KR20040050587A

KR20040050587A - Ｄｎａ 감지체 및 이를 이용한 ｄｎａ 감지방법

Info

Publication number: KR20040050587A
Application number: KR1020020078444A
Authority: KR
Inventors: 김규원; 양해식; 신용범; 이대식; 박세호; 김성진; 윤태환; 김윤태
Original assignee: 한국전자통신연구원
Priority date: 2002-12-10
Filing date: 2002-12-10
Publication date: 2004-06-16
Also published as: KR100475312B1; US20040110214A1

Abstract

본 발명은 DNA 감지체 및 이를 이용한 DNA 감지방법을 제공한다. 본 발명의 DNA 감지체는 서로 상보적이고 타겟 DNA의 염기서열에 대해서도 각각 상보적이지만, 타겟 DNA에 대한 상보성과 둘 사이의 상보성의 정도에 차이가 있는 프로브 DNA와 시그널링 DNA의 하이브리다이제이션을 통해 형성된 이중가닥이 전극에 고정되어 있으며 시그널링 DNA는 전기화학적으로 활성인 화합물이 결합되어 있는 것이다. 또한, 본 발명의 DNA 감지방법은 DNA 감지체에 타겟 DNA 용액을 넣어, 프로브 DNA, 시그널링 DNA 및 타겟 DNA 사이에서 하이브리드를 이루기 위한 경쟁반응을 유도하고, 이어서 시그널링 DNA의 전기화학적 신호를 측정하여 타겟 DNA를 감지하는 것이다. 이와 같이 본 발명에 따른 DNA 감지체 및 이를 이용한 DNA 감지방법은 타겟 DNA에 직접 표지화를 하지 않으면서도 종래 감지 방법과 같은 정도의 감도를 가지며, DNA 감지 시스템의 소형화에 유리한 전기화학측정 단계에서 세척이 필요 없다는 장점을 갖는다.

Description

ＤＮＡ 감지체 및 이를 이용한 ＤＮＡ 감지방법 {Chips for detecting DNA and method for detecting DNA using them}

본 발명은 하이브리다이제이션을 이루기 위한 경쟁반응을 통한 전기화학적 신호의 변화를 측정하여 DNA를 감지할 수 있는 DNA 감지체 및 이를 이용한 DNA 감지 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 타겟 DNA, 프로브 DNA 및 전기화학적으로 활성인 화합물이 부착된 시그널링 DNA의 상보성을 다르게 구성하여 하이브리다이제이션을 이루기 위한 경쟁반응을 통한 전기화학적 신호의 변화를 측정함으로써 별도의 세척단계 필요 없이 타겟 DNA를 감지하는 DNA 감지체 및 이를 이용한 DNA 감지 방법에 관한 것이다.

DNA 시퀀싱 또는 유전자 발현을 연구하기 위한 DNA의 효과적인 감지 방법은 휴먼 지놈 프로젝트와 시기를 같이하여 발전하여왔다. DNA 시퀀싱을 위한 주된 일반적인 방법은 방사선 동위 원소를 사용하는 방법이다. 그러나, DNA 시퀀싱을 위한 방사선 동위원소의 사용은 정교한 조작, 방사능 물질의 취급에 따른 안정성 문제로 언제나 개선의 대상이 되어왔다. 또한, 이런 안정성 문제를 해결하기 위해형광법이 후발 주자로 나섰으나, 형광물질의 일부도 돌연변이 유발체이기 때문에 방사능 표지와 마찬가지로 안전 주의가 요구되며, 형광의 실제 감지를 위한 추가장비의 요구로 인한 고비용 때문에 여전히 새로운 감지 방법이 요구되고 있다. 새로운 DNA 감지법이 갖추어야 할 요건으로는 단일염기변이를 관찰할 정도의 감도(sensitivity)나 특이성(specificity) 이외에도 실시간으로 감지가 가능하고 제반 비용이 싸야 하며 감지 시스템의 소형화에 대한 적절성 등을 들 수 있다.

여러 가지 감지법 중에서 이러한 조건들을 만족시키는 것이 전기화학적 방법이다. 전기화학적 DNA 감지는 단일가닥의 프로브 DNA가 타겟 DNA와 하이브리드 반응을 통해서 전극 상에 이중가닥을 이룰 때 그 전후의 전기화학적인 신호를 잘 구별하는 것이 핵심이다. 전기화학적 방법으로 DNA를 감지하는 기술은 크게 두 가지로 대별된다. 첫번째로는 DNA 자체의 전기화학적인 활성을 이용하는 것이고, 두 번째로는 DNA가 아닌 전기화학적으로 활성이 있는 물질을 이용하는 것이다. 전자의 경우 특히 DNA의 염기 중 구아닌의 전기화학적인 반응의 양이 이중가닥을 이루면서 증가하는 것을 통해 DNA를 감지하는 방법이 널리 쓰이고 있으나, DNA의 비특이적인 흡착으로 인해 성능이 떨어지는 단점과 비가역적인 구아닌의 산화과정을 거치므로 전기화학의 관측의 일회성이 단점이다. 후자의 경우 하이브리드 반응 전후에 전기화학적으로 활성이 있는 물질이 DNA와 상호 작용하는 정도의 차이가 전기화학적인 신호의 차이를 낸다. 후자는 두 가지 방식으로 다시 나눌 수 있는데 전기화학적인 신호를 내는 인터컬레이터(intercalator)나 바인더(binder)가 DNA의 단일 가닥과 하이브리다이제이션이 일어난 이중가닥과 결합되는 정도의 차이가 나타내는전기화학적인 신호의 양의 차이에 의존하는 방식과 타겟 DNA에 전기화학적으로 활성이 있는 분자를 표지화시킨 뒤 프로브 DNA와 하이브리드시켜 상보성의 차이에 따른 전기화학적인 신호의 차이를 측정하는 방식이 그것이다. 직접 표지화하는 경우는 그렇지 않은 경우에 비해 감도가 뛰어나지만 일일이 타겟 DNA를 화학반응시키고 정제하는 과정이 따라야 하므로 번거로운 단점이 있다. 대체로 이러한 방법들은 비특이적인 표면흡착으로 인한 신호 대 잡음비가 낮은 것이 단점으로 지적되어 왔으며, 이를 개선시키기 위한 후처리 과정인 표면 세척이 반드시 필요하게 된다. 이처럼 하이브리드 반응 후 전기화학적인 신호의 측정 전 세척 단계를 거쳐야 하는 점은 랩온어칩 (Lab-on-a-chip) 형태의 전기화학적인 DNA 감지 시스템의 소형화에 있어 걸림돌로 지적되고 있다.

이에 따라 DNA 감지 방법을 개선시키고자 많은 연구를 하고 있으며, 다음과 같은 논문들이 발표되기도 하였다.

C.J. Yu et al., Journal of the American Chemical Society, Vol.123, 11155-11161, 2001, "Electronic Detection of Single-Base Mismatches in DNA with Ferrocene-Modified Probes"에서는 전기화학적으로 전도성이 있는 유기 화합물의 단분자층을 전극상에 비전도성의 유기 화합물과 DNA 층과 혼합하여 두개의 다른 시그널링 DNA를 형성시키고, 이를 와일드 타입의 타겟 DNA 용액과 반응시켜 전기화학적인 신호의 변화를 통한 DNA 감지방법이 기재되어 있다. 이 기술은 이중 시그널링 DNA를 사용하여 신호 대 잡음비를 개선하였으나, 여전히 감지체의 구성이 복잡하여 감지 시스템의 소형화에 바람직하지 않다.

J. Lahiri et al., Journal of the American Chemical Society, Vol.124, 2396-2397, 2002 "Method for Detection of Single-Base Mismathches Using Biomolecular Beacons"에서는 프로브 DNA와 부분적으로 상보적인 DNA에 형광을 흡수하는 물질을 라벨링하고 형광을 내는 물질을 라벨링한 프로브 DNA가 고정된 DNA 어레이에 하이브리드 반응을 시켜 이중가닥을 형성하여 어레이의 형광을 줄인 후, 이것을 프로브 DNA와 완전히 상보적인 타겟 DNA 용액에 담가서 경쟁 반응시켜 형광의 변화를 감지하여 단일 염기 변이를 감지하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법 역시 경쟁 반응을 적용하여 일반적인 형광법에 비해서 타겟 DNA의 비특이적 흡착에 의한 감지신호의 방해를 덜 받는다는 장점은 있지만, 형광을 감지하는데 추가 장비가 요구되기 때문에 감지 시스템의 소형화에 여전히 부정적이다.

WO 0250308에는 타겟 DNA와 상보적인 DNA(1)와 이 보다 짧으면서 이 DNA에 상보적인 DNA(2) 간의 이중나선을 형성하고, 여기에 타겟 DNA를 가하여 반응을 시키면 부분적으로 하이브리드를 이루던 DNA가 떨어져 나가고 타겟 DNA와 DNA(1) 사이에 보다 강한 이중가닥이 만들어진다. 여기에 형광 공명 에너지 전이(FRET) 원리를 DNA(1)과 DNA(2)의 이중가닥에 적용하면 DNA(2)가 떨어져 나갈때 형광이 크게 증가하게 되고, 이에 따라 타겟 DNA를 감지하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 복잡한 극한(stringent) 과정없이 DNA 단일염기 다형성의 감지가 가능하나 장비가 복잡하여 감지 시스템의 소형화에는 부적합하다.

이와 같이 최근의 기술들도 감지체를 단순화하거나 감지 시스템을 소형화하는데에는 여전히 만족스럽지 않다.

이에 본 발명자들은 감도가 높으면서 감지 시스템의 소형화 및 감지체의 단순화를 이룰 수 있는 DNA 감지체를 연구하면서, 전기화학적 방법으로 DNA를 감지하는 방법에 있어서, 서로 상보적이고 타겟 DNA의 염기서열에 대해도 각각 상보적이지만, 타겟 DNA에 대한 상보성과 둘 사이의 상보성에 차이가 있는 프로브 DNA와 시그널링 DNA를 도입하는 경우, 타겟 DNA에 직접 표지화를 하지 않고도 높은 감도로 DNA를 감지할 수 있으며, 따라서, 직접 표지화에 따른 비특이적 흡착을 방지하기 위한 표면 세척을 생략할 수 있고, 더 나아가 이런 점이 전기화학적 DNA 감지 시스템의 소형화를 달성할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 타겟 DNA에 표지화를 하지 않으면서도 감도가 우수한 단순한 구조의 DNA 감지체를 제공하는 데 그 목적이 있다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 타겟 DNA에 표지화를 하지 않으면서도 감도가 우수한 DNA 구조체를 이용하여 세척단계 필요없이 DNA를 검출하는 DNA 감지 방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

도 1a은 본 발명에 따른 타겟 DNA와 시그널링 DNA 간의 경쟁 반응을 유도하기 위해 제작된 제 1의 DNA 감지체의 구조도이다.

도 1b는 도 1a의 DNA 감지체에 타겟 DNA 용액을 넣어 프로브 DNA, 시그널링 DNA 및 타겟 DNA 간의 경쟁 반응의 과정을 보여주는 모식도이다.

도 2a는 본 발명에 따른 타겟 DNA와 프로브 DNA 간의 경쟁 반응을 유도하기 위해 제작된 제 2의 DNA 감지체의 구조도이다.

도 2b는 도 2a의 DNA 감지체에 타겟 DNA 용액을 넣어 프로브 DNA, 시그널링 DNA 및 타겟 DNA 간의 경쟁 반응의 과정을 보여주는 모식도이다.

도 3a는 본 발명에서 전기화학측정을 위해 도입된 페로센을 DNA에 연결시킨 상태를 도시한 구조도이다.

도 3b는 본 발명에서 전기화학측정을 위해 도입된 페로센을 우라실을 염기로 가지는 DNA의 단위체에 연결시킨 상태를 도시한 구조도이다.

도 4a는 본 발명에 따른 감지체를 이용하여 세척과정 없이 타겟 DNA의 검출 여부를 실험한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 4b는 본 발명에 따른 감지체를 이용하여 세척과정 후 타겟 DNA의 검출 여부를 실험한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

10, 20: DNA 감지체 11, 21: 전극

12, 22: 프로브 DNA 13, 23: 시그널링 DNA

14, 24: 타겟 DNA

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서로 상보적이고 타겟 DNA의 염기서열에 대해서도 각각 상보적이지만, 타겟 DNA에 대한 상보성과 둘 사이의 상보성의 정도에 차이가 있는 프로브 DNA와 시그널링 DNA의 하이브리다이제이션을 통해 형성된 이중가닥이 전극에 고정되어 있고, 시그널링 DNA는 전기화학적으로 활성인 화합물이 결합된 것인 DNA 감지체를 제공한다.

상기에서, 전극은 전극이 하나 이상 배열된 전극 어레이의 형태일 수 있다.

상기 DNA 감지체의 DNA 대신에 PNA (펩티드 핵산) 또는 LNA (미분리(locked) 핵산)의 올리고머를 사용하여 감지체를 같은 방법으로 제작할 수도 있다.

상기 DNA 감지체의 형성방법은 두 가지 방법으로 형성될 수 있으며, 그 첫 번째 방법은 프로브 DNA를 자기 조립 박막 형성 방법으로 전극에 고정시키고, 이어서 상기 전극을 시그널링 DNA 용액에 담가 온도를 용융 온도까지 올렸다가 내리면서 하이브리드 반응을 유도하여 이중가닥을 형성하는 것으로 제조될 수 있다.

두 번째 방법은 동량의 프로브 DNA와 시그널링 DNA의 용액을 용융 온도까지 상승시킨 후 천천히 식히면서 하이브리드 반응을 유도하여 이중가닥을 형성하고, 형성된 이중가닥을 전극에 자기 조립 박막 형성방법으로 고정시키는 단계를 포함한다.

타겟 DNA에 대한 프로브 DNA와 시그널링 DNA의 염기서열 상보성은 다음 두 가지 방식으로 디자인되어 본 발명에 따른 DNA 감지체를 디자인할 수 있다. 그 첫 번째는 프로브 DNA와 타겟 DNA의 염기서열 간의 상보성을 프로브 DNA와 시그널링 DNA의 염기서열 간의 상보성보다 크게 하는 것이다.

두 번째는 시그널링 DNA와 타겟 DNA의 염기서열 간의 상보성을 시그널링 DNA와 프로브 DNA의 염기서열 간의 상보성보다 크게 하는 것이다.

또한, 본 발명에 있어서, 시그널링 DNA에 결합하는 전기화학적으로 활성인 화합물로는 페로센, 루세늄(Ru) 이나 오스뮴(Os)의 폴리피리딘(polypyridine) 또는 폴리페난트롤린(polyphenanthroline) 착화합물, 바이올로진, 하이드로퀴논, 안트라퀴논 및 피롤로 퀴놀린 퀴논으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 DNA 감지체는 서로 다른 두개 이상의 프로브 DNA와 각각에 대한 시그널링 DNA를 사용하여 형성된 두개 이상의 이중가닥 DNA를 전극이 두개 이상 배열된 전극 어레이의 각각의 전극에 고정되어 형성될 수도 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서로 상보적이고 타겟 DNA의 염기서열에 대해서도 각각 상보적이지만, 타겟 DNA에 대한 상보성과 둘 사이의 상보성의 정도에 차이가 있는 프로브 DNA와 시그널링 DNA의 하이브리다이제이션을 통해 형성된 이중가닥이 전극에 고정되어 있고, 시그널링 DNA는 전기화학적으로 활성인 화합물이 결합되어 있는 것인 DNA 감지체를 형성하는 단계, 상기 DNA 감지체에 타겟 DNA 용액을 넣어, 프로브 DNA, 시그널링 DNA 및 타겟 DNA 사이에서 하이브리드를 이루기 위한 경쟁반응을 유도하는 단계; 및 시그널링 DNA의 경쟁반응 전후의 전기화학적 신호의 변화를 측정하여 타겟 DNA의 양과 종류를 검출하는 단계를 포함하는 DNA 감지 방법을 제공한다.

또한, 상기 경쟁반응 유도단계에서는 DNA 감지체의 전극을 시그널링 DNA와 프로브 DNA의 이중가닥이 갖는 용융 온도 근처로 가열하고 식히는 작업을 반복하는 것이 바람직하다.

상기에서 타겟 DNA의 양은 시그널링 DNA의 경쟁반응 전과 경쟁반응 후의 전기화학적 신호의 측정값의 변화량을 측정하여 정량한다.

상기에서 타겟 DNA의 종류는 예상되는 몇 가지 종류의 염기서열에 대해서프로브 DNA와 시그널링 DNA의 이중가닥을 형성하고, 전극이 하나 이상 배열된 전극 어레이의 각각의 전극에 각각의 이중가닥을 고정시킨 후, 미지의 타겟 DNA와 경쟁반응시켜 이에 따른 전기화학적 신호를 관찰하여 타겟 DNA의 종류를 결정한다.

상기 본 발명에 따른 타겟 DNA의 감지 방법은 서로 다른 두개 이상의 프로브DNA와 각각에 대한 시그널링 DNA를 사용하여 형성된 두가지 이상의 이중가닥 DNA를 전극이 두개 이상 배열된 전극 어레이의 각각의 전극에 고정시켜 형성된 다중 DNA 감지체를 이용하여 DNA의 다중검출이 가능하다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명된다.

본 발명에서 사용되는 프로브 DNA라는 용어는 일측 종단에 티올, 아민, 실란, 바이오틴 중 어느 하나의 작용기를 가지며, 이것을 통해서 금, 백금, ITO (Indium tin oxide) 및 탄소 중 어느 하나의 재료로 이루어진 전극에 고정되어 시그널링 DNA를 하이브리드 반응을 통해서 묶어 두어 전기화학적 신호를 전극으로 전달(transfer)하든지 타겟 DNA를 하이브리드 반응을 통해서 묶어 두는 역할을 수행한다.

또한, 본 발명에서 사용되는 타겟 DNA라는 용어는 감지하고자 하는 염기서열을 가지고 있을 가능성이 있는 DNA 올리고머나 염색체에서 추출한 DNA를 PCR (Polymerization chain reaction)등의 방법으로 증폭시킨 결과물을 의미한다.

그리고, 시그널링 DNA는 프로브 DNA와 하이브리드할 수 있게끔 부분적으로 상보적인 염기서열을 가지며, 전기화학적으로 활성이 있는 물질인 페로센(ferrocene), 루세늄(Ru) 이나 오스뮴(Os)의 폴리피리딘(polypyridine) 이나폴리페난트롤린(polyphenanthroline) 착화합물과 같은 배위금속 화합물과 바이올로진(viologen), 하이드로퀴논(hydroquinone), 안트라퀴논(anthraquinone), 피롤로 퀴놀린 퀴논(pyrrolo quinoline quinone) 중 어느 하나와 DNA의 당, 염기, 인산 중 어느 한 부분과의 공유 결합 반응을 통하여 준비된다. 이러한 공유결합은 두 가지 다른 방법으로 진행될 수 있는데, 하나는 먼저 올리고머 형태로 합성된 시그널링 DNA의 3' 또는 5' 말단에 위의 화합물 중 어느 하나를 결합시키거나, DNA 모노머 단계에서 위의 화합물을 결합시킨 후 DNA 합성기에서 올리고머 형태로 합성할 수도 있다. 또한 후자의 경우 전체 DNA를 구성하는 다수의 모노머들에 대해서 위의 화합물들의 도입이 가능하다. 이것은 전기화학신호가 미미할 때 신호를 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 이와 같이, 전기 화학적으로 활성이 있는 물질을 표지로 공유결합시켜 사용함으로써, 감도가 높은 DNA 감지가 가능하다.

본 발명의 DNA 감지체는 프로브 DNA와 시그널링 DNA를 하이브리드시켜 형성된 이중가닥을 전극에 고정시켜 제조된다. 이것은 두 가지 다른 과정으로 준비 될 수 있다.

첫번째 방법은 프로브 DNA를 자기 조립 박막 형성 방법으로 전극에 고정시키고, 이 전극을 시그널링 DNA가 녹아있는 용액에 일정시간 동안 담가 용액의 온도를 용융온도(Tm, 대략 90??)까지 올렸다가 내리면서 하이브리드 반응을 유도하여 이중가닥 DNA를 만든 후 버퍼(buffer) 용액으로 세척한다. 여기서, 자기 조립 박막 형성 방법이라는 것은 전극을 티올, 아민, 실란 및 바이오틴 중에서 선택된 하나에 연결된 프로브 DNA 용액에 일정시간 동안 담가 전극 표면을 개질시킨 후, 개질된전극 표면을 머캅토알코올의 용액에 담가 DNA가 차지하고 남은 빈 공간에 머캅토알코올의 박막을 고정시키는 것이다. 상기 머캅토알코올의 역할은 넘어져 있는 DNA를 일으켜 세우고, 약하게 결합된 프로브 DNA를 떼어내며, 전극 표면에 DNA의 비특이적 흡착을 막아주는 역할을 한다. 대표적인 예로 머캅토헥사놀을 들 수 있다. 여기서, 시그널링 DNA와 프로브 DNA 용액의 용매로는 DNA의 종류에 따라 달라질 수 있고, 바람직하게 SSC(시트르산나트륨 염수), PBS(인산염 완충된 염수), HBS(HEPES 완충된 염수), TBS(트리스 완충된 염수) 등이 사용될 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

다른 방법은 같은 양의 프로브 DNA와 시그널링 DNA의 용액을 용융온도(예를 들면, 90??)로 올렸다가 천천히 식히면서 하이브리드시켜 이중가닥 DNA을 만든 뒤 이것을 전극에 자기 조립 박막 형성 방법으로 고정시키는 것이다.

이렇게 해서 얻어진 DNA 감지체에 타겟 DNA가 녹아있는 용액을 넣으면 이미 형성되어 있는 전극상의 이중가닥 DNA와 용액중의 타겟 DNA, 삼자간에 서로 하이브리드를 형성하는 경쟁반응이 일어난다. 이때 열역학적으로 유리한 하이브리드를 형성하기 위하여 용액을 시그널링 DNA와 프로브 DNA의 이중가닥이 갖는 용융온도 근처로 가열하고 식히는 작업을 반복하여 주게 된다. 여기서, 가열하는 작업은 전극 옆에 히터를 장치하여 진행시킬 수 있다. 또한, 타겟 DNA 용액의 용매도 DNA의 종류에 따라 달라질 수 있고, 바람직하게 SSC(시트르산나트륨 염수), PBS(인산염완충된 염수), HBS(HEPES 완충된 염수), TBS(트리스 완충된 염수) 등이 사용될 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

이 경쟁 반응은 프로브 DNA와 시그널링 DNA의 염기서열을 어떻게 디자인하는 가에 따라 두 가지 과정으로 진행될 수 있다.

첫 번째로는 프로브 DNA의 염기서열을 디자인할 때 타겟 DNA의 염기서열에 대한 상보성을 시그널링 DNA에 대한 상보성보다 크게 고안하여 경쟁 반응 후 용액중의 타겟 DNA가 시그널링 DNA 대신에 프로브 DNA와 이중 가닥의 하이브리드를 형성하게 하여 시그널링 DNA가 전극 표면으로부터 용액 중으로 떨어져 나가게 진행시킨다. 여기서 프로브 DNA와 타겟 DNA 간의 상보성을 보다 크게 하는 방법은 타겟 DNA에 상보적인 염기의 개수를 프로브 DNA가 시그널링 DNA보다 더 많도록 고안하여 합성하는 것이다.

다른 한가지 방법은 시그널링 DNA의 염기서열을 결정할 때 타겟 DNA의 염기서열에 대한 상보성을 프로브 DNA에 대한 상보성보다 크게 고안하여 경쟁 반응 후 용액 중의 타겟 DNA가 시그널링 DNA와 이중 가닥의 하이브리드를 형성하여 전극 표면에는 프로브 DNA만 남게 진행시킨다. 시그널링 DNA와 타겟 DNA 간의 상보성을 프로브 DNA와 타겟 DNA 간의 상보성 보다 크게 하는 방법은 타겟 DNA에 상보적인 염기의 개수를 시그널링 DNA가 프로브 DNA보다 더 많도록 고안하여 합성하는 것이다.

위의 두 가지 경쟁반응에서는 모두 시그널링 DNA가 떨어져 나가는데, 이런 결과는 용액 중에 원하는 염기서열을 가진, 즉 타겟 DNA의 염기서열을 가지는 DNA가 존재할 때만 크게 일어나며, 원하는 염기서열에서 하나 이상의 염기서열이 차이가 날 경우 경쟁반응의 정도는 줄어들고 시그널링 DNA가 전극 표면에서 떨어져나가는 정도도 비례해서 줄어든다.

이러한 경쟁 과정을 거친 후의 감지체에는 경쟁반응 전에 비해 시그널링 DNA의 양이 줄어들게 된다. 따라서, 경쟁 반응 전후의 전극에 고정된 이중가닥 내의 시그널링 DNA의 양을 측정함으로써 타겟 DNA를 감지할 수 있다. 이때 시그널링 DNA에 결합된 전기화학적으로 활성인 화합물의 산화나 환원 반응에 따른 전류의 양을 측정하여, 시그널링 DNA의 양을 도출한다. 이 경우, 전류의 양은 이 분야의 일반적인 방법을 사용하여 측정될 수 있지만, 바람직하게는 DNA 감지체의 전극을 작업전극으로 하고, 기준전극으로써 Ag/AgCl를 사용하고, Pt 와이어를 보조전극으로 하는 삼전극계 전기화학장치를 이용하며, 시그널링 DNA에 결합된 페로센과 같은 전기화학 활성물질이 반응하는 전압을 예상하고 적당한 범위의 전압을 일정전위기를 사용하여 작업전극에 주사하여 측정한다. 시그널링 DNA의 양에 대한 타겟 DNA 양의 상관관계로부터 검정 곡선을 작성하여 미지 시료가 가지는 타겟 DNA 양을 정량할 수 있다.

여기서, 경쟁 반응 후 떨어져 나간만큼의 시그널링 DNA의 양이 전기화학 측정의 신호에 영향을 주지 못하고, 경쟁 반응을 유도할 때 용액이 전기화학을 수행할 수 있을 정도의 전해질 농도를 가지므로 경쟁 반응 후 그 용액을 그대로 전기화학 반응을 위한 전해질로 사용할 수 있어 별도의 전극 세척이 없이 전기화학 반응을 관찰할 수 있다.

세척여부에 따른 결과를 비교하여 보면 상호간의 전기화학적인 신호의 차이가 오차수준에서 벗어나지 않는다는 것을 확인할 수 있다.

또한, DNA 감지체는 다수로 형성될 수 있으며, 이 때는 다수의 상이한 프로브 DNA들과 그에 따른 각각의 시그널링 DNA를 각각에 대해 하이브리드 반응을 시켜 다수의 상이한 이중가닥을 형성시키고 전극 어레이의 각각의 전극에 상이한 이중가닥을 고정시켜 형성할 수 있다. 이와 같은 다중 DNA 감지체도 역시 상기와 같은 과정에 적용되어 다중 DNA 검출이 가능하다. 즉, 각 전극에 해당되는 다수의 타겟 DNA들이 있는 용액에 이 다중 DNA 감지체를 담가 경쟁반응을 시키고, 각각의 전극에 대해 전기화학적인 신호의 변화를 관찰하거나 다중 채널 일정 전위기를 사용하여 타겟 DNA를 동시에 감지할 수도 있다.

또한, 타겟 DNA의 종류를 정확히 알 수 없을 때 예상되는 몇 가지 종류의 염기서열에 대해서 앞서 밝힌 방법으로 프로브 DNA와 시그널링 DNA를 합성하고 전극어레이에 각각의 이중가닥 DNA를 고정시킨 후 미지의 타겟 DNA 용액에 담가 경쟁 반응시키면 해당되는 전극의 전기화학 신호만이 다른 전극에 비해 크게 줄어든 것을 관찰하게 되어 결국 DNA의 종류를 감지하게 된다. 이 방법을 적용하면 단일 염기 다형성을 구별할 수 있다.

또한, 프로브 DNA와 상보적이지 않은 DNA의 용액에서 마찬가지의 경쟁반응을 시킨 경우의 전기화학적인 신호를 측정하여 본 발명의 DNA 감지체가 상보성이 있는 DNA를 검출할 수 있는 지의 여부를 판단 할 수 있다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

도 1a은 프로브 DNA(12)와 시그널링 DNA(13)의 이중가닥이 전극 어레이중 하나의 전극에 고정되어 구성된 DNA 감지체를 나타낸 도면이고, 도 1b는 도 1a의 DNA 감지체(10)에 타겟 DNA(14) 용액을 넣고 프로브 DNA(12)와 하이브리드를 이루려고 하는 타겟 DNA(14)와 시그널링 DNA(13)간의 경쟁반응을 일으키는 과정을 보여주는 도면이다. 도 1a와 1b에서는 프로브 DNA(12)가 가지는 타겟 DNA(14)의 염기서열에 대한 상보성을 시그널링 DNA(13)에 대한 상보성보다 크게 고안하였다.

도 1a의 DNA 감지체는 금으로 된 전극(11)을 티올이 연결된 프로브 DNA(12)의 SSC 용액(2 마이크로몰)에 30분간 담가 전극 표면을 개질시키고, 이렇게 개질된 전극 표면을 1mM 머캅토헥사놀 수용액에 30분간 담가 자기 조립 박막 형성 방법으로 나머지 전극 표면에 머캅토헥사놀의 박막을 고정시키고, 이 전극 표면을 다시 시그널링 DNA(13)가 녹아 있는 SSC 용액(10 마이크로몰)에 담근 후 온도를 용융온도까지 올렸다가 내리면서 하이브리드 반응을 유도하여 이중가닥 DNA를 만든 후 SSC 용액을 세척하여 제조한다.

여기서 같은 양의 프로브 DNA와 시그널링 DNA의 용액을 온도를 용융온도까지 올렸다가 천천히 식히면서 하이브리드시켜 이중가닥 DNA을 만든 뒤 전극에 자기 조립 박막 형성 방법으로 고정시키고 머캅토헥사놀로 같은 방법으로 처리하여 도 1a의 DNA 감지체를 준비할 수도 있다.

도 1b에서는 도 1a의 감지체(10)에 타겟 DNA(14)가 녹아 있는 용액을 넣어 프로브 DNA(12), 시그널링 DNA(13) 및 타겟 DNA(14)의 삼자간에 하이브리드를 형성하는 경쟁반응을 일으켜 타겟 DNA(14)가 시그널링 DNA(13) 대신에 프로브 DNA(12)와 이중 가닥의 하이브리드를 형성하게 하여 시그널링 DNA가 전극 표면으로부터 용액 중으로 떨어져 나가게 한다.

이와 같은 경쟁반응을 효과적으로 진행시키기 위해서 시그널링 DNA(13)와 프로브 DNA(12)의 이중가닥이 가지는 용융 온도(Tm) 근처에서 가열해주는 작업이 필요하다. 그러면 세 가지 DNA가 모두 단일가닥으로 떨어진 상태가 있을 수 있고 최종적으로 하이브리드를 이루어 이중가닥을 형성하는 짝은 상보성이 더 큰 프로브 DNA(12)와 타겟 DNA(14)가 된다. 그러면 시그널링 DNA(13)는 용액 중에 남게 되고 이 DNA 자체가 가지는 전기화학적인 물질은 전극과 떨어지게 되므로 DNA 감지체의 전기화학적인 신호에 영향을 주지 못한다.

한편 감지 대상인 타겟 DNA와 프로브 DNA간의 상보성이 시그널링 DNA와 프로브 DNA 사이의 상보성보다 낮다면 경쟁반응 후 결국 하이브리드를 이루는 짝은 시그널링 DNA와 프로브 DNA일 것이며 경쟁반응 전의 상태로 돌아가게 되어 DNA 감지체의 전기화학적인 신호에 기여하게 될 것이다.

따라서, 경쟁 반응 전후의 전극에 고정된 시그널링 DNA 양을 측정하여 타겟 DNA를 감지한다. 이때 시그널링 DNA의 양은 시그널링 DNA에 결합된 전기화학적 활성인 화합물의 전류의 양을 측정하여 얻고, 여기서 전류의 양은 DNA 감지체의 전극을 작업전극으로하고, 기준전극을 Ag/AgCl로 하고, Pt 와이어를 보조전극으로 하는 삼전극계 전기화학장치를 이용하여, 작업전극에 시그널링 DNA에 결합된 페로센과 같은 전기화학 활성물질이 반응하는 전압을 예상하고 적당한 범위의 전압을 주사하는데, 여기서는 400 - 700 mV 사이의 전압을 주사하여 측정한다. 결국, 전기화학적 신호의 측정을 통한 시그널링 DNA 양에 대한 타겟 DNA 양의 상관관계로부터 검정 곡선을 작성하여 타겟 DNA를 감지한다.

도 2a와 2b는 시그널링 DNA(23)의 염기서열을 결정할 때 타겟 DNA(24)의 염기서열에 대한 상보성을 프로브 DNA(22)의 상보성보다 크게 디자인한 경우이며, 도 2a는 프로브 DNA(22)와 시그널링 DNA(23)의 이중가닥이 전극에 고정되어 구성된 DNA 감지체를 나타낸 도면이고, 도 2b는 도 2a의 DNA 감지체(20)에 타겟 DNA(24) 용액을 넣고 프로브 DNA(22)와 하이브리드를 이루려고 하는 타겟 DNA(24)와 시그널링 DNA(23)간의 경쟁반응을 일으키는 과정을 보여주는 도면이다.

도 2b는 시그널링 DNA(23)의 염기서열을 결정할 때 타겟 DNA(24)의 염기서열에 대한 상보성을 프로브 DNA(22)의 상보성보다 크게 고안하여 경쟁 반응 후 시그널링 DNA(23)가 프로브 DNA(22) 대신에 타겟 DNA(24)와 이중 가닥의 하이브리드를 형성하게 하여 타겟 DNA(24)와 시그널링 DNA(23)의 이중가닥이 전극 표면으로부터 용액 중으로 떨어져 나가는 것을 나타냈다. 이 경우도 도 1a과 1b에 대해서 예시한 것과 동일한 방법을 적용하여 DNA 감지에 이용할 수 있다.

상기 도 1 내지 2에서는 시그널링 DNA의 전기화학적으로 활성이 있는 물질로서 금속 배위화합물 중의 하나인 페로센을 사용하고 있다. 도 3a는 DNA 올리고머를 DNA 합성기에서 합성하고 말단에 일차 아민을 도입한 다음 페로센 카르복실산과 아미드 결합으로 공유결합시킨 시그널링 DNA의 예이다. 도 3b는 DNA 모노머 중에서 우라실을 페로센과 공유결합과 고리화 반응을 시켜 얻은 물질의 예를 보이고 있다. 이러한 모노머를 포스포아미다이트(phosphoramidite) 형태로 만들어 DNA 합성기에서 원하는 염기서열 중에 끼워 넣거나 DNA 말단에 결합시킬 수 있다.

도 3a와 같은 시그널링 DNA를 사용하여 도 1a의 감지체를 구성한 경우 페로센은 Ag/AgCl 기준전극에 대해서 650 mV 근처에서 산화하고, 도 3b의 모노머를 사용하여 합성한 DNA를 사용한 경우에 대해서는 페로센이 600 mV 근처에서 산화한다.

도 4는 본 발명에 따른 감지체를 이용하여 타겟 DNA의 검출 여부를 실험한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 실험방법은 다음과 같다.

실험방법

하기 표 1에 나타낸 염기서열을 갖는 시그널링 DNA, 타겟 DNA, 네가티브 대조 DNA 및 프로브 DNA를 준비하였다. 상기 시그널링 DNA에는 도 3b의 페로센이 결합된 모노머를 시그널링 DNA의 5' 말단에 연속으로 연결시켰다. 이어서, 시그널링 DNA와 프로브 DNA를 가지고, 도 1a의 DNA 감지체를 제조하였다. 상기 DNA 감지체에 타겟 DNA 용액과 비교실험을 위한 네가티브 대조 DNA 용액을 각각 넣어 경쟁반응시켰다. 여기서, 경쟁반응 전에 DNA 감지체의 시그널링 DNA와 프로브 DNA가 하이브리드를 이루었을때 상기 감지체의 전극을 작업전극으로 하고, Ag/AgCl을 기준전극으로 하고, Pt 와이어를 보조전극으로 하는 삼전극계 전기화학장치를 이용하고, 작업전극에 400 - 700 mV의 전압을 인가하여 시그널링 DNA의 페로센의 산화 전류량을 측정하였다. 그리고, 타겟 DNA 및 네가티브 대조 DNA와의 경쟁반응 후 동일한 전기화학장치를 이용하고, 작업전극에 300 - 700 mV의 전압을 인가하여 각각에 대한 시그널링 DNA의 전류의 양을 세척단계의 유무에 따라 측정하였다. 그 세척 전 측정 결과를 각각 도 4a에 세척 후 측정결과를 도 4b에 각각 나타내었다.도 4a 에서 실선은 경쟁반응 전 DNA 감지체에서 프로브 DNA와 하이브리드를 형성한 시그널링 DNA의 전류량을 나타낸 것이고, 점선은 네가티브 대조 DNA와 경쟁반응한 후 시그널링 DNA의 전류량이고, 이중점선은 타겟 DNA와 경쟁반응한 후 시그널링 DNA의 전류량이다. 도 4b에서도 마찬가지의 대응관계로 도시하였다. 예상한 바와 같이 타겟 DNA 용액에 대한 전류량이 급격히 감소하였으며, 도 4a 및 도 4b 모두에서 거의 유사한 그래프가 나오는 것을 통해 세척 유무에 상관없이 거의 유사한 전기화학적인 신호를 얻을 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.

한편 타겟 DNA의 농도를 달리하여 본 발명에 따른 DNA 감지체와 경쟁반응 시켜 전기화학적 신호를 측정하고 농도의 변화에 대한 검정곡선을 작성하면 미지양의 타겟 DNA 양을 전기화학적으로 정량할 수도 있다.

DNA 종류	염기서열
시그널링 DNA	5'FeFeG CGG GGA GCA G 3'
타겟 DNA	5' CC ACG CGG GGA GCA G 3'
네가티브 대조 DNA	5' CCG ATG GAC GCA CCG G 3'
프로브 DNA	5' CTG CTC CCC GCG TGG C 3'

본 발명에 따른 전기화학적인 DNA 감지체 및 이를 이용한 감지방법은 종래 전기화학적으로 DNA를 검출하는 경우 타겟 DNA에 직접 표지를 하여 비특이적 흡착에 따른 감지신호가 방해를 많이 받기 때문에 전기화학 측정전 세척단계가 요구된다는 단점과 또한 형광적으로 DNA를 검출하는 경우 필요한 장비가 많기 때문에 고비용을 초래하며, 또한 DNA 감지 시스템의 소형화에 유리하지 않다는 단점을 해결하여 타겟 DNA에 일일이 따로 표지를 하지 않고, 시그널링 DNA에 전기화학적으로 활성이 있는 물질을 표지로 공유결합시켜 사용하므로 감도가 높은 DNA 감지를 가능하게 하고, 기존의 전기화학적 감지 방법에서 비특이적 흡착을 제거하기 위해 요구되는 세척과정이 필요없기 때문에 DNA 감지시스템의 소형화를 가능하게 하며, 또한 세척과정이 필요 없으므로 랩온어칩 (Lab-on-a-chip) 형태의 DNA 감지 시스템에 적용할 때 DNA 감지 중에 유체 제어를 최소화시킬 수 있다.

Claims

서로 상보적이고 타겟 DNA의 염기서열에 대해서도 각각 상보적이지만, 타겟 DNA에 대한 상보성과 둘 사이의 상보성의 정도에 차이가 있는 프로브 DNA와 시그널링 DNA의 하이브리다이제이션을 통해 형성된 이중가닥이 전극에 고정되어 있으며, 시그널링 DNA는 전기화학적 활성 물질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA 감지체.
제 1항에 있어서, 상기 DNA 감지체의 전극은 전극이 하나 이상 배열된 전극 어레이 형태인 것을 특징으로 하는 DNA 감지체.
제 1항에 있어서, 상기 DNA 감지체는 프로브 DNA를 자기 조립 박막 형성 방법으로 전극에 고정시키고, 상기 전극을 시그널링 DNA 용액에 담가 용융 온도까지 온도를 올렸다가 내리면서 하이브리드 반응을 유도하여 이중가닥을 형성시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 DNA 감지체.
제 1항에 있어서, 상기 DNA 감지체는 동량의 프로브 DNA와 시그널링 DNA의 용액을 용융 온도까지 상승시킨 후 천천히 식히면서 하이브리드 반응을 유도하여 이중가닥을 형성하고, 형성된 이중가닥을 전극에 자기 조립 박막 형성방법으로 고정시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 DNA 감지체.
제 1항에 있어서, 프로브 DNA와 타겟 DNA의 염기서열 간의 상보성이 프로브 DNA와 시그널링 DNA의 염기서열 간의 상보성보다 큰 것을 특징으로 하는 DNA 감지체.
제 1항에 있어서, 시그널링 DNA와 타겟 DNA의 염기서열 간의 상보성이 프로브 DNA와 시그널링 DNA의 염기서열 간의 상보성보다 큰 것을 특징으로 하는 DNA 감지체.
제 1항에 있어서, 시그널링 DNA에 결합하는 전기화학적으로 활성인 화합물로는 페로센, 루세늄(Ru) 이나 오스뮴(Os)의 폴리피리딘(polypyridine) 또는 폴리페난트롤린(polyphenanthroline) 착화합물, 바이올로진, 하이드로퀴논, 안트라퀴논 및 피롤 퀴놀린 퀴논으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA 감지체.
제 1항에 있어서, 상기 DNA 감지체는 동시적인 DNA 다중 검출이 가능하도록 서로 다른 두개 이상의 프로브 DNA와 각각에 대한 시그널링 DNA를 사용하여 형성된 두개 이상의 이중가닥 DNA를 전극이 두개 이상 배열된 전극 어레이의 각각의 전극에 고정시켜 형성되는 것을 특징으로 하는 DNA 감지체.
제 1항에 따른 DNA 감지체를 준비하는 단계;

상기 DNA 감지체에 타겟 DNA 용액을 넣어, 프로브 DNA, 시그널링 DNA 및 타겟 DNA 사이에서 하이브리드를 이루기 위한 경쟁반응을 유도하는 단계; 및

경쟁반응 전후의 시그널링 DNA의 전기화학적 신호의 변화를 측정하여 타겟 DNA의 양과 종류를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 감지 방법.
제 9항에 있어서, 상기 경쟁반응 유도단계에서 DNA 감지체의 전극을 시그널링 DNA와 프로브 DNA의 이중가닥이 갖는 용융 온도 근처로 가열하고 식히는 작업을 반복하는 것을 특징으로 하는 DNA 감지 방법.
제 9항에 있어서, 타겟 DNA의 양은 시그널링 DNA의 경쟁반응 전과 경쟁반응 후의 전기화학적 신호의 측정값의 변화량을 측정하여 정량하는 것을 특징으로 하는 DNA 감지방법.
제 9항에 있어서, 타겟 DNA의 종류는 예상되는 몇가지 종류의 염기서열에 대해서 프로브 DNA와 시그널링 DNA의 이중가닥을 형성하고, 전극이 하나 이상 배열된 전극 어레이의 각각의 전극에 각각의 이중가닥을 고정시킨 후, 미지의 타겟 DNA와 경쟁반응시켜 이에 따른 전기화학적 신호를 측정하여 결정하는 것을 특징으로 하는 DNA 감지방법.
제 9항에 있어서, 상기 DNA 감지체로 서로 다른 두개 이상의 프로브 DNA와 각각에 대한 시그널링 DNA를 사용하여 형성된 두가지 이상의 이중가닥 DNA를 전극이 두개 이상 배열된 전극 어레이의 각각의 전극에 고정시켜 형성된 DNA 다중 검출이 가능한 DNA 감지체를 이용하는 것을 특징으로 하는 DNA 감지방법.