DE60019512T2

DE60019512T2 - DNA Chip, PNA Chip, sowie Herstellungsverfahren

Info

Publication number: DE60019512T2
Application number: DE60019512T
Authority: DE
Inventors: Yoshihiko Asaka-shi Makino; Yoshihiko Asaka-shi Abe; Masashi Ogawa; Makoto Fukuoka-shi Takagi; Shigeori Koga-shi Takenaka; Kenichi Fukuoka-shi Yamashita
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 1999-06-07
Filing date: 2000-06-07
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2020-06-08
Also published as: DE60019512D1; EP1077264B1; EP1077264A2; EP1077264A3; US6713255B1; US20040185492A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf einen DNA-Chip oder einen PNA-Chip, der vorteilhaft zum Detektieren eines Nucleinsäurefragmentes, welches zu einem DNA-Fragment oder einem PNA-Fragment des DNA-Chips bzw. des PNA-Chips komplementär ist, mit hoher Sensitivität verwendet werden kann. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren der quantitativen Analyse eines Nucleinsäurefragments, das in einer flüssigen Probe in extrem geringer Menge enthalten ist, unter Verwendung eines DNA-Chips oder eines PNA-Chips, welcher ein DNA-Fragment bzw. ein PNA-Fragment auf seinem festen Träger aufweist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Detektion eines Nucleinsäurefragments wird im Allgemeinen vorgenommen, indem eine Sonden-DNA verwendet wird, welche zu dem zu detektierenden Nucleinsäurefragment komplementär ist, und zwar mittels der Hybridisierung. Die Sonden-DNA ist im Allgemeinen unter Erhalt eines DNA-Chips auf einem festen Träger (Trägermaterial) befestigt. Ausführlicher beschrieben, ein Nucleinsäurefragment in einer Probenflüssigkeit wird einmal mit einer Fluoreszenzmarkierung oder einer Radioisotop-Markierung markiert, und dann wird die Probenflüssigkeit mit der Sonden-DNA auf dem DNA-Chip in Kontakt gebracht. Wenn das markierte Nucleinsäurefragment in der Probenflüssigkeit zur Sonden-DNA komplementär ist, wird das markierte Nucleinsäurefragment mittels Hybridisierung mit der Sonden-DNA kombiniert. Das markierte Nucleinsäurefragment, das über Hybridisierung mit der Sonden-DNA an den DNA-Chip gebunden ist, wird dann mittels eines geeigneten Detektionsverfahrens, wie Fluorometrie oder Autoradiographie, detektiert. Der DNA-Chip findet eine breite Anwendung in der Gentechnologie, z.B. zum Detektieren eines komplementären Nucleinsäurefragments oder zum Sequenzieren einer Nucleinsäure.
Der DNA-Chip ist z.B. beschrieben in Fodor S.P.A., Science 251, 767 (1991), und Schena M., Science, 270, 467 (1995). Es ist bekannt, dass der DNA-Chip eine kleine Menge eines komplementären Nucleinsäurefragments in einer kleinen Menge Probenflüssigkeit effizient detektiert. Der vordem bekannte DNA-Chip weist jedoch eine Beschränkung in Bezug auf das Detektionsniveau eines Nucleinsäurefragmentes auf, wie beispielsweise ein Niveau von nicht weniger als 10^–19 mol/dot. In bestimmten Fällen ist eine verbesserte hochsensitive Detektion erforderlich. So erfordern z.B. ein Verfahren zum Überwachen der Genexpression, insbesondere der Genexpression auf niedrigem Niveau, ein Verfahren zum Analysieren einer Genvariation, und ein Verfahren zum Analysieren von Genpolymorphismus eine höhere Sensitivität bei der Detektion von komplementären Nucleinsäurefragmenten.
Die Detektion eines Nucleinsäurefragments unter Verwendung einer elektrochemischen Markierung ist ebenfalls bekannt (japanische vorläufige Patentveröffentlichung Nr. 9-288080, und ein Vordruck der 57. Analytischen Chemie-Konferenz S. 137–138 (1996)). Die elektrochemische Markierung, wie beispielsweise ein N-Hydroxysuccinimidester einer Ferrocencarbonsäure, wird an eine Sonden-DNA gebunden. Die Sonden-DNA wird auf einem elektrisch leitenden Trägermaterial mit Ausgangsklemme befestigt. Beim Detektionsverfahren wird eine Probenflüssigkeit, die das Ziel-Nucleinsäurefragment enthält, mit der Sonden-DNA, die die Ferrocenderivat-Markierung aufweist, in Gegenwart eines elektrochemisch aktiven Strang-Interkalators in Kontakt gebracht. Das Ziel-Nucleinsäurefragment hybridisiert mit der Sonden-DNA, wenn es zur Sonden-DNA komplementär ist. In die gebildete Hybridstruktur intercaliert der elektrochemisch aktive Strang-Intercalator. Danach wird an das elektrisch leitende Trägermaterial ein Potential angelegt um einen elektrischen Strom zu messen, der zwischen der Ferrocenderivat-Markierung und dem Strang-Intercalator fließt.
Auf dem oben genannten elektrisch leitenden Trägermaterial sind ungefähr 10^–11 mol des Ferrocenderivat-modifizierten DNA-Fragments befestigt, und zwar pro 1 mm² Oberflächenbereich des Trägermaterials. Es ist beschrieben, dass komplementäre Nucleinsäuremoleküle im Bereich von 10^–5 bis 10^–11/mm² detektiert werden, wenn eine Probenflüssigkeit, die Ziel-Nucleinsäuremoleküle enthält, mit der Sonden-DNA in Kontakt gebracht wird.
Der Vordruck der 47. Polymer-Gesellschafts-Konferenz, S. 3155–3156 (1998) beschreibt ein elektrochemisches Detektionsverfahren, bei dem eine Probenflüssigkeit, die ein Ziel-Nucleinsäurefragment enthält, mit einer DNA-Sonde in Kontakt gebracht wird, welche auf einem elektrisch leitenden Trägematerial befestigt ist, und zwar in Anwesenheit eines elektrochemisch aktiven Strang-Intercalators. Auf dem elektrisch leitenden Trägermaterial sind die DNA-Sonden in einer Menge von ungefähr 10^–11 mol/2 mm² (Oberflächenbereich des Trägermaterials) befestigt. Wenn eine Probenflüssigkeit, die Ziel-Nucleinsäurefragmente im Überschuss (beispielsweise ungefähr zehnfach oder mehr) enthält, mit der Sonden-DNA in Kontakt gebracht wird, werden komplementäre Nucleinsäurefragmente in einer Menge von ungefähr 10^–11 mol detektiert.
P.E. Nielsen et al., Science 254, 1497–1500 (1991) und P.E. Nielsen et al., Biochemistry, 36, S. 5072–5077 (1997) beschreiben PNA (Peptidnucleinsäure oder Polyamidnucleinsäure), welche keine negative Ladung aufweist und auf dieselbe Weise funktioniert wie DNA. PNA besitzt ein Polyamidrückgrat aus N-(2-Aminoethyl)glycin-Einheiten und besitzt weder Glucose-Einheiten noch Phosphatgruppen. Eine typische PNA sowie eine typische DNA sind unten beispielhaft dargestellt:
Da PNA elektrisch neutral ist und in Abwesenheit eines elektrolytischen Salzes nicht geladen ist, ist PNA in der Lage, mit einem komplementären Nucleinsäurefragment unter Bildung eines Hybrids zu hybridisieren, welches stabiler ist als ein Hybrid, das sich aus einer DNA-Sonde und ihrem komplementären Nucleinsäurefragment ergibt (Vordruck der 74. Frühlings-Konferenz der Japanischen Chemischen Gesellschaft, S. 1287, berichtet von Naomi Sugimoto).
Die japanische vorläufige Patentveröffentlichung Nr. 11-332595 beschreibt eine PNA-Sonde, die auf einem festen Träger an einem ihrer Enden befestigt ist, und ein Detektionsverfahren, das sich der PNA-Sonde bedient. Die PNA-Sonde ist mittels des Avidinbiotin-Verfahrens auf dem festen Träger befestigt.
Die zuvor genannte Veröffentlichung P.E. Nielsen et al., Science, 254, 1497–1500 (1991) beschreibt außerdem eine PNA-Sonde, die mit einem Isotopenelement markiert ist, und ein Detektionsverfahren eines komplementären Nucleinsäurefragmentes.
Da die PNA-Sonde in einer Probenflüssigkeit keine elektrische Abstoßung gegenüber einem Ziel-Nucleinsäurefragment zeigt, wird eine verbesserte hohe Detektionssensitivität erwartet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Mittel zum Detektieren eines Nucleinsäurefragments zur Verfügung zu stellen, die eine verbesserte hohe Sensitivität für ein Nucleinsäurefragment, das in einer Probenflüssigkeit enthalten ist, zeigen.
Insbesondere ist es ein Ziel der Erfindung, einen DNA-Chip und einen PNA-Chip zur Verfügung zu stellen, welche zur quantitativen Detektion eines Nucleinsäurefragments, das in einer Probenflüssigkeit in einer extrem geringen Menge enthalten ist, geeignet sind.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Verfahren zum quantitativen Detektieren eines Nucleinsäurefragments, das in einer Probenflüssigkeit in einer extrem geringen Menge enthalten ist, mit einer hohen Sensitivität und guter Reproduzierbarkeit zur Verfügung zu stellen.
Die vorliegende Erfindung wohnt einem DNA-Chip inne, der einen festen Träger und eine Vielzahl von DNA-Fragmenten, welche an jeweils einem Ende an dem Träger befestigt sind, umfasst, wobei eine Vielzahl von kurzkettigen Abstandhaltermolekülen, die jeweils eine hydrophile Gruppierung an einem Ende aufweisen, mit dem jeweils anderen Ende an einen Oberflächenbereich des festen Trägers befestigt sind, der keine DNA-Fragmente aufweist.
Die Erfindung wohnt außerdem einem PNA-Chip inne, der einen festen Träger und eine Vielzahl von PNA-Fragmenten, die an jeweils einem Ende an dem festen Träger befestigt sind, umfasst, wobei eine Vielzahl von kurzkettigen Abstandhalterniolekülen, die jeweils eine hydrophile Gruppierung an einem Ende aufweisen, mit dem jeweils anderen Ende an einen Oberflächenbereich des festen Trägers befestigt sind, der keine PNA-Fragmente aufweist.
Der erfindungsgemäße DNA-Chip (oder PNA-Chip) wird vorteilhaft durch ein Verfahren hergestellt, das die folgenden Schritte umfasst:
Aufbringen einer wässrigen Lösung einer Vielzahl von DNA-Fragmenten (oder PNA-Fragmenten), die in einem wässrigen Medium gelöst oder dispergiert sind, auf einen festen Träger, um die DNA-Fragmente (oder PNA-Fragmente) auf dem festen Träger zu befestigen; und
Aufbringen einer wässrigen Lösung kurzkettiger Abstandhaltermoleküle, die jeweils an einem Ende eine hydrophile Gruppierung und am jeweils anderen Ende eine reaktive Verbindung zum Befestigen an den festen Träger aufweisen, auf den festen Träger, der darauf die befestigten DNA-Fragmente (oder PNA-Fragmente) aufweist.
Beim erfindungsgemäßen DNA-Chip und PNA-Chip ist der feste Träger bevorzugt ein elektrisch leitendes Trägermaterial.
Der erfindungsgemäße DNA-Chip (oder PNA-Chip) wird vorteilhaft in einem Verfahren der quantitativen Analyse eines Nucleinsäurefragments verwendet, das in einer Probenflüssigkeit enthalten ist und welches zu den DNA-Fragmenten (oder PNA-Fragmenten) auf dem DNA-Chip (oder PNA-Chip) komplementär ist, welches die folgenden Schritte umfasst:
Einstellen der Konzentration des Nucleinsäurefragments in der Probenflüssigkeit, so dass ein Tropfen der Probenflüssigkeit, der auf den DNA-Chip (oder PNA-Chip) aufgebracht wird, 10^–20 bis 10^–16 mol des Nucleinsäurefragments pro 1 mm² der Oberfläche des elektrisch leitenden Trägermaterials des DNA-Chips (oder PNA-Chips) enthalten sollte;
Inkontaktbringen der Probenflüssigkeit, bei der die Nucleinsäurekonzentration eingestellt wurde, mit dem DNA-Chip (oder PNA-Chip) mit einem elektrisch leitenden Trägermaterial, wobei die Nucleinsäure mit dem DNA-Fragment (oder PNA-Fragment) auf dem DNA-Chip (oder PNA-Chip) hybridisiert;
Inkontaktbringen eines elektrochemisch aktiven Moleküls mit dem Nucleinsäure-DNA-Fragment-Hybrid (oder Nucleinsäure-PNA-Fragment-Hybrid), wobei sich das elektrochemisch aktive Molekül an die hybridisierte Nucleinsäure und das DNA-Fragment (oder PNA-Fragment) anlagert;
Anlegen eines Potentials an den DNA-Chip (oder PNA-Chip);
und
Messen eines elektrischen Stroms, der von dem oder zu dem elektrisch leitenden Trägermaterial durch das angelagerte elektrochemisch aktive Molekül fließt.
Dementsprechend wird der DNA-Chip (oder PNA-Chip) der Erfindung bevorzugt in Form eines Kits zum Durchführen der quantitativen Analyse eines Nucleinsäurefragmentes, das in einer Probenflüssigkeit enthalten ist, welches komplementär zu den DNA-Fragmenten (oder PNA-Fragmenten) des DNA-Chips (oder PNA-Fragments) ist, geliefert, welcher den DNA-Chip (oder PNA-Chip) mit einem elektrisch leitenden Substrat und ein elektrochemisch aktives Molekül, welches sich an ein Nucleinsäurefragment-Hybrid anlagern kann, und ein DNA-Fragment umfasst.
Bei dem erfindungsgemäßen DNA-Chip (oder PNA-Chip) sind die DNA-Fragmente (oder PNA-Fragmente) bevorzugt in einer Menge von 10^–20 bis 10^–12 mol/mm² auf dem festen Träger befestigt.
Die hydrophile Gruppierung des Abstandhaltermoleküls ist bevorzugt eine Hydroxylgruppe, und das Abstandhaltermolekül ist bevorzugt über eine Sulfhydrylgruppierung, die an das Ende des Abstandhaltermoleküls gebunden ist, auf dem festen Träger befestigt. Das Abstandhaltermolekül ist bevorzugt von einer Verbindung abgeleitet, die aus der Gruppe bestehend aus 2-Mercaptoethanol, 3-Mercaptoethanol, 6-Mercaptoethanol und N,N'-Di-(3-hydroxyn-propyl)imidazol-2-thion ausgewählt ist. Das Abstandhaltermolekül kann eine cyclische Gruppe in der molekularen Struktur enthalten.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt schematisch einen erfindungsgemäßen DNA-Chip (oder einen PNA-Chip) und einen Mechanismus zur Detektion komplementärer Nucleinsäurefragmente entsprechend der vorliegenden Erfindung.
2 ist eine gaphische Darstellung, die einen elektrischen Strom darstellt, der bei dem erfindungsgemäßen Detektionsverfahren beobachtet wird, sowie einen elektrischen Strom, der in dem Fall beobachtet wird, dass keine Hybridisierung zwischen der Sonden-DNA und einem Ziel-Nucleinsäurefragment auftritt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der erfindungsgemäße DNA-Chip und PNA-Chip sind detaillierter unter Bezugnahme auf 1 beschrieben. Da der DNA-Chip und der PNA-Chip im Wesentlichen dieselbe Struktur besitzen, bezieht sich die folgende Beschreibung hauptsächlich auf die Struktur und Herstellung des DNA-Chips.
1-(1) stellt schematisch einen herkömmlich verwendeten DNA-Chip 31 dar, welcher einen festen Träger (z.B. ein elektrisch leitendes Trägermaterial) 11 und eine Vielzahl von DNA-Fragmenten 21 umfasst, welche an jeweils einem Ende auf dem festen Träger befestigt sind.
1-(2) stellt schematisch einen DNA-Chip 51 entsprechend der Erfindung dar, welcher hergestellt wird, indem eine wässrige Lösung, die eine Vielzahl von Abstandhalterverbindungen (oder Abdeckungsverbindungen bzw. Markierungsverbindungen, welche im Vergleich mit der Kettenstruktur des zuvor befestigten DNA-Fragmentes eine kurze Kettenstruktur aufweisen) 41a enthält, mit dem DNA-Chip 31 von 1-(1) in Kontakt gebracht wird, so dass die Vielzahl an Abstandhalterverbindungen 41a in den Bereichen auf dem festen Träger 11 angebracht werden, in denen die DNA-Fragmente nicht befestigt sind. Die befestigten Abstandhalterverbindungen (nämlich die Abstandhaltermoleküle) 41b weisen eine hydrophile Gruppe 42 an jedem ihrer freien Enden auf.
[Fester Träger]
Der feste Träger des erfindungsgemäßen DNA-Chips kann jeder bekannte feste Träger oder dessen äquivalentes Material sein, z.B. ein elektrisch leitendes Trägermaterial (z.B. Elektrode), eine Kunststofffolie bzw. -lage ["plastic sheet"] und eine Glaslage ["glas sheet"]. Das elektrisch leitende Trägermaterial wird hauptsächlich zum Durchführen der elektrochemischen Analyse verwendet.
Das elektrisch leitende Trägermaterial kann auf einem elektrisch-isolierenden Stütz- bzw. Trägermaterial bereitgestellt werden. Das elektrisch leitende Trägermaterial und das Stützmaterial weisen bevorzugt eine weniger hydrophile Oberfläche oder eine hydrophobe Oberfläche auf. Das elektrisch leitende Trägermaterial kann eine ebene Oberfläche besitzen oder eine Oberfläche, die viele feine konkave und konvexe Strukturen aufweist.
Das elektrisch-isolierende Trägermaterial kann aus Glas, Keramik, Polymermaterialien (z.B. Polyethylenterephthalat, Celluloseacetat, Polycarbonat von Bisphenol A, Polystyrol, Poly(methylmethacrylat), Silicium, Aktivkohle und porösen Materialien (z.B. porösem Glas, poröser Keramik, porösem Silicium, poröser Aktivkohle, Gewebe, Maschenware, Vliesware, Filterpapier und Membranfilter) hergestellt sein. Polymermaterialien, Glas und Silicium werden bevorzugt verwendet.
Im Allgemeinen wird das elektrisch-isolierende Trägermaterial in Form einer flächigen Lage bzw. Schicht (oder eines Belags bzw. einer Folie) verwendet. Die flächige Lage bzw. Schicht dieses Trägermaterials hat bevorzugt eine Dicke im Bereich von 100 bis 1.000 μm.
Das elektrisch leitende Trägermaterial kann aus einem Elektrodenmaterial, Glasfiber, einer Photodiode, einem Thermistor, einem elektrischen Piezoelement oder einem Oberflächenelastizitätselement hergestellt sein. Im Allgemeinen wird das Elektrodenmaterial verwendet. Die Elektrode kann eine Kohleelektrode aus Graphit oder Glaskohle ("glassy carbon"), eine Edelmetallelektrode aus Platin, Gold, Palladium oder Rhodium, eine Metalloxidelektrode aus Titandioxid, Zinnoxid, Manganoxid oder Bleioxid, eine Halbleiterelektrode aus Si, Ge, ZnO oder Cds sein oder ein Elektronenleiter aus Titan. Bevorzugt sind eine Glaskohleelektrode und eine Goldelektrode. Die Elektrode kann mit einem elektrisch leitenden Polymerfilm oder Monomolekularfilm überzogen sein.
Der erfindungsgemäße DNA-Chip setzt sich bevorzugt aus einem hydrophoben, elektrisch-isolierenden Stütz- bzw. Trägermaterial, einer Vielzahl von hydrophoben, elektrisch leitenden Trägermaterialien, die auf dem Stützmaterial platziert sind, einer Vielzahl von DNA-Fragmenten, die auf jedem der elektrisch leitenden Trägermaterialien befestigt sind, und einer Vielzahl von Abstandhaltermolekülen, die auf den Trägermaterialien auf freien Bereichen (d.h. Bereichen, an denen keine DNA-Fragmente vorhanden sind) befestigt sind, zusammen. Jedes der elektrisch leitenden Trägermaterialien ist bevorzugt getrennt von den benachbarten elektrisch leitenden Trägermaterialien angeordnet, so dass jedes Trägermaterial von den benachbarten Trägermaterialien isoliert ist. Das elektrisch leitende Trägermaterial kann über eine Zwischenlage, wie beispielweise eine hydrophile Zwischenlage, die Elektronenladungen aufweisen kann, auf dem Stützmaterial angeordnet sein.
Ein Beispiel der Struktur, die sich aus einem elektrisch-isolierenden Stützmaterial und einer Vielzahl von Elektroden, die auf dem Stützmaterial angeordnet sind, zusammensetzt, ist ein Silicium-Chip, der in Sosnowski, R.G., et al., Proc. Natl. Acad. USA, 94, 1119–1123 (1997) beschrieben ist. Die Elektrode kann auf einem Polymerfilm hergestellt werden, indem eine zusammengesetzte Lage aus einem Polymerfilm und einem Metallfilm verwendet wird.
[DNA-Fragment]
Ein DNA-Fragment, das auf dem festen Träger zu befestigen ist, kann ein Polynucleotid sein, wie beispielsweise eine cDNA, ein Teil einer cDNA oder ein EST. Das Polynucleotid wird vorteilhaft zum Studieren der Genexpression verwendet. Andererseits kann das auf dem festen Träger zu befestigende DNA-Fragment ein Oligonucleotid sein, welches vorteilhaft zum Studieren von Genvariationen und -polymorphismus verwendet wird. Das auf dem festen Träger zu befestigende DNA-Fragment ist bevorzugt ausgewählt aus 3-meren bis 50-meren, bevorzugter 10-meren bis 25-meren.
Wenn der erfindungsgemäße DNA-Chip mehrere DNA-Chip-Einheiten umfasst, von denen jede ein elektrisch leitendes Trägermaterial (z.B. eine Elektrode) und DNA-Fragmente, die auf dem Trägermaterial befestigt sind, umfasst, können die mehreren DNA-Chip-Einheiten dieselben DNA-Fragmente oder unterschiedliche DNA-Fragmente aufweisen.
Die Befestigung der DNA-Fragmente an dem Trägermaterial kann mittels jedes bekannten Verfahrens vorgenommen werden. Z.B. können DNA-Fragmente, die eine reaktive Gruppe an einem Ende aufweisen, über kovalente Bindung mittels der Reaktion der reaktiven Gruppe und der funktionellen Gruppe der Oberfläche des Trägermaterials auf dem Trägermaterial befestigt werden. Z.B. wird eine Sulfhydrylgruppe (bzw. Mercaptogruppe) an das DNA-Fragment an sein 5'- oder 3'-Ende angehängt, und dann wird die Mercaptogruppe veranlasst, mit einer Goldelektrode zu reagieren, so dass ein elektrisch leitendes Trägermaterial mit darauf befestigten DNA-Fragmenten hervorgebracht wird. Das Verfahren zum Anhängen einer Mercaptogruppe an DNA-Fragmente ist bei M. Maeda, et al., Chem. Lett., 1805–1808 (1994) und B.A. Connolly, Nucleic Acids Res., 13, 4484 (1985) beschrieben.
Wenn das elektrisch leitende Trägermaterial aus einer Glaskohleelektrode besteht, wird die Glaskohleelektrode mit Kaliumpermanganat oxidiert um eine Carbonsäuregruppe auf der Elektrode zu erzeugen. Die Carbonsäuregruppe auf der Elektrode bildet eine Amidbindung mit dem DNA-Fragment, so dass das DNA-Fragment an dem Trägermaterial befestigt wird. Siehe K.M. Millan, et al., Analytical Chemistry, 65, 2317–2323 (1993).
DNA-Fragmente können anfänglich in Form von Hybrid-DNA-Fragmenten auf dem Substrat befestigt werden. Z.B. werden Hybrid-DNA-Fragmente mit einer Mercaptogruppe an ihren 5'- oder 3'-Enden (bevorzugt 5'-Enden) von einem einzelnen Fragment kombiniert, und sie werden mit einer Goldelektrode in Kontakt gebracht, so dass die Hybrid-DNA-Fragmente an der Elektrode befestigt werden. Das Hybrid-DNA-Fragment, das an der Elektrode befestigt ist, wird dann so behandelt, dass ein einzelnes Fragment ohne Mercaptogruppe abdissoziiert, so dass der gewünschte DNA-Chip hergestellt wird.
Die kovalente Bindung zwischen dem DNA-Fragment und dem Trägermaterial kann unter Verwendung einer Aminogruppe, einer Aldehydgruppe, einer Mercaptogruppe oder eines Biotin-Moleküls, welche bzw. welches an das DNA-Fragment angehängt wird, gebildet werden. Wenn das Substrat aus einer Glas-Lage oder Silicium-Lage bzw. -schicht besteht, wird seine Oberfläche bevorzugt mit einem Silanhaftmittel behandelt, und zwar vor der Bildung der kovalenten Bindung.
Andererseits können DNA-Fragmente mittels eines bekannten Verfahrens auf dem Substrat synthetisiert werden.
Das DNA-Fragment mit einer reaktiven Gruppe an einem Ende kann auf einem festen Träger, wie einem elektrisch leitenden Trägermaterial, befestigt werden, indem auf den Träger eine wässrige Lösung, die das DNA-Fragment enthält, getüpfelt wird. Die wässrige Lösung enthält das DNA-Fragment bevorzugt in einer Konzentration von mehreren pM bis mehreren mM. Das Volumen zum Tüpfeln liegt im Allgemeinen im Bereich von 1 bis 100 nl, bevorzugt 1 bis 10 nl. Die wässrige Lösung kann einen Viskositäts-erhöhenden Zusatz wie Saccharose, Polyethylenglykol oder Glycerin enthalten. Das Tüpfeln kann manuell oder unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Spotters vorgenommen werden. Die aufgetüpfelte Lösung wird dann auf dem festen Träger für mehrere Stunden bei einer vorbestimmten Temperatur gehalten (Inkubation), wobei das DNA-Fragment mittels kovalenter Bindung auf dem Träger befestigt wird. Nachdem die Inkubation beendet ist, wird freies DNA-Fragment (welches nicht auf dem Träger befestigt ist) vorzugsweise abgewaschen.
Das DNA-Fragment wird auf dem festen Träger bevorzugt in einer Menge von 10^–20 bis 10^–12 mol/mm² des Oberflächenbereichs des Trägers befestigt. Die Menge des befestigten DNA-Fragments kann mittels HPLC ("high performance liquid chromatography"; Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) oder eines anderen analytischen Apparates bestimmt werden.
[PNA-Fragment]
Das in der Erfindung bevorzugt verwendete PNA-Fragment hat die folgende Formel (I):
In der Formel haben die Symbole B¹¹, R¹¹, L¹¹, a, b, c und d die unten beschriebenen Bedeutungen.
B¹¹ ist ein Ligand und stellt eine der Basen von natürlichen Nucleinsäuren (d.h. A, T, C, G, I oder U) oder ihr Analogon dar. Im Fall, dass die Base eine Purinbase wie Adenin, Guanin oder Inosin ist, ist B¹¹ an der 9. Position gebunden, und über die erste Position in dem Fall, dass die Base eine Pyrimidinbase wie Thymin, Uracil oder Cytosin ist. Das Basen-Analogon ist eine organische Base, welche der Base natürlicher Herkunft in ihrer chemischen Struktur ähnlich ist, z.B. eine basische Gruppe, welche hergestellt wird, indem das Kohlenstoff- oder Stickstoff-Atom des Purin- oder Pyrimidinrings durch ein Stickstoff- bzw. Kohlenstoffatom ersetzt wird, oder eine basische Gruppe, die den Purin- oder Pyrimidinring mit einem Substituenten, wie beispielsweise einer Sulfhydrylgruppe oder einem Halogenatom modifiziert. Ansonsten kann B¹¹ eine aromatische Gruppierung sein, die keine Nucleinsäurebase enthält, eine Alkanoylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine Hydroxylgruppe oder ein Wasserstoffatom. Beispiele der Basen-Analoga umfassen 7-Deazaadenin, 6-Azauracil und 5-Azacytosin. B¹¹ kann auch ein DNA-Intercalator, ein Reporterligand, eine Protein-Markierung wie ein Hapten oder ein Biotin, eine Spinmarkierung oder eine radioaktive Markierung sein. Besonders bevorzugt sind Nucleinsäurebasen (d.h. A, T, C, G und U).
R¹¹ ist ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe, die von einer Seitenkette einer α-Aminosäure natürlicher Herkunft abgeleitet ist. Beispiele solcher Gruppen umfassen eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, eine Aralkylgruppe mit einer Alkylgruppe von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Heteroarylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, eine Hydroxylgruppe, eine Alkoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Alkylthiogruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Gruppe -NR¹³R¹⁴ [wobei R¹³ und R¹⁴ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, eine Alkoxygruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, eine Alkylthiogruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder eine Hydroxylgruppe sind), und eine Mercaptogruppe. R¹¹ kann einen alicyclischen Ring oder einen heterocyclischen Ring in Kombination mit dem Kohlenstoffatom, an das R¹¹ gebunden ist, bilden.
L¹¹ ist eine Verbindungsgruppe, wie eine divalente Gruppe, verkörpert durch die Gruppe -CO- oder -CONR¹²-[R¹² ist ein Wasserstoffatom, eine Alkylengruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine Hydroxylgruppe, eine Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder eine Aminogruppe] oder eine Alkylengruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Die Alkoxygruppe und die Aminogruppe können einen oder mehrere Substituenten, wie beispielsweise Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, und eine Hydroxylgruppe aufweisen.
a, b und c sind jeweils unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 0 bis 5, bevorzugt 1, und d ist eine ganze Zahl von 1 bis 60, bevorzugt eine ganze Zahl von 1 bis 40.
Ein besonders bevorzugtes PNA-Fragment hat die folgende Formel (II), bei der jeweils B¹¹ und d dieselbe Bedeutung wie für die Formel (I) oben beschrieben haben:
Das PNA-Fragment kann auf bekannte Weise an dem festen Träger befestigt sein (siehe Protein, Nucleic Acid, Enzyme, Bd. 43, Nr. 13, 2004–2011 (1988) und japanische vorläufige Patentveröffentlichung Nr. 9-288080). Ebenso sind Verfahren, die den oben erwähnten DNA-Fragment-Befestigungsverfahren ähnlich sind, anwendbar.
[Kurzkettige Abstandhaltermoleküle]
Der erfindungsgemäße DNA-Chip weist eine Vielzahl von kurzkettigen Abstandhaltermolekülen mit einer hydrophilen Gruppe an jeweils einem Ende auf, welche am jeweils anderen Ende auf einem Oberflächenbereich des festen Trägers, der keine DNA-Fragmente darauf aufweist, befestigt sind, wie schematisch in der beigefügten 1-(2) dargestellt. Das Bedecken des festen Trägers unter Verwendung der Abstandhaltermoleküle kann auch mit dem Begriff "Maskierungsbehandlung" ausgedrückt werden.
Die kurze Kette des Abstandhaltermoleküls bedeutet, dass die molekulare Länge des Abstandhaltermoleküls ausreichend kurz ist, verglichen mit der Länge des DNA-Fragments, das in deren naher Umgebung auf dem Träger befestigt ist.
Das Abstandhaltermolekül besitzt bevorzugt ein Hauptrückgrat, das sich aus einer Alkylengruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen zusammensetzt. Das Abstandhaltermolekül kann eine cyclische Gruppe in der molekularen Kette oder als Substituent aufweisen. Beispiele der cycli schen Gruppen umfassen eine Arylgruppe mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkylgruppe mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen und eine heterocyclische Gruppe mit 1 bis 4 Heteroatomen (z.B. N, S, O oder P) und 2 bis 20 Kohlenstoffatomen. Die cyclische Gruppe kann die reaktive Gruppe enthalten, welche mit der Trägeroberfläche zur Reaktion gebracht werden kann um die Abstandhalteratome auf dem Träger zu befestigen. Ein Beispiel ist eine Imidazol-2-thion-Gruppe.
Die hydrophile Gruppierung kann in der Endposition oder in der Nähe der Endposition an das Abstandhaltermolekül gebunden werden. Eine oder mehrere hydrophile Gruppierungen können an das Abstandhaltermolekül gebunden werden. Beispiele der hydrophilen Gruppierungen umfassen Hydroxyl-, Carboxyl-, Amido-, Phosphoryl- und Sulfonylgruppen. Bevorzugt ist eine Hydroxylgruppe.
Das andere Ende des Abstandhaltermoleküls wird auf einem Oberflächenbereich des Trägers befestigt, an den das DNA-Fragment nicht gebunden ist. Die Befestigung des Abstandhaltermoleküls wird bevorzugt unter Verwendung einer reaktiven Gruppe durchgeführt, welche am anderen Ende an das Abstandhaltermolekül gebunden ist. Beispiele der reaktiven Gruppen umfassen Mercapto- bzw. Sulfhydryl-, Sulfid-, Disulfid-, Thiocarbonyl- und Thiocarboxylgruppen. Bevorzugt sind Mercapto-, Thiocarbonyl- und Sulfidgruppen. Besonders bevorzugt ist eine Mercaptogruppe. Es ist auch bevorzugt, dass der feste Träger auf seiner Oberfläche eine reaktive Gruppe aufweist, wie beispielsweise eine Amino-, Imino-, Hydrazino-, Hydrazid-, Amid-, Carboxyl-, Aldehyd-, Epoxy- oder Peroxygruppe.
Beispiele der reaktiven Verbindungen, die als Abstandhaltermoleküle dienen, umfassen Mercaptomethanol, 2-Mercaptoethanol, 3-Mercaptopropanol, 4-Mercaptobutanol, 5-Mercaptopentanol, 6-Mercaptohexanol, N,N'-Di-(3-hydroxy-n-propyl)imidazol-2-thion und verschiedene Imidazol-2-thion-Derivate, die in A.J. Arduengo, et al., J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 6153-6154, beschrieben sind. Bevorzugt sind 2-Mercaptoethanol, 3-Mercaptopropanol, 4-Mercaptobutanol, 5-Mercaptopentanol und 6-Mercaptohexanol. Am meisten bevorzugt ist 2-Mercaptoethanol. Diese aktiven Verbindungen können in Form von ihren Salzen mit Natrium oder Kalium vorliegen. Die Alkylenkette der aktiven Verbindung kann mit einem oder mehreren Substituenten substituiert sein, wie beispielsweise einer Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen (z.B. Methyl, Ethyl oder Phenyl).
Es können zwei oder mehr unterschiedliche Abstandhaltermoleküle auf den festen Träger angeordnet werden.
[Hybridisierung]
Die Hybridisierung kann im Wesentlichen auf dieselbe Weise durchgeführt werden, wie in verschiedenen Assay-Verfahren eingesetzt, die den herkömmlichen DNA-Chip verwenden.
Wenn die elektrochemische Analyse durchgeführt wird, wird ein elektrochemisch aktives Molekül, insbesondere ein elektrochemisch aktiver Strang-Intercalator, bevorzugt zur Insertion in ein Hybrid, das aus dem DNA-Fragment und einem Proben-Nucleinsäurefragment auf dem elektrisch leitenden Trägermaterial gebildet ist, verwendet. Der Strang-Intercalator unterstützt das einfache Fließen eines elektrischen Stroms über die gebildete Hybridstruktur, und zwar von oder zu dem Trägermaterial. Der elektrochemische Strang-Intercalator kann schon vorliegen, wenn die Hybridisierung stattfindet. Andererseits kann der Strang-Intercalator mit einer zuvor gebildeten Hybridstruktur in Kontakt gebracht werden. In dem letzten Fall wird ein freies Nucleinsäurefragment, welches nicht mit dem befestigten DNA-Fragment hybridisiert, bevorzugt durch Waschen mit einem Gemisch aus einem oberflächenaktiven Mittel (bevorzugt Natriumdodecylsulfat) und einem Puffer (bevorzugt einem Citratpuffer) vor dem Kontakt mit dem Intercalator entfernt. Der Intercalator wird bevorzugt in einer wässrigen Lösung bei einer Konzentration von 10 nM bis 10 mM mit dem Hybrid in Kontakt gebracht.
Die Hybridisierung wird bevorzugt bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und ungefähr 70°C über 0,5 bis 20 Stunden durchgeführt.
[Proben-Nucleinsäurefragment]
Das Proben-Nucleinsäurefragment kann ein DNA-Fragment sein, das von einer lebenden Probe erhalten wurde, wenn notwendig nach dem Durchführen eines geeigneten Verfahrens, ein DNA-Fragment, das erhalten wurde, indem ein DNA-Fragment geschnitten wurde, das durch Gentechnologie hervorgebracht wurde, und indem das geschnittene Produkt mittels Elektrophorese isoliert wurde, ein einzelsträngiges DNA-Fragment, welches mittels eines chemischen Prozesses synthetisiert wurde. Ein doppelsträngiges DNA-Fragment wird bevorzugt mit Hitze oder einer alkalischen Lösung behandelt um ein einzelsträngiges Fragment zu erhaltert. Mehrere Arten von Nucleinsäurefragmenten können auf einem DNA-Chip analysiert werden.
Das Proben-Nucleinsäurefragment wird in Form seiner wässrigen Lösung mit einem DNA-Fragment, das auf dem festen Träger befestigt ist, in Kontakt gebracht. Die wässrige Lösung enthält das Proben-Nucleinsäurefragment bevorzugt bei einer Konzentration von mehreren pM bis mehreren mM, bevorzugt bei einer Konzentration von mehreren pM bis mehreren nM.
[Elektrochemisch aktiver Strang-Intercalator]
Die elektrochemisch aktiven Strang-Intercalatoren, die vorteilhaft für die elektrochemische Analyse der Nucleinsäurefragmente verwendet werden, sind bereits bekannt. Ein repräsentatives Beispiel für den Intercalator ist ein Strang-Intercalator mit einer elektrisch leitenden Gruppe an einem Ende oder an beiden Enden. Der Strang-Intercalator mit der elektrisch leitenden Gruppe hat bevorzugt eine oxidativ-reduktive Aktivität. Die oxidativ-reduktive Aktivität kann dem Strang-Intercalator verliehen werden, indem eine Ferrocengruppe, eine Catecholamingruppe, eine Metall-Bipyridin-Komplex-Gruppe, eine Metall-Phenathrolin-Komplex-Gruppe oder eine Viologengruppe in den Intercalator eingebaut wird. Die Intercalatorgruppierung umfasst bevorzugt eine Naphthalinimidgruppierung, eine Anthracengruppierung oder eine Anthrachinongruppierung. Ein bevorzugter elektrochemisch aktiver Strang-Intercalator ist eine Ferrocen-enthaltende Naphthalindiimidverbindung [NDIFc₂-1, welche aus einem Carbonsäu reester von N-Hydroxysuccinimid und einer entsprechenden Aminverbindung hergestellt wird, siehe S. Takenaka, et al., J. Chem. Soc. Commun., 1111 (1998)]:
Ein Ferrocen-enthaltendes Naphthalindiimid-Derivat mit der folgenden Formel wird ebenfalls bevorzugt verwendet:
In der oben dargestellten Formel bedeutet X eine der folgenden Ferrocen-Derivat-Gruppen:
Der Strang-Intercalator mit einer elektrisch leitenden Gruppe umfasst nicht nur die oxidativ-reduktiv aktive Gruppierung und die Intercalator-Gruppierung, sondern auch eine Linker-Gruppierung, die zwischen diesen Gruppierungen platziert wird. Die 1,4-Dipropylpiperazinylgruppe der Formel ist ein Beispiel für eine Linker-Gruppierung. Die Piperazinylgruppe kann durch eine quaternäre Iminogruppe ersetzt werden. Ein Intercalator der unten dargestellten Formel, welcher eine quaternäre Iminogruppe aufweist, ist immer kationisch, ungeachtet der pH-Bedingungen. Dies bedeutet, dass der Intercalator fest an das DNA-Hybrid und das PNA-Hybrid gebunden ist. Dementsprechend wird er in dieser Erfindung bevorzugt verwendet. Insbesondere ist der Intercalator mit einer quaternären Iminogruppe bei der Verwendung in Kombination mit dem PNA-Chip bevorzugt. Der Linker kann eine n-Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen (z.B. Methyl, Ethyl oder n-Propyl) sein. Das oxidativ-reduktive Potential der Ferrocengruppierung des Intercalators schwankt in Abhängigkeit von der Natur der Linker-Gruppierung.
[Hoch-sensitive quantitative Analyse eines Proben-Nucleinsäurefragments]
1-(1), -(2), -(3) und -(4) stellen den Mechanismus der hoch-sensitiven quantitativen Analyse von einem Proben-Nucleinsäurefragment entsprechend der vorliegenden Erfindung schematisch dar. Wie oben beschrieben stellt 1-(2) beispielhaft einen DNA-Chip (oder PNA-Chip) 51 entsprechend der Erfindung dar, und zwar mit den Abstandhaltermolekülen 41b auf einem elektrisch leitenden Trägermaterial 11 zwischen den Fragmenten 21. Die Abstandhaltergruppe 41b weist eine hydrophile Gruppe (z.B. eine Hydroxylgruppe) 42 an einem Ende auf, welches dem anderen gegenüber liegt, an dem der Abstandhalter am Trägermaterial befestigt ist.
Wenn eine wässrige Lösung, die ein Proben-Nucleinsäurefragment 61 enthält, welches zu dem DNA-Fragment 21 des DNA-Chips 51 komplementär ist, auf den DNA-Chip aufgebracht bzw. aufgetüpfelt wird, hybridisiert das Proben-Nucleinsäurefragment 61 mit dem DNA-Fragment 21 und ergibt eine doppelsträngige Hybridstruktur 71, wie in 1-(3) dargestellt. Wird die Hybridisierung in Gegenwart eines elektrochemisch aktiven Strang-Intercalators 81a durchgeführt, tritt dieser in die Hybridstruktur 71 unter Erhalt eines elektrisch leitenden Teils 81b ein, wie in 1-(4) dargestellt. Die Verfahren werden im Allgemeinen in einem wässrigen Medium durchgeführt. Unter dieser Bedingung wird ein elektrisches Potential an das elektrisch leitende Trägermaterial 11 angelegt, wonach ein elektrischer Strom entlang der Hybridstruktur 71 mit dem elektrisch leitenden Teilen 81b von oder zu dem elektrisch leitenden Trägermaterial 11 fließt. Der elektrische Strom wird dann gemessen. Die erfindungsgemäße quantitative Analyse wird unten detaillierter beschrieben.
Im ersten Schritt wird eine wässrige Lösung eines Proben-Nucleinsäurefragments hergestellt. Das Proben-Nucleinsäurefragment wird in einem wässrigen Medium gelöst oder dispergiert. Die wässrige Lösung eines Proben-Nucleinsäurefragments wird dann mit dem DNA-Chip in Kontakt gebracht. Der Kontakt kann hergestellt werden, indem die wässrige Lösung auf den DNA-Chip aufgebracht bzw. aufgetüpfelt wird oder indem der DNA-Chip in die wässrige Lösung eingetaucht wird. Das frühere Tüpfel ("spotting")-Verfahren wird bevorzugt. Das Proben-Nucleinsäurefragment ist bevorzugt in der aufgetüpfelten wässrigen Lösung in einer molaren Menge von ungefähr 1 bis 10⁴ pro einem Mol des am Träger befestigten DNA-Fragments enthalten.
Bei dem erfindungsgemäßen DNA-Chip sind die DNA-Fragmente auf dem festen Träger bevorzugt in einer Menge von 10^–20 bis 10^–12 mol/mm² befestigt. Im bevorzugten Bereich sind die Abstandhaltermoleküle auf dem festen Träger an freien Zwischenräumen zwischen den befestigten DNA-Fragmenten gut befestigt, wodurch die DNA-Fragmente vertikal gut nebeneinander auf dem Träger angeordnet sind und die freien Zwischenräume mit den Abstandhaltermolekülen mit einer hydrophilen Gruppe an der Spitze bedeckt sind. Die hydrophilen Gruppen an den freien Zwischenräumen bewirken auch, dass das Proben-Nucleinsäurefragment und der Strang-Intercalator von ihrer nicht-spezifischen Adsorption an den festen Träger ferngehalten werden.
Entsprechend der experimentellen Studie, die von den Erfindern durchgeführt wurde, kann der erfindungsgemäße maskierte DNA-Chip (d.h. der DNA-Chip mit den Abstandhaltermolekülen, die zwischen den auf einen festen Träger befestigten DNA-Fragmenten befestigt sind) für extrem hoch-sensitive quantitative Bestimmung eines Proben-Nucleinsäurefragments verwendet werden, wie beispielsweise einer molaren Menge von 10^–20 bis 10^–16 mol, bevorzugt 10^–20 bis 10^–18 mol, pro 1 mm² des festen Trägers. Wenn ein kleinerer fester Träger wie beispielsweise ein extrem kleines elektrisch leitendes Trägermaterial verwendet wird, kann eine verbesserte hoch-sensitive quantitative Bestimmung eines Proben-Nucleinsäurefragments erreicht werden, wie beispielsweise einer molaren Menge von bis zu 10^–21 mol, pro 1 mm² des Trägers.
Der DNA-Chip, der auf seiner Oberfläche die aufgetüpfelte wässrige Lösung eines Proben-Nucleinsäurefragments trägt, wird dann für eine bestimmte Zeitspanne zum Durchführen der Inkubation stehen gelassen. Bei dem Inkubationsverfahren neigt der Strang-Intercalator dazu, nicht-spezifisch von freien DNA-Fragmenten auf dem DNA-Chip adsorbiert zu werden, welche an der Hybridisierung mit dem Proben-Nucleinsäurefragment nicht teilgenommen haben. Solch eine ungünstige nicht-spezifische Adsorption des Intercalators durch die freien DNA-Fragmente kann vermieden werden, indem eine Salzkonzentration der wässrigen Lösung des Proben-Nucleinsäurefragments von 0,1 M oder mehr, bevorzugt 0,1 bis 1,0 M, eingestellt wird.
Es ist nicht vorteilhaft, dass der DNA-Chip, der der Hybridisierung unterworfen wurde, gewaschen wird um freie Strang-Intercalatoren zu entfernen. Das liegt daran, dass bei dem Waschverfahren die Strang-Intercalatoren, die mit der Hybridstruktur verbunden sind, freigesetzt werden könnten.
Die Bindung des elektrochemisch aktiven Strang-Intercalators an die Hybridstruktur kann untersucht werden, indem ein elektrischer Strom gemessen wird, der über die Hybridstruktur mit dem elektrochemisch aktiven Strang-Intercalator von oder zu dem festen Träger (d.h. dem elektrisch leitenden Trägermaterial) fließt. Die Messung eines elektrischen Stroms kann mittels jedes bekannten Verfahrens durchgeführt werden, wie z.B. cyclischer Voltammetrie ("cyclic voltamography", CV), differentieller Puls-Voltanmmetrie ("differential pulse voltamography", DPD) und mittels eines Potentiostaten. Insbesondere bevorzugt ist die differentielle Puls-Voltammetrie.
Die vorliegende Erfindung wird mittels der folgenden Beispiele weiter beschrieben.
BEISPIEL 1
(1) Herstellung eines DNA-Chips
Eine Goldelektrode (Oberfläche: 1 mm²) wurde für eine Stunde in eine wässrige 2N-Natriumhydroxidlösung eingetaucht, mit Wasser gewaschen und in konzentrierte Salpetersäure eingetaucht. Die Salpetersäure wurde für 15 Min. gerührt. Die Goldelektrode wurde dann mit superreinem Wasser gewaschen und getrocknet. Auf die so behandelte Goldelektrode wurde 1 μl einer wässrigen Lösung, die 20-mere von Adenin mit einer Mercaptohexylgruppe an ihren 5'-Enden (HS-dA₂₀, in einer Menge von 10^–14 mol/μl) enthielt, aufgetüpfelt, und die Elektrode wurde für 2 Stunden stehen gelassen. Die Elektrode wurde mit superreinem Wasser gewaschen und man erhielt einen DNA-Chip. Die Herstellung von HS-dA₂₀ wurde auf die Art und Weise durchgeführt, wie sie in der vorläufigen japanischen Patentveröffentlichung Nr. 9-288080 beschrieben ist.
(2) Befestigung der Abstandhaltermoleküle
Auf den in (1) oben hergestellten DNA-Chip wurde 1 μl einer wässrigen 2-Mercaptoethanollösung (1 mM) aufgetüpfelt. Die aufgetüpfelte Lösung wurde bedeckt und man ließ sie für 2 Stunden stehen. Der DNA-Chip wurde dann mit superreinem Wasser gewaschen und man erhielt den erfindungsgemäßen DNA-Chip mit Abstandhaltermolekülen auf seiner Elektrode.
(3) Synthese von Ferrocen-enthaltendem Strang-Intercalator
Das unten dargestellte Ferrocen-enthaltende Naphthalindiimid wurde auf die Weise synthetisiert, die in der vorläufigen japanischen Patentveröffentlichung Nr. 9-288080 beschrieben ist:
(4) Detektion eines Proben-Nucleinsäurefragments
Ein Proben-Nucleinsäurefragment, und zwar 20-mere aus Thymin (dT₂₀, was zu dA₂₀, das auf dem DNA-Chip befestigt ist, komplementär ist) wurde auf ähnliche Weise wie der in der oben erwähnten Veröffentlichung hergestellt.
Auf den in (2) oben hergestellten DNA-Chip wurde 1 μl einer wässrigen Lösung von dT₂₀ getüpfelt und man ließ den DNA-Chip bei 25°C für 30 Min. zur Inkubation stehen.
Eine wässrige elektrolytische Lösung [Gemisch aus wässriger 0,1 M Essigsäure/Kaliumacetatlösung (pH 5,6) und wässriger 0,1 M Kaliumchloridlösung), das 50 μM des Ferrocen-enthaltenden Naphthalindiimids (wie in (3) oben hergestellt) enthielt] wurde in eine Thermostatzelle eingebracht und bei 20°C gehalten. In der wässrigen elektrolytischen Lösung wurden Trioden platziert, die sich aus dem DNA-Chip (Arbeitselektrode), einer Platinelektrode (Gegenelektrode) und einer Silber/Silberchlorid-Referenzelektrode zusammensetzten und es wurde eine differentielle Puls-Voltammetrie (DPV) durchgeführt. Anschließend wurde aus den DPV-Daten ein Peak-Strom bei 460 mV bestimmt.
Die oben erwähnten Detektionsverfahren wurden unter Verwendung wässriger Proben-Nucleinsäurefragment-Lösungen mit 10^–19 mol/μl und 10^–18 mol/μl wiederholt um aus den erhaltenen DPV-Daten Peak-Ströme bei 460 mV zu bestimmen.
Die Peak-Ströme sind graphisch in 2 mittels der Linie dargestellt, die die Kreise verbindet.
Die oben beschriebenen Detektionsverfahren wurden zu Vergleichszwecken wiederholt, indem eine wässrige Proben-Nucleinsäurefragment-Lösung verwendet wurde, die nichtkomplementäres dA₂₀-Fragment enthielt. Die Peak-Ströme sind graphisch in 2 mittels der Linie dargestellt, die die leeren Quadrate verbindet.
2 zeigt, dass ein linearer Zusammenhang zwischen der Menge des aufgetüpfelten Nucleinsäurefragments und dem Peak-Strom im 10^–20 bis 10^–18 mol-Bereich bei Verwendung des erfindungsgemäßen DNA-Chips beobachtet wird. Das bedeutet, dass eine wässrige Proben-Nucleinsäurefragment-Lösung zumindest im Bereich von 10^–20 bis 10^–18 mol pro 1 mm² der Elektrodenoberfläche quantitativ analysiert wird.
BEISPIEL 2
(1) Herstellung eines PNA-Chips
Auf eine Goldelektrode (Oberfläche: 2,25 mm²) mit einer Mercaptogruppe wurde eine Phosphatpufferlösung aufgebracht, die 1,2-Bis(vinylsulfonylacetamid)ethan enthielt um auf der Elektrodenoberfläche eine freie Vinylsulfonylgruppe zu bilden. Auf diese Oberfläche wurde weiterhin 1 nl einer wässrigen Lösung des unten dargestellten PNA-Thyminfragments (PNA-T₁₀, 50 nM-Lösung) aufgebracht. Man ließ die aufgetüpfelte Lösung für eine Stunde bei Raumtemperatur stehen. Die Elektrode wurde dann mit destilliertem reinen Wasser gewaschen um freies PNA-T₁₀ zu entfernen, wobei man einen PNA-Chip erhielt. Die Herstellung von PNA-T₁₀ wurde auf die Weise durchgeführt, die in P.E. Nielsen et al., Journal of Americal Chemical Society, 114, 1895–1897 (1992), ebd. 114, 9677–9678 (1992) beschrieben ist.
(2) Befestigung von Abstandhaltermolekülen
Auf den PNA-Chip, der in (1) oben hergestellt wurde, wurde 1 μl einer wässrigen 2-Mercaptoethanollösung (1 mM) aufgetüpfelt. Die aufgetüpfelte Lösung wurde abgedeckt und man ließ sie für 2 Stunden stehen. Der PNA-Chip wurde dann mit superreinem Wasser gewaschen und man erhielt den erfindungsgemäßen PNA-Chip mit Abstandhaltermolekülen auf seiner Elektrode.
(3) Detektion eines Proben-Nucleinsäurefragments
Die Detektionsverfahren von Beispiel 1–(4) wurden wiederholt, mit der Ausnahme, dass der DNA-Chip durch den PNA-Chip, der in (2) oben hergestellt wurde, ersetzt wurde.
Es wurden beinahe dieselben Detektionsergebnisse wie jene, die oben in Beispiel 1–(4) beobachtet wurden, erhalten.

Claims

DNA-Chip umfassend einen festen Träger und eine Vielzahl von DNA-Fragmenten, von denen jedes an einem Ende an dem Träger befestigt ist, wobei eine Vielzahl von kurzkettigen Abstandhaltermolekülen, die verglichen mit der Länge der DNA-Fragmente kurz sind, und die eine hydrophile Gruppierung an einem Ende aufweisen, mit dem anderen Ende an einen Oberflächenbereich des festen Trägers befestigt ist, der keine DNA-Fragmente aufweist.
DNA-Chip nach Anspruch 1, wobei der feste Träger ein elektrisch leitendes Trägermaterial ist.
DNA-Chip nach Anspruch 1, wobei die DNA-Fragmente in einer Menge von 10^–20–10^–12 Mol/mm² an dem Träger befestigt sind.
DNA-Chip nach Anspruch 1, wobei die hydrophile Gruppierung des Abstandhaltermoleküls eine Hydroxylgruppe ist.
DNA-Chip nach Anspruch 1, wobei das Abstandhaltermolekül über eine Sulfhydrylgruppierung, die an das Ende des Abstandhaltermoleküls angehängt ist, an dem festen Träger befestigt ist.
DNA-Chip nach Anspruch 1, wobei das Abstandhaltermolekül von einer Verbindung abgeleitet ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2-Mercaptoethanol, 3-Mercaptopropanol, 6-Mercaptohexanol, und N,N'-Di(3-hydroxy-n-propyl)-imidazol-2-thion.
Verfahren zur Herstellung eines DNA-Chips nach Anspruch 1, welches die Schritte umfasst: Aufbringen einer wässrigen Lösung einer Vielzahl von DNA-Fragmenten, die in einem wässrigen Medium gelöst oder dispergiert sind, auf einen festen Träger, um die DNA-Fragmente auf dem festen Träger zu befestigen; und Aufbringen einer wässrigen Lösung kurzkettiger Abstandhaltermoleküle, die verglichen mit der Länge der DNA-Fragmente kurz sind, und die eine hydrophile Gruppierung an einem Ende aufweisen und an dem anderen Ende eine reaktive Gruppierung zum Befestigen an dem festen Träger, auf den festen Träger, der darauf die befestigten DNA-Fragmente aufweist.
Verfahren zur quantitativen Analyse eines Nucleinsäurefragments, das in einer Probenflüssigkeit enthalten ist, welches komplementär zu den DNA-Fragmenten des DNA-Chips nach Anspruch 2 ist, welches die Schritte umfasst: Einstellen der Konzentration des Nucleinsäurefragments in der Probenflüssigkeit, so dass ein Tropfen der Probenflüssigkeit, der auf den DNA-Chip aufgebracht wird, 10^–20–10^–16 Mol des Nucleinsäurefragments pro 1 mm² der Oberfläche des elektrisch leitenden Trägermaterials des DNA-Chips enthalten sollte; In-Kontakt-Bringen der Probenflüssigkeit, bei der die Nucleinsäurekonzentration eingestellt wurde, mit dem DNA-Chip, wobei die Nucleinsäure mit dem DNA-Fragment auf dem DNA-Chip hybridisiert; In-Kontakt-Bringen eines elektrochemisch aktiven Moleküls mit dem Nucleinsäure-DNA-Fragment-Hybrid, wobei sich das elektrochemisch aktive Molekül an die hybridisierte Nucleinsäure und das DNA-Fragment anlagert; Anlegen eines Potenzials an den DNA-Chip; und Messen eines elektrischen Stroms, der von dem oder zu dem elektrisch leitenden Trägermaterial durch das angelagerte elektrochemisch aktive Molekül fließt.
Kit zur Durchführung einer quantitativen Analyse eines Nucleinsäurefragments, das in einer Probenflüssigkeit enthalten ist, welches komplementär zu den DNA-Fragmenten des DNA-Chips nach Anspruch 2 ist, welcher den DNA-Chip nach Anspruch 2 und ein elektrochemisch aktives Molekül, welches sich an ein Nucleinsäure-DNA-Fragment-Hybrid anlagern kann, umfasst.
PNA-Chip, umfassend einen festen Träger und eine Vielzahl von PNA-Fragmenten, von denen jedes an einem Ende an dem Träger befestigt ist, wobei eine Vielzahl von kurzkettigen Abstandhaltermolekülen, die verglichen mit der Länge der PNA-Fragmente kurz sind, jeweils eine hydrophile Gruppierung an einem Ende aufweisen, mit dem anderen Ende an einen Oberflächenbereich des festen Trägers befestigt ist, der keine PNA-Fragmente aufweist.
PNA-Chip nach Anspruch 10, wobei der feste Träger ein elektrisch leitendes Trägermaterial ist.
PNA-Chip nach Anspruch 10, wobei die PNA-Fragmente in einer Menge von 10^–20–10^–12 Mol/mm² auf dem festen Träger befestigt sind.
PNA-Chip nach Anspruch 10, wobei die hydrophile Gruppierung des Abstandhaltermoleküls eine Hydroxylgruppe ist.
PNA-Chip nach Anspruch 10, wobei das Abstandhaltermolekül über eine Sulfhydrylgruppierung, die an das Ende des Abstandhaltermoleküls angehängt ist, an den festen Träger befestigt ist.
PNA-Chip nach Anspruch 10, wobei das Abstandhaltermolekül von einer Verbindung abgeleitet ist, die aus der Gruppe, bestehend aus 2-Mercaptoethanol, 3-Mercaptopropanol, 6- Mercaptohexanol und N,N'-Di(3-hydroxy-n-propyl)-imidazol-2-thion ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung eines PNA-Chips nach Anspruch 10, welches die Schritte umfasst: Aufbringen einer wässrigen Lösung einer Vielzahl von PNA-Fragmenten, die in einem wässrigen Medium gelöst oder dispergiert sind, auf einen festen Träger, um die PNA-Fragmente an dem festen Träger zu befestigen; und Aufbringen einer wässrigen Lösung kurzkettiger Abstandhaltermoleküle, die verglichen mit der Länge der PNA-Fragmente kurz sind und die jeweils an einem Ende eine hydrophile Gruppierung aufweisen und an dem anderen Ende eine reaktive Gruppierung zum Befestigen an dem festen Träger, auf den festen Träger, der darauf die befestigten PNA-Fragmente aufweist.
Verfahren zur quantitativen Analyse eines Nucleinsäurefragments, das in einer Probenflüssigkeit enthalten ist, welches komplementär zu den PNA-Fragmenten des PNA-Chips nach Anspruch 11 ist, welches die Schritte umfasst: Einstellen der Konzentration des Nucleinsäurefragments in der Probenflüssigkeit, so dass ein Tropfen der Probenflüssigkeit, der auf den PNA-Chip aufgebracht wird, 10^–20–10^–16 Mol des Nucleinsäurefragments pro 1 mm² der Oberfläche des elektrisch leitenden Trägermaterials des PNA-Chips enthalten sollte; In-Kontakt-Bringen der Probenflüssigkeit, bei der die Nucleinsäurekonzentration eingestellt wurde, mit dem PNA-Chip, wobei das Nucleinsäuremolekül mit dem PNA-Fragment auf dem PNA-Chip hybridisiert; In-Kontakt-Bringen eines elektrochemisch aktiven Moleküls mit dem Nucleinsäuremolekül-PNA-Fragment-hybrid, wobei sich das elektrochemisch aktive Molekül an die hybridisierte Nucleinsäure und das PNA-Fragment anlagert; Anlegen eines Potenzials an den PNA-Chip; und Messen eines elektrischen Stroms, der von dem oder zu dem elektrisch leitenden Trägermaterial durch das angelagerte elektrochemisch aktive Molekül fließt.
Kit zum Durchführen einer quantitativen Analyse eines Nucleinsäurefragments, das in einer Probenflüssigkeit enthalten ist, welches komplementär zu den PNA-Fragmenten des PNA-Chips nach Anspruch 11 ist, welcher den PNA-Chip nach Anspruch 11 und ein elektrochemisch aktives Molekül, das sich an ein Nucleinsäuremolekül-PNA-Fragment-Hybrid anlagern kann, umfasst.