FR2687931A1 - Procedes d'electrophorese et d'optimisation d'electrophorese et appareil pour leur mise en óoeuvre. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne l'électrophorèse en veine liquide. Elle se rapporte à un appareil qui comprend un corps (12, 14, 16, 18, 32, 38) délimitant un volume sensiblement parallélépipédique, et un premier jeu d'électrodes (24, 26) placées sur les petits côtés délimités par les directions d'épaisseur et de longueur. Selon l'invention, l'appareil comporte un second jeu d'électrodes (44, 46) placées sur les côtés parallèles au plan contenant la largeur et la longueur, et assurant un couplage capacitif. Par exemple, ces électrodes (44, 46) portent une couche de passivation de téréphtalate de polyéthylène. Application à la préparation de substances d'origine biologique.

Description

La présente invention concerne un procédé d'électrophorèse en veine liquide, un procédé d'optimisation de la résolution de la séparation dans un tel procédé, ainsi qu'un appareil d'électrophorèse en veine liquide.

On utilise de très nombreux procédés d'électrophorèse, aussi bien pour l'analyse que pour la préparation de différentes substances. La préparation de substances par électrophorèse en quantités notables est essentiellement réalisée par électrophorèse en veine liquide. Ce procédé est mis en oeuvre dans un appareil qui comporte une chambre de séparation de forme parallélépipédique, suivant la longueur de laquelle circule le liquide traité alors qu'un champ électrique est appliqué dans la direction de la largeur de la chambre. Des électrodes sont disposées aux extrémités du volume délimitées par les directions de longueur et d'épaisseur. Comme l'épaisseur est très inférieure à la largeur, le champ électrique créé dans le liquide qui s'écoule suivant la longueur est relativement uniforme.

L'écoulement du liquide dans la chambre est laminaire. La matière à séparer est introduite à une extrémité longitudinale de la chambre, par un orifice d'injection, et un produit sépare intéressant au moins est en général récupéré par un orifice collecteur placé à l'autre extrémité de la chambre. Des dispositifs auxiliaires destinés à homogénéiser la température, à la réguler, à détecter et/ou visualiser les produits, etc. sont aussi utilisés en général.

Lors du fonctionnement d'un tel appareil, la matière à séparer est introduite par l'orifice d'injection et forme un filet qui est entraîné par le courant. En l'absence de tout phénomène perturbateur et pour un écoulement parfaitement laminaire et homogène, le produit initial se sépare en plusieurs filets contenant chacun des particules d'une mobilité électrophorétique déterminée.

En pratique, cette séparation est soumise à un certain nombre de phénomènes perturbateurs qui provoquent une distorsion de ces filets. Parmi ces phénomènes perturbateurs, on peut citer celui qui est dû au profil des vitesses du fluide dans la chambre (profil de Poiseuille), dans le cas de l'électrophorèse en continu. Un autre phénomène perturbateur est l'électroendosmose qui dépend du potentiel zéta de la paroi des faces de la chambre.

On sait déjà compenser convenablement les effets de ces phénomènes perturbateurs. Par exemple, on peut introduire le produit à séparer de manière intermittente. On peut aussi utiliser des parois mobiles ou des distorsions volontaires des lignes d'écoulement. Plus simplement, on peut réduire au minimum les distorsions dues au profil de
Poiseuille et à l'électroendosmose par introduction de la matière par un orifice dont la dimension, mesurée dans la direction de l'épaisseur, est faible par rapport à l'épaisseur de la chambre. On peut en outre utiliser un traitement particulier des surfaces de la chambre afin qu'elles possèdent un potentiel particulier.

Lorsque ces distorsions ont été compensées et permettent donc l'obtention d'une meilleure résolution, on se rend compte qu'il subsiste une distorsion dite en ellipse" de la matière introduite (on la désigne, dans la présent mémoire, par cette expression "en ellipse", bien que sa forme puisse parfois être plus complexe). Cette distorsion a été décrite par exemple par Rhodes et al., "Electrohydrodynamic Distorsion of Sample Streams in
Continuous Flow Electrophoresis", Journal of Colloid and
Interface Science, Vol. 129, n" 1, Avril 1989, pages 78 à 90. Cette perturbation, appelée "électrohydrodynamique", est attribuée à la différence de conductivité existant entre le produit à séparer et le milieu, mais elle ne dépend pas des propriétés électrocinétiques individuelles des particules contenues dans la matière à séparer.

Ce phénomène électrohydrodynamique est actuellement celui qui réduit le plus la résolution qui peut être obtenue au cours d'une séparation par électrophorèse en veine liquide, lorsque des précautions suffisantes ont été prises.

L'invention a pour objet la compensation du phénomène perturbateur électrohydrodynamique observé dans une électrophorèse en veine liquide. On a constaté selon l'invention que, lorsqu'un champ électrique uniforme ayant une composante alternative transversale, c'est-à-dire orientée dans la direction de l'épaisseur, était appliqué avec une amplitude et une fréquence convenables, la moyenne de cette composante alternative transversale étant pratiquement nulle, le phénomène perturbateur électrohydrodynamique décrit par Rhodes et al. pouvait être presque totalement supprimé.

On a déjà appliqué un champ électrique ayant une composante alternative transversale à un échantillon à séparer dans des procédés dits d'11électrophorèse pulsée sur gel". Ainsi, la demande internationale de brevet
WO 84/02001 décrit un procédé d'électrophorèse mettant en oeuvre des champs électriques transversaux alternatifs. Ces procédés ont pour effet de changer les mobilités de certaines des particules au moins que l'on veut séparer par rapport à leur mobilité en champ constant, dans une proportion qui dépend de la taille de ces particules. Cet effet n'existe qu'au sein d'un milieu gélifié, car il met en jeu une orientation des particules sous l'action conjointe du champ électrique et des forces de réaction du gel. Il ne se manifeste que lorsque la variation du champ électrique est suffisamment lente pour permettre un changement significatif d'orientation et/ou de position au cours d'une période.

Au contraire, les procédés selon l'invention ne modifient aucunement les mobilités des particules à séparer dont le déplacement moyen reste inchangé en présence ou en l'absence d'une composante transversale du champ électrique. La déformation hydrodynamique du milieu contenant les particules à séparer est si réduite qu'elle n' aurait pratiquement aucun effet sur un gel. En conséquence, les fréquences utilisées selon l'invention sont très supérieures à celles des procédés d'électrophorèse pulsée sur gel, et ne provoqueraient donc pas la différentiation selon la taille qui est l'objet des procédés connus. A l'inverse, les fréquences utilisées dans ces procédés connus ne conviennent pas aux procédés selon l'invention.

Ainsi, l'invention concerne un procédé d'électrophorèse en veine liquide, du type qui comprend la circulation d'un milieu liquide dans un volume, de préférence sensiblement parallélépipédique, ayant des dimensions d'épaisseur, de largeur et de longueur, la direction de circulation correspondant à la direction de la longueur dudit volume, l'application d'un champ électrique de séparation ayant une composante, dans la direction de la largeur, dont la moyenne n'est pas nulle, l'introduction dans ce volume, en amont dans le sens de circulation, d'un échantillon destiné à subir une séparation par électrophorèse par migration de constituants dans la direction de la largeur, et l'extraction d'une fraction du milieu liquide ayant subi la séparation ; selon l'invention, l'application du champ électrique de séparation est réalisée avec un champ qui possède aussi une composante alternative transversale, c'est-à-dire orientée dans la direction de l'épaisseur, dont la moyenne est pratiquement nulle.

De préférence, le procédé comporte en outre une étape préalable de détermination d'au moins un paramètre de la composante alternative transversale. Dans un mode de réalisation, l'étape de détermination comprend la détermination de l'amplitude de la composante alternative afin qu'elle soit de l'ordre de la racine carrée de l'amplitude de la composante dans la direction de la largeur. Dans un autre mode de réalisation, l'étape de détermination du paramètre comprend la lecture d'au moins une valeur du paramètre de la composante alternative transversale sur un abaque ou un tableau. Dans un autre mode de réalisation plus élaboré, l'étape de détermination comprend la mesure expérimentale préalable de la variation d'une propriété au moins de la fraction obtenue par extraction en fonction de la variation d'au moins un paramètre de la composante alternative transversale.

De préférence, le paramètre de la composante alternative transversale est l'amplitude de cette composante. En outre, cette étape peut avantageusement comprendre la détermination d'un paramètre supplémentaire qui est la fréquence de la composante alternative transversale.

L'invention concerne aussi un procédé d'optimisation d'un procédé d'électrophorèse en veine liquide du type décrit dans les précédents paragraphes, qui comprend l'exécution d'une série d'opérations préliminaires d'électrophorèse telles que, à chaque opération, le champ électrique appliqué comporte, en plus d'une composante dans la direction de la largeur, une composante alternative transversale, c'est-à-dire orientée dans la direction de l'épaisseur, dont la moyenne est pratiquement nulle, d'amplitude déterminée et ayant une fréquence déterminée, et une propriété voulue au moins d'une fraction obtenue à chaque opération est déterminée, les opérations d'électrophorèse préliminaires de la série différant les unes des autres par l'amplitude de la composante alternative transversale du champ appliqué ; le procédé d'optimisation comprend en outre la détermination, à partir des résultats des opérations préliminaires, de l'amplitude de la composante alternative transversale du champ électrique pour laquelle la propriété voulue au moins de la fraction obtenue est optimale.

I1 est aussi avantageux que ce procédé comprenne en outre l'exécution répétée des différentes étapes du procédé pour diverses valeurs de la fréquence de la composante alternative transversale, afin que la valeur de la fréquence pour laquelle la propriété voulue au moins de la fraction obtenue est optimale soit déterminée.

L'invention concerne aussi un appareil d'électrophorèse en veine liquide, du type qui comprend un corps délimitant un volume, de préférence sensiblement parallélépipédique, ayant, dans la direction de l'épaisseur, une dimension très inférieure à ses dimensions dans les directions de longueur et de largeur, ledit volume étant ouvert à ses extrémités longitudinales afin qu'un fluide puisse circuler dans la direction de la longueur du volume, et un premier jeu d'électrodes placées sur les petits côtés délimités par les directions d'épaisseur et de longueur ou à proximité de ces petits côtés ; selon l'invention, l'appareil comporte un second jeu d'électrodes placées sur les côtés parallèles au plan contenant la largeur et la longueur, ce deuxième jeu d'électrodes étant destiné à assurer un couplage capacitif en courant alternatif entre un générateur externe de courant alternatif et le liquide placé dans ledit volume.

Dans un premier mode de réalisation, le couplage capacitif est obtenu par utilisation d'un jeu d'électrodes comprenant deux électrodes de grande étendue, placées de part et d'autre dudit volume et séparées chacune de ce volume par un mince film diélectrique l'isolant du milieu liquide. De préférence, le diélectrique est un polymère choisi parmi les polyimides, les polysulfones, et le téréphtalate de polyéthylène.

Dans un second mode de réalisation, le couplage capacitif est obtenu par utilisation, comme second jeu d'électrodes, de deux ensembles d'électrodes formés chacun de plusieurs éléments d'électrode qui sont sensiblement parallèles et allongés dans la direction de la longueur du corps, les éléments d'électrode étant destinés à être directement au contact du milieu liquide placé dans ledit volume du corps et étant couplés individuellement par des condensateurs à un générateur de courant alternatif.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront mieux de la description qui va suivre, faite en référence aux dessins annexés sur lesquels
la figure 1 est une vue schématique en perspective et en partie sous forme de diagramme synoptique d'un appareil d'électrophorèse dans un mode de réalisation de l'invention ;
la figure 2 est une coupe transversale de l'appareil de la figure 1 ; et
la figure 3 est un schéma d'un autre mode de réalisation d'appareil d'électrophorèse selon l'invention.

Les figures 1 et 2 représentent un exemple d'appareil qui peut être utilisé pour la mise en oeuvre du procédé d'électrophorèse selon l'invention. L'appareil 10 comporte des faces avant 12, 14, par exemple formées de verre, de polycarbonate, etc., avantageusement sous forme transparente ou semi-transparente de manière qu'on puisse observer la séparation des différents constituants de la matière à séparer lorsqu'ils sont colorés ou visibles d'une autre manière. Ces parois de grande étendue sont disposées verticalement sur la figure 1, la longueur étant orientée en direction verticale, la largeur en direction horizontale dans le plan de la figure alors que la direction de l'épaisseur est sensiblement perpendiculaire au plan de la figure. Il faut noter que l'épaisseur a été exagérée sur les figures 1 et 2 et qu'elle est en général bien plus petite que la longueur et la largeur. Dans un exemple, la longueur est égale à 20 cm, la largeur à 5 cm, et l'épaisseur à 3 mm. I1 faut cependant noter que la largeur peut être supérieure à la longueur, ce dernier terme étant ainsi utilisé parce qu'il correspond à la direction longitudinale de courant de fluide.

La chambre d'électrophorèse est délimitée par des petits côtés verticaux 16, 18, délimités dans les directions de longueur et d'épaisseur, et qui retiennent le liquide. Des membranes 20, 22, parallèles aux petits côtés 16, 18, sont destinées à délimiter des chambres dans lesquelles sont placées des électrodes 24, 26, par exemple des fils métalliques. Le volume délimité entre les côtés et les membranes contient un liquide sensiblement identique à celui qui est placé à l'intérieur de la chambre, mais qui est séparé de la chambre par des membranes qui sont perméables aux ions, afin qu'un contact électrique et ionique soit établi entre les électrodes et la chambre, mais que les produits d'électrolyse qui pourraient se former aux électrodes ne puissent pas pénétrer dans la chambre. Les électrodes 24 et 26 sont reliées par des fils 28 et 30 à un générateur 29 qui, dans le mode de réalisation représenté sur la figure 2, est une simple alimentation en courant continu, qui est destinée à créer, avec les électrodes 24 et 26, une composante du champ électrique d'électrophorèse orientée dans la direction de la largeur de la chambre et dont la moyenne est non nulle.

La partie inférieure de la chambre est délimitée par une paroi 32 d'extrémité. Celle-ci a plusieurs buses 34, 36, de préférence de forme circulaire, qui permettent l'introduction d'un fluide à travers la paroi 32. Ces buses peuvent être identiques, mais on les a désignées par des références différentes afin de distinguer les buses 34 utilisées pour l'introduction du liquide qui constitue le fluide porteur, de la buse 36 utilisée pour l'introduction de la matière à séparer. La partie supérieure de la chambre est fermée par une paroi supérieure 38 qui comporte aussi des buses 40, 42. Les buses 40 permettent la sortie du liquide porteur pratiquement dépourvu des constituants de la matière à séparer, et les buses 42 collectent des filets de constituants de la matière introduite par la buse 36.

Ces affectations des buses ne constituent qu'un exemple de mise en oeuvre, car les hommes du métier connaissent de nombreux dispositifs d'introduction et de récupération du liquide et de la matière à séparer.

L'appareil décrit jusqu'à présent est tout à fait classique. Son utilisation permet une séparation, mais la résolution de la séparation des constituants est perturbée par le phénomène électrodynamique précité. Plus précisément, lorsque le champ électrique appliqué est orienté dans la direction de la largeur, qu'il soit sous forme continue ou pulsée, le filet formé par un constituant de la matière à séparer, au lieu de garder la même section sur toute sa longueur, se déforme en ellipse (ou avec une configuration plus complexe) et son étendue augmente dans le sens de la largeur. Ce phénomène est décrit plus en détail dans la suite, en référence aux procédés selon l'invention.

L'appareil est perfectionné selon l'invention par addition d'électrodes supplémentaires 44, 46. Comme l'indiquent les figures 1 et 2, ces électrodes 44, 46 sont placées aux faces internes des grandes parois 12, 14 de la cellule. Par exemple, les électrodes 44, 46 sont formées d'une mince couche d'or, d'oxyde d'étain et d'indium, de platine, d'aluminium, etc., formée par un procédé connu des hommes du métier. Pour les raisons indiquées précédemment, ces électrodes sont de préférence transparentes ou semitransparentes. Afin qu'elles ne mettent pas en courtcircuit les électrodes 24, 26 qui créent une composante du champ électrique suivant la largeur, elles sont recouvertes d'une mince couche diélectrique de passivation, formée par un procédé connu des hommes du métier, par exemple à la tournette, par évaporation sous vide ou par application d'un film. La couche diélectrique de passivation peut être notamment formée d'un film de téréphtalate de polyéthylène, de polyimide, de polysulfone, d'oxyde de titane ou d'oxyde de silicium. L'épaisseur optimale de cette couche dépend des paramètres électriques de l'appareil et du liquide et elle peut être comprise entre 0,1 et 20 pm. Dans une variante très avantageuse, l'ensemble constitué par l'électrode et son film de passivation est préparé au préalable sous forme d'un film polymère, par exemple de têréphtalate de polyéthylène, ayant une épaisseur uniforme et métallisé sur une face, par exemple par de l'or ou de l'aluminium. Le film est appliqué à la face interne des grandes parois de sorte que le polymère est tourné vers le liquide.

Les électrodes 44 et 46 sont reliées par des fils 48 et 50 à un générateur de courant alternatif 56. I1 faut noter que l'alimentation en courant continu et le générateur de courant alternatif doivent être découplés afin d'être flottants l'un par rapport à l'autre. En outre, il est préférable que le générateur de courant alternatif assure un accord de phase entre le courant et la tension afin que la surtension de la couche diélectrique soit réduite. Ces caractéristiques sont bien connues de l'homme du métier et on ne les décrit donc pas plus en détail.

On n'a pas représenté de circuit de refroidissement, de régulation de température, etc. Bien entendu, de tels dispositifs sont utilisés le cas échéant, mais comme leur utilisation est bien connue et comme ils compliqueraient la représentation des figures, on ne les a pas représentés.

L'homme du métier sait lorsqu'il doit utiliser de tels perfectionnements de la technique antérieure.

On considère maintenant l'utilisation de l'appareil qu'on vient de décrire. Comme indiqué précédemment, lors d'une séparation, le filet formé par un constituant, par exemple entre les buses 36 et 42, présente un certain nombre de distorsions. On peut citer d'abord une distorsion "en croissant" qui est due au profil de vitesses ou profil de Poiseuille dans l'épaisseur de la cellule, ainsi qu'à l'électroendosmose éventuelle le long des parois. D'autres distorsions sont dues aux gradients thermiques et de densité. On a indiqué que les procédés connus permettaient la compensation de ces effets, et on ne les décrit donc pas plus en détail dans le présent mémoire.

Enfin, il existe un autre phénomène perturbateur qui n'a pas été corrigé jusqu'à présent. Cet effet perturbateur est l'effet électrohydrodynamique décrit par Rhodes et al.

dans le document précité. En effet, quand la conductivité et/ou la polarisabilité du filet formé diffèrent de celles du milieu environnant, une distorsion en ellipse du filet (ou plus complexe) apparat et est d'autant plus importante que le champ est intense.

On peut envisager de réduire l'acuité de ce phénomène perturbateur électrohydrodynamique par réduction du champ électrique ou de la concentration de la matière à séparer ; cependant, ces mesures réduisent le pouvoir séparateur ou le rendement. Il faut noter que ce phénomène perturbateur est celui qui limite actuellement le plus le rendement de l'électrophorèse en veine liquide utilisée comme procédé préparatif.

L'invention permet la suppression ou une diminution importante de ce phénomène perturbateur.

Rhodes et al. ont représenté ce phénomène perturbateur par une équation donnant la vitesse radiale u(e) par rapport au centre du filet, dans un plan perpendiculaire à la longueur de la cellule, sous la forme
u(e) = [(4/3)aEo2KEDcos2#]/(16#( e+ i)(R+1)2] a étant le rayon du filet, E0 l'amplitude d'un champ constant appliqué, K E et K1 les constantes diélectriques du milieu et du filet, pe et pi les viscosités du milieu et du filet, R le rapport a./ae des conductivités du filet et du milieu, D la valeur R2+R+1-3S et S le rapport KI/KE.

Ces auteurs ont obtenu ce résultat moyennant quelques hypothèses, qui sont les suivantes : la tension superficielle entre le filet et le milieu est négligeable, la diffusion est négligeable, et la vitesse est uniforme suivant la longueur de la cellule. On note que cette relation est indépendante de la fréquence.

Bien que l'invention ne soit nullement limitée par l'interprétation théorique qui suit, celle-ci peut être utile pour l'évaluation de l'action de certains paramètres.

Selon l'invention, on superpose au champ E0 d'électrophorèse, utilisé en l'absence de composante transversale, une composante transversale oscillante dont la moyenne est nulle. Une composante particulièrement simple peut être représentée par la relation
Ey(t) = pE0Reexp(iwt)i dans laquelle p est un coefficient de proportionnalité.

On utilise alors deux hypothèses supplémentaires d'une part la variation de la constante électrique et de la polarisation de la surface en fonction de la fréquence est négligeable, et d'autre part la pulsation X est suffisamment élevée pour que le filet n'ait pas le temps de se déformer de façon significative pendant une seule période, c'est-à-dire que la fréquence doit être suffisamment élevée. On peut alors montrer que la répartition des vitesses u'(0,ss) est donnée par une relation de la forme
u' (e,p) = u(o)(l-ss2/2)
Cette relation suggère que la composante transversale n'introduit pas de nouvelle distorsion du filet et modifie simplement l'amplitude de la distorsion due au champ constant. D'après la dernière relation, lorsque le paramètre ss est égal à , l'effet électrohydrodynamique est supprimé. Ce résultat ne dépend pas de la valeur de la conductivité, et il est donc le même pour tous les constituants du produit à séparer.

L'exemple précédent d'une forme sinusoïdale donnant une valeur égale à la racine carrée de deux est particulièrement démonstratif, mais d'autres types d'évolution temporelle de la composante transversale du champ électrique peuvent aussi être utilisés, dès lors qu'ils sont alternatifs, de moyenne nulle et de fréquence suffisamment élevée.

Ces déductions théoriques, obtenues dans le cadre de certaines hypothèses, suggèrent qu'il existe une composante transversale ayant des valeurs de ses paramètres (amplitude, et accessoirement fréquence) qui permettent pratiquement la correction de la perturbation électrohydrodynamique.

L'invention met en oeuvre cette propriété de trois manières différentes. Dans un premier procédé, l'électrophorèse en veine liquide est exécutée avec application d'une composante transversale dont l'amplitude est égale à la racine carrée de l'amplitude du champ constant utilisé pour la séparation en l'absence de composante transversale, avec une fréquence suffisamment élevée. Ce procédé convient à une électrophorèse dont les conditions correspondent bien aux hypothèses simplificatrices énoncées précédemment.

Dans un second procédé plus élaboré, un paramètre au moins (amplitude, fréquence) de la composante transversale est déterminé par lecture sur un abaque qui indique la valeur du paramètre en fonction des conditions de la séparation. Ce procédé convient surtout aux cas qui ne correspondent pas parfaitement aux hypothèses énoncées précédemment. Dans ces cas particuliers, il est possible que le rapport des amplitudes des composantes transversale et continue ne doive pas être exactement égal à . Les résultats obtenus antérieurement ou par mise en oeuvre du troisième procédé considéré dans la suite sont portés sur un abaque qui est utilisé chaque fois que de nouvelles conditions de séparation doivent être utilisées. Bien entendu, l'abaque peut être remplacé par un tableau ou par l'utilisation du résultat d'une formule mathématique, éventuellement calculé sur un ordinateur.

Dans un troisième procédé très élaboré, la valeur de l'amplitude de la composante transversale, éventuellement à plusieurs fréquences, est déterminée au cours d'une série d'électrophorèses dans lesquelles la distorsion (observée optiquement, au microscope, ou obtenue par analyse, par tout procédé physique ou chimique approprié, d'une fraction séparée au moins) est mesurée en fonction de l'amplitude de cette composante transversale. A chaque fréquence utilisée, on obtient une courbe dont un extremum indique la valeur optimale de l'amplitude.

Dans le cas d'une électrophorèse occasionnelle, on peut se limiter à la détermination de l'amplitude de la composante transversale à une valeur égale à la racine carrée de celle de la composante continue d'électrophorèse.

Au contraire, dans le cas d'électrophorèses industrielles, il conviendra d'utiliser le dernier procédé dans lequel la courbe de résolution est déterminée en fonction des différentes amplitudes de la composante transversale, à une fréquence suffisamment élevée ou même à plusieurs fréquences, afin que la compensation optimale puisse être obtenue.

L'appareil représenté sur les figures 1 et 2 peut être utilisé dans le cadre de l'invention parce que les fréquences utilisées sont relativement élevées, si bien que la mince couche diélectrique de passivation placée sur les électrodes des grandes faces, par exemple formée de téréphtalate de polyéthylène, de polysulfone, de polyimide, assure l'isolement en courant continu mais le couplage en courant alternatif. L'invention peut aussi être mise en oeuvre avec un appareil dans lequel l'isolement en courant continu et le couplage en courant alternatif sont obtenus non par utilisation d'une couche de passivation placée sur les électrodes des grandes faces, mais par division de ces électrodes, chaque élément d'électrode étant allongé dans la direction de la longueur de la chambre. Un tel appareil est schématiquement représenté sur la figure 3. Dans ce cas, on note que les parois des grandes faces, qui portent les références 12 et 14 sur la figure 1, sont remplacées par des parois 60, 62 qui portent chacune des éléments d'électrode sous forme de bandes allongées 64 qui sont directement au contact de la phase liquide. Les dimensions des éléments d'électrode dans les directions de la largeur et de l'épaisseur sont suffisamment réduites pour ne pas perturber l'uniformité du champ électrique. Chaque élément d'électrode est relié à l'alimentation 56 par l'intermédiaire d'un condensateur séparé 66 de couplage.

On connaît déjà, pour l'exécution d'électrophorèses sur gel, des cuves ayant des électrodes constituées d'éléments séparés. Cependant, comme ces cuves travaillent à très basse fréquence ou en courant continu, l'élément d'isolement n'est pas constitué par un condensateur, mais par une ou plusieurs diodes. Dans ces conditions, l'appareil représenté sur la figure 3 est lui-même original par rapport à la technique antérieure. On peut aussi effectuer, dans certains cas, des électrophorèses selon l'invention avec des éléments d'électrodes découplés par des diodes.

L'appareil des figures 1 et 2 est de préférence utilisé aux fréquences élevées, supérieures à 50 kHz, et l'appareil de la figure 3 est utilisé aux fréquences trop basses pour que l'appareil des figures 1 et 2 puisse être utilisé de manière satisfaisante.

On ne décrit pas plus en détail les générateurs de courant et autres éléments électriques car ils sont bien connus des hommes du métier.

On décrit maintenant un exemple de séparation réalisée avec une cellule selon l'invention et dont la résolution est limitée par l'effet électrohydrodynamique.

D'abord, une circulation stationnaire du liquide porteur est établie dans la chambre, par introduction du fluide porteur par les buses 34 de la paroi inférieure 32.

Ensuite, on injecte en continu la matière à séparer par la buse 36. On applique le potentiel déterminé comme optimal aux électrodes principales 20, 22. On sélectionne alors la buse ou les buses de sortie donnant les constituants cherchés. Lorsque le constituant séparé est coloré ou présente un phénomène optique d'une autre sorte, on peut déterminer optiquement si le filet présente un manque de

Bien qu'on ait utilisé l'expression "générateur de courant", il faut noter que le procédé et l'appareil selon l'invention peuvent être utilisés avec une régulation en courant ou en tension. La seconde possibilité est la plus fréquente, mais la première permet une meilleure maîtrise de la chaleur dégagée.

On a indiqué que les procédés selon l'invention étaient mis en oeuvre dans un liquide non gélifié. Le liquide peut cependant contenir un ou plusieurs polymères dissous qui présentent l'avantage de réduire les mouvements de convection et facilitent ainsi la formation d'un écoulement laminaire.

L'invention présente des avantages importants. En effet, pour une même composante continue de séparation par électrophorèse, la résolution est accrue. Cependant, il est aussi possible d'accroître l'amplitude de la composante continue d'électrophorèse pour obtenir un rendement plus élevé pour une même résolution. Bien entendu, il faut que l'augmentation de l'amplitude de la composante continue et la superposition de la composante alternative ne créent pas une quantité de chaleur élevée au point de perturber l'homogénéité thermique, car d'autres phénomènes perturbateurs apparaîtraient alors.

Parmi les applications industrielles de l'invention, utilisée seule ou en combinaison avec d'autres procédés, on peut citer la séparation et la purification de divers produits d'origine naturelle, tels que des protéines, des enzymes, des peptides, des polypeptides, des acides nucléiques, notamment 1'ADN et 1'ARN, des cellules d'organismes vivants ou des parties de cellules, en particulier des chromosomes, des médicaments ou des produits utilisés dans leur fabrication, et différents produits d'origine minérale ou synthétique tels que des macromolécules, des molécules ou des particules en suspension colloïdale.

Bien entendu, 1 invention a bien d'autres applications, et les indications qui précèdent ne sont que des exemples. En effet, 1 invention s'applique d'une part à tout procédé existant d'électrophorèse en veine liquide, dont elle permet une optimisation de la résolution.

Claims (10)

REVENDICATIONS

1. Procédé d'électrophorèse en veine liquide, du type qui comprend la circulation d'un milieu liquide dans un volume ayant des dimensions d'épaisseur, de largeur et de longueur, la direction de circulation correspondant à la direction de la longueur dudit volume, l'application d'un champ électrique de séparation ayant une composante, dans la direction de la largeur, dont la moyenne n'est pas nulle, l'introduction dans ce volume, en amont dans le sens de circulation, d'une matière destinée à subir une séparation par électrophorèse par migration de constituants au sein du liquide dans la direction de la largeur, et l'extraction d'une fraction de la matière ayant subi la séparation, caractérisé en ce que l'application du champ électrique de séparation est réalisée avec un champ qui possède aussi une composante alternative transversale, c'est-à-dire orientée dans la direction de l'épaisseur, dont la moyenne est pratiquement nulle.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape préalable de détermination d'au moins un paramètre de la composante alternative transversale du champ électrique.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'étape de détermination comprend la mesure expérimentale préalable de la variation d'une propriété au moins de la fraction obtenue par extraction en fonction de la variation d'au moins un paramètre de la composante alternative transversale du champ électrique.

4. Procédé selon l'une des revendications 2 et 3, caractérisé en ce que le paramètre de la composante alternative transversale du champ électrique est l'amplitude de cette composante.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que l'étape de détermination d'au moins un paramètre comprend la détermination d'un paramètre supplémentaire qui est la fréquence de la composante alternative transversale du champ électrique.

6. Procédé d'optimisation d'un procédé d'électrophorèse en veine liquide selon l'une quelconque des revendications précédentes, du type qui comprend l'exécution d'un série d'opérations préliminaires d'électrophorèse telles que, à chaque opération, le champ électrique appliqué comporte, en plus d'une composante dans la direction de la largeur, une composante alternative transversale, c'està-dire orientée dans la direction de l'épaisseur, dont la moyenne est pratiquement nulle, d'amplitude déterminée et ayant une fréquence déterminée, et la détermination d'une propriété voulue au moins d'une fraction obtenue à chaque opération, les opérations d'électrophorèse préliminaires de la série différant les unes des autres par l'amplitude de la composante alternative transversale du champ appliqué, le procédé d'optimisation étant caractérisé en ce qu'il comprend en outre la détermination, à partir des résultats des opérations préliminaires, de l'amplitude de la composante alternative transversale du champ électrique pour laquelle la propriété voulue au moins de la fraction obtenue est optimale.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'exécution répétée des différentes étapes du procédé pour diverses valeurs de la fréquence de la composante transversale pour la détermination de la valeur de la fréquence pour laquelle la propriété voulue au moins de la fraction obtenue est optimale.

8. Appareil d'électrophorèse en veine liquide, du type qui comprend

- un corps (12, 14, 16, 18, 32, 38) délimitant un volume ayant, dans la direction de l'épaisseur, une dimension très inférieure à ses dimensions dans les directions de longueur et de largeur, ledit volume étant ouvert à ses extrémités longitudinales afin qu'un fluide puisse circuler dans la direction de la longueur du volume, et

- un premier jeu d'électrodes (24, 26) placées sur les petits côtés délimités par les directions d'épaisseur et de longueur ou à proximité de ces petits côtés,

caractérisé en ce que l'appareil comporte un second jeu d'électrodes (44, 46) placées sur les côtés parallèles au plan contenant la largeur et la longueur, ce deuxième jeu d'électrodes étant destiné à assurer un couplage capacitif en courant alternatif entre un générateur externe de courant électrique alternatif et le liquide placé dans ledit volume.

9. Appareil selon la revendication 8, caractérisé en ce que le couplage capacitif est obtenu par utilisation d'un jeu d'électrodes comprenant deux électrodes (44, 46) de grande étendue, placées de part et d'autre dudit volume et séparées chacune de ce volume par un mince film diélectrique (52, 54).

10. Appareil selon la revendication 8, caractérisé en ce que le couplage capacitif est obtenu par utilisation, comme second jeu d'électrodes, de deux ensembles d'électrodes formés chacun de plusieurs éléments (64) d'électrode qui sont sensiblement parallèles et allongés dans la direction de la longueur du corps, les éléments d'électrode étant destinés à être directement au contact d'un liquide placé dans ledit volume du corps et étant couplés individuellement par des condensateurs (66).