DE102010000906B4

DE102010000906B4 - Konjugate für den Nachweis doppelsträngiger Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE102010000906B4
Application number: DE102010000906A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Schuhmann; Gerhard Hartwich; Magdalena Gebala; Leonard Stoica
Original assignee: Ruhr Universitaet Bochum
Current assignee: Ruhr Universitaet Bochum
Priority date: 2009-01-22
Filing date: 2010-01-14
Publication date: 2012-07-12
Anticipated expiration: 2030-01-15
Also published as: DE102010000906A1

Abstract

Konjugat zum Nachweis doppelsträngiger Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass das Konjugat umfasst: (i) mindestens einen Interkalator, der ungeladen ist und spezifisch an doppelsträngige Nukleinsäure bindet; (ii) mindestens einen Spacer, der kovalent an den Interkalator gebunden ist; (iii) mindestens ein erstes Linkermolekül, das kovalent an den Spacer gebunden ist, wobei das erste Linkermolekül Biotin oder ein Biotinderivat ist; (iv) mindestens ein zweites Linkermolekül, das spezifisch an das erste Linkermolekül bindet, wobei das zweite Linkermolekül Avidin, Streptavidin, Neutravidin oder ein biotin-bindendes Fragment von Avidin, Streptavidin oder Neutravidin ist; und (v) mindestens einen nachweisbaren Marker, der an das zweite Linkermolekül gebunden ist und ein nachweisbares Signal erzeugt, wobei der Marker ein biotinylierter Marker ist.

Description

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Nukleinsäureanalytik und betrifft Konjugate zum Nachweis von doppelsträngigen Nukleinsäuren, die mindestens einen spezifisch doppelsträngige Nukleinsäuren bindenden, ungeladenen Interkalator, mindestens ein kovalent an den Interkalator gebundenen Spacer, mindestens ein kovalent an den Spacer gebundenes erstes Linkermolekül, mindestens ein zweites Linkermolekül, das spezifisch an das erste Linkermolekül bindet, und mindestens einen nachweisbaren Marker umfassen, sowie Verfahren zum Nachweis doppelsträngiger Nukleinsäuren mittels dieser Konjugate und die Verwendung dieser Konjugate zum Nachweis doppelsträngiger Nukleinsäuren.
Die ultrasensitive Bestimmung von DNA-Sequenzen ist von steigender Bedeutung, wobei die meisten Techniken zur sequenzspezifischen Detektion von DNA die Markierung der Ziel-DNA zur Voraussetzung haben.
Zur Markierung der Ziel-DNA werden vielfach Oligonukleotidsonden mit zur Ziel-DNA komplementärer Sequenz eingesetzt, die mit Enzymen oder Fluorophoren markiert sind, die eine sensitive Detektion der Sonde:Ziel-Hybridisierung ermöglichen. Enzym-markierte Sonden erlauben dabei durch Amplifizierung die Detektion geringster Ziel-DNA Konzentrationen.
Alternativ kann die Ziel-DNA auch direkt, z. B. durch eine DNA-Amplifizierung mittels PCR, markiert werden. So kann z. B. Biotin-modifizierte einzelsträngige DNA erhalten werden, die dann in einem sekundären Schritt weiter modifiziert werden kann.
Um die aufwendige Modifikation der Ziel-DNA zu vermeiden, müssen sogenannte labelfreie Methoden zur Detektion von DNA-Hybridisierung entwickelt werden, so dass nach Hybridisierung selektiv und mit hoher Spezifität doppelsträngige DNA erkannt werden kann. Insbesondere ist das Ziel eine vorgelagerte PCR als Basis der Detektion zu vermeiden und trotzdem eine hochsensitive Detektion der Ziel-DNA zu erlauben. Labelfrei bedeutet damit, dass die Ziel-DNA direkt aus einer Probe mit hoher Selektivität erkannt wird, ihr Nachweis aber erst nach einer hochselektiven Markierung erfolgen kann. Ist die Markierung hochselektiv für beispielsweise doppelsträngige DNA, kann mit Hilfe von Arrayanordnungen eine beliebige Zahl von Ziel-DNA Sequenzen erkannt und nachgewiesen werden.
Interkalierende Nachweiskonjugate bieten durch die Bildung nicht-kovalenter Komplexe mit doppelsträngiger DNA (dsDNA) eine Möglichkeit zur spezifischen Erkennung von dsDNA. Die spezifische Bindung solcher Konjugate an dsDNA kann mit Hilfe elektrochemischer Techniken detektiert werden, wobei die Nutzung elektrochemisch detektierbarer Interkalatoren wegen der inhärent hohen Sensitivität, der geringen Kosten und der Miniaturisierbarkeit entsprechender Assaykonzepte besonders interessant ist.
Zusätzlich zu bekannten Interkalatoren wurden daher Substanzen synthetisiert, in denen durch Anbindung von z. B. Übergangsmetallkomplexen verbesserte elektrochemische Eigenschaften oder Elektrochemilumineszenz angestrebt werden ( WO 2008/057054 ; WO 2006/135343 ; DE 600 33 909 T2 ). Allerdings zeigen die meisten dieser Interkalatoren eine geringe Selektivität und damit ein schlechtes Signal zu Rausch Verhältnis, da sie nicht nur an dsDNA sondern auch, wenn auch deutlich schwacher, aufgrund von elektrostatischen Wechselwirkungen an ssDNA binden.
Daher besteht weiterhin ein großer Bedarf zur Entwicklung neuer interkalierender dsDNA-Nachweiskonjugate mit verbessertem Signal zu Rausch Verhältnis und verringerter Nachweisgrenze.
In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher ein Konjugat zum Nachweis doppelsträngiger Nukleinsäure, wobei das Konjugat

(i) mindestens einen Interkalator, der ungeladen ist und spezifisch an doppelsträngige Nukleinsäure bindet;
(ii) mindestens einen Spacer, der kovalent an den Interkalator gebunden ist;
(iii) mindestens ein erstes Linkermolekül, das kovalent an den Spacer gebunden ist;
(iv) mindestens ein zweites Linkermolekül, das spezifisch an das erste Linkermolekül bindet; und
(v) mindestens einen nachweisbaren Marker, der an das zweite Linkermolekül gebunden ist und ein nachweisbares Signal erzeugt,

In einem weiteren Aspekt, richtet sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zum Nachweis eines Nukleinsäureanalyts, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Hybridisierung des Nukleinsäureanalyts an eine Nukleinsäure-Fängersequenz, um eine doppelsträngige Nukleinsäure zu bilden;
(b) Inkubation der doppelsträngigen Nukleinsäure mit einem erfindungsgemäßen Nachweiskonjugat, um einen Komplex aus doppelsträngiger Nukleinsäure und Nachweiskonjugat zu bilden; und
(c) Nachweis des doppelsträngige Nukleinsäure:Nachweiskonjugat-Komplexes.

In einer weiteren Ausführungsform richtet sich die Erfindung auf ein Kit, das mindestens ein erfindungsgemäßes Nachweiskonjugat enthält.
In weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Nachweiskonjugate oder Kits zum Nachweis doppelsträngiger Nukleinsäuren in einer Probe. In einer besonderen Ausführungsform kann dieser Nachweis mittels des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens erfolgen.
Beschreibung der Abbildungen
zeigt verschiedene Assaydesigns basierend auf der Biotin-Avidin Interaktion. LAB (markiertes Avidin-Biotin; labeled avidin biotin). BRAB (überbrücktes Avidin-Biotin System; bridged avidin-biotin system). ABC (Avidin-Biotin-Komplex; avidin-biotin complex).
zeigt ein Reaktionsschema für die Kopplung von Proflavin an ein TFP-PEG₃-Biotin Molekül.
zeigt den Einfluss der DNA-Hybridisierung, der Interkalation und der sekundären Bindung von Avidin-konjugiertem Markerenzym (alkalische Phosphatase) auf den Ladungstransferwiderstand in der EIS. A) Nyquistplot und B) Bodeplot aufgenommen in Anwesenheit von 5 mM [Fe(CN)₆]^3-/4. (o) ssDNA/MCH-modifizierte Au-Elektrode;
dsDNA/MCH-modifizierte Au-Elektrode, (♦) Interkalator/dsDNA-Komplex/MCH-modifizierte Au-Elektrode, (♢) Konjugation mit Avidin-alkalischer Phosphatase.
zeigt (A) einen Nyquistplot und (B) einen Bodeplot nach Inkubation einer ssDNA/MCH modifizierten Elektrode mit Biotin-modifiziertem Proflavin. (o) ssDNA/MCH-modifizierte Au Elektrode, (•) ssDNA/MCH-modifizierte Au Elektrode nach Inkubation mit Biotin-modifiziertem Proflavin. EIS in 5 mM [Fe(CN)₆]^3-/4 bei einem Offsetpotential von E +210 mV vs. Ag/AgCl.
zeigt die Ergebnisse einer chronoamperometrische Untersuchung der DNA Hybridisierung unter Verstärkung mittels alkalischer Phosphatase nach Zugabe von p-APP: (–) interkalierte dsDNA/MCH modifizierte Au Elektrode; (o) ssDNA/MCH modifizierte Au Elektrode; sowie (Δ) nicht-interkalierte dsDNA/MCH modifizierte Au Elektrode nach Ultraschallbehandlung der modifizierten Au-Elektrode in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.4; 20 mM NaCl) für 5 min.
zeigt schematisch die Verwendung von alkalische Phosphatase als Nachweisenzym ( ) sowie die von der alkalischen Phosphatase katalysierte Hydrolyse des nicht elektrochemisch aktiven p-Aminophenylphosphat (p-APP) zum elektroaktiven P-Aminophenol (p-AP), das bei einem Potential von +300 mV vs Ag/AgCl weiter zum p-Quinonimin oxidiert werden kann ( ).
Ausführungsformen
Die Erfindung betrifft Konjugate für den hochselektiven Nachweis von doppelsträngigen Nukleinsäuren.
Die erfindungsgemäßen Konjugate umfassen einen Interkalatorbestandteil, der selektiv doppelsträngige Nukleinsäuren, insbesondere dsDNA, erkennt, nicht geladen ist und somit nur geringe Wechselwirkungen mit ssDNA aufweist. „Selektiv” bedeutet in diesem Zusammenhang, dass der Interkalator mit einer einzelsträngigen Nukleinsäure bzw. der Oberfläche eines geeignet modifizierten Sensors nicht oder relativ zu der Interaktion mit einer Doppelstrangstruktur nur in geringem Maße interagiert. In einer Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Interkalator um ein Acridin, vorzugsweise ein amino-modifiziertes Acridin, wie zum Beispiel Diaminoacridin (Proflavin) oder ein Derivat davon. „Derivat” bezieht sich in diesem Zusammenhang auf Acridin- bzw. Diaminoacridinmoleküle, die durch zusätzliche Substituenten am aromatischen Ringsystem modifiziert sind, wobei aber die Eigenschaft spezifisch in doppelsträngige Nukleinsäuren zu interkalieren beibehalten wird.
Um die Bindung des Interkalator an eine doppelsträngige Nukleinsäure nachweisen zu können, muss der Interkalator über eine weitere Erkennungsstruktur verfügen, die nach erfolgreicher Interkalation den Nachweis ermöglicht. Bei dieser Erkennungsstruktur kann es sich in einer Ausführungsform der Erfindung um mindestens ein erstes Linkermolekül handeln, das über einen Spacer kovalent mit dem Interkalator verbunden ist. Geeignete erste Linkermoleküle sind beispielsweise Antigene, Haptene, Biotin oder Biotinderivate.
Diese kovalent mit dem Interkalator verbundene Erkennungsstruktur, die mindestens ein erstes Linkermolekül beinhaltet, wird durch einen komplementären Bindungspartner mit hoher Selektivität gebunden. Der komplementäre Bindungspartner umfasst dabei mindestens ein zweites Linkermolekül, das spezifisch an das erste Linkermolekül bindet. Bei dem zweiten Linkermolekül kann es sich beispielsweise um einen Antikörper, Avidin, Streptavidin, Neutravidin oder Biotin-bindende Fragmente von Avidin, Streptavidin oder Neutravidin handeln. In einer Ausführungsform der Erfindung bilden erstes und zweites Linkermolekül ein Antigen/Hapten:Antikörper-Paar. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das mindestens eine erste Linkermolekül Biotin oder ein Biotinderivat und das mindestens eine zweite Linkermolekül ist Avidin, Streptavidin, Neutravidin oder ein biotin-bindendes Fragment dieser Moleküle. Bei den erfindungsgemäß verwendbaren Biotinderivaten handelt es sich um Biotinderivate, die von Avidin, Streptavidin und/oder Neutravidin gebunden werden. Die Bindung des zweiten Linkermoleküls an das erste Linkermolekül ist vorzugsweise nicht-kovalent.
Neben dem zweiten Linkermolekül, das vorzugsweise nicht-kovalent an das erste Linkermolekül bindet, umfasst der sekundäre Bindungspartner auch einen nachweisbaren Marker, der entweder kovalent oder nicht-kovalent an das zweite Linkermolekül gebunden ist. Bei dem nachweisbaren Marker, der über geeignete Nachweisverfahren, zum Beispiel spektroskopisch oder elektrochemisch, nachweisbar ist, kann es sich beispielsweise um ein Enzym, eine redoxaktive, fluoreszierende oder chemolumineszente Verbindung handeln. Beispiele für geeignete Enzyme sind alkalische Phosphatase, Peroxidase oder Glucoseoxidase. In einer Ausführungsform der Erfindung, in der das zweite Linkermolekül Avidin, Streptavidin, Neutravidin oder ein biotin-bindendes Fragment dieser Moleküle ist, ist das Markermolekül biotinyliert und über den Biotin-Rest nicht-kovalent an das zweite Linkermolekül gebunden.
Die hochselektive Bindung des sekundären Bindungspartners führt zu einer molekularen Architektur des Konjugats, die mittels geeigneter elektrochemischer oder spektroskopischer Methoden mit hoher Sensitivität nachweisbar wird. Insbesondere erlaubt die sekundäre Bindung von Detektionselementen ausschließlich durch den primär an dsDNA gebundenen Interkalator das Einführen von molekularen Verstärkungskaskaden, die zu einer erheblichen Verbesserung der Nachweisgrenze (ihren.
In einer Ausführungsform der Erfindung sind die Interkalatormoleküle, die mit hoher Selektivität dsDNA erkennen und von ssDNA mit sehr geringer Affinität gebunden werden, über einen Spacer, z. B. PEG, mit Biotin verknüpft. Durch den Interkalationsprozess werden somit doppelsträngige Nukleinsäuren, wie z. B. dsDNA, hochselektiv mit Biotin modifiziert. In einer sekundären Reaktion mit Avidin, Streptavidin oder Neutravidin werden dann unter Nutzung der sehr hohen Bindungskonstante und der hohen Spezifität von Biotin/Avidin Komplexen geeignete Detektionselemente (z. B. Enzyme, wie Meerrettichperoxidase, Glucoseoxidase, alkalische Phosphatase, Fluorophore oder Redoxspezies) eingeführt, so dass eine Amplifikation des Signals erreicht wird. Da das Biotin über Spacer an den Interkalator gebunden wird, können nahezu beliebige Detektionselemente nach entsprechender Konjugation mit (Strept-/Neutr-)Avidinderivaten an die doppelsträngige Nukleinsäure, z. B. dsDNA, gebunden werden. Da Avidin und Streptavidin Proteine mit vier Untereinheiten mit jeweils einer hochaffinen Bindungsstelle für Biotin sind, können bis zu vier Biotin-Einheiten von einem Avidin- oder Streptavidinmolekül gebunden werden. Somit wird ein sequentieller Aufbau einer komplexen molekularen Architektur möglich, die zur Verstärkung einer primären Erkennungsreaktion dienen kann. Derartige Assaydesigns umfassen (s. a. ):

a) LAB (markiertes Avidin-Biotin; labeled avidin biotin). Das Zielmolekül wird mit Biotin markiert und dann einem Avidin- oder Streptavidinkonjugat ausgesetzt.
b) BRAB (überbrücktes Avidin-Biotin System; bridged avidin-biotin system). Multiple Biotinbindungsstellen werden benutzt, um die Zahl der Detektionsmoleküle zu erhöhen. Das Zielmolekül wird mit Biotin modifiziert und wie bei LAB durch ein Avidin- oder Streptavidin erkannt, das wiederum ein mit Biotin markiertes Detektionsmolekül binden kann. Die Avidinmoleküle fungieren somit als Brücken zwischen mehreren Biotin-modifizierten Molekülen.
c) ABC (Avidin-Biotin-Komplex; avidin-biotin complex). Ein Polymer eines biotinylierten Detektionsmoleküls und Avidin reagiert mit dem biotinylierten Zielmolekül über ein überbrückendes Avidinmolekül.

Insbesondere ist es somit möglich, abhängig vom gewählten Assaydesign, nachweisbare Marker zu verwenden, die mehrfach, d. h. mindestens zweifach biotinyliert sind. Durch die mehrfache Biotinylierung und die vier Biotin-Bindungsstellen im Avidin- oder Streptavidinmolekül lassen sich somit oligomere Strukturen erzeugen, die mehrere Avidin-, Streptavidin- oder Neutravidinmoleküle und mehrere Markermoleküle enthalten. Diese oligomeren Strukturen können dann über freie Biotin-Bindungstellen an einen oder mehrere Biotin-modifizierte Interkalatoren gekoppelt werden. Über solche oligomeren Netzwerke lässt sich eine Amplifizierung des Signals erreichen.
In einer Ausführungsform der Erfindung können die erfindungsgemäßen Konjugate daher unabhängig voneinander mehr als einen Interkalator, Spacer, erstes Linkermolekül, zweites Linkermolekül und/oder Marker enthalten. „Mindestens einen/ein” bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung daher 1 oder mehr, z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 oder mehr Gruppe(n).
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung, enthalten die erfindungsgemäßen Konjugate mindestens einen Interkalator, mindestens zwei Spacer, mindestens zwei erste Linkermoleküle, mindestens zwei zweite Linkermoleküle und/oder mindestens zwei Marker. In einer solchen Ausführungsform kann beispielsweise ein Interkalator über zwei Spacer mit zwei ersten Linkermolekülen verknüpft sein. Die ersten Linkermoleküle werden dann von jeweils mindestens einem mit mindestens einem Markermolekül verbundenen zweiten Linkermolekül gebunden.
Wenn die erfindungsgemäßen Konjugate mehr als einen Interkalator, Spacer, erstes Linkermolekül, zweites Linkermolekül und/oder Marker enthalten, können diese jeweils gleich oder unterschiedlich sein.
In besonderen Ausführungsformen der Erfindung, ist der Spacer eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Alkoxy-, oder Polyethylenglykolgruppe handelt. „Substituiert” bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Gruppe mit weiteren Resten modifiziert sein kann. Falls substituiert, ist der Substituent eine oder mehrere Gruppen, zum Beispiel ein oder zwei Gruppen, unabhängig ausgewählt aus C₃-C₈ Cycloalkyl, C₆-C₁₄ Aryl, einem 5–10 gliedrigen Heteroarylring in dem 1 bis 4 Ringatome unabhängig Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel sind, einem 5–10 gliedrigen heteroalicyclischen Ring in dem 1 bis 3 Ringatome unabhängig Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel sind, Hydroxy, C₁-C₁₀ Alkoxy, C₃-C₈ Cycloalkoxy, Aryloxy, Mercapto, Alkylthio, Arylthio, Cyano, Halogen, Carbonyl, Thiocarbonyl, O-Carbamyl, N-Carbamyl, O-Thiocarbamyl, N-Thiocarbamyl, C-Amid, N-Amid, C-Carboxy, O-Carboxy, Nitro, Silyl, Sulfinyl, Sulfonyl, Amino und -NR¹R² wobei R¹ und R² unabhängig Wasserstoff, C₁-C₄ Alkyl, C₃-C₈ Cycloalkyl, C₆-C₁₄ Aryl oder Carbonyl, sind.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird der Spacer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus substituiertem oder unsubstituiertem -(CH₂)_n-, -((CH₂)_m-O-)_n- oder -O-((CH₂)_m-O)_n-, mit m = 1–4 und n = 1–30. In einer besonderen Ausführungsform ist der Spacer ein Molekül der Formel -O-((CH₂)_m-O-)_n- mit m = 2 und n = 2–5, vorzugsweise 3.
In einer Ausführungsform haben Interkalator, Spacer und erstes Linkermolekül zusammen die folgende Struktur:
Formel I
Dabei kann ein biotinylierter Marker über Avidin, Streptavidin oder Neutravidin (als zweites Linkermolekül) an den Biotinrest der Formel I gebunden werden, um ein Nachweiskonjugat zu erhalten. Der biotinylierte Marker kann dabei beispielsweise biotinylierte alkalische Phosphatase sein.
In einer weiteren Ausführungsform haben Interkalator, Spacer und erste Linkermoleküle zusammen die folgende Struktur:
Formel II
Dabei können biotinylierte Marker über Avidin, Streptavidin oder Neutravidin (als zweites Linkermolekül) an einen oder beide Biotinrest(e) der Formel II gebunden werden, um ein Nachweiskonjugat zu erhalten. Der biotinylierte Marker kann dabei beispielsweise biotinylierte alkalische Phosphatase sein.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis doppelsträngiger Nukleinsäure, das die erfindungsgemäßen Konjugate verwendet.
Ein solches Verfahren zum Nachweis eines Nukleinsäureanalyts kann die Schritte umfassen:

– Hybridisierung der Ziel-Nukleinsäure an eine Nukleinsäure-Fängersequenz, um eine doppelsträngige Nukleinsäure zu bilden;
– Inkubation der doppelsträngigen Nukleinsäure mit einem erfindungsgemäßen Konjugat, um einen Komplex aus doppelsträngiger Nukleinsäure und Konjugat zu bilden; und
– Nachweis des doppelsträngige Nukleinsäure:Konjugat-Komplexes.

„Nukleinsäureanalyt” oder „Ziel-Nukleinsäure” werden hierin austauschbar verwendet, um die nachzuweisende Nukleinsäure zu bezeichnen. Diese kann beispielsweise in einer Probe, wie z. B. einer biologischen Probe enthalten sein.
In einem solchen erfindungsgemäßen Verfahren kann die Nukleinsäure-Fängersequenz an einen festen Träger, beispielsweise die Oberfläche einer Elektrode, gebunden sein. Diese Oberfläche kann insbesondere eine Metalloberfläche, wie z. B. eine Goldoberfläche sein. Dabei kann die Bindung der Nukleinsäurefängersequenz über gut bekannte Verfahren erfolgen. In einem solchen Verfahren wird die Nukleinsäure-Fängersequenz mit einer oder mehreren Thiolgruppen (-SH) modifiziert, die die Chemisorption an den festen Träger, beispielsweise einer Goldoberfläche, erlauben.
Um die unspezifische Adsorption der Ziel-Nukleinsäure und/oder des Konjugats an den festen Träger zu verhindern, kann der feste Träger mit der daran gebundenen Nukleinsäure-Fängersequenz vor der Inkubation mit der Ziel-Nukleinsäure oder dem Nachweiskonjugat mit einem Alkylthiol, wie z. B. Mercaptohexanol, inkubiert werden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann vor jedem der oben genannten Schritte ein zusätzlicher Waschschritt durchgeführt werden, um beispielsweise ungebundene Fänger- oder Ziel-Nukleinsäuren oder ungebundenes Nachweiskonjugat vor dem eigentlichen Nachweisschritt zu entfernen. Um unspezifische Wechselwirkungen zu vermeiden, können diese Waschschritte auch unter Bedingungen erhöhter Stringenz, d. h. bei erhöhter Temperatur und/oder in Gegenwart von entsprechenden chemischen Agenzien, wie beispielsweise Harnstoff, Imidazol oder Lithiumsalzen, durchgeführt werden. Die Waschschritte können auch bei gleichzeitiger Behandlung mit Ultraschall durchgeführt werden.
Der Nachweis der Zielnukleinsäure erfolgt vorzugsweise mittels elektrochemischer oder spektroskopischer Verfahren, die als solche im Stand der Technik bekannt sind. Geeignete Verfahren sind z. B. elektrochemische Impedanzspektroskopie, cyclische Voltammetrie oder Amperometrie.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die Erfindung auch auf Kits, die Konjugate gemäß der Erfindung enthalten. Dabei können die Konjugatbestandteile in getrennten Behältern vorliegen. Beispielsweise können das Konjugat aus Interkalator, Spacer und erstem Linkermolekül sowie das Konjugat aus zweitem Linkermolekül und Marker in verschiedenen Behältern vorliegen, so dass das erfindungsgemäße Konjugat erst bei Verwendung gebildet wird.
Schließlich betrifft die Erfindung auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Konjugate oder Kits für den Nachweis doppelsträngiger Nukleinsäuren. Der Nachweis kann in einer Ausführungsform mittels des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens erfolgen.
Beispiele
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Die Erfindung ist allerdings nicht auf die Beispiele beschränkt.
Materialien und Reagenzien
DNA Oligonukleotide waren von FRIZ Biochem (Neuried) und hatten die folgenden Sequenzen: Fänger DNA (20-mer) (TCC ACT GAC ACA ATA GGC GT; SEQ ID NO: 1); komplementäre Ziel-DNA (5' ACG CCT ATT GTG TCA GTG GA; SEQ ID NO: 2); nicht-komplementäre Ziel-DNA (5' AGC AGT GAC AGT CAC AGT CT; SEQ ID NO: 3).
Für die Herstellung der Lösungen wurde dreifach destilliertes Wasser benutzt. Alle Chemikalien hatten analytische Qualität und wurden wie gekauft eingesetzt. Ethanol, NaH₂PO₄·2H₂O, K₃[Fe(CN)₆], K₄[Fe(CN)₆] waren von Riedel-de-Haën (Seelze), H₂SO₄, Na₂PO₄·2H₂O, NaCl, Dimethylformamid (DMF) waren von J. T. Baker (Deventer). 6-Mercapto-1-Hexanol (MCH) und Proflavin waren von Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim). TFP-PEG₃-Biotin war von Pierce.
Beispiel 1: Herstellung von Elektroden und Immobilisierung von ssDNA
Polykristalline Goldelektroden (2 mm Durchmesser; CH Instruments, Austin, USA) wurden mit feuchten Aluminiumoxidpasten mit Partikelgrößen von 0.3 μm und 0.05 μm (Leco, St. Josephs, USA) auf Polierfilzen (Heraeus, Wehrheim) poliert. Danach wurden die Elektroden mit dreifach destilliertem Wasser gespült und 10 min im Ultraschallbad behandelt, um adsorbierte Polierpaste zu entfernen. Eine zusätzliche Reinigung der frisch polierten Goldoberfläche erfolgte durch cyclische Voltammetrie in 0.5 M H₂SO₄ zwischen –0.3 V und +1.7 V vs. Ag/AgCl mit einer Spannungsvorschubgeschwindigkeit von 100 mV s^–1 bis reproduzierbare Voltammogramme erhalten wurden (ca. 20 Scans). Die Elektrode wurde vor der chemischen Modifikation der Oberfläche mit dreifach destilliertem Wasser gewaschen und in einem Argonstrom getrocknet.
Am 5' Ende Thiol-funktionalisierte ssDNA mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 (OH-SS-(CH₂)₃-TCC ACT GAC ACA ATA GGC GT) als Fängersequenz wurde auf der Oberfläche chemisorbiert. Dazu wurden 2 μL der Fänger-DNA (1 μM in 10 mM Phosphatpuffer; 20 mM NaCl, pH = 7.4) auf die gereinigte Goldoberfläche pipettiert und 2 h bei 36°C in Wasserdampf-gesättigter Atmosphäre inkubiert.
Dazu wurde die Elektrode mit einer zugeschmolzenen Pipettenspitze abgedeckt, um das Verdampfen der Lösung zu vermeiden. Die modifizierte Elektrodenoberfläche wurde mit 10 mM Phosphatpuffer; 20 mM NaCl (pH = 7.4) abgespült, um nur schwach adsorbierte Fänger-Oligonukleotide zu entfernen. Danach wurden 2 μL einer 10 μM 6-Mercapto-1-Hexanol (MCH) Lösung in Phosphatpuffer auf die Elektrodenoberfläche pipettiert und in analoger Weise für 2 h bei 36°C in Wasserdampf-gesättigter Atmosphäre inkubiert. Vor der Messung wurden die Elektroden für 10 s in 10 mM Phosphatpuffer, 20 mM NaCl, pH = 7.4 gespült.
Beispiel 2: Hybridisierung
Die Hybridisierung der immobilisierten ssDNA erfolgte durch Inkubation mit 2 μL einer Lösung, die 1 μM Ziel-DNA (SEQ ID NO: 2) in 10 mM Phosphatpuffer (20 mM NaCl, pH = 7.4) enthält, auf der ssDNA/MCH modifizierten Elektrodenoberfläche. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 36°C, wobei die Verdunstung mit Hilfe einer geschlossenen Pipettenspitze vermieden wurde. Nach der Hybridisierung wurde die Elektrode mit 10 mM Phosphatpuffer; 20 mM NaCl, pH 7.4, 10 s gewaschen, um nicht-hybridisierte Oligonukleotide und schwach adsorbierte Spezies zu entfernen.
Beispiel 3: Biotinylierung des Interkalators
Proflavin gehört zu der Verbindungsklasse der Acridine. Acridine waren die ersten Chromophore, deren nicht-kovalente Wechselwirkung mit DNA durch Interkalation intensiv untersucht wurde. Proflavin weist eine hohe Affinität gegenüber dsDNA auf und bindet bevorzugt an einem GC Basenpaar durch Interkalation des planaren Chromophors.
Proflavin (0.49 mg, 20 μmol) wurde mit TFP-PEG₃-Biotin (0.69 mg, 10 μmol) in getrocknetem DMF (5 mL) 4 Tage bei Raumtemperatur gerührt und dadurch mit PEG₃-Biotin modifiziert ( ).
In einem alternativen Biotinylierungsprotokoll wurden Proflavin (3,0 mg in 30 μl DMF: Wasser 2:1), TFP-PEG₃-Biotin (7,0 mg in 20 μl DMF) und Triethylamin (10 μl) gemischt und für eine Woche bei 4°C inkubiert um mit PEG₃-Biotin modifiziertes Proflavin zu erhalten.
Der Tetrafluorophenylester (TFP Ester) reagiert aufgrund der guten Abgangsgruppe leicht mit primären und sekundären Aminen bei pH-Werten von 7–9 unter Bildung einer stabilen Amidbindung.
Der Polyethylenglycol (PEG) Spacer verleiht dem Molekül gute Wasserlöslichkeit, die auf das biotinylierte Molekül übertragen wird. Darüber hinaus vermindert die lange und flexible Verbindung des in die dsDNA interkalierenden Teils des Moleküls mit der Biotinmarkierung mögliche sterische Hinderungen bei der späteren Bindung des Avidin-konjugierten Nachweismoleküls.
Beispiel 4: Interkalation
Eine Lösung des biotinylierten Proflavins in 10 mM Phosphatpuffer (20 mM NaCl, pH = 7.4) wurde auf die DNA-modifizierte Elektrodenoberfläche getropft und 30 min bei 36°C inkubiert. Danach wurde die Elektrode 10 s mit Puffer gewaschen, um nicht-gebundenen bzw. adsorbierten Interkalator zu entfernen.
Beispiel 5: Elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS)
Elektrochemische Impedanzspektroskopie wurde beim Gleichgewichtspotential des Redoxpaars K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆] (+210 mV vs. Ag/AgCl) bei äquimolarer Konzentration von jeweils 5 mM in Dreielektrodenkonfiguration mit einer Ag/AgCl/3 M KCl Referenzelektrode und einer Pt-Draht Gegenelektrode sowie der unmodifizierten bzw. modifizierten Goldelektrode als Arbeitselektrode durchgeführt. Elektrochemische Impedanzspektren wurden mithilfe eines Solartron 1250 Frequenzganganalysators in Kombination mit einem 1286 Potentiostat/Galvanostat (Solartron, Farnborough, UK) aufgenommen. Die Datenerfassung und Datenauswertung erfolgte mittels der Softwarepakete ZPlot und ZView (Solartron) sowie OriginPro8G (OriginLab, Northampton, USA). Ein konstantes Offsetpotential (+210 mV vs. Ag/AgCl) wurde an die Arbeitselektrode angelegt, das mit einer Wechselspannungsmodulation mit einer Amplitude von typischerweise 5 mV wird. Die Wechselspannungsfrequenz wird von 30 kHz bis 0.1 Hz gescannt mit 10 Messpunkten pro Dekade und logarithmischer Verteilung. Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die Detektion von DNA mittels elektrochemischer Impedanzspektroskopie (EIS) beruht auf der Abstoßung zwischen dem negativ geladenen Phosphatrückgrat der DNA und negativ geladenen frei-diffundierenden Redoxmediatoren (z. B. [Fe(CN)₆]^3-/4-), in deren Gegenwart die Faraday'sche Impedanz der modifizierten Elektrodenoberfläche aufgenommen wird. Eine Thiol-modifizierte Oligonukleotidfängersequenz mit einer spezifischen zur Ziel-DNA komplementären wird auf einer gereinigten polykristallinen Goldoberfläche chemisorbiert und bildet eine negativ geladene Phasengrenzfläche, die negativ geladenen Redoxspezies in der Lösung abstoßt ( ). Diese Abstoßung moduliert die Elektronentransferrate an der Grenzfläche Elektrode/Elektrolyt, was durch eine Erhöhung des Ladungstransferwiderstandes, R_ct, im EIS repräsentiert wird ( , ). Die Co-chemisorption eines kurzkettigen Thiols führt zur Bildung einer gemischten Thiol/Oligonukleotid Monoschicht, bei der der Raum zwischen den individuellen Oberflächen-gebundenen Oligonukleotidsträngen mit Thiolen ausgefüllt ist.
Die Coadsorption eines geeigneten kurzkettigen Thiols moduliert substantiell die Charakteristika der untersuchten Phasengrenzfläche sowie die Umgebung eines individuellen ssDNA Strangs. Die Auswahl der coadsorbierten Thiolspezies ist von großer Bedeutung, um unspezifische Adsorption möglichst weitgehend zurück zu drangen. Die Hybridisierung mit der Ziel-DNA führt zur Zunahme der negativen Ladungsakkumulation an der Phasengrenzfläche ( ), so dass seine höhere Barriere für die negative geladenen Redoxspezies in Lösung resultiert und so ein weiterer Anstieg des Ladungstransferwiderstandes mit EIS gemessen wird ( , ). Die Zugabe des Biotin-modifizierten Interkalators verringert den Ladungstransferwiderstand als Folge der strukturellen Implikationen der Bindung des Interkalators in der DNA sowie möglicherweise einer zumindest partiellen Kompensation negativer Ladungen am DNA-Rückgrat ( ). Die beobachteten Änderungen des Ladungstransferwiderstandes R_ct nach Zugabe des Interkalators ( , ) beweist eindeutig das Vorhandensein doppelsträngiger DNA. Die Inkubation der interkalierten dsDNA/MCH modifizierten Elektrode mit einem Konjugat aus Avidin und alkalischer Phosphatase ändert substantiell die Redoxreaktion des [Fe(CN)₆]^3-/4 und erhöht damit den Ladungstransferwiderstand R_ct im EIS ( ; ; ), da das Avidin-Enzym-Konjugat aufgrund seiner Größe eine weitere Diffusionsbarriere für die Redoxspezies in Lösung.
Um die Spezifität der vorgeschlagenen Interkalationsmethode für die Detektion von DNA-Hybridisierung nachzuweisen, wurde ein Kontrollexperiment unter Verwendung einer ssDNA/MCH modifizierten Goldoberfläche durchgeführt. Die mit einzelsträngiger DNA modifizierte Oberfläche sollte den Biotin-modifizierten Interkalator nicht bzw. lediglich unspezifisch binden. Eine ssDNA/MCH-modifizierte Elektrode wurde 30 min mit biotinyliertem Proflavin inkubiert. EIS Messungen belegen, dass keine Reaktion mit der einzelsträngigen DNA erfolgt. Der Ladungstransferwiderstand R_ct = 893 [Ω] für die ssDNA/MCH modizierte Elektrode und R_ct = 901 [Ω] nach Inkubation mit dem Biotin-modifizierten Proflavin ( ).
Beispiel 6: Chronoamperometrische Untersuchung der DNA Hybridisierung
Die DNA Hybridisierung wurde mittels der erfindungsgemäßen Konjugate unter Verstärkung mittels alkalischer Phosphatase nach Zugabe von p-APP elektrochemisch bestimmt ( ). Alkalische Phosphatase katalysiert die Hydrolyse des nicht elektrochemisch aktiven p-Aminophenylphosphat (p-APP) zum elektroaktiven p-Aminophenol (p-AP), das bei einem Potential von +300 mV vs Ag/AgCl weiter zum p-Quinonimin oxidiert werden kann ( ).
Die spezifische Markierung der durch Hybridisierung gebildeten dsDNA mittels komplementärer Biotin/Avidin Bindung unter Einführung eines Enzyms beweist auf der einen Seite unzweifelhaft die Bildung der dsDNA und erlaubt auf der anderen Seite die Amplifizierung, die schließlich die Detektion sehr geringer Mengen Oberflächen-gebundener Ziel-DNA ermöglicht. Durch die selektive Markierung von dsDNA infolge des Interkalationsprozesses mit Biotin und der folgenden Bindung des Avidin/Enzym-Konjugates werden nur solche Bereiche der Oberfläche mit Enzym modifiziert, die dsDNA tragen.
zeigt die amperometrische Antwort nach Zugabe von p-APP als Folge der biokatalytischen Aktivität der an die Sensoroberfläche gebundenen alkalischen Phosphatase: (–) interkalierte dsDNA/MCH modifizierte Au Elektrode; (o) ssDNA/MCH modifizierte Au Elektrode; sowie (Δ) nicht-interkalierte dsDNA/MCH modifizierte Au Elektrode als Maß für die unspezifische Adsorption der Avidin-konjugierten alkalischen Phosphatase nach Ultraschallbehandlung der modifizierten Au-Elektrode in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.4; 20 mM NaCl) für 5 min.
In wird klar, dass die Zugabe des Enzymsubstrates p-APP zu einem anodischen Strom führt, der die erfolgreiche Hybridisierung anzeigt. Der Strom nach Zugabe des Substrates ist damit proportional zur oberflächen-gebundenen Enzymaktivität und korreliert damit eindeutig mit dem Vorhandensein von oberflächen-gebundener dsDNA.
Wie erwartet zeigen sowohl die ssDNA/Thiol, die dsDNA/Thiol sowie die mit Interkalator inkubierte dsDNA/Thiol modifizierte Goldelektrode, die nicht mit dem Avidin/Enzymkonjugat in Kontakt war, keine elektrochemische Aktivität in dem untersuchten Potentialbereich (Ergebnisse nicht gezeigt).
Allerdings zeigen sowohl die ssDNA/Thiol (o) als auch die nicht mit Interkalator versetzte dsDNA/Thiol (Δ) modifizierte Elektrode nach 10 minütiger Inkubation mit dem Avidin/Enzym Konjugat einen geringen Oxidationsstrom als Nachweis einer unerwünschten unspezifischen Adsorption des Avidin/Enzym Konjugates. Die Behandlung der Messelektrode mit Ultraschall in Phosphatpuffer für einen Zeitraum von 5 min löst das Problem der unspezifischen Adsorption und erhöht das Signal-Rausch-Verhältnis.
Im Falle der dsDNS/Thiol modifizierten Elektrode nach Interaktion mit dem Interkalator und dann dem Avidin/Enzym Konjugat ist das Verhältnis des spezifischen zum unspezifischen Signal 30 zu 5. Allerdings wird selbst durch Ultraschallbehandlung unspezifisch adsorbiertes Enzym nicht vollständig entfernt.
Im Falle der ssDNA/Thiol modifizierten Elektrode ist die unerwünschte Adsorption des Avidin/Enzym Konjugates ca. 2fach stärker ist als im Falle der nicht-interkalierten dsDNA/Thiol modifizierten Elektrode. Damit kann angenommen werden, dass die unspezifische Adsorption des Avidin/Enzym Konjugates im Wesentlichen auf der Thiolschicht und nicht an der DNA erfolgt.
Avidin-konjugierte alkalische Phosphatase zeigt eine unspezifische Adsorption auf den modifizierten Elektroden. Es ist bekannt, dass Avidin infolge seines hohen pI von 10 eine hohe Tendenz zur Bindung an andere Moleküle durch ionische Wechselwirkungen aufweist, was eine verringerte Selektivität des Assays zur Folge hat. Eine mögliche Lösung für dieses Problem ist die Ultraschallbehandlung der Messelektrode oder der Ersatz von Avidin durch Streptavidin oder Neutravidin, die eine erheblich verringerte unspezifische Adsorption aufweisen. Hier wurde Avidin-konjugierte alkalische Phosphatase benutzt, um das Konzept der vorgestellten Methode nachzuweisen.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung finden sich in den folgenden Patentansprüchen. Sequenzliste SEQUENCE LISTING

Claims

Konjugat zum Nachweis doppelsträngiger Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass das Konjugat umfasst: (i) mindestens einen Interkalator, der ungeladen ist und spezifisch an doppelsträngige Nukleinsäure bindet; (ii) mindestens einen Spacer, der kovalent an den Interkalator gebunden ist; (iii) mindestens ein erstes Linkermolekül, das kovalent an den Spacer gebunden ist, wobei das erste Linkermolekül Biotin oder ein Biotinderivat ist; (iv) mindestens ein zweites Linkermolekül, das spezifisch an das erste Linkermolekül bindet, wobei das zweite Linkermolekül Avidin, Streptavidin, Neutravidin oder ein biotin-bindendes Fragment von Avidin, Streptavidin oder Neutravidin ist; und (v) mindestens einen nachweisbaren Marker, der an das zweite Linkermolekül gebunden ist und ein nachweisbares Signal erzeugt, wobei der Marker ein biotinylierter Marker ist.
Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Konjugat aus mindestens zwei Spacern, mindestens zwei ersten Linkermolekülen, mindestens zwei zweiten Linkermolekülen und/oder mindestens zwei Markern besteht, wobei die mindestens zwei Spacer, mindestens zwei ersten Linkermoleküle, mindestens zwei zweiten Linkermoleküle und/oder mindestens zwei Marker jeweils gleich oder unterschiedlich sind.
Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass (1) der Marker ein Enzym, eine redoxaktive, fluoreszierende oder chemolumineszente Verbindung ist; und/oder (2) der Interkalator ein Acridin ist, vorzugsweise Diaminoacridin (Proflavin) oder ein Derivat davon; und/oder (3) der Spacer eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, Alken-, Alkin-, Alkoxy-, oder Polyethylenglykolgruppe ist, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus substituiertem oder unsubstituiertem -(CH₂)_n-, -O-(CH₂)_m)_n- oder -O-((CH₂)_m-O)_n-, mit m = 1–4 und n = 1–30.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1–3, wobei Interkalator, Spacer und erste(s) Linkermolekül(e) zusammen eine der folgenden Strukturen besitzen:
Formel I
Formel II
Verfahren zum Nachweis eines Nukleinsäureanalyts, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (i) Hybridisierung der Ziel-Nukleinsäure an eine Nukleinsäure-Fängersequenz um eine doppelsträngige Nukleinsäure zu bilden; (ii) Inkubation der doppelsträngigen Nukleinsäure mit einem Konjugat nach einem der Ansprüche 1–4, um einen Komplex aus doppelsträngiger Nukleinsäure und Konjugat zu bilden; und (iii) Nachweis des doppelsträngige Nukleinsäure:Konjugat-Komplexes.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure-Fängersequenz an einen festen Träger gebunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass (1) die Nukleinsäure-Fängersequenz mit einer oder mehreren Thiolgruppen modifiziert ist, die die Chemisorption an den festen Träger erlauben; und/oder (2) das Verfahren ferner die Inkubation des festen Trägers und der daran gebundenen Nukleinsäure-Fängersequenz mit einem Alkylthiol umfasst, um die unspezifische Adsorption der Ziel-Nukleinsäure und/oder des Konjugats an den festen Träger zu verhindern.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5–7, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis durch ein elektrochemisches oder spektroskopisches Verfahren erfolgt.
Kit dadurch gekennzeichnet, dass der Kit ein Konjugat nach einem der Ansprüche 1–4 enthält.
Verwendung des Konjugats nach einem der Ansprüche 1–4 oder des Kits nach Anspruch 9 zum Nachweis doppelsträngiger Nukleinsäuren.