KR100653975B1

KR100653975B1 - 집코드 방식을 이용한 ｐｎａ 칩 및 이의 제작방법

Info

Publication number: KR100653975B1
Application number: KR1020040099514A
Authority: KR
Inventors: 박현규; 송재양
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2004-11-30
Filing date: 2004-11-30
Publication date: 2006-12-05
Also published as: JP2006153839A; US7659064B2; JP4189929B2; CN1782096B; KR20060060443A; CN1782096A; US20060115825A1

Abstract

본 발명은 집코드 방식을 이용한 PNA 집코드 칩 및 이의 제작방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 집코드를 가지는 PNA 집코드 탐침을 에폭시화합물을 링커로 사용하여 고밀도로 고정화시키는 것을 특징으로 하는 PNA 집코드 칩 및 이의 제작방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, DNA보다 물성이 뛰어난 PNA를 이용하여 DNA 칩보다 훨씬 우수한 감도로 정확하게 유전병이나 염기변이를 진단할 수 있으며, 집코드 방식을 사용하여 목적 유전자에 따라 매번 탐침을 직접 기판에 고정화시키는 번거로움 없이 혼성화 반응만으로 간편하게 유전자 변이를 진단할 수 있다.

PNA, 집 코드, 칩, 에폭시화합물

Description

집코드 방식을 이용한 ＰＮＡ 칩 및 이의 제작방법{PNA Chip Using Zip-code and Fabricating Method Thereof}

도 1은 PNA(Peptide Nucleic Acid)와 DNA의 구조식을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 에폭시화합물을 이용하여 DNA, PNA 등을 아민으로 표면개질된 유리기판 위에 고정화 시키는 방법을 도식화한 것이다.

도 3은 6×SSPET 혼성화 용액에서 형광물질(Cy3)로 표지된 목적 DNA를 PNA 집코드 칩에 혼성화시킨 형광 이미지를 나타낸 것이다.

도 4는 혼성화 용액 내의 SSPET 혼성화 용액 농도 변화에 따른 혼성화 경향을 나타낸 것이다.

도 5는 혼성화 용액의 농도에 따른 PNA 집코드 칩과 DNA 집코드 칩의 한 염기차이 구별능력을 나타낸 것이다. (A)는 PNA 집코드 칩에서의 혼성화 용액의 농도에 따른 한 염기차이 구별능력을 나타낸 것이고, (B)는 DNA 집코드 칩에서의 혼성화 용액의 농도에 따른 한 염기차이 구별능력을 나타낸 것이다.

도 6은 TAMRA-ddCTP를 이용한 PNA 집코드 칩에서의 다중염기변이 분석을 나타낸 것이다.

도 7은 본 발명의 실시예에 의해서 얻어진 PNA 집코드 칩에서 동시에 여러개 의 염기변이 부분을 분석한 형광이미지를 나타낸 것이다 (A)는 PNA 집코드 칩의 배열을 나타낸 그림(숫자는 유전자의 위치이고, AA, GG, CC, TT는 그 유전자의 정상 형질을 나타낸다)이고, (B)는 4개의 칩을 이용하여 동시에 10개의 염기변이를 규명한 형광 이미지를 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명의 실시예 6에서 사용한 집 코드를 이용한 염기변이의 분석방법을 간단히 도식화한 것이다.

발명의 분야

발명의 배경

인간 게놈 프로젝트를 비롯한 여러 생물의 게놈 프로젝트의 결과로 수많은 유전정보가 쏟아져 나옴에 따라, 이러한 유전정보를 해석하고, 연관관계를 분석하는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 분자생물학 분야와 유전공학 분야의 연구방향 은 DNA의 구조적 해석으로부터 유전자의 기능적 해석과 상호 연관성을 규명하는 방향으로 바뀌고 있다. 이러한 추세에 따라 여러가지 유전 정보의 분석방법이 개발되고 있으며, 특히, DNA 칩은 게놈 프로젝트의 결과인 방대한 양의 유전정보를 이용하여 시료를 보다 효율적으로 분석할 수 있는 방법으로 주목받고 있다. 이는 DNA 칩이 방대한 양의 유전정보를 짧은 시간에 분석할 수 있으며 자동화가 용이하기 때문이다.

DNA 칩은 실리콘, 표면개질 유리, 폴리프로필렌, 활성화 폴리아크릴아마이드와 같은 고체표면에 8~25 염기의 올리고뉴클레오타이드를 적게는 1000개, 많게는 1,000,000개까지 배열하여 부착시킨 것이다. 칩에 고정시키는 DNA는 목적 유전자의 DNA 염기서열로부터 결정된다. 이러한 DNA 칩은 재조합 유전자기술과 PCR에 비견될 만큼 다양한 응용분야와 기존 기술을 능가하는 장점을 가지고 있다. DNA칩은 그 이용방법에 따라 그 적용대상이 매우 넓기 때문에 응용분야 또한 광범위하다. DNA 칩을 사용함으로써 극미량의 시료만으로도 분석이 가능할 뿐만 아니라 목적 DNA의 염기서열을 여러부위에서 동시에 규명할 수 있게 되었다.

DNA 칩을 이용한 DNA 분석시스템은 DNA 분석속도를 수십~수백 배 증가시켜 현재 진행 중인 여러 유기체의 게놈 프로젝트의 완성시기를 크게 앞당겨 줄 뿐만 아니라, 현재 염기하나 당 분석비용의 단가를 크게 낮추어 줄 것으로 기대되며, 유전병의 진단, 돌연변이의 탐색, 암 진단, 병원균의 검출, 유전자 발현분석, 신약개발 등 폭넓은 분야로 응용되고 있다.

집코드를 이용한 DNA칩(Gerry, N.P. et al., J. Mol. Biol., 292:251, 1999; Hirschhorn, J.N., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:12164, 2000)은 서로 상동성이 없는 일정한 길이의 염기서열을 가진 탐침을 고체기판 위에 고정화시키고, 칩 위에 혼성화시킬 목적 DNA의 5' 쪽을 칩에 고정화된 탐침과 상보적인 염기서열을 가지고, 3' 쪽은 진단하고자 하는 유전자에 상보적인 염기서열을 가지게 제작하여, 별도의 탐침 제작이 필요없이, 목적 DNA의 염기서열 부분만을 유전자에 맞게 다시 제작하여, 동일한 칩 위에서 진단 결과를 볼 수 있으며 칩 제작을 간편하게 할 수 있는 이점이 있다.

PNA는 DNA의 유사체로서 펩타이드 결합을 골격으로 하고, DNA와 같이 4가지 염기를 포함하고 있으며, DNA와 달리 골격에 음전하를 띠지 않는다(Nielsen, P.E. et al., Sci., 254:1497, 1991). 도 1에는 당-인산 골격을 가지는 DNA와 폡타이드결합 골격을 가지는 PNA의 구조를 나타내었다. PNA는 DNA에 비해 핵산분해효소나 여러 화학물질에 안정한 성질을 가지며, 또한 넓은 범위의 온도 및 pH에서도 DNA보다 안정한 성질을 보인다. PNA는 DNA 및 RNA에 강하게 결합하는 성질을 가지고 있으며 DNA에 보다 높은 특이성과 선택성을 가지고 있어(Nielsen, P.E Acc. Chem.Res., 32: 624, 1999), 항원항체 반응, 혼성화 기술, 약물 전달 등에 다양한 응용이 가능하다(Dean, D.A., Adv. Drug Delivery Rev., 44:81, 2000).

지금까지의 DNA 칩은 어떤 염기변이나 SNPs를 진단하느냐에 따라 칩에 고정화시키는 탐침의 염기서열을 대상 DNA에 맞춰서 제작해야 하는 번거로움이 있었다. 즉 어떤 대상 DNA를 진단하느냐에 따라, DNA 칩을 구성하는 탐침을 다시 제작해야 하기 때문에 번거로울 뿐만아니라, 제작 비용을 증가시키는 원인이되었다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제점들을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, DNA보다 뛰어난 물성을 가지는 PNA를 이용하여, 집코드 방식으로 PNA 칩을 제작하고, 상기 제작된 PNA 칩을 이용하여 다중염기 분석, 염기변이 분석 및 SNPs 분석을 정확하고 높은 감도로 수행할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 아민기로 개질된 기판상에 에폭시화합물을 링커로 하여 PNA 탐침을 결합시키는 집 코드 방식을 이용한 PNA 집코드 칩의 제작방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제작된 에폭시 화합물을 링커로 PNA집코드 탐침이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 PNA 집코드 칩을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 PNA 칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 DNA의 검출방법, 다중 염기변이 분석방법 및 SNPs 분석방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 아민기로 개질된 기판상에 디메틸술폭사이드(DMSO), PNA 집코드 탐침 및 에폭시 화합물을 포함하는 고정화 시료를 스폿팅하여 PNA 집코드 탐침을 고정화시키는 단계; 및 (b)상기 PNA 집코드 탐침 이 고정화된 기판을 SDS 용액으로 세척한 후 건조하는 단계를 포함하는 집코드 방식을 이용한 PNA 칩의 제작방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 디메틸술폭사이드(DMSO), PNA 탐침 및 에폭시 화합물의 부피비는 1:1:1인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 에폭시화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 할 수 있다.

(a+b+c+d~3)

본 발명에 있어서, 상기 PNA 집코드 탐침의 농도는 10μM~1mM인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 PNA 집코드 탐침은 복수개이고, 상기 복수개의 PNA 집코드 탐침은 서로 간에 30%이하의 상동성을 가지는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 PNA 집코드 탐침은 서열번호 1 내지 서열번호 10의 염기서열 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으고, 서열번호 1 내지 서열번호 10 및 서열번호 16 내지 서열번호 45의 염기서열 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징 으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조되고, 에폭시 화합물을 링커로 PNA 집코드 탐침이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 PNA 집코드 칩을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 PNA 집코드 칩에 목적 DNA를 혼성화시키는 것을 특징으로 하는 목적 DNA의 검출방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 검출은 형광신호를 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 대상 유전자의 염기변이 부분을 선정하는 단계; (b) SBE 프라이머를 디자인하는 단계; (c) 상기 (a)단계의 대상 유전자를 PCR로 증폭시키는 단계; (d) 상기 증폭된 대상 유전자를 (b) 단계에서 제작된 SBE 프라이머 및 형광물질로 표지된 ddATP, ddTTP, ddCTP 또는 ddGTP를 이용하여 SBE 반응을 수행하는 단계; (e) 상기 SBE 반응물을 상기 PNA 집코드 칩에 혼성화시키는 단계; 및 (f) 형광물질을 이용하여 시그널을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 염기변이 분석방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 SBE 프라이머는 5' 말단 부위에 상기 PNA 집코드 칩 에 고정되어 있는 PNA 집코드와 상보적인 서열을 포함하고, 3' 말단 부위에 대상 유전자와 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고, 복수 개인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 대상 유전자는 당뇨병 관련 유전자 HNF 1-a인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 대상 유전자의 염기변이 부분을 선정하는 단계; (b) SBE 프라이머를 디자인하는 단계; (c) 상기 (a)단계의 대상 유전자를 PCR로 증폭시 키는 단계; (d) 상기 증폭된 대상 유전자를 (b) 단계에서 제작된 SBE 프라이머 및 특정화합물로 표지된 ddNTP를 사용하여 dATP, ddTTP, ddCTP 또는 ddGTP를 각각 넣은 4개의 튜브에서 따로 SBE 반응을 수행하는 단계; (e) 상기 SBE 반응물을 상기 PNA 집코드 칩에 혼성화시키는 단계; 및 (f) 상기 화합물 표지를 이용하여 시그널을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 염기변이의 분석 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, SBE 프라이머는 5' 말단 부위에 상기 PNA 집코드 칩에 고정되어 있는 PNA 집코드와 상보적인 서열을 포함하고, 3' 말단 부위에 대상 유전자와 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고, SBE 프라이머는 복수 개인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 특정화합물은 비오틴(biotin)이고, 상기 시그널을 확인하는 단계는 비오틴과 친화력이 강한 단백질인 스트렙타비딘(Streptavidin)이 결합되어 있는 피코에리스린(Phycoerithrin)으로 염색하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 PNA 칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 SNPs 분석 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

집 코드칩은 서로 상동성이 없는 일정한 길이의 염기서열로 구성된 탐침(집코드)을 고체기판에 고정화시킨 칩으로, 상기 탐침의 염기서열과 상동성이 있는 서 열을 5' 말단에 가지고, 목적 DNA의 염기서열과 상보적인 서열을 3' 말단에 가지는 올리고뉴클레오타이드를 상기 칩에 혼성화시켜 시그널을 판독할 수 있는 칩을 말한다.

즉, 본 발명에 있어서, 상기 탐침은 탐침의 염기서열 사이에 상동성이 가장 적은 서열들을 선정하였으며, 상기와 같은 염기서열들을 가진 탐침을 집코드라고 한다.

본 발명에서 상기 집코드 칩의 탐침은 PNA를 사용하였다.

본 발명에서 혼성화에 사용되는 목적물질들은 PNA 탐침과 반응하거나 결합하여 검출되는 것이라면 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 DNA, RNA 등 생체유래 분자들을 사용할 수 있다.

본 발명에서는 PNA 집코드 탐침을 아민으로 표면개질된 고체기판에 고정시켰으며, 본 발명에서 사용한 고정화 방법은 에폭시 화합물을 가교로서 이용하여 아민개질 고체기판 위에 PNA를 화학적으로 결합시켜 고정화시키는 것이다.

본 발명에서 사용한 에폭시 화합물은 화학식 1과 같은 구조를 가지는 화합물로서, 도 2에 나타낸 바와 같이, 아민기로 표면개질된 유리기판과 에폭시 화합물의 에폭시기가 화학결합하고, PNA 탐침의 아민기와 상기 유리기판과 결합한 에폭시 화합물의 다른 에폭시가 화합결합하여 결국, PNA 탐침이 유리기판에 고정되게 되며, 부분적으로는 PNA 집코드 탐침과 유리기판 사이의 물리적 흡착에 의한 결합 또한 일어나게 된다.

[화학식 1]

(a+b+c+d~3)
여기서, a+b+c+d~3은 CH₂(OCH₂CH₂)_n의 당량(n은 각각 a,b,c,d에 해당함)이 평균 3개라는 것을 나타낸다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 구체적으로 제한되지 않는다는 것은, 당 업계에서 통상적인 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예 1. PNA 집코드 칩의 제작

본 실시예에서는 표면이 아민으로 개질된 유리기판을 PNA 칩의 기판으로 사용하였다. 칩에 고정화 시킬 PNA 집코드 탐침은 10개를 사용하였으며, 12개의 염기를 가지고, 서로 간에 낮은 상동성을 가지는 하기의 10개의 염기서열로 구성되었다 (서열번호 1 ~ 서열번호 10). PNA 탐침의 N 말단에는 아민(-NH₂)기를 가지고 있으므로, 상기 아민기와 에폭시기와의 결합이 하기 탐침을 기판에 고정화시키는 데 사용하였다.

서열번호 1: N-TGCGGGTAATCG-C

서열번호 2: N-TGCGACCTATCG-C

서열번호 3: N-ATCGTGCGACCT-C

서열번호 4: N-ATCGGGTATGCG-C

서열번호 5: N-CAGCATCGTGCG-C

서열번호 6: N-CAGCACCTTGCG-C

서열번호 7: N-GGTAATCGACCT-C

서열번호 8: N-GACCATCGACCT-C

서열번호 9: N-GACCCAGCATCG-C

서열번호 10: N-ACCTGACCATCG-C

상기 PNA 집코드 탐침을 하기의 방법으로 유리기판에 고정화시켜 PNA 집코드 칩을 제작하였다.

디메틸술폭사이드(DMSO), PNA 집코드 탐침, 에폭시 화합물을 부피비 1:1:1로 섞어 PNA의 최종 농도가 100μM이 되도록 제조한 고정화 시료를 아민으로 개질된 유리기판 위에 스팟터를 이용하여 스폿팅한 후, 0.2% SDS 용액으로 씻어낸 후 실온에서 건조시켜 PNA 집코드 칩을 제작하였다.

실시예 2. PNA 집코드 칩 상에서 DNA 혼성화

PNA 집 코드의 DNA와 혼성화 능력을 시험해 보기 위해 실시예 1의 방법으로 제작된 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 9의 염기서열을 가지는 4개의 PNA 집코드 탐침이 고정된 PNA 집코드 칩을 이용하여 혼성화 실험을 하였다.

먼저 형광물질(Cy3)로 표지된 25개의 염기를 가지는 목적 DNA(서열 11)를 준비하였다. 1nM의 목적 DNA를 혼합한 6×SSPET(Saline Sodium Phosphate EDTA) 혼성화 용액을 총 부피 30㎕로 하여 PNA 집코드 칩에 올리고, 혼성화 챔버(hybridization chamber)에 넣어 37℃에서 12시간동안 혼성화시켰다. 상기 목적 DNA는 칩 위에 고정되어 있는 4개의 PNA 탑침 중 서열번호 7의 서열을 가지는 탐침과 상보적인 염기서열을 가지고 있다.

서열 11: 5'-AAGAAGAAGGTCGATTACCAAAGGA-3' (목적 DNA)

그러므로, 상기 PNA 집코드 칩과 혼성화 시켰을 경우 한개의 탐침에서만 형광이 관찰되어야 하며, 도 3에서와 같이 네 가지의 탐침 가운데 목적 DNA와 상보적인 서열을 가지고 있는 세 번째 PNA 탐침(서열번호 7)에만 혼성화가 일어나 형광이 관찰되었다 (도 3).

실시예 3. 혼성화 용액의 농도에 따른 PNA 집코드 칩의 감도변화

본 발명의 PNA 집코드칩의 가장 효과적인 감도를 나타내는 조건을 찾기 위하여 혼성화 용액의 농도를 달리하여 혼성화를 수행하였다. 실시예 2에서 사용한 PNA 칩과 목적 DNA(서열번호 11)를 각각 0.1×, 0.3×, 0.5×, 1×, 3× 및 6×농도의 SSPET 혼성화 용액을 사용하여 혼성화를 수행하였다. 그 결과, 0.1× SSPET 혼성화 용액에서 가장 높은 형광신호를 관찰할 수 있었고, 농도가 가장 높은 6× SSPET 혼성화 용액에서 가장 낮은 형광신호를 관찰할 수 있었다(도 4). 그러므로, 혼성화 용액의 농도가 감소할수록 PNA 집코드 칩의 혼성화가 더 효과적으로 일어나는 것으로 확인되었다.

실시예 4. PNA 집코드 칩과 DNA 집코드 칩의 한 염기차이 구별능력 실험

PNA 집코드 칩의 염기차이 구별능력이 DNA 집코드 칩보다 더 우수한 것을 확인하기 위해 서열이 같은 PNA 탐침과 DNA 탐침을 아민으로 표면이 개질된 유리기판 위에 고정화시켜 결과를 비교하였다.

염기 차이 구별 능력에 사용된 탐침들의 서열을 하기에 나타내었으며, DNA 탐침의 경우, 고정화 시에 에폭시화합물과 결합시키기 위하여, 5'말단에 아민기를 첨가하였다.

DNA(PM)-5'-NH_2-GGTAATCGACCT-3'(서열번호 7의 염기서열을 가지는 DNA탐침)

DNA(MM)-5'-NH₂-GGTAATTGACCT-3'(서열번호 7의 단일변이 서열을 가지는 DNA 탐침)

PNA(PM)-N-GGTAATCGACCT-C(서열 7의 염기서열을 가지는 PNA탐침)

PNA(MM)-N-GGTAATTGACCT-C(서열 7의 단일변이 서열을 가지는 PNA탐침)

염기차이 구별능력을 확인하기 위하여, 각각 다른 농도(0.1× SSPET, 0.3× SSPET, 1× SSPET, 3× SSPET, 6× SSPET)의 혼성화 용액에서 혼성화를 수행하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, PNA 집코드 칩의 경우는 혼성화 용액의 농도가 증가함에 따라, 전체적인 형광 신호 값은 감소하는 경향을 보였으나, 염기차이 구별능력은 증가함을 확인할 수 있었다. 이에 반해, DNA 집코드 칩의 경우는 혼성화 용액의 농도가 증가함에 따라, 염기차이 구별능력과 형광 신호값이 모두 증가하였지만, 형광신호의 절대값은 PNA 집코드 칩에서 보다 현저히 낮음을 확인할 수 있었다(도 5).

실시예 5. PNA 집코드 칩 상에서 멀티플렉스로 염기 규명 (1)

본 실시예에서는 당뇨병의 한 종류인 MODY-3에 관련된 유전자인 HNF 1-a 유전자(서열번호 12)를 목적 유전자로 사용하였으며, 상기 유전자의 엑손 2에 포함된 3개의 염기변이 부분을 표 1과 같이 선정하였다.

PNA 집코드 탐침과 결합하는 SBE 프라이머의 5'쪽은 PNA 집코드 칩에 고정화된 각각의 PNA 탐침과 상보적인 서열을 가지고 있고 3'쪽은 염기변이를 포함하는 목적유전자와 상보적인 서열을 갖도록 디자인하였다. 본 실시예에서 사용된 SBE 프라이머는 Tm 값을 60℃ 부근으로 균일하게 하기 위해서 각각 다른 길이로 디자인하였다. 모든 SBE 프라이머는 목적 유전자의 염기변이 부분의 한 염기 앞까지만 제작하였다.

PNA 집코드 칩 위에서 다중 염기변이 분석을 위해 당뇨병과 관련된 유전자인 HNF 1-a의 엑손 2 부분을 PCR로 증폭하였다. 증폭된 DNA를 형광물질(TAMRA)로 표지된 ddCTP를 이용하여 SBE 반응을 수행하였으며, SBE01-6P(서열번호 13), SBE01-18P(서열번호 14) 및 SBE01-31P(서열번호 15)의 세 개의 SBE 프라이머를 사용하여 동일한 튜브에서 동시에 SBE 반응을 진행하였다. SBE 반응이 끝난 반응물은 40개의 집 코드가 고정화된 PNA 집코드 칩에 혼성화 시켰다 (표 2).

SBE01-6P: 5'-TACCAGGTCGCAGATACCACTGGCCTCAACCAG-3' (서열번호 13)

SBE01-18P: 5'-CGCAAGGTGCTGCACTGGCCTCAACCAGTCC-3' (서열번호 14)

SBE01-31P: 5'-TGCTGGGTCAGATGGTCAAGT-3' (서열번호 15)

실시예 5에서 사용한 PNA 집코드 칩의 40개의 집코드

PNA	N말단→C말단	PNA	N말단→C말단
1	TGCGGGTAATCG(서열번호 1)	21	GGTAATCGTGCG(서열번호 30)
2	TGCGGGTACAGC(서열번호 16)	22	GGTAATCGACCT(서열번호 7)
3	TGCGGACCATCG(서열번호 17)	23	GGTACAGCATCG(서열번호 31)
4	TGCGGACCACCT(서열번호 18)	24	GGTACAGCGACC(서열번호 32)
5	TGCGACCTATCG(서열번호 2)	25	GGTAGACCTGCG(서열번호 33)
6	TGCGACCTGGTA(서열번호 19)	26	GGTAGACCACCT(서열번호 34)
7	ATCGTGCGACCT(서열번호 3)	27	GGTAACCTTGCG(서열번호 35)
8	ATCGGGTATGCG(서열번호 4)	28	GGTAACCTCAGC(서열번호 36)
9	ATCGGGTAGACC(서열번호 20)	29	GACTATCGTGCG(서열번호 37)
10	ATCGGACCTGCG(서열번호 21)	30	GACCATCGACCT(서열번호 8)
11	ATCGACCTTGCG(서열번호 22)	31	GACCCAGCATCG(서열번호 9)
12	ATCGACCTCAGC(서열번호 23)	32	GACCCAGCACCT(서열번호 38)
13	CAGCATCGTGCG(서열번호 5)	33	GACCACCTTGCG(서열번호 39)
14	CAGCATCGACCT(서열번호 24)	34	GACCACCTATCG(서열번호 40)
15	CAGCGGTAATCG(서열번호 25)	35	ACCTATCGTGCG(서열번호 41)
16	CAGCGGTAGACC(서열번호 26)	36	ACCTATCGCAGC(서열번호 42)
17	CAGCGACCTGCG(서열번호 27)	37	ACCTCAGCGACC(서열번호 43)
18	CAGCACCTTGCG(서열번호 6)	38	ACCTGGTAATCG(서열번호 44)
19	CAGCACCTGACC(서열번호 28)	39	ACCTGACCTGCG(서열번호 45)
20	GGTATGCGGACC(서열번호 29)	40	ACCTGACCATCG(서열번호 10)

그 결과, 6번 위치의 PNA 집코드 탐침(서열번호 19), 18번 위치의 PNA 집코드 탐침(서열번호 6) 및 31번 위치의 PNA 집코드 탐침(서열번호 9)에서 형광시그널이 나타났다 (도 6). 그러므로, 본 발명의 PNA 집코드 칩을 이용하여 한 개의 집코드 칩에서 다중으로 염기변이의 분석이 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 6. PNA 집코드 칩 상에서의 멀티플렉스로 염기 규명 (2)

본 실시예에서는 실시예 5에서 사용한 목적 유전자를 TAMRA 대신에 비오틴(Biotin)이 표지된 ddNTP를 사용하여 SBE 반응시킨 후, 이를 실시예 1에서 제작한 10개의 PNA 집코드 탐침이 고정화된 칩에 혼성화시켰다. 그리고 형광신호를 관찰하기 위하여 혼성화시킨 칩을 비오틴과 친화력이 강한 단백질인 Streptavidin이 결합되어 있는 Phycoerithrin을 형광염색하였다. SBE 반응은 비오틴-dATP, 비오틴-dTTP, 비오틴-dCTP 및 비오틴-dGTP를 각각 첨가한 4 개의 반응용액을 만들어 수행하였다 (표 3).

다중 SBE 반응에 사용된 반응용액의 조성

	set 1	set 2	set 3	set 4
주형	8㎕
프라이머	10개 SBE 프라이머 첨가
비오틴-ddNTP	비오틴-ddATP	비오틴-ddGTP	비오틴-ddCTP	비오틴-ddUTP
10× 반응용액	2㎕
Thermosequenase	2 units
ddH₂0	3㎕

상기 4개의 반응용액에는 10개의 염기변이 부분을 포함하는 하기의 10개 SBE 프라이머(서열번호 46~ 서열번호 55)를 모두 넣었다. 염기변이 분석에 사용된 SBE 프라이머 서열을 나타낸 것으로, PNA 집-코드 서열의 상보적 서열은 밑줄로 표시하였다.

서열 46: 5'- CGATTACCCGCA GCAGCACAACATCCCACAGC-3' (SBE02-P1)

서열 47: 5'- CGATAGGTCGCA TACCTGCAGCAGCACAACATC-3' (SBE02-P2)

서열 48: 5'- AGGTCGCACGAT CCGTGGCGTGTGGCG-3' (SBE02-P3)

서열 49: 5'- CGCATACCCGAT AGCAGCACAACATCCCACAG-3' (SBE02-P4)

서열 50: 5'- CGCACGATGCTG ACAGCGGGAGGTGGTCG-3' (SBE02-P5)

서열 51: 5'- CGCAAGGTGCTG CACTGGCCTCAACCAGTCC-3' (SBE02-P6)

서열 52: 5'- AGGTCGATTACC GACGCAGAAGCGGGCC-3' (SBE02-P7)

서열 53: 5'- AGGTCGATGGTC AACCAGTCCCACCTGTCCCAAC-3' (SBE02-P8)

서열 54: 5'- CGATGCTGGGTC TCCCATGAAGACGCAGAAGC-3' (SBE02-P9)

서열 55: 5'- CGATGGTCAGGT CCTACCTGCAGCAGCACAACA-3' (SBE02-P10)

SBE 반응을 수행한 후, 각각의 반응용액을 PNA 집코드 칩에 혼성화 시켰다.

도 8에서는 실시예 6의 염기변이 분석방법을 도식화 하여 나타내었다.

도 7은 각각의 세트에서 SBE 반응을 수행한 반응물을 PNA 집코드 칩에 혼성화한 후, Streptavidin이 컨쥬게이트된 phycoerythrin으로 염색하여 결과를 형광스캐너로 본 것이다. 도 7(B)에서 보면, AA형질을 나타내야 하는 (biotin-ddATP를 넣음) 칩에서는 예상했던 것과 같이 AA의 형질에만 형광신호가 들어왔다. 그리고, 나머지 세 가지의 경우(GG, CC, TT)도 모두 예상했던 것과 정확하게 같은 결과가 나왔다. 이를 통해서 한 튜브 안에서 10개의 염기변이 부분을 한 번의 SBE 반응을 통해서 정확하게 진단할 수 있었다. 이 방법을 이용하면 여러 개의 질병에 관련된 염기변이 부분이나 SNPs를 동시에 대량으로 분석할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 아민기로 개질된 기판상에 에폭시 화합물을 링커로 하여 PNA 탐침을 결합시키는 집 코드 방식을 이용한 PNA 집코드 칩의 제작방법을 제공하는 효과가 있고, 목적은 상기 방법으로 제작된 에폭시 화합물이 링커로서 기판과 PNA집코드 탐침을 연결하는 형태를 가지는 PNA 집코드 칩을 제공하는 효과가 있다. 본 발명은 또한, 상기 PNA 칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 DNA의 검출방법, 다중 염기변이 분석방법 및 SNPs 분석방법을 제공하는 효과가 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

다음 단계를 포함하는 집코드 방식을 이용한 PNA 칩의 제작방법:

(a) 아민기로 개질된 기판상에 디메탈술폭사이드(DMSO), 서로간에 30% 이하의 상동성을 가지는 염기서열을 포함하는 복수개의 PNA 집코드 탐침 및 하기 화학식 1로 표시되는 에폭시화합물을 포함하는 고정화시료를 스폿팅하여 PNA 집코드 탐침을 고정화시키는 단계; 및

(b) 상기 PNA 집코드 탐침이 고정화된 기판을 SDS 용액으로 세척한 후 건조하는 단계.

[화학식 1]

(a+b+c+d~3)
제1항에 있어서, 상기 (a)단계의 디메틸술폭사이드(DMSO), PNA 탐침 및 에폭시 화합물의 부피비는 1:1:1인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제2항에 있어서, PNA 집코드 탐침의 농도는 10μM~1mM인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, PNA 집코드 탐침은 서열번호 1 내지 서열번호 10의 염기서열 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, PNA 집코드 탐침은 서열번호 1 내지 서열번호 10 및 서열번호 16 내지 서열번호 45의 염기서열 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항, 제2항, 제4항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되고, 에폭시 화합물을 링커로 PNA 집코드 탐침이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 PNA 집코드 칩.
제8항의 PNA 집코드 칩에 목적 DNA를 혼성화시키는 것을 특징으로 하는 목적 DNA의 검출방법.
제9항에 있어서, 상기 검출은 형광신호를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 염기변이 분석방법:

(a) 대상 유전자의 염기변이 부분을 선정하는 단계;

(b) 5' 말단 부위에 제8항의 PNA 집코드 칩에 고정되어 있는 PNA 집코드와 상보적인 서열을 포함하고, 3' 말단 부위에 대상 유전자와 상보적인 서열을 포함하도록 SBE 프라이머를 디자인하는 단계;

(c) 상기 (a)단계의 대상 유전자를 PCR로 증폭시키는 단계;

(d) 상기 증폭된 대상 유전자를 (b) 단계에서 제작된 SBE 프라이머 및 형광물질로 표지된 ddATP, ddTTP, ddCTP 또는 ddGTP를 이용하여 SBE 반응을 수행하는 단계;

(e) 상기 SBE 반응물을 제8항의 PNA 집코드 칩에 혼성화시키는 단계; 및

(f) 형광물질을 이용하여 시그널을 확인하는 단계.
삭제
제11항에 있어서, SBE 프라이머는 복수 개인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 대상 유전자는 당뇨병 관련 유전자 HNF 1-a인 것을 특징으로 하는 방법.
다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 염기변이 분석방법:

(a) 대상 유전자의 염기변이 부분을 선정하는 단계;

(b) 5' 말단 부위에 제8항의 PNA 집코드 칩에 고정되어 있는 PNA 집코드와 상보적인 서열을 포함하고, 3' 말단 부위에 대상 유전자와 상보적인 서열을 포함하도록 SBE 프라이머를 디자인하는 단계;

(c) 상기 (a)단계의 대상 유전자를 PCR로 증폭시키는 단계;

(d) 상기 증폭된 대상 유전자를 (b) 단계에서 제작된 SBE 프라이머 및 형광물질로 표지된 ddNTP를 사용하여 ddATP, ddTTP, ddCTP 또는 ddGTP를 각각 넣은 4개의 튜브에서 따로 SBE 반응을 수행한는 단계;

(e) 상기 SBE 반응물을 제8항의 PNA 집코드 칩에 혼성화시키는 단계; 및

(f) 형광물질을 이용하여 시그널을 확인하는 단계.
삭제
제15항에 있어서, SBE 프라이머는 복수 개인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 특정화합물은 비오틴(biotin)이고, 상기 시그널을 확인하는 단계는 비오틴과 친화력이 강한 단백질인 스트렙타비딘(Streptavidin)이 결합되어 있는 피코에리스린(Phycoerithrin)으로 염색하는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항의 PNA 집코드 칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 SNPs 분석 방법.