CN2611383Y - 检测生物样品中dna的装置 - Google Patents

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Abstract

本实用新型描述了应用捕获探针和电子杂交检测生物样品中的靶DNA的装置。为具有更好的热力和物理性能，反应池是用氧化铝作为贴附表面而制成的。氧化铝表层是用抗地高辛抗体包被的，可为捕获探针提供更方便的贴附层，使其能正确定位，而捕获探针是用一种地高辛标记制成的，可通过抗地高辛/地高辛的连接贴附到元件的表面。

Description

检测生物样品中DNA的装置
技术领域
本实用新型涉及检测生物样品中DNA的装置和方法。本实用新型尤其涉及应用电子核酸杂交检测DNA序列的新装置，以及优化该装置操作的方法。
背景技术
电子核酸杂交是一项用于分析如血、血浆、尿等含DNA的生物样品的已知的技术。传统上，用于DNA检测的基片可由包括玻璃、硅晶和金属等多种材料的任一种来制备。在基片的表面上，应用现有技术制作多个电接触点。为检测生物样品中的某种特定的DNA序列，将含互补DNA片段的捕获探针贴附到基片上。如果生物样品中含靶DNA，靶DNA将通过杂交与互补DNA片段结合，并可使用各种成像技术对这种杂交以及样品中存在的靶DNA进行检测。可通过将电流引入到捕获探针上以加快杂交的过程，从而也加快检测的过程。这种基本的杂交技术已在如美国专利5849486中进行了描述。
在这种装置和技术中，要点是捕获探针与基片表面的结合，以及杂交发生后的成像与显影。对于后者，传统的检测方法是荧光法。但最近，Taton等(“Science”，289卷，8期，2000年9月，第1757-1760页)描述了应用链亲和素包被的金纳颗粒的检测方法。在这种技术中，金纳颗粒是用一种与靶DNA序列互补的寡核甘酸序列进行包被的。含这种包被的金纳颗粒的溶液在流过基片表面时，金颗粒将与可结合靶DNA的所有探针结合。金颗粒本身太小，无法进行检测，但基片表面可接着与含银离子的溶液孵育。银离子沉淀到金纳颗粒表面形成可见的银层，这种银层可用传统的成像设备检测。
关于捕获探针与基片表面的结合，一个难点是DNA寡核甘酸在基片表面(如硅晶片)的贴附，这是一个非常关键的步骤，而且对实验条件中的干扰高度敏感。特别是在电子杂交过程中应用电流时，可能产生电解作用并反过来影响随后的反应和检测。已知的例子有用琼脂糖凝胶包被基片表面，而用作捕获探针的DNA寡核苷酸的一端用生物素进行标记，并通过生物素与包被基片前溶解于琼脂糖中的链亲和素之间的高亲和作用将其包埋于琼脂糖层。
然而，应用琼脂糖存在几个问题。首先，溶化的琼脂糖凝胶很难操作以便保持对基片的均匀包被。另外，琼脂糖凝胶的密度与浓度必须精确控制。因此，制作具有合适的琼脂糖层的基片非常困难。进一步说，已使用的凝胶必须保持潮湿以防干燥和裂化，而且琼脂糖很不稳定，在高温时可降解，因此在包被琼脂糖层后，基片必须冷藏。琼脂糖层也非常脆弱，对机械压力很敏感，因此贮存和运输已制成的基片都很困难。在任何情况下，使用琼脂糖凝胶均不能克服电解造成的潜在问题。
实用新型内容
本实用新型提供一种用于检测生物样品中靶DNA的装置，包括至少由一个反应池制成的基底，其中所述的反应池包括一种用于贴附DNA捕获探针的氧化铝表层。
通过这种方式，可以解决或至少缓解现有技术中的某些问题，这是由于氧化铝可提供一种稳定的贴附表面，容易制备和操作，可便利随后对装置的操作和贮存，并且可克服或至少缓解由电解造成的问题。
氧化铝贴附表面可通过氧化以前形成的铝层而制备，或通过如喷镀的方法而直接制备。
将捕获探针贴附到氧化铝层的方法可增加制备的便利性。吸附到氧化铝的贴附层可实现这种功能。将捕获探针正确定位到贴附层上也非常重要。一种蛋白质可执行这两种功能。优选地，这种蛋白质可以是一种用来标记DNA捕获探针的蛋白质的抗体，这样捕获探针可通过抗体-蛋白质的配对连接以确定的方向连接到贴附表面。当然，也可以用任意一种蛋白质包被表面，而捕获探针可以用与第一蛋白有高亲和力的蛋白质进行标记，例如链亲和素和/或生物素。
为降低背景信号，贴附表面可以用例如白蛋白、鲑精DNA、匪科尔(FICOLL)或其它蛋白质等试剂进行包被。
从另一方面看，本实用新型包括一种检测生物样品中的靶DNA的试剂盒，所述的试剂盒包括：
(a)一种包括至少一个反应池的基底，所述的至少一个反应池具有一种氧化铝表层。
(b)包含捕获探针的第一试剂，该试剂包括一个所述的靶DNA的互补DNA片段，
(c)一种接受所述样品的缓冲溶液，
(d)包含检测探针的第二试剂，该试剂包括一个所述的靶DNA的互补DNA片段，
(e)一种链亲和素包被的金纳颗粒溶液，和一种含银离子的溶液。
从另一方面看，本实用新型也延括到用于检测样品中的靶DNA的一种DNA基片，该样品包含一种有氧化铝表层的底物，和一种贴附到所述的氧化铝表层的DNA捕获探针。
另一个方面，本实用新型也公开了一种检测生物样品中的靶DNA的方法，其包括的步骤为：
(a)提供以氧化铝表层制成的一个反应池，
(b)用第一蛋白质包被所述的表面以便于贴附于捕获探针的第二蛋白质的结合，使所述的捕获探针正确地定位，
(c)向所述的池中加入一种溶液，该溶液包括由所述靶DNA的互补DNA序列制成的捕获探针，该探针是用与所述的第一蛋白质有高亲和力的第二蛋白质所标记的，
(d)将所述的样品加到所述的池中，
(e)向所述的池中加入一种溶液，该溶液含由所述靶DNA的互补DNA序列制成的靶DNA检测探针，
(f)加入到所述的池中是指在一个池中产生一种可检测的信号，池中的靶DNA已被所述的捕获探针所捕获，并由所述的检测探针所检测，以及
(g)检测所述的信号。
附图说明
现在将本实用新型的某些实施方案以实施例以及参考附图的方式进行描述，其中
图1是根据本实用新型的一个实施方案显示一种基片以及显示杂交和检测方案的示意图；
图2(a)至(d)显示实验获得的反应池，表明捕获探针的存在可保证检测到靶DNA；
图3(a)至(d)显示实验获得的反应池，显示在银沉淀形成之前靶DNA的存在是必需的；
图4(a)至(d)显示实验获得的反应池，显示银沉淀的密度随样品中靶DNA的浓度增加而增加；以及
图5显示实验获得的反应池，显示银沉淀的密度随捕获探针的浓度而变化。
具体实施方式
首先看图1，其显示的是根据本实用新型的一个实施方案的检测生物样品中DNA的一种新装置。基片包括第1层的硅晶层，其上覆盖铝作为第2层，在第2层上形成氧化铝作为第3层。第3层的氧化铝是将在以下进行描述的DNA探针的贴附表面。
第3层氧化铝可由铝层经氧化而形成，也可将氧化铝直接沉积于基片的表面上，而根本不需要铝层。下面将对这些可能性作更详尽的描述。
在第一种制作氧化铝层的方法中，允许在一种干净的、并暴露于氧气和水的铝表面上沉积铝。表面为铝层的二氧化硅基片首先用蒸馏水漂洗，浸于5％(w/v)的氢氧化钠溶液约30秒进行清洗，然后根据Sharma CP和Sunny MC“白蛋白吸附于氧化铝和聚氨基甲酸乙酯表面”Biomaterials，1990；11：255-257中所描述的技术用蒸馏水进行多次冲洗。然后将基片在烘箱中37℃加热过夜，用装水的容器来保持湿度。在这些条件下，氧化铝表层到氧化铝的厚度约为50。在这个方法的一种改良方法中，可以只是简单地将基片用蒸馏水进行清洗，然后在60℃加热48小时。
作为通过铝层的氧化来形成氧化铝的替代方法，可根据以下的喷镀条件，将氧化铝直接沉淀于硅晶上。
装置：      ARC-12M喷镀系统
RF电压：    120瓦
基础压力：  1.04×10-5托
操作压力：  5×10-3托
气流：      Ar/O2＝30.2/7.5sccm
转速：      8转/分
喷镀时间：  45分钟
最小厚度：  100
基片大小：  5毫米×5毫米
由氧化铝包被的基片可由传统的照相平版印刷技术制作。另外，无论使用那一种方法制备氧化铝层，在杂交前，需通过在室温时用1倍PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.4)反复吹打基片的表面来清洗包被的基片。在制作氧化铝层的替代方法中，优选喷镀法，这是由于研究显示这样可产生最低的背景信号。无论使用那一种方法制作铝层，其厚度至少为50。
将氧化铝作探针贴附表面的优选材料是由于与例如琼脂糖相比，它更便宜、稳定并更具耐受性。另外，氧化铝可在干燥和室温条件下保存。重要的是，氧化铝也可减少与电解作用相关的问题。另外，用琼脂糖制作控制层的操作非常困难，而氧化铝层的孔径和厚度很容易控制(例如通过改变喷镀条件或空气湿度)。氧化铝也很容易用传统的照相平版印刷技术制作。采用制作的氧化铝层的优越性在于它可以通过减少非特异性结合而降低背景信号，也可通过提高由检测器成像的区域和背景之间的对比度来降低背景信号。
回过来看图1，也示意了使用根据本实用新型的一个实施方案的装置和方法的基本杂交过程。特别地，在图1中贴附表面是在铝2上制成的氧化铝层3。一个循环的反应孔可通过将氧化硅沉淀到氧化铝贴附表面上而界定。在每一个反应孔内，捕获探针5贴附于氧化铝层。然而，捕获探针并不是直接贴附的，而是通过地高辛(DIG)6与抗地高辛抗体7的连接而形成的。特别地，抗地高辛抗体7是由氧化铝表层3所吸附的，而捕获探针5是由地高辛标记6而制成的，由此捕获探针5可通过抗地高辛抗体7与氧化铝贴附表层3连接。氧化铝表层有许多孔，具结合多种不同分子的能力。抗地高辛包被作为贴附层的功能，可确保所固定的DNA捕获探针正确地定位。如果不进行包被，检测探针(将在以下描述)有结合氧化铝表层的危险，并在检测靶DNA时造成干扰。另外，如果不进行包被，捕获探针有可能与氧化铝以不正确的方向进行结合。总之，抗地高辛/地高辛的联接可被任何一对类似的化合物所替换，如靶蛋白质及其抗体，或一对相互具高亲和力的蛋白质，或任何一对可相互作用的非蛋白质分子。也应该理解的是，抗体/蛋白质或蛋白/蛋白的连接可颠倒。例如，在这里描述的优选的实施方案中，作为反应限制性包被的抗地高辛和地高辛标记的捕获探针可颠倒。然而，从实用性讲，与将抗体贴附到捕获探针相比，更容易将如地高辛这类小分子贴附到捕获探针上。更值得一提的是，可通过加入一种末端氧基酸或醛族而直接将捕获探针贴附到氧化铝表层。
也应理解的是，捕获探针是由样品中需检测的靶DNA的互补DNA序列制成的。因此，当将样品加到捕获探针所贴附的基片表面时，如果存在靶DNA 8，靶DNA 8将通过已知的DNA杂交工艺与捕获探针5中的互补DNA序列结合。可优选地通过应用在本行业中已知的电流来加快杂交过程。
一旦将样品加到基片表面，接着要检测样品中已与捕获探针结合的任何靶DNA 8。为达到该目的，需加入一种含生物素化检测探针9的溶液。检测探针包括与靶DNA互补的DNA序列，因此可与先前被捕获探针所捕获的所有靶DNA结合。为确保捕获的靶DNA可肉眼检测，加入用链亲和素包被的金纳颗粒10，由于链亲和素和生物素的亲和性，金纳颗粒将贴附到检测探针上。金纳颗粒因本身非常小而不能被清楚地看到，但接着可加入一种含银离子的溶液，它将沉积到链亲和素包被的金纳颗粒表面上形成银层11，它作为黑色沉淀是可见的。
为降低背景信号，可优选地用鲑精DNA处理基片。作为鲑精DNA的替代物，可使用白蛋白或其它蛋白质，或匪科尔。
可通过进一步使用一种如硫代硫酸钠的固定液来增加银沉淀的可见度。接着可采用传统的成像设备和技术来检测反应池中由于样品中存在靶DNA而形成的黑色沉淀。
实施例
以下的实施例是一个检测样品中β-肌动蛋白的方案。杂交步骤是电助的，优选的是应用脉冲的脉冲杂交，尽管也可以采用持续电流。然而，脉冲杂交限制对基片的损害从而造成高信号。典型的样品DNA与捕获探针杂交的条件包括应用10秒钟脉冲(13毫安)，然后是3秒钟的暂停，重复8分钟(即48次脉冲)。检测探针与捕获的样品DNA的杂交，可采用相同的条件，但只用3分钟(即18次脉冲)。
1.用1倍的pH7.4的PBS(磷酸盐缓冲液)将抗地高辛抗体稀释100倍。
2.将50微升稀释的地高辛抗体加入到氧化铝包被的基片上，41℃孵育2小时。
3.弃去抗地高辛溶液，用80微升1倍的pH7.4的PBS将基片冲洗3次(每次冲洗时，用吸液管上下冲洗)。
4.将1微升10微摩尔地高辛标记的捕获探针和溶于50微升1倍PBS的0.2微克鲑精DNA加入到基片上，41℃孵育30分钟。鲑精DNA先加热到95℃变性形成单链，然后与地高辛标记的捕获探针混合。
5.弃去地高辛标记的捕获探针溶液和鲑精DNA溶液，用80微升1倍PBS洗3次，再用1倍SSPE洗1次。
6.加用1倍SSPE配制的5微升11微摩尔β-肌动蛋白序列(一种91个核苷酸单链靶序列)，采用8分钟描述过的脉冲电流。杂交后，基片用0.1倍SSPE洗3次。
7.加检测探针(1微升，10微摩尔)到基片上。采用3分钟描述过的脉冲电流。基片用0.1倍SSPE洗3次，用1倍PBS洗1次。
8.用pH7.4的1倍PBS将链亲和素包被的金纳颗粒(购自Sigma化学有限公司，St.Louis，Missouri，美国)稀释10倍。
9.将稀释的链亲和素包被的金纳颗粒加到基片表面，41℃孵育15分钟。
10.弃去链亲和素包被的金纳颗粒溶液，基片用80微升pH7.4的1倍PBS洗2次(每次冲洗时，用吸液管上下冲洗)，并用80微升高压灭菌的去离子水洗3次(每次冲洗时，用吸液管上下冲洗)。
11.使用前配制银增强液A和B的1∶1混合液(购自Sigma化学有限公司，St.Louis，Missouri，美国)，以下的步骤在暗室中操作。将50微升银增强液加到基片上，室温孵育5分钟。
12.弃去银增强液，基片用高压灭菌的去离子水洗1次，然后在基片上加50微升2％硫代硫酸钠。用移液管冲洗1次以去除背景并固定颜色。
13.孵育2分钟后弃去硫代硫酸钠溶液，用50微升去离子水冲洗，然后在基片上加50微升高压灭菌的去离子水。
14.用光学信号检测系统观察基片上暗点的外观。
实验结果
以下图2至图5所显示的实验结果是采用上述的杂交方案所得到的，其中某些参数的变化可从下述来理解。在所有的例子中，基本的DNA检测程序如下：氧化铝贴附层用来提供抗地高辛，地高辛标记的捕获探针含单链靶核酸的互补DNA片段，生物素标记检测探针用来结合捕获的靶序列，用银加强的链亲和素包被的金纳颗粒使靶DNA显色。
图2(a)-(d)显示了地高辛标记的捕获探针在检测靶DNA时的有效性。图2(a)-(c)均显示杂交前的基片。反应池是白色的，这是因为尚未形成银的沉淀。图2(b)和(d)显示杂交后的基片，此时在图2(b)有地高辛标记的捕获探针，而在图2(d)中没有。从反应池中可见，图2(b)较图2(d)暗，显示银的沉淀。
图3(b)-(d)显示发暗的银沉淀只存在于有靶DNA的反应池中。与图2相似，图3(a)和(c)显示杂交前的基片，而图3(b)和(d)显示杂交后的基片，其中图3(b)有靶DNA，而在图3(d)中没有。同样只在图3(b)有靶DNA的反应池中可见暗色的银沉淀。
图4(a)-(d)进一步通过显示随靶DNA浓度的增加银沉淀变暗，因此光学信号随靶DNA浓度按比例增加来证实本实用新型的有效性。图4(a)-(c)显示杂交后的基片，并用以下试剂检测(a)未稀释的靶DNA，(b)5倍稀释的靶DNA，和(c)10倍稀释的靶DNA。可观察到图4(a)的反应池较图4(b)暗，而图4(b)较图4(c)暗。相比较，图4(d)表示无靶DNA的基片，因此反应池为白色，无银沉淀。
最后，图5显示光学信号密度随地高辛捕获探针的浓度而变化。在图5中，地高辛捕获探针浓度的变化为从左到右降低，而反应池由于银沉淀减少而相应地变淡。

Claims (14)

1.检测生物样品中的靶DNA的装置，包括由至少一个反应池制成的基底，其特征在于：所述的反应池包含一层为贴附DNA捕获探针的氧化铝表层。
2.如权利要求1所述的装置，其特征在于：所述的氧化铝表层是通过铝层的氧化而制成的。
3.如权利要求1所述的装置，其特征在于：所述的氧化铝表层是通过一种喷镀技术而制成的。
4.如如权利要求1所述的装置，其特征在于：所述的氧化铝表层是用作为捕获探针贴附层的第一蛋白质所包被的。
5.如如权利要求4所述的装置，其特征在于：所述的装置进一步包括贴附于所述的氧化铝表层的捕获探针，其中所述的捕获探针是用可结合于所述的第一蛋白质的第二蛋白质所标记的。
6.如权利要求5所述的装置，其特征在于：所述的第一和第二蛋白质包含一对抗体/蛋白质。
7.如权利要求6所述的装置，其特征在于：所述的第一蛋白质包含抗地高辛抗体，且所述的第二蛋白质含地高辛。
8.如权利要求5所述的装置，其特征在于：所述的第一和第二蛋白质包含链亲和素和生物素，或是相反顺序。
9.如权利要求1所述的装置，其特征在于：所述的氧化铝表层是由作为捕获探针的贴附层的第一分子所包被的。
10.如权利要求9所述的装置，其特征在于：所述的装置进一步包括贴附于所述的氧化铝表层的捕获探针，且所述的捕获探针是由与所述的第一蛋白有亲和力的第二分子所标记的。
11.如权利要求1所述的装置，其特征在于：所述的氧化铝层的厚度至少为50。
12.如权利要求1所述的装置，其特征在于：所述的氧化铝表层是用一种在检测过程中可降低背景信号的试剂所包被的。
13.如权利要求12所述的装置，其特征在于：所述的试剂包含鲑精DNA。
14.如权利要求12所述的装置，其特征在于：所述的试剂包含白蛋白，或其它蛋白质，或匪科尔。
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