるいは
未混入のままにされた。サルモネラまたはリステリア菌が混入された試料につい
ては、一晩強化物をブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ／Ｄｉｆｃｏ）で
１：１０（１ｍｌの強化物＋９ｍｌのＢＨＩ）に希釈した後、３７℃で３時間イ
ンキュベーションした。
ｈｅｍｉｓｔｓにより１９９５年に出版されたＢａｃｔｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（ＢＡＭ）に記載される手法に従って予め強化した（
ｐｒｅ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ）。規定の強化を行った後、試料は、標的生物を用い
て１０8／ｍｌ、１０5／ｍｌ、１０4／ｍｌのレベルに混入されたか、あるいは
未混入のままにされた。サルモネラまたはリステリア菌が混入された試料につい
ては、一晩強化物をブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ／Ｄｉｆｃｏ）で
１：１０（１ｍｌの強化物＋９ｍｌのＢＨＩ）に希釈した後、３７℃で３時間イ
ンキュベーションした。
【００６４】 サルモネラの試料調製：２ｍｌのねじ付きキャップチューブにおいて、５マイ
クロリットル（μｌ）のインキュベーションした希釈強化物を、ＤＮＡインター
カレート色素ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ
ｓ）の１：１０，０００希釈物を含有する２００μｌの溶解試薬（５μｌのＢＡ
Ｘ（登録商標）溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）および６２．５μｌの
ＢＡＸ（登録商標）プロテアーゼ）に加えた。チューブを３７℃で２０分間イン
キュベーションし、次いで、９５℃で１０分間インキュベーションした。５０マ
イクロリットルのこの粗細菌溶菌液を用いて、パーキンエルマー７７００配列検
出器装置で用いられるタイプのＰＣＲチューブのそれぞれに含有される１錠のＢ
ＡＸ（登録商標）サルモネラ試料錠剤を水和した。チューブにキャップをして、
パーキンエルマー９６００熱サイクル装置において下記プロトコルに従って熱サ
イクル処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３５サイクル ７２℃ ３．０分 ７２℃ ７分 １サイクル ４℃ 「永久」* *９６００装置は保持時間の指定または「永久」の指示を使用者に要求する。
クロリットル（μｌ）のインキュベーションした希釈強化物を、ＤＮＡインター
カレート色素ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ
ｓ）の１：１０，０００希釈物を含有する２００μｌの溶解試薬（５μｌのＢＡ
Ｘ（登録商標）溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）および６２．５μｌの
ＢＡＸ（登録商標）プロテアーゼ）に加えた。チューブを３７℃で２０分間イン
キュベーションし、次いで、９５℃で１０分間インキュベーションした。５０マ
イクロリットルのこの粗細菌溶菌液を用いて、パーキンエルマー７７００配列検
出器装置で用いられるタイプのＰＣＲチューブのそれぞれに含有される１錠のＢ
ＡＸ（登録商標）サルモネラ試料錠剤を水和した。チューブにキャップをして、
パーキンエルマー９６００熱サイクル装置において下記プロトコルに従って熱サ
イクル処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３５サイクル ７２℃ ３．０分 ７２℃ ７分 １サイクル ４℃ 「永久」* *９６００装置は保持時間の指定または「永久」の指示を使用者に要求する。
【００６５】 リステリア菌試料の調製：２ｍｌのねじ付きキャップチューブにおいて、５マ
イクロリットルのインキュベーションした希釈強化物を、ＤＮＡインターカレー
ト色素ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の
１：１０，０００希釈物を含有する２００μｌの溶解試薬（５ｍｌのＢＡＸ（登
録商標）溶解緩衝液および６２．５μｌのＢＡＸ（登録商標）プロテアーゼ）に
加えた。チューブを５５℃で６０分間インキュベーションし、次いで、９５℃で
１０分間インキュベーションした。５０マイクロリットルのこの粗細菌溶菌液を
用いて、パーキンエルマー７７００配列検出器装置で用いられるＰＣＲチューブ
に含有される１錠のＢＡＸ（登録商標）リステリア菌試料錠剤を水和した。チュ
ーブにキャップをして、パーキンエルマー９６００熱サイクル装置において下記
プロトコルに従って熱サイクル処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３８サイクル ７０℃ ３．０分 ７２℃ ７分 ４℃ 「永久」
イクロリットルのインキュベーションした希釈強化物を、ＤＮＡインターカレー
ト色素ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の
１：１０，０００希釈物を含有する２００μｌの溶解試薬（５ｍｌのＢＡＸ（登
録商標）溶解緩衝液および６２．５μｌのＢＡＸ（登録商標）プロテアーゼ）に
加えた。チューブを５５℃で６０分間インキュベーションし、次いで、９５℃で
１０分間インキュベーションした。５０マイクロリットルのこの粗細菌溶菌液を
用いて、パーキンエルマー７７００配列検出器装置で用いられるＰＣＲチューブ
に含有される１錠のＢＡＸ（登録商標）リステリア菌試料錠剤を水和した。チュ
ーブにキャップをして、パーキンエルマー９６００熱サイクル装置において下記
プロトコルに従って熱サイクル処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３８サイクル ７０℃ ３．０分 ７２℃ ７分 ４℃ 「永久」
【００６６】 大腸菌試料の調製：２ｍｌのねじ付きキャップチューブにおいて、３マイクロ
リットルの一晩強化物を、ＤＮＡインターカレート色素ＳＹＢＲ（登録商標）グ
リーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の１：２５，０００希釈物を含有
する４００μｌの溶解試薬（５ｍｌのＢＡＸ（登録商標）溶解緩衝液＋６２．５
μｌのＢＡＸ（登録商標）プロテアーゼ）に加えた。チューブを３７℃で２０分
間インキュベーションし、次いで、９５℃で１０分間インキュベーションした。
５０マイクロリットルのこの粗細菌溶菌液を用いて、パーキンエルマー７７００
配列検出器装置で用いられるＰＣＲチューブに含有される１錠のＢＡＸ（登録商
標）大腸菌試料を水和した。チューブにキャップをして、パーキンエルマー９６
００熱サイクル装置において下記プロトコルに従って熱サイクル処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３５サイクル ７０℃ ２．０分 ７２℃ ７分 １サイクル ４℃ 「永久」
リットルの一晩強化物を、ＤＮＡインターカレート色素ＳＹＢＲ（登録商標）グ
リーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の１：２５，０００希釈物を含有
する４００μｌの溶解試薬（５ｍｌのＢＡＸ（登録商標）溶解緩衝液＋６２．５
μｌのＢＡＸ（登録商標）プロテアーゼ）に加えた。チューブを３７℃で２０分
間インキュベーションし、次いで、９５℃で１０分間インキュベーションした。
５０マイクロリットルのこの粗細菌溶菌液を用いて、パーキンエルマー７７００
配列検出器装置で用いられるＰＣＲチューブに含有される１錠のＢＡＸ（登録商
標）大腸菌試料を水和した。チューブにキャップをして、パーキンエルマー９６
００熱サイクル装置において下記プロトコルに従って熱サイクル処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３５サイクル ７０℃ ２．０分 ７２℃ ７分 １サイクル ４℃ 「永久」
【００６７】 （増幅（熱サイクリング）後の分析：） 増幅後、融解曲線を、下記の条件を用いることによってパーキンエルマー７７
００ＤＮＡ配列検出器において作製した： プレートタイプ：シングルレポータ 装置： ７７００配列検出システム 操作： リアルタイム 色素層： ＦＡＭ 試料タイプ： 不明 試料体積： ５０μｌ 操作条件： ７０℃ ２分 １サイクル データ収集なし ６８℃ １０秒 ９８サイクル データ収集 自動増分 ＋０．３℃／サイクル ２５℃ 「永久」
００ＤＮＡ配列検出器において作製した： プレートタイプ：シングルレポータ 装置： ７７００配列検出システム 操作： リアルタイム 色素層： ＦＡＭ 試料タイプ： 不明 試料体積： ５０μｌ 操作条件： ７０℃ ２分 １サイクル データ収集なし ６８℃ １０秒 ９８サイクル データ収集 自動増分 ＋０．３℃／サイクル ２５℃ 「永久」
【００６８】 多成分データを装置からエクスポートして、分析において用いた。特異的なＤ
ＮＡフラグメントの生成を、１５μｌのＢＡＸ（登録商標）ローディング色素を
増幅試料に加えることによって確認した。次いで、１５μｌ部分を、臭化エチジ
ウムを含有する２％アガロースゲルのウエルにローディングした。ゲルを１８０
ボルトで３０分間泳動した。次いで、特異的な産物を、ＵＶ透視法を用いて可視
化した。
ＮＡフラグメントの生成を、１５μｌのＢＡＸ（登録商標）ローディング色素を
増幅試料に加えることによって確認した。次いで、１５μｌ部分を、臭化エチジ
ウムを含有する２％アガロースゲルのウエルにローディングした。ゲルを１８０
ボルトで３０分間泳動した。次いで、特異的な産物を、ＵＶ透視法を用いて可視
化した。
【００６９】 （データ分析：） 生の蛍光データを処理のためにマイクロソフトエクセルにインポートした。そ
れぞれのウエルについて、蛍光データを、最低の蛍光値を残りのデータポイント
から減じることによって規格化した。この段階から、多様な方法をデータのモデ
ル化のために用いた。
れぞれのウエルについて、蛍光データを、最低の蛍光値を残りのデータポイント
から減じることによって規格化した。この段階から、多様な方法をデータのモデ
ル化のために用いた。
【００７０】 （１．融解曲線） 次いで、規格化されたデータを、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴ
リズムで平滑化した。温度に関する蛍光の対数の負の微分係数（−ｄｌｏｇ（Ｆ
）／ｄＴ）を取り、−ｄｌｏｇ（Ｆ）／ｄＴ（ｙ軸）対温度（ｘ軸）でプロット
した。
リズムで平滑化した。温度に関する蛍光の対数の負の微分係数（−ｄｌｏｇ（Ｆ
）／ｄＴ）を取り、−ｄｌｏｇ（Ｆ）／ｄＴ（ｙ軸）対温度（ｘ軸）でプロット
した。
【００７１】 ３つの標的ＰＣＲ産物のすべてに対する融解温度範囲を確立した。特異的な標
的に対する温度範囲に融解曲線ピークを有するすべての試料を陽性と見なし、そ
してピークがその範囲内に見出されない場合、その試料を陰性と判定した。この
判定は、ピーク高さとは関係なく行われた。
的に対する温度範囲に融解曲線ピークを有するすべての試料を陽性と見なし、そ
してピークがその範囲内に見出されない場合、その試料を陰性と判定した。この
判定は、ピーク高さとは関係なく行われた。
【００７２】 閾値および温度範囲が確立されると、データを、試料が陽性または陰性である
かを自動的に決定するＥｘｃｅｌのマクロによって処理した。処理されると、次
いで、データをＢＡＸ（商標）ゲルの結果と比較した。方法の一致度を、同じ結
果を与えるそのような試料を加え、試料総数で分割することによって決定した。
かを自動的に決定するＥｘｃｅｌのマクロによって処理した。処理されると、次
いで、データをＢＡＸ（商標）ゲルの結果と比較した。方法の一致度を、同じ結
果を与えるそのような試料を加え、試料総数で分割することによって決定した。
【００７３】 （２．データのモデル化） 規格化されたデータを用いて開始した場合、データは、三次のスプライン補間
関数を用いて０．１℃の分解能で補間される。次いで、補間されたデータの対数
が取られ、２．５度についてＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴリズム
によって平滑化される。温度に関してｌｏｇ蛍光の負の微分係数（−ｄ（ｌｏｇ
Ｆ）／ｄＴ）を取り、下記のデータ範囲を用いて１．０℃間隔で分析する： サルモネラ ８２．０℃〜９３．０℃（１２データポイント） 大腸菌 ８２．０℃〜９２．０℃（１１データポイント） リステリア菌 ７５．０℃〜９２．０℃（１３データポイント）
関数を用いて０．１℃の分解能で補間される。次いで、補間されたデータの対数
が取られ、２．５度についてＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴリズム
によって平滑化される。温度に関してｌｏｇ蛍光の負の微分係数（−ｄ（ｌｏｇ
Ｆ）／ｄＴ）を取り、下記のデータ範囲を用いて１．０℃間隔で分析する： サルモネラ ８２．０℃〜９３．０℃（１２データポイント） 大腸菌 ８２．０℃〜９２．０℃（１１データポイント） リステリア菌 ７５．０℃〜９２．０℃（１３データポイント）
【００７４】 これらのデータポイントは、試料に関する大部分の情報を含有することが明ら
かにされている融解曲線の部分である。データをモデル化することの目的は、融
解曲線データに基づいて陽性試料をブランク反応から区別することである。シス
テムをモデル化するために、陽性試料には「１」の分類が割り当てられているが
、ブランク反応には「０」の分類が割り当てられた。次いで、合せたデータ集合
は、約７５：２５の比率を用いて調整集合および試験集合にランダムに分割され
る。調整集合を用いて、ニューラルネットワークが調整され、次いで、試験集合
を用いて、調整されたモデルが確認される。モデルが調整されると、同じ反応お
よび融解曲線の条件を用いて得られた任意のデータが、予測された結果を得るた
めに、この方法により処理することができるはずである。モデル化には、調整用
試料および試験試料を分類する際の誤差を最少にすることが含まれる。ニューラ
ルネットワーク、ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅおよびロジスティック回帰の３通りのモ
デル化法が、データを分析するために用いられた。
かにされている融解曲線の部分である。データをモデル化することの目的は、融
解曲線データに基づいて陽性試料をブランク反応から区別することである。シス
テムをモデル化するために、陽性試料には「１」の分類が割り当てられているが
、ブランク反応には「０」の分類が割り当てられた。次いで、合せたデータ集合
は、約７５：２５の比率を用いて調整集合および試験集合にランダムに分割され
る。調整集合を用いて、ニューラルネットワークが調整され、次いで、試験集合
を用いて、調整されたモデルが確認される。モデルが調整されると、同じ反応お
よび融解曲線の条件を用いて得られた任意のデータが、予測された結果を得るた
めに、この方法により処理することができるはずである。モデル化には、調整用
試料および試験試料を分類する際の誤差を最少にすることが含まれる。ニューラ
ルネットワーク、ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅおよびロジスティック回帰の３通りのモ
デル化法が、データを分析するために用いられた。
【００７５】 （サルモネラの結果：） １４９個のサルモネラ試料がこれらの実験のときに作製された。データ集合は
、１１９個の陽性試料（サルモネラが混入された試料）および３０個のブランク
反応物（非混入試料）からなった。サルモネラが混入された試料はすべて、アガ
ロースゲルの結果に基づいて陽性であった。３０個のブランク反応物は、１個を
除くすべてがゲルで陰性であった。この１個の試料は、サルモネラの融解曲線パ
ターンを示さなかった。残りの融解曲線を調べることによって、融解曲線パター
ンと試料の混入／非混入状態との間に１００％の一致が存在した。
、１１９個の陽性試料（サルモネラが混入された試料）および３０個のブランク
反応物（非混入試料）からなった。サルモネラが混入された試料はすべて、アガ
ロースゲルの結果に基づいて陽性であった。３０個のブランク反応物は、１個を
除くすべてがゲルで陰性であった。この１個の試料は、サルモネラの融解曲線パ
ターンを示さなかった。残りの融解曲線を調べることによって、融解曲線パター
ンと試料の混入／非混入状態との間に１００％の一致が存在した。
【００７６】 試料の「混入」／「非混入」状態を（ゲル結果とは対照的に）分類として用い
て、調整集合および試験集合を作製した。試験集合は１１０個の試料からなり、
試験集合は３９個の試料からなった。各々の集合は、混入試料および未混入試料
の比例的な分布を含んでいた。調整データ集合に基づいて、それぞれのモデル化
技術により、試験試料のすべてを正しく分類することができた。
て、調整集合および試験集合を作製した。試験集合は１１０個の試料からなり、
試験集合は３９個の試料からなった。各々の集合は、混入試料および未混入試料
の比例的な分布を含んでいた。調整データ集合に基づいて、それぞれのモデル化
技術により、試験試料のすべてを正しく分類することができた。
【００７７】 方法 混入に対する一致％ ニューラルネットワーク ３９／３９＝１００％ ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅ ３９／３９＝１００％ ロジスティック回帰 ３９／３９＝１００％
【００７８】 （大腸菌の結果：） ５８個の大腸菌試料がこれらの実験のときに作製された。データ集合は、４８
個の陽性試料（大腸菌が混入された試料）および１０個のブランク反応物（非混
入試料）からなった。大腸菌が混入された試料は、１個を除くすべてが、アガロ
ースゲルの結果に基づいて陰性であった。ゲルにおいてバンドを有しなかった混
入試料は、大腸菌の特徴的な融解曲線を示しているが、そのパターンはシステム
のノイズの中に存在する。
個の陽性試料（大腸菌が混入された試料）および１０個のブランク反応物（非混
入試料）からなった。大腸菌が混入された試料は、１個を除くすべてが、アガロ
ースゲルの結果に基づいて陰性であった。ゲルにおいてバンドを有しなかった混
入試料は、大腸菌の特徴的な融解曲線を示しているが、そのパターンはシステム
のノイズの中に存在する。
【００７９】 １０個のブランク反応物はすべてゲルで陰性であった。融解曲線の視覚による
検査により、融解曲線パターンと試料の混入／未混入状態との間に９７％の一致
が明らかにされた。２つの一致しない試料はともにゲルでバンドをもたらしたが
、融解曲線パターンはノイズから区別することができなかった。
検査により、融解曲線パターンと試料の混入／未混入状態との間に９７％の一致
が明らかにされた。２つの一致しない試料はともにゲルでバンドをもたらしたが
、融解曲線パターンはノイズから区別することができなかった。
【００８０】 試料の「混入」／「非混入」状態を分類として用いて、調整集合および試験集
合を作製した。調整集合は４５個の試料からなり、一方、試験集合は１３個の試
料からなった。各々の集合は、混入試料および非混入試料の比例的な分布を含ん
でいた。
合を作製した。調整集合は４５個の試料からなり、一方、試験集合は１３個の試
料からなった。各々の集合は、混入試料および非混入試料の比例的な分布を含ん
でいた。
【００８１】 調整データ集合に基づいて、ニューラルネットワークおよびＩｎｆｏＥｖｏｌ
ｖｅはともに、１３個の試料のうち、１２個の正しい分類を示した。両方の誤差
は、混入され、かつゲルで陽性であったが、検出可能な融解曲線を生じさせなか
った試料の１つによって生じていた。ロジスティック回帰は、試験試料の完全な
分類をもたらした。
ｖｅはともに、１３個の試料のうち、１２個の正しい分類を示した。両方の誤差
は、混入され、かつゲルで陽性であったが、検出可能な融解曲線を生じさせなか
った試料の１つによって生じていた。ロジスティック回帰は、試験試料の完全な
分類をもたらした。
【００８２】 方法 混入に対する一致％ ニューラルネットワーク １２／１３＝９２．３％ ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅ １２／１３＝９２．３％ ロジスティック回帰 １３／１３＝１００％
【００８３】 （リステリア菌の結果：） 分析されたデータ集合は、９６個の陽性試料（リステリア菌が混入された試料
）および２４個のブランク反応物（非混入試料）からなった。リステリア菌が混
入された試料の中で、７８個が、アガロースゲルの結果に基づいて陽性であった
。ゲル法で検出されなかった１８個の混入試料の中で、１４個がチョコレートに
存在し、４個がコールスローに存在した。混入試料のすべてが、リステリア菌の
特徴的な融解曲線パターンを有し、本発明の方法によって陽性として検出された
。２４個のブランク反応物はすべて、ゲルで陰性であり、融解曲線パターンの分
析において陰性であった。
）および２４個のブランク反応物（非混入試料）からなった。リステリア菌が混
入された試料の中で、７８個が、アガロースゲルの結果に基づいて陽性であった
。ゲル法で検出されなかった１８個の混入試料の中で、１４個がチョコレートに
存在し、４個がコールスローに存在した。混入試料のすべてが、リステリア菌の
特徴的な融解曲線パターンを有し、本発明の方法によって陽性として検出された
。２４個のブランク反応物はすべて、ゲルで陰性であり、融解曲線パターンの分
析において陰性であった。
【００８４】 試料の「混入」／「非混入」状態を分類として用いて、調整集合および試験集
合を作製した。調整集合は８９個の試料からなり、一方、試験集合は３１個の試
料からなった。各々の集合は、混入試料および非混入試料の比例的な分布を含ん
でいた。調整データ集合に基づいて、ニューラルネットワークモデルおよびＩｎ
ｆｏＥｖｏｌｖｅモデルは試験試料のすべてを正しく分類することができた。ロ
ジスティック回帰モデルは１個の試料について成功しなかった。
合を作製した。調整集合は８９個の試料からなり、一方、試験集合は３１個の試
料からなった。各々の集合は、混入試料および非混入試料の比例的な分布を含ん
でいた。調整データ集合に基づいて、ニューラルネットワークモデルおよびＩｎ
ｆｏＥｖｏｌｖｅモデルは試験試料のすべてを正しく分類することができた。ロ
ジスティック回帰モデルは１個の試料について成功しなかった。
【００８５】 方法 混入に対する一致％ ニューラルネットワーク ３１／３１＝１００％ ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅ ３１／３１＝１００％ ロジスティック回帰 ３０／３１＝９６．７％
【００８６】 上記例において専門家コミティを用い、それによって、３つのモデルのいずれ
か１つが混入試料を予測するかどうかの陽性の結果が報告されることにより、試
験の全体的な予測性能が改善される。そのような方法を用いることにより、試験
されたすべての標的に対する混入レベルに対して１００％一致した予測結果がも
たらされる。
か１つが混入試料を予測するかどうかの陽性の結果が報告されることにより、試
験の全体的な予測性能が改善される。そのような方法を用いることにより、試験
されたすべての標的に対する混入レベルに対して１００％一致した予測結果がも
たらされる。
【００８７】 （実施例２） （問題とする食品試料における融解曲線分析を用いるＰＣＲフラグメントの
均一検出の評価） 混入食品試料の調製：この試験により、ＰＣＲを阻害することが知られている
食品が評価された。その評価では、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を反応物に添
加することの、阻害食品の阻害効果を克服する能力が調べられた。さらに、融解
曲線分析を用いるＰＣＲ産物の均一検出を、臭化エチジウム染色を用いた標準的
なゲル電気泳動と比較した。
均一検出の評価） 混入食品試料の調製：この試験により、ＰＣＲを阻害することが知られている
食品が評価された。その評価では、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を反応物に添
加することの、阻害食品の阻害効果を克服する能力が調べられた。さらに、融解
曲線分析を用いるＰＣＲ産物の均一検出を、臭化エチジウム染色を用いた標準的
なゲル電気泳動と比較した。
【００８８】 食品をローカルな食料品店から購入し、４℃で保存した。３０個の異なる食品
をＢＡＭ法に従って予め強化した。規定の強化を行った後、試料は、サルモネラ
ニューポート（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｎｅｗｐｏｒｔ）が混入されたか、ある
いは非混入のままにされた（表ＩＩＩを参照のこと）。次いで、強化物をＢＨＩ
（Ｄｉｆｃｏ）で１：１０に希釈した後、３７℃で３時間インキュベーションし
た。
をＢＡＭ法に従って予め強化した。規定の強化を行った後、試料は、サルモネラ
ニューポート（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｎｅｗｐｏｒｔ）が混入されたか、ある
いは非混入のままにされた（表ＩＩＩを参照のこと）。次いで、強化物をＢＨＩ
（Ｄｉｆｃｏ）で１：１０に希釈した後、３７℃で３時間インキュベーションし
た。
【００８９】
【表３】
【００９０】 ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）処理：成長（ｇｒｏｗｂａｃｋ）試料
のアリコート５００μｌを、５０ｍｇ錠のＰＶＰＰ（Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｉｎｃ
．）を含有するチューブに加えた。チューブを激しく振り、ＰＶＰＰを１５分間
沈降させた。次いで、得られた上清を溶解手順において用いた。
のアリコート５００μｌを、５０ｍｇ錠のＰＶＰＰ（Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｉｎｃ
．）を含有するチューブに加えた。チューブを激しく振り、ＰＶＰＰを１５分間
沈降させた。次いで、得られた上清を溶解手順において用いた。
【００９１】 サルモネラの試料調製：２ｍｌのねじ付きキャップチューブにおいて、５マイ
クロリットルの強化物またはＰＶＰＰ処理試料を、ＤＮＡインターカレート色素
ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の１：１
０，０００希釈物を含有する２００μｌの溶解試薬（５ｍｌのＢＡＸ（登録商標
）溶解緩衝液および６２．５μｌのＢＡＸ（登録商標）プロテアーゼ）に加えた
。チューブを３７℃で２０分間インキュベーションし、次いで、９５℃で１０分
間インキュベーションした。９５℃でインキュベーションした後、５０μｌの４
ｍｇ／ｍｌＢＳＡ溶液を溶菌液に加えた。これをＰＶＰＰ処理試料およびＰＶＰ
Ｐ未処理試料の両方について行った。コントロールとして、数個の試料を未処理
のままにした。５０マイクロリットルのこの粗細菌溶菌液を用いて、パーキンエ
ルマー７７００配列検出器装置で用いられるＰＣＲチューブに含有される１錠の
ＢＡＸ（登録商標）サルモネラ試料錠剤を水和した。チューブにキャップをして
、パーキンエルマー９６００熱サイクル装置において下記プロトコルに従って熱
サイクル処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３５サイクル ７２℃ ３．０分 ７２℃ ７分 １サイクル ４℃ 「永久」
クロリットルの強化物またはＰＶＰＰ処理試料を、ＤＮＡインターカレート色素
ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の１：１
０，０００希釈物を含有する２００μｌの溶解試薬（５ｍｌのＢＡＸ（登録商標
）溶解緩衝液および６２．５μｌのＢＡＸ（登録商標）プロテアーゼ）に加えた
。チューブを３７℃で２０分間インキュベーションし、次いで、９５℃で１０分
間インキュベーションした。９５℃でインキュベーションした後、５０μｌの４
ｍｇ／ｍｌＢＳＡ溶液を溶菌液に加えた。これをＰＶＰＰ処理試料およびＰＶＰ
Ｐ未処理試料の両方について行った。コントロールとして、数個の試料を未処理
のままにした。５０マイクロリットルのこの粗細菌溶菌液を用いて、パーキンエ
ルマー７７００配列検出器装置で用いられるＰＣＲチューブに含有される１錠の
ＢＡＸ（登録商標）サルモネラ試料錠剤を水和した。チューブにキャップをして
、パーキンエルマー９６００熱サイクル装置において下記プロトコルに従って熱
サイクル処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３５サイクル ７２℃ ３．０分 ７２℃ ７分 １サイクル ４℃ 「永久」
【００９２】 増幅後の分析：増幅後、融解曲線を、下記の条件を用いることによってパーキ
ンエルマー７７００ＤＮＡ配列検出器において作製した： プレートタイプ：シングルレポータ 装置： ７７００配列検出システム 操作： リアルタイム 色素層： ＦＡＭ 試料タイプ： 不明 試料体積： ５０μｌ 操作条件： ７０℃ ２分 １サイクル データ収集なし ６８℃ １０秒 ９８サイクル データ収集 自動増分 ＋０．３℃／サイクル ２５℃ 「永久」
ンエルマー７７００ＤＮＡ配列検出器において作製した： プレートタイプ：シングルレポータ 装置： ７７００配列検出システム 操作： リアルタイム 色素層： ＦＡＭ 試料タイプ： 不明 試料体積： ５０μｌ 操作条件： ７０℃ ２分 １サイクル データ収集なし ６８℃ １０秒 ９８サイクル データ収集 自動増分 ＋０．３℃／サイクル ２５℃ 「永久」
【００９３】 多成分データを装置からエクスポートして、分析において用いた。特異的なＤ
ＮＡフラグメントの生成を、１５μｌのＢＡＸ（登録商標）ローディング色素を
増幅試料に加えることによって確認した。次いで、アリコート１５μｌを、臭化
エチジウムを含有する２％アガロースゲルのウエルにローディングした。ゲルを
１８０ボルトで３０分間泳動した。次いで、特異的な産物を、ＵＶ透視法を用い
て可視化した。
ＮＡフラグメントの生成を、１５μｌのＢＡＸ（登録商標）ローディング色素を
増幅試料に加えることによって確認した。次いで、アリコート１５μｌを、臭化
エチジウムを含有する２％アガロースゲルのウエルにローディングした。ゲルを
１８０ボルトで３０分間泳動した。次いで、特異的な産物を、ＵＶ透視法を用い
て可視化した。
【００９４】 （データ分析：） 生の蛍光データを処理のためにマイクロソフトエクセルにインポートした。そ
れぞれのウエルについて、蛍光データを、最低の蛍光値を残りのデータポイント
から減じることによって規格化した。この段階から、データを可視化し、データ
から予測を行うために、多様な方法が用いられた。
れぞれのウエルについて、蛍光データを、最低の蛍光値を残りのデータポイント
から減じることによって規格化した。この段階から、データを可視化し、データ
から予測を行うために、多様な方法が用いられた。
【００９５】 （１．融解曲線） 規格化されたデータを、次いで、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴ
リズムで平滑化した。温度に関する平滑化蛍光の負の微分係数（−ｄｌｏｇ（Ｆ
）／ｄＴ）を取り、−ｄｌｏｇ（Ｆ）／ｄＴ（ｙ軸）対温度（ｘ軸）でプロット
した。
リズムで平滑化した。温度に関する平滑化蛍光の負の微分係数（−ｄｌｏｇ（Ｆ
）／ｄＴ）を取り、−ｄｌｏｇ（Ｆ）／ｄＴ（ｙ軸）対温度（ｘ軸）でプロット
した。
【００９６】 （２．データからの予測） 規格化されたデータを用いて開始した場合、データは、三次のスプライン補間
関数を用いて０．１℃の分解能で補間される。次いで、補間されたデータの対数
が取られ、２．５度についてＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴリズム
によって平滑化される。温度に関してｌｏｇ蛍光の負の微分係数（−ｄ（ｌｏｇ
Ｆ）／ｄＴ）を取り、サルモネラに関するデータ範囲（８２．０℃〜９３．０℃
（１２個のデータポイント））を用いて１．０℃間隔で分析する。
関数を用いて０．１℃の分解能で補間される。次いで、補間されたデータの対数
が取られ、２．５度についてＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴリズム
によって平滑化される。温度に関してｌｏｇ蛍光の負の微分係数（−ｄ（ｌｏｇ
Ｆ）／ｄＴ）を取り、サルモネラに関するデータ範囲（８２．０℃〜９３．０℃
（１２個のデータポイント））を用いて１．０℃間隔で分析する。
【００９７】 試料の予測のために用いられたモデルは、前記に述べられた元の１４９個のサ
ルモネラデータポイントを用いて作製されたモデルである。方法比較のために、
ニューラルネットワーク、ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅおよびロジスティック回帰の３
通りのモデル化方法が、データからの予測を行うために用いられた。
ルモネラデータポイントを用いて作製されたモデルである。方法比較のために、
ニューラルネットワーク、ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅおよびロジスティック回帰の３
通りのモデル化方法が、データからの予測を行うために用いられた。
【００９８】 （結果：） これらの実験のときに作製された３０９個のデータ試料の中で、２０４個はサ
ルモネラが混入され、１０５個の試料はブランク反応物であった。２０４個の混
入試料の中で、１４３個の試料がアガロースゲルで陽性であり、６１個がゲルで
陰性であった。陰性試料は、ＰＣＲの阻害あるいは不適切なゲルまたはＰＣＲ感
度に原因があるとすることができる。１０５個のブランク反応物の中で、９５個
がゲルで陰性であり、１０個がゲルで陽性であった。これらの陽性試料は、自然
の食品汚染（例えば、液状卵試料）または技術的誤差にに原因があるとすること
ができる。
ルモネラが混入され、１０５個の試料はブランク反応物であった。２０４個の混
入試料の中で、１４３個の試料がアガロースゲルで陽性であり、６１個がゲルで
陰性であった。陰性試料は、ＰＣＲの阻害あるいは不適切なゲルまたはＰＣＲ感
度に原因があるとすることができる。１０５個のブランク反応物の中で、９５個
がゲルで陰性であり、１０個がゲルで陽性であった。これらの陽性試料は、自然
の食品汚染（例えば、液状卵試料）または技術的誤差にに原因があるとすること
ができる。
【００９９】 下記の表ＩＶには、３つのモデル化方法の結果がまとめられている。それぞれ
のモデル化方法の出力は１と０との間の数字である。「１」は「混入」の予測を
表し、一方、「０」は「非混入」の予測を表す。この数字が０または１に近いほ
ど、大きな信頼性を予測に置くことができる。０．５の閾値よりも大きな予測は
いずれも陽性と見なされる。下記の各方法に対する数字は、予想された予測と一
致した試料の数を示している。
のモデル化方法の出力は１と０との間の数字である。「１」は「混入」の予測を
表し、一方、「０」は「非混入」の予測を表す。この数字が０または１に近いほ
ど、大きな信頼性を予測に置くことができる。０．５の閾値よりも大きな予測は
いずれも陽性と見なされる。下記の各方法に対する数字は、予想された予測と一
致した試料の数を示している。
【０１００】
【表４】
【０１０１】 上記データを分析するために専門家コミティ方法が用いることができる方法が
いくつか存在する。食品媒介の病原体について試験する場合のように偽陰性の割
合を最小限にすることが望まれる場合、陽性の結果は、用いられたモデルのいず
れか１つが混入試料を予測した場合に報告される。この規準が本実施例のデータ
に適用された場合、ゲルの結果に基づく偽陰性は０．７％未満である。これに対
して、いずれか１つのモデルに対する偽陰性率は、ニューラルネット、Ｉｎｆｏ
Ｅｖｏｌｖｅおよびロジスティック回帰について、それぞれ、４．５％、３．９
％および５．８％である。いずれか１つの判定という規準を用いることの不利な
点は、偽陽性の割合が著しく増大してしまうということである。
いくつか存在する。食品媒介の病原体について試験する場合のように偽陰性の割
合を最小限にすることが望まれる場合、陽性の結果は、用いられたモデルのいず
れか１つが混入試料を予測した場合に報告される。この規準が本実施例のデータ
に適用された場合、ゲルの結果に基づく偽陰性は０．７％未満である。これに対
して、いずれか１つのモデルに対する偽陰性率は、ニューラルネット、Ｉｎｆｏ
Ｅｖｏｌｖｅおよびロジスティック回帰について、それぞれ、４．５％、３．９
％および５．８％である。いずれか１つの判定という規準を用いることの不利な
点は、偽陽性の割合が著しく増大してしまうということである。
【０１０２】 （実施例３） （非特異的なＰＣＲ産物を特異的なＰＣＲ産物から識別するための均一検出
の評価） ＰＣＲプロセスは、標的ＤＮＡの非存在下または存在下において非特異的なＤ
ＮＡ産物を生成させ得る。このような産物の形成を生じさせる機構は十分には理
解されていない。受け入れられる検出性能を有するためには、方法は、特異的な
標的ＤＮＡフラグメントを、プライマー二量体および多数のサイズのフラグメン
トなどの非特異的なＤＮＡ産物から識別することができなければならない。
の評価） ＰＣＲプロセスは、標的ＤＮＡの非存在下または存在下において非特異的なＤ
ＮＡ産物を生成させ得る。このような産物の形成を生じさせる機構は十分には理
解されていない。受け入れられる検出性能を有するためには、方法は、特異的な
標的ＤＮＡフラグメントを、プライマー二量体および多数のサイズのフラグメン
トなどの非特異的なＤＮＡ産物から識別することができなければならない。
【０１０３】 （非特異的なＰＣＲ産物の生成） 大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の一晩培養物を、寒天平板から１つのコロニーを移し、
１０ｍＬのＢＨＩ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ブロスに入れるこ
とによって調製した。培養物を３５℃で一晩（２２±２時間）インキュベーショ
ンした。２ｍｌのねじ付きキャップチューブにおいて、３μｌの一晩培養物を、
４００μｌのＢＡＸ（登録商標）（５ｍｌのＢＡＸ（登録商標）溶解緩衝液およ
び６２．５μｌのＢＡＸ（登録商標）プロテアーゼ）に加えた。これを三連で行
った。チューブを３７℃の水浴に２０分間入れ、次いで、９５℃の水浴に１０分
間入れた。溶解後、試料を氷冷した。それぞれの溶菌液について、ＰＣＲチュー
ブに含有される２錠のＢＡＸ（登録商標）大腸菌試料錠剤を５０μｌの溶菌液で
水和した。チューブにキャップをして、下記の条件を用いてパーキン−エルマー
９６００熱サイクル装置において熱サイクル処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３５サイクル ７０℃ ２．０分 ７２℃ ７分 １サイクル ４℃ 「永久」
１０ｍＬのＢＨＩ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ブロスに入れるこ
とによって調製した。培養物を３５℃で一晩（２２±２時間）インキュベーショ
ンした。２ｍｌのねじ付きキャップチューブにおいて、３μｌの一晩培養物を、
４００μｌのＢＡＸ（登録商標）（５ｍｌのＢＡＸ（登録商標）溶解緩衝液およ
び６２．５μｌのＢＡＸ（登録商標）プロテアーゼ）に加えた。これを三連で行
った。チューブを３７℃の水浴に２０分間入れ、次いで、９５℃の水浴に１０分
間入れた。溶解後、試料を氷冷した。それぞれの溶菌液について、ＰＣＲチュー
ブに含有される２錠のＢＡＸ（登録商標）大腸菌試料錠剤を５０μｌの溶菌液で
水和した。チューブにキャップをして、下記の条件を用いてパーキン−エルマー
９６００熱サイクル装置において熱サイクル処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３５サイクル ７０℃ ２．０分 ７２℃ ７分 １サイクル ４℃ 「永久」
【０１０４】 増幅後、特異的な大腸菌ＤＮＡフラグメントの生成を、１５μｌのＢＡＸ（登
録商標）ローディング色素をそれぞれの溶菌液から得られる１つの試料に加える
ことによって確認した。次いで、アリコート１５μｌを、臭化エチジウムを含有
する２％アガロースゲルのウエルにローディングした。ゲルを１８０ボルトで３
０分間泳動した。次いで、特異的な産物を、ＵＶ透視法を用いて可視化した。
録商標）ローディング色素をそれぞれの溶菌液から得られる１つの試料に加える
ことによって確認した。次いで、アリコート１５μｌを、臭化エチジウムを含有
する２％アガロースゲルのウエルにローディングした。ゲルを１８０ボルトで３
０分間泳動した。次いで、特異的な産物を、ＵＶ透視法を用いて可視化した。
【０１０５】 非特異的なＰＣＲ産物を生成させるために、１０μｌの大腸菌増幅産物と、５
μｌのＤＮＡ分子量ラダー溶液（２００μｌのＢＡＸ（登録商標）溶解緩衝液で
水和したＢＡＸ（登録商標）ＤＮＡ分子量ラダー錠剤）とを、ＳＹＢＲ（登録商
標）グリーンの１：１０，０００希釈物を含有する１０ｍｌのＢＡＸ（登録商標
）溶解緩衝液に加えた。この溶液（５０μｌ）を用いて、パーキンエルマー光学
ＰＣＲチューブに含有される８錠のＢＡＸ（登録商標）サルモネラ試料錠剤を水
和した。チューブにキャップをして、下記の条件を用いてパーキン−エルマー９
６００熱サイクル装置において熱サイクル処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３５サイクル ７２℃ ３．０分 ７２℃ ７分 １サイクル ４℃ 「永久」
μｌのＤＮＡ分子量ラダー溶液（２００μｌのＢＡＸ（登録商標）溶解緩衝液で
水和したＢＡＸ（登録商標）ＤＮＡ分子量ラダー錠剤）とを、ＳＹＢＲ（登録商
標）グリーンの１：１０，０００希釈物を含有する１０ｍｌのＢＡＸ（登録商標
）溶解緩衝液に加えた。この溶液（５０μｌ）を用いて、パーキンエルマー光学
ＰＣＲチューブに含有される８錠のＢＡＸ（登録商標）サルモネラ試料錠剤を水
和した。チューブにキャップをして、下記の条件を用いてパーキン−エルマー９
６００熱サイクル装置において熱サイクル処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３５サイクル ７２℃ ３．０分 ７２℃ ７分 １サイクル ４℃ 「永久」
【０１０６】 非特異的な産物を含有するさらなる増幅反応物を、環境細菌単離物およびサル
モネラ単離物から作製した。単離物を１０ｍｌのＢＨＩにおいて３７℃で２４時
間〜４８時間インキュベーションした。２ｍｌのねじ付きキャップチューブにお
いて、５μｌの一晩培養物を、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンの１：１０，００
０希釈物を含有する２００μｌのＢＡＸ（登録商標）（５ｍｌのＢＡＸ（登録商
標）溶解緩衝液および６２．５μｌのＢＡＸ（登録商標）プロテアーゼ）に加え
た。チューブを３７℃の水浴に２０分間入れ、次いで、９５℃の水浴に１０分間
入れた。それぞれの溶菌液について、ＰＣＲチューブに含有される１錠のＢＡＸ
（登録商標）サルモネラ試料錠剤を５０μｌの溶菌液で水和した。チューブにキ
ャップをして、下記の条件を用いてパーキン−エルマー９６００熱サイクル装置
において熱サイクル処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３５サイクル ７２℃ ３．０分 ７２℃ ７分 １サイクル ４℃ 「永久」
モネラ単離物から作製した。単離物を１０ｍｌのＢＨＩにおいて３７℃で２４時
間〜４８時間インキュベーションした。２ｍｌのねじ付きキャップチューブにお
いて、５μｌの一晩培養物を、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンの１：１０，００
０希釈物を含有する２００μｌのＢＡＸ（登録商標）（５ｍｌのＢＡＸ（登録商
標）溶解緩衝液および６２．５μｌのＢＡＸ（登録商標）プロテアーゼ）に加え
た。チューブを３７℃の水浴に２０分間入れ、次いで、９５℃の水浴に１０分間
入れた。それぞれの溶菌液について、ＰＣＲチューブに含有される１錠のＢＡＸ
（登録商標）サルモネラ試料錠剤を５０μｌの溶菌液で水和した。チューブにキ
ャップをして、下記の条件を用いてパーキン−エルマー９６００熱サイクル装置
において熱サイクル処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３５サイクル ７２℃ ３．０分 ７２℃ ７分 １サイクル ４℃ 「永久」
【０１０７】 増幅後の分析：増幅プロセスの後、すべての試料を融解曲線分析およびアガロ
ースゲル電気泳動によって分析した。融解曲線を、下記の条件を用いることによ
ってパーキンエルマー７７００ＤＮＡ配列検出器において作製した： プレートタイプ：シングルレポータ 装置： ７７００配列検出システム 操作： リアルタイム 色素層： ＦＡＭ 試料タイプ： 不明 試料体積： ５０μｌ 操作条件： ７０℃ ２分 １サイクル データ収集なし ６８℃ １０秒 ９８サイクル データ収集 自動増分 ＋０．３℃／サイクル ２５℃ 「永久」
ースゲル電気泳動によって分析した。融解曲線を、下記の条件を用いることによ
ってパーキンエルマー７７００ＤＮＡ配列検出器において作製した： プレートタイプ：シングルレポータ 装置： ７７００配列検出システム 操作： リアルタイム 色素層： ＦＡＭ 試料タイプ： 不明 試料体積： ５０μｌ 操作条件： ７０℃ ２分 １サイクル データ収集なし ６８℃ １０秒 ９８サイクル データ収集 自動増分 ＋０．３℃／サイクル ２５℃ 「永久」
【０１０８】 多成分データを装置からエクスポートして、分析において用いた。
【０１０９】 （データ処理およびモデル化） 生の蛍光データを処理のためにマイクロソフトエクセルにインポートした。そ
れぞれのウエルについて、蛍光データを、最低の蛍光値を残りのデータポイント
から減じることによって規格化した。この段階から、多様な方法をデータの可視
化およびデータのモデル化のために用いた。
れぞれのウエルについて、蛍光データを、最低の蛍光値を残りのデータポイント
から減じることによって規格化した。この段階から、多様な方法をデータの可視
化およびデータのモデル化のために用いた。
【０１１０】 （１．融解曲線） 規格化されたデータを、次いで、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴ
リズムで平滑化した。温度に関する蛍光の負の微分係数（−ｄｌｏｇ（Ｆ）／ｄ
Ｔ）を取り、−ｄｌｏｇ（Ｆ）／ｄＴ（ｙ軸）対温度（ｘ軸）でプロットした。
リズムで平滑化した。温度に関する蛍光の負の微分係数（−ｄｌｏｇ（Ｆ）／ｄ
Ｔ）を取り、−ｄｌｏｇ（Ｆ）／ｄＴ（ｙ軸）対温度（ｘ軸）でプロットした。
【０１１１】 （２．データのモデル化） 規格化されたデータを用いて開始した場合、データは、三次のスプライン補間
関数を用いて０．１℃の分解能で補間された。次いで、補間されたデータの対数
を取り、２．５度についてＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴリズムに
よって平滑化した。温度に関してｌｏｇ蛍光の負の微分係数（−ｄ（ｌｏｇＦ）
／ｄＴ）を取った。次いで、微分係数データを、８２．０℃から９３．０℃まで
１．０℃の間隔で分析した（１２個のデータポイント）。これらの１２個の点は
、試料に対する大部分の情報を含有することが明らかにされている融解曲線の部
分である。
関数を用いて０．１℃の分解能で補間された。次いで、補間されたデータの対数
を取り、２．５度についてＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴリズムに
よって平滑化した。温度に関してｌｏｇ蛍光の負の微分係数（−ｄ（ｌｏｇＦ）
／ｄＴ）を取った。次いで、微分係数データを、８２．０℃から９３．０℃まで
１．０℃の間隔で分析した（１２個のデータポイント）。これらの１２個の点は
、試料に対する大部分の情報を含有することが明らかにされている融解曲線の部
分である。
【０１１２】 モデル化プロセスには、上記に記載された１２個のデータポイントが利用され
る。データをモデル化することの目的は、スメア物を非スメア物から区別するこ
とである（この場合、サルモネラ試料とブランク試料との区別）。このため、デ
ータをサルモネラ試料およびブランク試料と一緒にした。スメアの試料には「１
」の分類を割り当て、一方、非スメアの試料には「０」の分類を割り当てた。次
いで、一緒にされたデータ集合を、約７５：２５の比率を用いて調整集合および
試験集合にランダムに分割した。調整集合を用いて、ニューラルネットワークを
調整した。試験集合を用いて、調整されたモデルの有効性を確認した。モデル化
プロセスの目的は、調整集合および試験集合における誤差を最小限にすることで
あった。
る。データをモデル化することの目的は、スメア物を非スメア物から区別するこ
とである（この場合、サルモネラ試料とブランク試料との区別）。このため、デ
ータをサルモネラ試料およびブランク試料と一緒にした。スメアの試料には「１
」の分類を割り当て、一方、非スメアの試料には「０」の分類を割り当てた。次
いで、一緒にされたデータ集合を、約７５：２５の比率を用いて調整集合および
試験集合にランダムに分割した。調整集合を用いて、ニューラルネットワークを
調整した。試験集合を用いて、調整されたモデルの有効性を確認した。モデル化
プロセスの目的は、調整集合および試験集合における誤差を最小限にすることで
あった。
【０１１３】 （結果） 合計で３０個のスメア試料が作製された。３０個の試料のうち、８個が、前記
に記載されたプロトコルによって人為的に作製された。残る２２個のスメア物は
、種々の実験において自然に生じ、８個の環境試料、１２個のサルモネラ試料、
および２個の非混入反応物からなった。
に記載されたプロトコルによって人為的に作製された。残る２２個のスメア物は
、種々の実験において自然に生じ、８個の環境試料、１２個のサルモネラ試料、
および２個の非混入反応物からなった。
【０１１４】 ３０個のスメア試料と一緒にした、１４９個の非スメアなサルモネラ試料（サ
ルモネラ混入試料およびブランク反応物）に基づくモデルを作製した。これらの
試料を調整集合（ｎ＝１３１）および試験集合（ｎ＝４８）にランダムに分割し
た。すべての試験試料を正しく分類することができる、２つの隠れ層を有するニ
ューラルネットワークモデルを作製した。このモデルに関する調節されたｒ2は
０．９９９であった。
ルモネラ混入試料およびブランク反応物）に基づくモデルを作製した。これらの
試料を調整集合（ｎ＝１３１）および試験集合（ｎ＝４８）にランダムに分割し
た。すべての試験試料を正しく分類することができる、２つの隠れ層を有するニ
ューラルネットワークモデルを作製した。このモデルに関する調節されたｒ2は
０．９９９であった。
【０１１５】 （実施例４） 融解曲線分析を用いる単一チューブにおける複数のＤＮＡフラグメントの検出 １本の反応チューブにおいて複数のＤＮＡフラグメントを均一に区別できる能
力を有することは好都合である。これにより、試験反応と同じチューブに増幅コ
ントロール反応を組み込むことができる。さらに、１つの試料が２つ以上の特異
的なＤＮＡ標的についてスクリーニングされる多重反応の増幅および検出が可能
になり得る。本実施例では、単一チューブにおける多数のＤＮＡフラグメントを
均一検出するために融解曲線分析を用いることの実施可能性が示される。
力を有することは好都合である。これにより、試験反応と同じチューブに増幅コ
ントロール反応を組み込むことができる。さらに、１つの試料が２つ以上の特異
的なＤＮＡ標的についてスクリーニングされる多重反応の増幅および検出が可能
になり得る。本実施例では、単一チューブにおける多数のＤＮＡフラグメントを
均一検出するために融解曲線分析を用いることの実施可能性が示される。
【０１１６】 ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンの１：１０，０００希釈物をＢＡＸ（登録商標
）溶解緩衝液（Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．）で作製した。希釈された色素溶液
の一部に、約１０3〜１０5コピー／反応のレベルが得られるようにコントロール
プラスミドを加えた。さらに、コントロールプラスミドに対する増幅プライマー
を０．１ｕＭの最終濃度で加えた。リステリア菌のＤＮＡを、２ｎｇＤＮＡ／反
応物、０．２ｎｇＤＮＡ／反応物、０．０２ｎｇＤＮＡ／反応物または０ｎｇＤ
ＮＡ／反応物を含有する反応が得られるように、プラスミドコントロール試薬を
有する希釈された色素溶液と、プラスミドコントロール試薬を有しない希釈され
た色素溶液との両方に加えた。次いで、これらの溶液を用いて、ＰＣＲ反応チュ
ーブに含有される１錠のスクリーニング／リステリア菌用ＢＡＸ（登録商標）試
料錠剤を水和した。チューブにキャップをして、下記の条件のもとで熱サイクル
処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３８サイクル ７０℃ ３．０分 ７２℃ ７分 ４℃ 「永久」
）溶解緩衝液（Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．）で作製した。希釈された色素溶液
の一部に、約１０3〜１０5コピー／反応のレベルが得られるようにコントロール
プラスミドを加えた。さらに、コントロールプラスミドに対する増幅プライマー
を０．１ｕＭの最終濃度で加えた。リステリア菌のＤＮＡを、２ｎｇＤＮＡ／反
応物、０．２ｎｇＤＮＡ／反応物、０．０２ｎｇＤＮＡ／反応物または０ｎｇＤ
ＮＡ／反応物を含有する反応が得られるように、プラスミドコントロール試薬を
有する希釈された色素溶液と、プラスミドコントロール試薬を有しない希釈され
た色素溶液との両方に加えた。次いで、これらの溶液を用いて、ＰＣＲ反応チュ
ーブに含有される１錠のスクリーニング／リステリア菌用ＢＡＸ（登録商標）試
料錠剤を水和した。チューブにキャップをして、下記の条件のもとで熱サイクル
処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３８サイクル ７０℃ ３．０分 ７２℃ ７分 ４℃ 「永久」
【０１１７】 増幅後の分析：増幅後、融解曲線を、下記の条件を用いることによってパーキ
ンエルマー７７００ＤＮＡ配列検出器において作製した： プレートタイプ：シングルレポータ 装置： ７７００配列検出システム 操作： リアルタイム 色素層： ＦＡＭ 試料タイプ： 不明 試料体積： ５０μｌ 操作条件： ７０℃ ２分 １サイクル データ収集なし ６８℃ １０秒 ９８サイクル データ収集 自動増分 ＋０．３℃／サイクル ２５℃ 「永久」
ンエルマー７７００ＤＮＡ配列検出器において作製した： プレートタイプ：シングルレポータ 装置： ７７００配列検出システム 操作： リアルタイム 色素層： ＦＡＭ 試料タイプ： 不明 試料体積： ５０μｌ 操作条件： ７０℃ ２分 １サイクル データ収集なし ６８℃ １０秒 ９８サイクル データ収集 自動増分 ＋０．３℃／サイクル ２５℃ 「永久」
【０１１８】 多成分データを装置からエクスポートして、分析に用いた。
【０１１９】 融解曲線分析の後、特異的なＤＮＡフラグメントの生成を、１５μｌのＢＡＸ
（登録商標）ローディング色素を増幅試料に加えることによって確認した。次い
で、アリコート１５μｌを、臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲルのウ
エルにローディングした。ゲルを１８０ボルトで３０分間泳動した。次いで、特
異的な産物を、ＵＶ透視法を用いて可視化した。
（登録商標）ローディング色素を増幅試料に加えることによって確認した。次い
で、アリコート１５μｌを、臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲルのウ
エルにローディングした。ゲルを１８０ボルトで３０分間泳動した。次いで、特
異的な産物を、ＵＶ透視法を用いて可視化した。
【０１２０】 （データ処理およびモデル化） 生の蛍光データを処理のためにマイクロソフトエクセルにインポートした。そ
れぞれのウエルについて、蛍光データを、最も低い蛍光値を残りのデータポイン
トから減じることによって規格化した。次いで、規格化されたデータをＳａｖｉ
ｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴリズムで平滑化した。温度に関する蛍光の負
の微分係数（−ｄＦ／ｄＴ）を取り、−ｄＦ／ｄＴ（ｙ軸）対温度（ｘ軸）でプ
ロットした。プロットを、特異的なＤＮＡ標的の有無を決定するために視覚によ
り調べた。これらの結果を、アガロースゲル検出から得られた結果と比較した。
れぞれのウエルについて、蛍光データを、最も低い蛍光値を残りのデータポイン
トから減じることによって規格化した。次いで、規格化されたデータをＳａｖｉ
ｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴリズムで平滑化した。温度に関する蛍光の負
の微分係数（−ｄＦ／ｄＴ）を取り、−ｄＦ／ｄＴ（ｙ軸）対温度（ｘ軸）でプ
ロットした。プロットを、特異的なＤＮＡ標的の有無を決定するために視覚によ
り調べた。これらの結果を、アガロースゲル検出から得られた結果と比較した。
【０１２１】 （結果） リステリア菌増幅産物およびポシティブコントロール増幅産物に関する融解曲
線プロフィルを本発明の方法に従って作製した（図１３および図１４）。一緒に
された産物の融解曲線プロフィルもまた作製した（図１５）。明らかな差が、リ
ステリア菌とポシティブコントロール産物との融解曲線プロフィルに存在した。
これらの２つの産物間におけるプロフィルの差は、調整されたモデルにより、リ
ステリアの増幅産物が、１個のチューブで増幅されたときのポシティブコントロ
ールから同定することができることを意味していた。
線プロフィルを本発明の方法に従って作製した（図１３および図１４）。一緒に
された産物の融解曲線プロフィルもまた作製した（図１５）。明らかな差が、リ
ステリア菌とポシティブコントロール産物との融解曲線プロフィルに存在した。
これらの２つの産物間におけるプロフィルの差は、調整されたモデルにより、リ
ステリアの増幅産物が、１個のチューブで増幅されたときのポシティブコントロ
ールから同定することができることを意味していた。
【０１２２】 （実施例５） （ゲルに基づく検出と融解曲線分析との感度比較） 前記の実施例は、融解曲線分析が特異的な増幅標的ｄｓＤＮＡを他の核酸物質
から識別するために用いることができることを示している。下記に記載される実
験を、増幅されたｄｓＤＮＡ産物の検出に関して、融解曲線分析に対するゲルに
基づく検出システムの感度を比較するために行った。
から識別するために用いることができることを示している。下記に記載される実
験を、増幅されたｄｓＤＮＡ産物の検出に関して、融解曲線分析に対するゲルに
基づく検出システムの感度を比較するために行った。
【０１２３】 （サルモネラ特異的ＰＣＲ産物の生成） サルモネラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の粗
細胞溶菌液を、１０8／ｍｌ培養物のアリコート５マイクロリットルを取り、Ｓ
ＹＢＲ（登録商標）グリーン（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅ
ｕｇｅｎｅ ＯＲ）の１：１０，０００希釈物をそれを含有する２００μｌの溶
解試薬（溶解緩衝液および６２．５μｌのプロテアーゼ）に加えることによって
調製した。チューブにキャップをして、３７℃で２０分間インキュベーションし
、次いで、９５℃で１０分間インキュベーションした。４つの複製した溶菌液を
調製した。この粗細菌溶菌液の５０マイクロリットルを用いて、パーキンエルマ
ー７７００配列検出器装置で用いられるＰＣＲチューブに含有される８錠のＢＡ
Ｘ（登録商標）サルモネラ試料錠剤を水和した。さらに、色素を含有する溶解試
薬の５０マイクロリットルを５６個のＰＣＲチューブに分注した。すべてのチュ
ーブにキャップをして、パーキンエルマー９６００熱サイクル装置において下記
プロトコルに従ってサーマルサイクル処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３５サイクル ７２℃ ３．０分 ７２℃ ７分 １サイクル ４℃ 「永久」
細胞溶菌液を、１０8／ｍｌ培養物のアリコート５マイクロリットルを取り、Ｓ
ＹＢＲ（登録商標）グリーン（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅ
ｕｇｅｎｅ ＯＲ）の１：１０，０００希釈物をそれを含有する２００μｌの溶
解試薬（溶解緩衝液および６２．５μｌのプロテアーゼ）に加えることによって
調製した。チューブにキャップをして、３７℃で２０分間インキュベーションし
、次いで、９５℃で１０分間インキュベーションした。４つの複製した溶菌液を
調製した。この粗細菌溶菌液の５０マイクロリットルを用いて、パーキンエルマ
ー７７００配列検出器装置で用いられるＰＣＲチューブに含有される８錠のＢＡ
Ｘ（登録商標）サルモネラ試料錠剤を水和した。さらに、色素を含有する溶解試
薬の５０マイクロリットルを５６個のＰＣＲチューブに分注した。すべてのチュ
ーブにキャップをして、パーキンエルマー９６００熱サイクル装置において下記
プロトコルに従ってサーマルサイクル処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３５サイクル ７２℃ ３．０分 ７２℃ ７分 １サイクル ４℃ 「永久」
【０１２４】 （ＰＣＲ産物の力価） ＰＣＲ後、５６個の色素含有溶解試薬反応物をプールし、サルモネラ特異的産
物を力価測定するための希釈剤として用いた。サルモネラ特異的産物の１：１０
希釈物を、３０マイクロリットルのＰＣＲ産物を２７０マイクロリットルの溶解
試薬希釈剤に加えることによって作製した。この物質の２倍連続希釈物を、１０
０マイクロリットルの１：１０希釈物を１００マイクロリットルの溶解試薬希釈
剤と混合することによって作製した。これを６回繰り返して、下記の希釈物を得
た：１：１０、１：２０、１：４０、１：８０、１：１６０、１：３２０、１：
６４０および１：１２８０。融解曲線を、下記の条件を用いることによって、す
べての希釈物についてパーキンエルマー７７００ＤＮＡ配列検出器で作製した： プレートタイプ：シングルレポータ 装置： ７７００配列検出システム 操作： リアルタイム 色素層： ＦＡＭ 試料タイプ： 不明 試料体積： ５０μｌ 操作条件： ７０℃ ２分 １サイクル データ収集なし ６８℃ １０秒 ９８サイクル データ収集 自動増分 ＋０．３℃／サイクル ２５℃ 「永久」
物を力価測定するための希釈剤として用いた。サルモネラ特異的産物の１：１０
希釈物を、３０マイクロリットルのＰＣＲ産物を２７０マイクロリットルの溶解
試薬希釈剤に加えることによって作製した。この物質の２倍連続希釈物を、１０
０マイクロリットルの１：１０希釈物を１００マイクロリットルの溶解試薬希釈
剤と混合することによって作製した。これを６回繰り返して、下記の希釈物を得
た：１：１０、１：２０、１：４０、１：８０、１：１６０、１：３２０、１：
６４０および１：１２８０。融解曲線を、下記の条件を用いることによって、す
べての希釈物についてパーキンエルマー７７００ＤＮＡ配列検出器で作製した： プレートタイプ：シングルレポータ 装置： ７７００配列検出システム 操作： リアルタイム 色素層： ＦＡＭ 試料タイプ： 不明 試料体積： ５０μｌ 操作条件： ７０℃ ２分 １サイクル データ収集なし ６８℃ １０秒 ９８サイクル データ収集 自動増分 ＋０．３℃／サイクル ２５℃ 「永久」
【０１２５】 多成分データを装置からエクスポートして、分析において用いた。
【０１２６】 融解曲線分析の後、特異的なＤＮＡフラグメントの生成を、１５μｌのＢＡＸ
（登録商標）ローディング色素を増幅試料に加えることによって確認した。次い
で、アリコート１５μｌを、臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲルのウ
エルにローディングした。ゲルを１８０ボルトで３０分間泳動した。次いで、特
異的な産物を、ＵＶ透視法を用いて可視化した。
（登録商標）ローディング色素を増幅試料に加えることによって確認した。次い
で、アリコート１５μｌを、臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲルのウ
エルにローディングした。ゲルを１８０ボルトで３０分間泳動した。次いで、特
異的な産物を、ＵＶ透視法を用いて可視化した。
【０１２７】 （データ処理およびモデル化） 生の蛍光データを処理のためにマイクロソフトエクセルにインポートした。そ
れぞれのウエルについて、蛍光データを、最低の蛍光値を残りのデータポイント
から減じることによって規格化した。次いで、規格化されたデータはＳａｖｉｔ
ｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴリズムで平滑化される。温度に関する蛍光の負
の微分係数（−ｄＦ／ｄＴ）を取り、−ｄＦ／ｄＴ（ｙ軸）対温度（ｘ軸）でプ
ロットする。プロットを、特異的なＤＮＡ標的の有無を決定するために視覚によ
り調べた。これらの結果を、アガロースゲル検出から得られた結果と比較した。
れぞれのウエルについて、蛍光データを、最低の蛍光値を残りのデータポイント
から減じることによって規格化した。次いで、規格化されたデータはＳａｖｉｔ
ｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴリズムで平滑化される。温度に関する蛍光の負
の微分係数（−ｄＦ／ｄＴ）を取り、−ｄＦ／ｄＴ（ｙ軸）対温度（ｘ軸）でプ
ロットする。プロットを、特異的なＤＮＡ標的の有無を決定するために視覚によ
り調べた。これらの結果を、アガロースゲル検出から得られた結果と比較した。
【０１２８】 （結果） ゲルに基づく検出の感度レベルは出発物の１：１０希釈物であったが、融解曲
線分析の感度レベルは１：４０であった。これらの結果は、融解曲線分析がゲル
に基づく検出よりも約４倍高感度であることを示している。
線分析の感度レベルは１：４０であった。これらの結果は、融解曲線分析がゲル
に基づく検出よりも約４倍高感度であることを示している。
【０１２９】
【表５】
【０１３０】 （実施例６） （錠剤化された試薬送達システムにおける、ポシティブコントロールＰＣＲ
反応物、標的特異的ＰＣＲ反応物およびＤＮＡインターカレートＤＮＡの一体化
） 錠剤化された試薬送達システムを、少ない体積の重要な試薬をピペット分注す
ることを除くために開発した。錠剤を、米国特許第５，３０７，６４０号（Ｆａ
ｗｚｙ他）、米国特許第５，４７５，９８４号および国際出願特許公開Ｗ／Ｏ９
７／１１１９７、ならびに米国特許出願第０８／９２９，７１３号（１９９７年
９月１５日出願）に開示される手法に従って調製した（これらの内容は援用によ
り本明細書中に取り入れる）。標的を増幅するために必要な試薬およびコントロ
ールＤＮＡが錠剤に加えられた。これらの試薬には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒ
ｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）によって製造される蛍光ＤＮＡインタ
ーカレート色素ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンと、いくつかの食品に関連してＰ
ＣＲ阻害を克服することが明らかにされているウシ血清アルブミンとが含まれた
。ＳＶ４０（シミアンウイルス）ＤＮＡの１６８ｂｐフラグメントをポシティブ
コントロール反応の標的として選んだ。ＳＶ４０は、ＳＶ４０がいかなる食品ま
たは工業用微生物学的環境において自然には存在していないために選ばれた。
反応物、標的特異的ＰＣＲ反応物およびＤＮＡインターカレートＤＮＡの一体化
） 錠剤化された試薬送達システムを、少ない体積の重要な試薬をピペット分注す
ることを除くために開発した。錠剤を、米国特許第５，３０７，６４０号（Ｆａ
ｗｚｙ他）、米国特許第５，４７５，９８４号および国際出願特許公開Ｗ／Ｏ９
７／１１１９７、ならびに米国特許出願第０８／９２９，７１３号（１９９７年
９月１５日出願）に開示される手法に従って調製した（これらの内容は援用によ
り本明細書中に取り入れる）。標的を増幅するために必要な試薬およびコントロ
ールＤＮＡが錠剤に加えられた。これらの試薬には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒ
ｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）によって製造される蛍光ＤＮＡインタ
ーカレート色素ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンと、いくつかの食品に関連してＰ
ＣＲ阻害を克服することが明らかにされているウシ血清アルブミンとが含まれた
。ＳＶ４０（シミアンウイルス）ＤＮＡの１６８ｂｐフラグメントをポシティブ
コントロール反応の標的として選んだ。ＳＶ４０は、ＳＶ４０がいかなる食品ま
たは工業用微生物学的環境において自然には存在していないために選ばれた。
【０１３１】 （サルモネラ内部ポシティブコントロール錠剤の配合） この錠剤は下記の成分を含有した：
【０１３２】
【表６】
【０１３３】 （サルモネラ内部ポシティブコントロール錠剤の調製） トレハロースおよびカーボワックスを脱イオン水に溶解した。溶液を４℃に冷
却した。デオキシヌクレオチド、プライマー、ＳＶ４０ＤＮＡ、Ｓｕｒｆａｃｔ
−Ａｍｐ、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン、ＢＳＡおよびＡｍｐｌｉＴａｑを、
トレハロースおよびカーボワックスの冷却溶液に加えた。溶液を５μｍカートリ
ッジでろ過し、次いで、約１２０ｍｌ／分の試薬噴霧速度で、１．１ｍｍチップ
を通して液体窒素チャンバ内に噴霧した。次いで、凍結混合物を重力によりチャ
ンバの端部にあるトレイに集めた。次いで、凍結混合物を凍結乾燥機（Ｆｉｎｎ
Ａｑｕａ（ドイツ）から入手可能なＧＴ６など）において凍結乾燥した。凍結
乾燥プログラムは、−４０℃の製品温度および５０ミクロンのチャンバ圧で５０
時間の一次乾燥からなった。二次乾燥を２５℃で２０時間行った。次いで、凍結
乾燥混合物を２４メッシュの篩いでサイズ分けした。次いで、サイズ分けされた
混合物を、３／３２成形工具を用いて７．６ｍｇ／錠の最終重量に錠剤化した。
却した。デオキシヌクレオチド、プライマー、ＳＶ４０ＤＮＡ、Ｓｕｒｆａｃｔ
−Ａｍｐ、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン、ＢＳＡおよびＡｍｐｌｉＴａｑを、
トレハロースおよびカーボワックスの冷却溶液に加えた。溶液を５μｍカートリ
ッジでろ過し、次いで、約１２０ｍｌ／分の試薬噴霧速度で、１．１ｍｍチップ
を通して液体窒素チャンバ内に噴霧した。次いで、凍結混合物を重力によりチャ
ンバの端部にあるトレイに集めた。次いで、凍結混合物を凍結乾燥機（Ｆｉｎｎ
Ａｑｕａ（ドイツ）から入手可能なＧＴ６など）において凍結乾燥した。凍結
乾燥プログラムは、−４０℃の製品温度および５０ミクロンのチャンバ圧で５０
時間の一次乾燥からなった。二次乾燥を２５℃で２０時間行った。次いで、凍結
乾燥混合物を２４メッシュの篩いでサイズ分けした。次いで、サイズ分けされた
混合物を、３／３２成形工具を用いて７．６ｍｇ／錠の最終重量に錠剤化した。
【０１３４】 （サルモネラ内部ポシティブコントロール錠剤の評価） （混入食品試料の調製） サルモネラ汚染について広く調べられている食品を、サルモネラ内部ポシティ
ブコントロール錠剤の性能を評価するために用いた。これらの食品には、ミルク
、アメリカンチーズ、牛ひき肉および七面鳥ひき肉が含まれた。すべての食品を
、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓに
より１９９５年に出版されたＢａｃｔｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａ
ｎｕａｌ（ＢＡＭ）に記載される手法に従って予め強化した。規定の強化を行っ
た後、試料は、１０8／ｍｌ、１０5／ｍｌ、１０4／ｍｌのレベルにまでサルモ
ネラを混入するか、非混入のままにした。混入試料をブレインハートインフュー
ジョン（ＢＨＩ／Ｄｉｆｃｏ）で１：１０（１ｍｌの強化物＋９ｍｌのＢＨＩ）
に希釈し、次いで、３７℃で３時間インキュベーションした。
ブコントロール錠剤の性能を評価するために用いた。これらの食品には、ミルク
、アメリカンチーズ、牛ひき肉および七面鳥ひき肉が含まれた。すべての食品を
、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓに
より１９９５年に出版されたＢａｃｔｅｒｉａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａ
ｎｕａｌ（ＢＡＭ）に記載される手法に従って予め強化した。規定の強化を行っ
た後、試料は、１０8／ｍｌ、１０5／ｍｌ、１０4／ｍｌのレベルにまでサルモ
ネラを混入するか、非混入のままにした。混入試料をブレインハートインフュー
ジョン（ＢＨＩ／Ｄｉｆｃｏ）で１：１０（１ｍｌの強化物＋９ｍｌのＢＨＩ）
に希釈し、次いで、３７℃で３時間インキュベーションした。
【０１３５】 溶菌液の調製：２ｍｌのねじ付きキャップチューブにおいて、５マイクロリッ
トル（μｌ）のインキュベーションした希釈強化物を２００μｌの溶解試薬（５
ｍｌのＢＡＸ（登録商標）溶解緩衝液および６２．５μｌのＢＡＸ（登録商標）
プロテアーゼ）に加えた。チューブを３７℃で２０分間インキュベーションし、
次いで、９５℃で１０分間インキュベーションした。５０マイクロリットルのこ
の粗細菌溶菌液を用いて、パーキンエルマー７７００配列検出器装置で用いられ
るタイプのＰＣＲチューブに含有される１錠のサルモネラ内部ポシティブコント
ロールを水和した。チューブにキャップをして、パーキンエルマー９６００熱サ
イクル装置において下記プロトコルに従って熱サイクル処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３５サイクル ７２℃ ３．０分 ４℃ 「永久」
トル（μｌ）のインキュベーションした希釈強化物を２００μｌの溶解試薬（５
ｍｌのＢＡＸ（登録商標）溶解緩衝液および６２．５μｌのＢＡＸ（登録商標）
プロテアーゼ）に加えた。チューブを３７℃で２０分間インキュベーションし、
次いで、９５℃で１０分間インキュベーションした。５０マイクロリットルのこ
の粗細菌溶菌液を用いて、パーキンエルマー７７００配列検出器装置で用いられ
るタイプのＰＣＲチューブに含有される１錠のサルモネラ内部ポシティブコント
ロールを水和した。チューブにキャップをして、パーキンエルマー９６００熱サ
イクル装置において下記プロトコルに従って熱サイクル処理を行った： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３５サイクル ７２℃ ３．０分 ４℃ 「永久」
【０１３６】 （増幅（熱サイクリング）後の分析：） 増幅後、融解曲線を、サルモネラ内部ポシティブコントロール錠剤を用いて処
理された試料を用いて作製した。融解曲線を、下記の条件を用いることによって
パーキンエルマー７７００ＤＮＡ配列検出器において作製した： プレートタイプ：シングルレポータ 装置： ７７００配列検出システム 操作： リアルタイム 色素層： ＦＡＭ 試料タイプ： 不明 試料体積： ５０μｌ 操作条件： ７０℃ ２分 １サイクル データ収集なし ６８℃ １０秒 ９８サイクル データ収集 自動増分 ＋０．３℃／サイクル ２５℃ 「永久」
理された試料を用いて作製した。融解曲線を、下記の条件を用いることによって
パーキンエルマー７７００ＤＮＡ配列検出器において作製した： プレートタイプ：シングルレポータ 装置： ７７００配列検出システム 操作： リアルタイム 色素層： ＦＡＭ 試料タイプ： 不明 試料体積： ５０μｌ 操作条件： ７０℃ ２分 １サイクル データ収集なし ６８℃ １０秒 ９８サイクル データ収集 自動増分 ＋０．３℃／サイクル ２５℃ 「永久」
【０１３７】 多成分データを装置からエクスポートして、分析において用いた。特異的なＤ
ＮＡフラグメントの生成を、１５μｌのＢＡＸ（登録商標）ローディング色素を
増幅試料に加えることによって確認した。次いで、アリコート１５μｌを、臭化
エチジウムを含有する２％アガロースゲルのウエルにローディングした。ゲルを
１８０ボルトで３０分間泳動した。次いで、特異的な産物を、ＵＶ透視法を用い
て可視化した。
ＮＡフラグメントの生成を、１５μｌのＢＡＸ（登録商標）ローディング色素を
増幅試料に加えることによって確認した。次いで、アリコート１５μｌを、臭化
エチジウムを含有する２％アガロースゲルのウエルにローディングした。ゲルを
１８０ボルトで３０分間泳動した。次いで、特異的な産物を、ＵＶ透視法を用い
て可視化した。
【０１３８】 （データ分析：） 生の蛍光データを処理のためにマイクロソフトエクセルにインポートした。そ
れぞれのウエルについて、蛍光データを、最低の蛍光値を残りのデータポイント
から減じることによって規格化した。
れぞれのウエルについて、蛍光データを、最低の蛍光値を残りのデータポイント
から減じることによって規格化した。
【０１３９】 （１．融解曲線） 規格化されたデータを、次いで、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴ
リズムで平滑化した。温度に関する蛍光の対数の負の微分係数（−ｄｌｏｇ（Ｆ
）／ｄＴ）を取り、−ｄｌｏｇ（Ｆ）／ｄＴ（ｙ軸）対温度（ｘ軸）でプロット
した。
リズムで平滑化した。温度に関する蛍光の対数の負の微分係数（−ｄｌｏｇ（Ｆ
）／ｄＴ）を取り、−ｄｌｏｇ（Ｆ）／ｄＴ（ｙ軸）対温度（ｘ軸）でプロット
した。
【０１４０】 内部ポシティブコントロール反応物に対する融解温度範囲を確立した。この温
度範囲に融解曲線ピークを有するすべての試料を陽性と見なし、そしてピークが
その範囲内に見出されない場合、その試料を陰性と判定した。試料が陽性または
陰性であるかという決定は、ピーク高さとは関係なく行われた。
度範囲に融解曲線ピークを有するすべての試料を陽性と見なし、そしてピークが
その範囲内に見出されない場合、その試料を陰性と判定した。試料が陽性または
陰性であるかという決定は、ピーク高さとは関係なく行われた。
【０１４１】 （２．内部ポシティブコントロールデータのモデル化） 規格化されたデータを用いて開始した場合、データは、三次のスプライン補間
関数を用いて０．１℃の分解能で補間された。次いで、補間されたデータの対数
を取り、２．５度についてＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴリズムに
よって平滑化した。温度に関してｌｏｇ蛍光の負の微分係数（−ｄ（ｌｏｇＦ）
／ｄＴ）を取り、下記のデータ範囲を用いて０．５℃間隔で分析した： 内部ポシティブコントロール ７５．０℃から８２．０℃ （１２個のデータポイント、０．５℃の分解能）
関数を用いて０．１℃の分解能で補間された。次いで、補間されたデータの対数
を取り、２．５度についてＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴリズムに
よって平滑化した。温度に関してｌｏｇ蛍光の負の微分係数（−ｄ（ｌｏｇＦ）
／ｄＴ）を取り、下記のデータ範囲を用いて０．５℃間隔で分析した： 内部ポシティブコントロール ７５．０℃から８２．０℃ （１２個のデータポイント、０．５℃の分解能）
【０１４２】 これらのデータポイントは、内部ポシティブコントロール反応物に関する大部
分の情報を含有することが明らかにされている融解曲線の部分である。データを
モデル化することの目的は、内部ポシティブコントロール反応物が生じる試料を
、内部ポシティブコントロール反応物を生じさせることができない試料から区別
することであった。システムをモデル化するために、陽性の内部コントロール反
応物には「１」の分類が割り当てられたが、陰性の反応物には「０」の分類が割
り当てられた。これらの分類は、サルモネラ反応の状態に関係なく行われた。次
いで、一緒にされたデータ集合を、７５：２５の比率を用いて調整集合および試
験集合にランダムに分割した。次いで、調整集合を用いて、ニューラルネットワ
ークが調整され、次いで、試験集合を用いて、調整されたモデルが確認された。
分の情報を含有することが明らかにされている融解曲線の部分である。データを
モデル化することの目的は、内部ポシティブコントロール反応物が生じる試料を
、内部ポシティブコントロール反応物を生じさせることができない試料から区別
することであった。システムをモデル化するために、陽性の内部コントロール反
応物には「１」の分類が割り当てられたが、陰性の反応物には「０」の分類が割
り当てられた。これらの分類は、サルモネラ反応の状態に関係なく行われた。次
いで、一緒にされたデータ集合を、７５：２５の比率を用いて調整集合および試
験集合にランダムに分割した。次いで、調整集合を用いて、ニューラルネットワ
ークが調整され、次いで、試験集合を用いて、調整されたモデルが確認された。
【０１４３】 （結果：） ３３６個のサルモネラ試料をこれらの実験中に作製した。データ集合は、２５
２個の陽性試料（サルモネラが混入された試料）および８４個のブランク反応物
（非混入試料）からなった。３３６個の試料のうち、１０３個の試料はサルモネ
ラ特異的バンドをゲルでもたらさなかった。これには、８３個の非混入試料（８
４個の非混入試料のうちの１個は陽性であった）および２０個の混入試料が含ま
れた。試料のすべては、内部ポシティブコントロール反応に必要な化学を含有し
ていた。２つのサルモネラ陰性反応物（両方とも混入）は、ゲルで内部ポシティ
ブコントロールバンドをもたらすことができなかった。これらの試料は、サルモ
ネラ反応または内部ポシティブコントロール反応のいずれも作用しなかったため
に不定と見なされた。残りの試料は、ゲルで、サルモネラ反応または内部ポシテ
ィブコントロール反応のいずれか、あるいはその両方を示した。これにより、サ
ルモネラ特異的反応を用いた多重内部コントロールに関する基礎が確立された。
２個の陽性試料（サルモネラが混入された試料）および８４個のブランク反応物
（非混入試料）からなった。３３６個の試料のうち、１０３個の試料はサルモネ
ラ特異的バンドをゲルでもたらさなかった。これには、８３個の非混入試料（８
４個の非混入試料のうちの１個は陽性であった）および２０個の混入試料が含ま
れた。試料のすべては、内部ポシティブコントロール反応に必要な化学を含有し
ていた。２つのサルモネラ陰性反応物（両方とも混入）は、ゲルで内部ポシティ
ブコントロールバンドをもたらすことができなかった。これらの試料は、サルモ
ネラ反応または内部ポシティブコントロール反応のいずれも作用しなかったため
に不定と見なされた。残りの試料は、ゲルで、サルモネラ反応または内部ポシテ
ィブコントロール反応のいずれか、あるいはその両方を示した。これにより、サ
ルモネラ特異的反応を用いた多重内部コントロールに関する基礎が確立された。
【０１４４】 内部ポシティブコントロール反応のゲル状態を分類として用いて、調整集合お
よび試験集合をこれらの試料から作製した。調整集合は２５２個の試料からなり
、一方、試験集合は８４個の試料からなった。各々の集合は、混入試料および非
混入試料の比例的な分布を含んでいた。調整データ集合に基づいて、ニューラル
ネットワークモデル化技術は、ゲル方法に対して効果的な１００％の一致に関し
て、試験試料のすべてを正しく分類することができた。
よび試験集合をこれらの試料から作製した。調整集合は２５２個の試料からなり
、一方、試験集合は８４個の試料からなった。各々の集合は、混入試料および非
混入試料の比例的な分布を含んでいた。調整データ集合に基づいて、ニューラル
ネットワークモデル化技術は、ゲル方法に対して効果的な１００％の一致に関し
て、試験試料のすべてを正しく分類することができた。
【０１４５】 （実施例７） （サルモネラに対する標的および内部ポシティブコントロールの同時モデル
化） 内部ポシティブコントロールＤＮＡ（「ＩＮＰＣ」）および特異的標的生物Ｄ
ＮＡ（「標的」）の両方を有する反応物では、試薬に対する固有的な競合が存在
する。したがって、標的およびＩＮＰＣに対するシグナルはこれらの反応物では
関連する。２つの関連した出力を同時にモデル化することは、ニューラルネット
ワークの場合には共通した操作である。この場合、１つのモデルが２つの出力を
有する。本実施例では、この方法の好ましい実施態様が明らかにされるが、他の
変形が、多数の出力反応について存在する。
化） 内部ポシティブコントロールＤＮＡ（「ＩＮＰＣ」）および特異的標的生物Ｄ
ＮＡ（「標的」）の両方を有する反応物では、試薬に対する固有的な競合が存在
する。したがって、標的およびＩＮＰＣに対するシグナルはこれらの反応物では
関連する。２つの関連した出力を同時にモデル化することは、ニューラルネット
ワークの場合には共通した操作である。この場合、１つのモデルが２つの出力を
有する。本実施例では、この方法の好ましい実施態様が明らかにされるが、他の
変形が、多数の出力反応について存在する。
【０１４６】 サルモネラＤＮＡをＢＡＸ（登録商標）溶解緩衝液で連続的に希釈して、１０
ｎｇ／ｍｌ〜０．００５ｎｇ／ｍｌの濃度物を作製した。次いで、これらの溶液
を用いて、光学的ＰＣＲ反応チューブに含有される１錠のコントロール内蔵スク
リーニング／サルモネラ用ＢＡＸ（登録商標）試料錠剤（Ｑｕａｌｉｃｏｎキッ
トカタログ＃１７７１０６０４）を水和した。さらに、錠剤を溶解緩衝液のみで
水和して、陰性の「標的」コントロールとして用いた。チューブにキャップをし
、サーマルサイクリングおよびＤＮＡフラグメントの蛍光検出が組み込まれた装
置で処理した。この装置は、米国仮特許出願第６０／１６５，２６７号（１９９
９年１１月１２日出願）に記載されている（この開示は援用により本明細書中に
取り入れる）。試料を、下記のプログラムを用いてサーマルサイクル処理した： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３８サイクル ７０℃ ３．０分
ｎｇ／ｍｌ〜０．００５ｎｇ／ｍｌの濃度物を作製した。次いで、これらの溶液
を用いて、光学的ＰＣＲ反応チューブに含有される１錠のコントロール内蔵スク
リーニング／サルモネラ用ＢＡＸ（登録商標）試料錠剤（Ｑｕａｌｉｃｏｎキッ
トカタログ＃１７７１０６０４）を水和した。さらに、錠剤を溶解緩衝液のみで
水和して、陰性の「標的」コントロールとして用いた。チューブにキャップをし
、サーマルサイクリングおよびＤＮＡフラグメントの蛍光検出が組み込まれた装
置で処理した。この装置は、米国仮特許出願第６０／１６５，２６７号（１９９
９年１１月１２日出願）に記載されている（この開示は援用により本明細書中に
取り入れる）。試料を、下記のプログラムを用いてサーマルサイクル処理した： ９４℃ ２．０分 １サイクル ９４℃ １５秒 ３８サイクル ７０℃ ３．０分
【０１４７】 増幅後、融解曲線を、下記の条件を用いることによってその装置で作製した： １）６８．０℃で１２０秒間の予備融解インキュベーション、次いで ２）６８．０℃〜９５．０℃の０．３℃間隔での融解曲線
【０１４８】 生の蛍光データを、エクセルを用いて装置からエキスポートして、モデルの調
整および試験において用いた。
整および試験において用いた。
【０１４９】 融解曲線分析後、特異的なＤＮＡフラグメントの生成を、１５μｌのＢＡＸ（
登録商標）ローディング色素を増幅試料に加えることによって確認した。次いで
、アリコート１５μｌを、臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲルのウエ
ルにローディングした。ゲルを１８０ボルトで２５分間泳動した。次いで、特異
的な産物を、ＵＶ透視法を用いて可視化した。
登録商標）ローディング色素を増幅試料に加えることによって確認した。次いで
、アリコート１５μｌを、臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲルのウエ
ルにローディングした。ゲルを１８０ボルトで２５分間泳動した。次いで、特異
的な産物を、ＵＶ透視法を用いて可視化した。
【０１５０】 （データ分析：） 生の蛍光データを処理のためにマイクロソフトエクセルにインポートした。そ
れぞれのウエルについて、蛍光データを、最低の蛍光値を残りのデータポイント
から減じることによって規格化した。
れぞれのウエルについて、蛍光データを、最低の蛍光値を残りのデータポイント
から減じることによって規格化した。
【０１５１】 （１．融解曲線） 規格化されたデータを、次いで、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴ
リズムで平滑化した。温度に関する蛍光の対数の負の微分係数（−ｄｌｏｇ（Ｆ
）／ｄＴ）を取り、−ｄｌｏｇ（Ｆ）／ｄＴ（ｙ軸）対温度（ｘ軸）でプロット
した。
リズムで平滑化した。温度に関する蛍光の対数の負の微分係数（−ｄｌｏｇ（Ｆ
）／ｄＴ）を取り、−ｄｌｏｇ（Ｆ）／ｄＴ（ｙ軸）対温度（ｘ軸）でプロット
した。
【０１５２】 標的生物（「標的」）および内部ポシティブコントロール反応物（「ＩＮＰＣ
」）の両方を含む融解温度範囲を確立した。適切な温度範囲に標的融解曲線ピー
クを有するすべての試料を標的陽性と見なし、ピークがその範囲内に見出されな
い場合、その試料を標的陰性と呼んだ。試料が陽性または陰性であるかという決
定は、ピーク高さとは関係なく行われた。同様に、試料を、ピークが適切な温度
範囲において認められるかどうかに依存して、ＩＮＰＣ陽性またはＩＮＰＣ陰性
と分類した。
」）の両方を含む融解温度範囲を確立した。適切な温度範囲に標的融解曲線ピー
クを有するすべての試料を標的陽性と見なし、ピークがその範囲内に見出されな
い場合、その試料を標的陰性と呼んだ。試料が陽性または陰性であるかという決
定は、ピーク高さとは関係なく行われた。同様に、試料を、ピークが適切な温度
範囲において認められるかどうかに依存して、ＩＮＰＣ陽性またはＩＮＰＣ陰性
と分類した。
【０１５３】 変数「Ｉｓピーク」が、標的またはＩＮＰＣのいずれか（または両方）が陽性
である場合には陽性と定義され、そして標的またはＩＮＰＣのいずれも陽性でな
い場合には陰性と定義される。したがって、「Ｉｓピーク」は、適切なピーク（
標的またはＩＮＰＣ）が融解曲線に存在する場合には陽性であり、対応するピー
クが、すなわち、無スペクトルまたはブランク試料について存在しない場合には
陰性である。分類精度は、ＩＮＰＣよりもむしろ出力としてＩｓピークを用いて
増大することが経験的に見出された。
である場合には陽性と定義され、そして標的またはＩＮＰＣのいずれも陽性でな
い場合には陰性と定義される。したがって、「Ｉｓピーク」は、適切なピーク（
標的またはＩＮＰＣ）が融解曲線に存在する場合には陽性であり、対応するピー
クが、すなわち、無スペクトルまたはブランク試料について存在しない場合には
陰性である。分類精度は、ＩＮＰＣよりもむしろ出力としてＩｓピークを用いて
増大することが経験的に見出された。
【０１５４】 （２．標的データおよびＩｓピークデータの同時モデル化） 規格化されたデータを用いて開始した場合、データは、三次のスプライン補間
関数を用いて０．１℃の分解能で補間された。次いで、補間されたデータの対数
を取り、２．５度についてＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴリズムに
よって平滑化した。７２．０℃から９３．０℃のデータ範囲を用いて、温度に関
してｌｏｇ蛍光の負の微分係数（−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴ）を取った。
関数を用いて０．１℃の分解能で補間された。次いで、補間されたデータの対数
を取り、２．５度についてＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ平滑化アルゴリズムに
よって平滑化した。７２．０℃から９３．０℃のデータ範囲を用いて、温度に関
してｌｏｇ蛍光の負の微分係数（−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴ）を取った。
【０１５５】 これらのデータポイントは、標的反応およびＩＮＰＣ反応の両方に関するピー
クを含有する融解曲線のそのような部分から得られる。システムをモデル化する
ために、陽性の標的事例およびＩｓピーク事例には「１」の分類が割り当てられ
たが、陰性の事例には「０」の分類が割り当てられた。モデルでは、入力として
のサンプリング点における融解曲線と、標的およびＩｓピークの２つの出力とを
用いた。データ集合を、７５：２５の比率を用いて調整集合および試験集合にラ
ンダムに分割した。次いで、調整集合を用いて、ニューラルネットワークが調整
され、次いで、試験集合を用いて、調整されたモデルが確認された。結果を、デ
ータ集合全体（調整用と試験用）で再調整された適切な複雑度（４つの隠れユニ
ット）のニューラルネットワークモデルについて報告する。
クを含有する融解曲線のそのような部分から得られる。システムをモデル化する
ために、陽性の標的事例およびＩｓピーク事例には「１」の分類が割り当てられ
たが、陰性の事例には「０」の分類が割り当てられた。モデルでは、入力として
のサンプリング点における融解曲線と、標的およびＩｓピークの２つの出力とを
用いた。データ集合を、７５：２５の比率を用いて調整集合および試験集合にラ
ンダムに分割した。次いで、調整集合を用いて、ニューラルネットワークが調整
され、次いで、試験集合を用いて、調整されたモデルが確認された。結果を、デ
ータ集合全体（調整用と試験用）で再調整された適切な複雑度（４つの隠れユニ
ット）のニューラルネットワークモデルについて報告する。
【０１５６】 （結果：） ２３０４個のサルモネラ試料がこれらの実験のときに作製された。データ集合
は、５４６個の陽性標的試料（視認されるサルモネラピークを有する試料）およ
び１７４０個の標的陰性試料からなった。Ｉｓピーク変数の値は、７３６個の試
料について陽性であり、１５６８個の試料について陰性であった。陰性の事例に
は、５７６個のブランク試料（反応物を有しない）が含まれた。下記の表にニュ
ーラルネットワークモデルの精度をまとめる： （標的に対する結果） モデル陰性 モデル陽性 実際の陰性 １７３２ ８ 実際の陽性 ８ ５５６ 誤差率：０．６９％（１６／２３０４） （標的に対する結果） モデル陰性 モデル陽性 モデル陰性 モデル陽性 実際の陰性 １５６３ ５ 実際の陽性 ５ ７３１ 誤差率：０．４３％（１０／２３０４）
は、５４６個の陽性標的試料（視認されるサルモネラピークを有する試料）およ
び１７４０個の標的陰性試料からなった。Ｉｓピーク変数の値は、７３６個の試
料について陽性であり、１５６８個の試料について陰性であった。陰性の事例に
は、５７６個のブランク試料（反応物を有しない）が含まれた。下記の表にニュ
ーラルネットワークモデルの精度をまとめる： （標的に対する結果） モデル陰性 モデル陽性 実際の陰性 １７３２ ８ 実際の陽性 ８ ５５６ 誤差率：０．６９％（１６／２３０４） （標的に対する結果） モデル陰性 モデル陽性 モデル陰性 モデル陽性 実際の陰性 １５６３ ５ 実際の陽性 ５ ７３１ 誤差率：０．４３％（１０／２３０４）
【０１５７】 調整されたニューラルネットワークは、標的およびＩｓピーク変数の両方を予
測することに関して１％未満の分類誤差をもたらす。
測することに関して１％未満の分類誤差をもたらす。
【配列表】
【図１ａ】 リステリア菌から増幅されたＤＮＡフラグメントについて、ａ）平滑融解曲線
データから、ｂ）変換された（すなわち、−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴ）データまで
の推移、およびｃ）部分サンプリングされたデータを温度の関数として示す。
データから、ｂ）変換された（すなわち、−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴ）データまで
の推移、およびｃ）部分サンプリングされたデータを温度の関数として示す。
【図１ｂ】 リステリア菌から増幅されたＤＮＡフラグメントについて、ａ）平滑融解曲線
データから、ｂ）変換された（すなわち、−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴ）データまで
の推移、およびｃ）部分サンプリングされたデータを温度の関数として示す。
データから、ｂ）変換された（すなわち、−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴ）データまで
の推移、およびｃ）部分サンプリングされたデータを温度の関数として示す。
【図１ｃ】 リステリア菌から増幅されたＤＮＡフラグメントについて、ａ）平滑融解曲線
データから、ｂ）変換された（すなわち、−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴ）データまで
の推移、およびｃ）部分サンプリングされたデータを温度の関数として示す。
データから、ｂ）変換された（すなわち、−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴ）データまで
の推移、およびｃ）部分サンプリングされたデータを温度の関数として示す。
【図２】 多数の試料の温度を変性レベルにまで上昇させることによって得られ、部分サ
ンプリングされ、かつ変換された−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴ蛍光データのプロット
である。このプロットは多くの実験の合成であり、実施例１に示されたサルモネ
ラ混入（細菌ＤＮＡの添加）試料および非混入（細菌ＤＮＡの非添加）試料の両
方を含む。
ンプリングされ、かつ変換された−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴ蛍光データのプロット
である。このプロットは多くの実験の合成であり、実施例１に示されたサルモネ
ラ混入（細菌ＤＮＡの添加）試料および非混入（細菌ＤＮＡの非添加）試料の両
方を含む。
【図３】 多数の試料の温度を変性レベルにまで上昇させることによって得られ、部分サ
ンプリングされ、かつ変換された−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴ蛍光データのプロット
である。このプロットは多くの実験の合成であり、実施例２に示されたサルモネ
ラ混入試料およびサルモネラ非混入試料の両方を含む。
ンプリングされ、かつ変換された−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴ蛍光データのプロット
である。このプロットは多くの実験の合成であり、実施例２に示されたサルモネ
ラ混入試料およびサルモネラ非混入試料の両方を含む。
【図４】 多数の試料の温度を変性レベルにまで上昇させることによって得られ、部分サ
ンプリングされ、かつ変換された−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴ蛍光データのプロット
である。このプロットは多くの実験の合成であり、実施例１に示された大腸菌混
入試料および大腸菌非混入試料の両方を含む。
ンプリングされ、かつ変換された−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴ蛍光データのプロット
である。このプロットは多くの実験の合成であり、実施例１に示された大腸菌混
入試料および大腸菌非混入試料の両方を含む。
【図５】 多数の試料の温度を変性レベルにまで上昇させることによって得られ、部分サ
ンプリングされ、かつ変換された−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴ蛍光データのプロット
である。このプロットは多くの実験の合成であり、実施例１に示されたリステリ
ア菌混入試料およびリステリア菌非混入試料の両方を含む。
ンプリングされ、かつ変換された−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴ蛍光データのプロット
である。このプロットは多くの実験の合成であり、実施例１に示されたリステリ
ア菌混入試料およびリステリア菌非混入試料の両方を含む。
【図６】 試料の温度を変性レベルにまで上昇させることによって得られ、部分サンプリ
ングされ、かつ変換された−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴ蛍光データのプロットである
。このプロットは、実施例１および２において得られた典型的な産物の「スメア
」物を含む。スメアは、広範囲のフラグメントサイズを有する非特異的な増幅Ｄ
ＮＡ産物として定義される。この範囲は、典型的には、１００塩基対から、２，
０００塩基対以上までである。
ングされ、かつ変換された−ｄ（ｌｏｇＦ）／ｄＴ蛍光データのプロットである
。このプロットは、実施例１および２において得られた典型的な産物の「スメア
」物を含む。スメアは、広範囲のフラグメントサイズを有する非特異的な増幅Ｄ
ＮＡ産物として定義される。この範囲は、典型的には、１００塩基対から、２，
０００塩基対以上までである。
【図７】 本発明のデータ分析法の流れ図である。ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅによって定義さ
れる情報に富む領域はニューラルネットワークを用いてモデル化できると考えら
れる。逆に、部分サンプリングされたデータは、それぞれのボックスをつなぐ矢
印によって示されているようにＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅによってモデル化すること
ができる。しかし、この実施は、本明細書においては明示的に示されていない。
れる情報に富む領域はニューラルネットワークを用いてモデル化できると考えら
れる。逆に、部分サンプリングされたデータは、それぞれのボックスをつなぐ矢
印によって示されているようにＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅによってモデル化すること
ができる。しかし、この実施は、本明細書においては明示的に示されていない。
【図８】 温度を関数とする典型的な処理前の融解曲線データを示す。
【図９】 典型的な変換された融解曲線スペクトルを示す。
【図１０】 ２つの特徴および２つの出力状態を有するセルの可視化である。
【図１１】 ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅのスメア対非スメアのサルモネラ例に対する情報マップ
である。
である。
【図１２】 ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅの第２のサルモネラ例において、陰性試料に対する陽性
試料を区別するための温度スペクトルにおける情報に富む領域を示す情報マップ
である。
試料を区別するための温度スペクトルにおける情報に富む領域を示す情報マップ
である。
【図１３】 実施例４のリステリア菌融解曲線のプロットである。
【図１４】 実施例４のポシティブコントロールの融解曲線のプロットである。
【図１５】 実施例４におけるポシティブコントロールおよびリステリア菌の両方を有する
溶液の融解曲線のプロットである。
溶液の融解曲線のプロットである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 アーロン ジェイ．オウンズ アメリカ合衆国 19713 デラウェア州 ニューアーク レナピ レーン 23 (72)発明者 マイケル シャッファー アメリカ合衆国 19342 ペンシルベニア 州 グレン ミルズ エイリッツ ウェイ 40 (72)発明者 マーク エイ．ジャンセン アメリカ合衆国 19382 ペンシルベニア 州 ウェスト フィールディング ドライ ブ 1176 (72)発明者 ジェームズ ダブリュ．ヘイゼル アメリカ合衆国 21918 メリーランド州 コノウィンゴー リバティ グローブ ロード 1181 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA28 AA35 CB21 DA13 FA29 FB01 FB02 FB04 FB07 FB12 GC15 JA01 JA05 4B024 AA11 CA01 CA09 HA11 4B063 QA05 QQ42 QS40 QX04
Claims (21)
- 【請求項１】 任意の出発マトリクスを含む未知配列の溶液中の特異的な標
的ＤＮＡ配列を均一検出するためのコンピュータ方法であって、 ｉ．特異的なＤＮＡ配列を有効濃度で含有する溶液を調製すること； ｉｉ．二本鎖ＤＮＡに結合したときに有意な蛍光シグナルを発し、一本鎖ＤＮ
Ａの存在下では有意でないシグナルを発するインターカレート色素を含む、特異
的なＤＮＡ配列を増幅するのに十分な、有効量の試薬を加えること； ｉｉｉ．前記反応物中の前記特異的な標的ＤＮＡを増幅するために連続した一
連の処理を施すこと； ｉｖ．選択された間隔で蛍光を励起し、該励起された蛍光をモニタしながら、
ステップｉｉの溶液にアニーリング状態から融解状態まで上昇させる１回の温度
サイクルを施して、前記溶液中のＤＮＡの融解曲線を表す一連のアナログ出力シ
グナルを得ること； ｖ．デジタル形式で前記曲線を分析するためにプログラム化されたコンピュー
タに前記出力シグナルを入力し、前記曲線のデータを平滑化および変換してスペ
クトルを作成し、既知のＤＮＡ配列でコンピュータプログラムを調整することに
よって予め決定された値に基づき、前記スペクトルを分析して前記スペクトルに
おける検索的予測値を決定すること；および ｖｉ．選択された閾値を超える予測値によって前記未知配列を同定すること、 を含むことを特徴とするコンピュータ方法。 - 【請求項２】 任意の出発マトリクスを含む溶液中の未知標的細菌の標的Ｄ
ＮＡ配列を均一検出するためのコンピュータ方法であって、 ｉ．未知細菌のＤＮＡ配列を有効濃度で含有する溶液を調製すること； ｉｉ．二本鎖ＤＮＡに結合したときに有意な蛍光シグナルを発し、一本鎖ＤＮ
Ａの存在下では有意でないシグナルを発するインターカレート色素を含む、特異
的なＤＮＡ配列を増幅するために十分な、有効量の試薬を加えること； ｉｉｉ．前記反応物中の前記特異的な標的ＤＮＡを増幅するために連続した一
連の処理を施すこと； ｉｖ．選択された間隔で蛍光を励起し、その励起された蛍光をモニタしながら
、ステップｉｉの溶液にアニーリング状態から融解状態まで上昇させる１回の温
度サイクルを施して、前記未知物の融解曲線を表す一連のアナログ出力シグナル
を得ること； ｖ．デジタル形式で前記曲線を平滑化および分析するためにプログラム化され
たコンピュータに前記出力シグナルを入力し、前記曲線のデータを平滑化および
変換してスペクトルを作成し、前記スペクトルにおける情報に富む領域からのデ
ータの部分集合を決定し、前記領域における前記曲線の平滑化された値を用い、
標的細菌の既知ＤＮＡでコンピュータプログラムを調整することによって予め決
定された細菌の属および種に特有な平滑化された値に基づき標的配列の存在を予
測すること；および ｖｉ．選択された閾値を超える予測値によって前記未知細菌を同定すること、 を含むことを特徴とするコンピュータ方法。 - 【請求項３】 前記領域におけるデータを前記曲線の負のｄ（ｌｏｇＦ）／
ｄｔに変換し、前記領域において平滑化し、そして既知細菌の変換および平滑化
された負のｄ（ｌｏｇＦ）／ｄｔ値で調整することに基づいてこれを予測的にモ
デル化して、未知細菌を同定することを特徴とする請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記標的ＤＮＡが増幅プロトコルによって生成されることを
特徴とする請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】 前記増幅プロトコルが、ＰＣＲ、鎖置換、ＬＣＲおよびＮＡ
ＳＢＡからなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 ステップｖの情報に富む領域の決定が、 ｉ．有意な特徴の視覚による単離；または ｉｉ．情報マップのアルゴリズムによる作製 により達成されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
- 【請求項７】 前記平滑化がＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙアルゴリズムに
より行われることを特徴とする請求項３に記載の方法。 - 【請求項８】 前記コンピュータプログラムによる分析がニューラルネット
法を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。 - 【請求項９】 前記コンピュータプログラムによる分析が、最適なモデルが
前記情報に富む領域から進化させられ、かつ進化プロセスが前記試験データに対
する予測誤差を用いることによって実行される、ＩｎｆｏＥｖｏｌｖｅ法を含む
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記コンピュータプログラムが、ＭＬＲ、ＰＬＳおよびＳ
ＩＭＣＡからなる群から選択される方法を含むことを特徴とする請求項１または
２のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記コンピュータプログラムが請求項８、９および１０に
記載される方法の少なくとも２つを含み、それらの結果をポーリングすることを
特徴とする請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記溶液が、前記標的からのデータから完全に独立したポ
シティブコントロールをさらに含み、該コントロールが、成功の増幅プロトコル
が達成されたときにだけ前記融解曲線において視覚的に区別されるシグナルを付
与し、それにより偽陰性の結果が除かれることを特徴とする請求項１または２の
いずれか一項に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記プログラムがピーク含有領域から離れた前記曲線の領
域を最初に調べてベースラインの変化を検出し、それによりスメアの存在を決定
し、したがって予測できない試験を示すことを特徴とする請求項１または２に記
載の方法。 - 【請求項１４】 前記二本鎖ＤＮＡ形態、前記選択された長さおよび有効濃
度がＰＣＲによって提供されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法
。 - 【請求項１５】 ＰＣＲ用の内部ポシティブコントロール反応物を含む試薬
が１個の錠剤で提供されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 前記錠剤が、有効量のデオキシヌクレオチド、プライマー
ｒｃ７６１、プライマー３５、プライマー４１８５、プライマーｒｃ４２８９、
ＳＶ−４０ＤＮＡ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ｓｕｒｆａｃｔ−Ａｍｐｓ、ＢＳＡ、カ
ーボワックスおよびトレハロースを含むことを特徴とする請求項１５に記載の方
法。 - 【請求項１７】 有効量の次の成分：デオキシヌクレオチド、プライマーｒ
ｃ７６１、プライマー３５、プライマー４１８５、プライマーｒｃ４２８９、Ｓ
Ｖ−４０ＤＮＡ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ｓｕｒｆａｃｔ−Ａｍｐｓ、ＢＳＡ、カー
ボワックスおよびトレハロースを含む内部ポシティブコントロールを含む均一Ｐ
ＣＲ用錠剤であって、（ａ）前記成分を凍結乾燥して粉末を作製し、（ｂ）前記
粉末を篩いに通して所望する粒子サイズを得て、（ｃ）前記粒子から錠剤を作製
することによって調製されることを特徴とする錠剤。 - 【請求項１８】 インターカレート色素が凍結乾燥前に加えられることを特
徴とする請求項１７に記載の錠剤。 - 【請求項１９】 前記インターカレート色素が約０．８μＭ〜１．５μＭで
存在することを特徴とする請求項１７に記載の錠剤。 - 【請求項２０】 前記二本鎖ＤＮＡが約０．０６２ｎｇ／μｌ〜１０ｎｇ／
μｌであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。 - 【請求項２１】 前記錠剤が、約５０μＭ〜２００μＭのデオキシヌクレオ
チド、約０．０３μＭ〜０．５μＭのプライマー、反応あたり約５ｐｇ〜２０ｐ
ｇのＳＶ−４０、反応あたり約１．０ユニット〜２．５ユニットのＡｍｐｌｉＴ
ａｑ、約０．０３％〜０．０５％のＳｕｒｆａｃｔ−Ａｍｐｓ、反応あたり約１
０μｇ〜４０μｇのＢＳＡ、反応あたり約５ｍｇ〜１０ｍｇのトレハロース、お
よびＤＮＡインターカレート色素ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンの１：１００希
釈物０．５μｌを含有することを特徴とする請求項１６に記載の方法。
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|---|---|---|---|
| US13190199P | 1999-04-30 | 1999-04-30 | |
| US60/131,901 | 1999-04-30 | ||
| PCT/US2000/011084 WO2000066777A2 (en) | 1999-04-30 | 2000-04-26 | Assay based on the analysis of dna melting curves |
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|---|---|
| JP2002543408A true JP2002543408A (ja) | 2002-12-17 |
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Family Applications (1)
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| JP (1) | JP2002543408A (ja) |
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-
2000
- 2000-04-26 WO PCT/US2000/011084 patent/WO2000066777A2/en not_active Application Discontinuation
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- 2000-04-26 JP JP2000615399A patent/JP2002543408A/ja active Pending
- 2000-04-26 EP EP00931949A patent/EP1185697A2/en not_active Withdrawn
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