CN1300941A - 核酸探针及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种核酸探针,它包含与待检序列互补的检测序列和编码序列。本发明还提供了该探针的用途,它被用于核酸的检测,其步骤包括:本发明核酸探针与样品液相杂交;分离出参与杂交的核酸探针;混合分离出的核酸探针;分析所述的编码序列。本发明还提供了一种试剂盒,其中包括含本发明核酸探针的液相杂交探针溶液系列和本发明所述固相支持物上的识别探针阵列。
Description
本发明属于核酸检测领域。尤其是用于检测多样品多目标核酸的核酸探针及其用途。
目前生物样品中目标核酸片段的主要检测方法之一是核酸杂交反应，即互补的核苷酸序列通过碱基配对形成稳定的杂合双链分子的过程。核酸杂交反应可分为液相杂交和固相杂交两类。液相杂交中，目标核酸片段与探针在同一溶液相中进行杂交反应。固相杂交中，目标核酸片段(或探针)被固定(可以是疏水力结合、共价交联等)在固相支持物(可以是各种尼仑膜、硝酸纤维素膜、滤纸、经修饰的玻璃或硅片、云母片等等)上，然后与溶液相中的探针(或目标核酸片段)进行杂交反应。
目前，检测样品中的目标核酸片段主要采用固相杂交法：将可能含有目标核酸序列的样品固定在固相支持物的不同位置上，然后与液相中经单一标记的探针杂交，根据位置信息以及标记信息来判定样品中某目标核酸序列的存在情况；或者，将探针固定在固相支持物的不同位置上，然后与液相中经单一标记的样品杂交，根据位置信息以及标记信息来判定样品中目标核酸序列的存在情况。当存在大量样品，而且需检测的目标核酸片段种类很丰富时，往往需要针对每份样品重复固相杂交，使得检测步骤变得繁琐，固相杂交法的实施因而显现出很大的缺陷，难以做到多样品中多种目标核酸片段的同时分析。
为了在一次检测中获得更多的信息，《Analytical Biochemistry》1997年第253卷第156-161页所载《Seven-color time-resolved fluorescence hybridization analysis ofhuman papilloma virus types》一文报道了利用三种镧系元素的离子及其组合产生不同荧光信号来标记7种探针，杂交后可同时检测七种HPV核酸序列(基因型)。其中杂交信号的检测是采用时间分辨荧光检测方法。美国专利5858737则记载了利用不同化学发光试剂标记不同探针，杂交后形成的杂交体在检测时因发射波长不同的光而实现不同样品中多种目标核酸片段的同时检测。中国公告专利(公告号：1131440)记载了用适合于质谱法检测的多种报告集团来标记不同核酸序列的方法。
但上述方法都具有局限性：1、可用于探针标记的荧光试剂和化学发光试剂种类十分有限，一次分析可检测的不同序列种类数目少。2、标记试剂不易得到。3、对检测技术设备要求较高。
本发明的目的在于克服上述不足，提供实现同时检测多样品中多目标核酸片段的工具和方法。本发明提供了包括检测序列和编码序列的新的核酸探针；还提供了所述核酸探针的用途；以及包含所述核酸探针的试剂盒。
本发明目的是通过以下方案达到的。
本发明提供了一种新的核酸探针，它包含与待检序列互补的检测序列和编码序列。
本发明的编码序列是用来为各目标核酸片段编号的一段核酸序列。各种目标片段包括不同源样品中的同序列目标核酸片段和同源样品中的不同序列目标核酸片段等。上述各目标核酸片段均各自具有互不相同的唯一的编码序列。根据样品数量，每个样品中目标核酸片段的数目、序列，需要获取的信息类型，就可以确定所需的具体编码序列。本发明中，核酸探针的数目仅受固相支持物上探针容量的限制。此外，编码序列在选定的杂交条件下不应与样品中任何目标核酸片段形成有效杂交。本发明的编码序列是根据以上目的和要求预先设计并人工合成的。核酸序列的设计与合成是本领域的常规技术，本领域一般技术人员都能实施。或者，还可参见《分子克隆实验指南》第二版。
本发明的检测序列指与待检的各目标核酸片段互补的序列。所述的检测序列既可以分离自天然来源，也可以是化学合成的。所述的分离和化学合成方法都是本领域的常规技术，本领域一般技术人员都能实施。或者，还可参见《分子克隆实验指南》第二版。
本发明核酸探针的检测序列和编码序列之间还可选性地含有一段间隔序列，不同核酸探针中的间隔序列可以相同也可以不同。但是该序列在所选液相杂交条件下不能与样品中的任何目的核酸序列形成有效杂交，在后文所述的固相杂交条件下也不能与识别探针形成有效杂交。在现有技术的基础上，由于核苷酸排列组合的无穷性，选取或制备这样的间隔序列对本领域一般技术人员来说是不难做到的。
作为本发明实施方式之一，将检测序列、可选的间隔序列与选定编码序列连接即形成本发明的核酸探针。核酸探针的制备可以采用多种方法，如将不同来源的检测序列、可选的间隔序列、编码序列用DNA或RNA连接酶进行酶促连接然后纯化，或者，直接采用人工合成的方法等，这些均为本领域的公知技术。在本发明核酸探针种，编码序列既可以位于检测序列的上游也可以位于其下游。
本发明的核酸探针可用于检测样品中的目标核酸片段，尤其是多样品多核酸的检测。所述的检测过程包括：
本发明的核酸探针与样品液相杂交：
分离出参与杂交的核酸探针；
混合分离出的杂交探针；
分析核酸探针中的编码序列，所述的分析方法选自：质谱法、SPR法和固相杂交法等。
每份样品中可能含有多种目标核酸片段，选择数量相当的核酸探针，用水或适宜缓冲液溶解并混合，制成针对该样品的液相杂交探针溶液。如欲一次同时分析多份样品，则需要制备分别适应各样品的液相杂交探针溶液。
取适量样品，加入对应的液相杂交探针溶液，与杂交缓冲溶液混合成液相杂交体系。先高温变性，接着在适宜温度进行液相杂交，充分反应后分离发生了杂交的核酸探针。至于反应体积，液相杂交探针溶液的加量，各种缓冲液的组成与浓度，变性温度与时间，杂交温度与时间等，都是根据具体的检测序列来选择的。但是，基于现有技术，本领域一般技术人员凭经验很容易做出适宜的选择。或者，还可参见：卢圣东主编的《现代分子生物学试验技术》(1993，第一版)第5章和第6章；王申五主编的《基因诊断技术—非放射性操作手册》。
本领域已知有多种分离核酸的方法，它们均适用于本发明。其中之一是利用生物素和链亲和素的亲和作用，具体方法如下：事先用生物素标记目标核酸片段，然后进行前文所述的液相杂交。需要指出的是，如果液相杂交时核酸探针已经带有标记，则核酸探针所带标记此时就不能是生物素。将各被测样品的液相杂交反应液分别加入对应的用链亲和素包壁的微量离心管，在0-40℃，最好是在37℃左右，保温足够长的时间，如3至10分钟，使得只有杂交体通过生物素分子与链亲和素分子的亲和作用充分固定到管壁上。小心去除管中溶液，然后3倍体积诸如5×SSC的缓冲液清洗管壁三次。最后向管中加入适量纯水或预杂交缓冲液，在高于各自液相杂交条件下杂交体解链温度(Tm)10℃的温度下保温5分钟，以释放出游离的核酸探针。也可以用链亲和素包裹的微磁珠配合磁性分离器来代替链亲和素包壁的微量离心管实现上述目的。
另一种方法是利用抗原和抗体间的亲和作用。具体方法与生物素-链亲和素方法类似，所不同的是用具有抗原或半抗原活性的物质(如荧光素、地高辛等)代替生物素来标记目标核酸序列，用该抗原或半抗原物质的相应抗体代替链亲和素包裹微离心管或微磁珠。同样，如果液相杂交时核酸探针已经带有标记，则核酸探针所带标记此时就不能是用于标记目标核酸片段的抗原或半抗原。
还可以利用经典的羟基磷灰石柱层析对双链核酸和单链核酸阻留能力的差别来分离液相杂交体与未参与杂交的单链核酸分之。详细内容可参见《分子克隆实验指南》第二版。分离出的杂交体上的编码序列可用后文所述的各种方法来分析。
将来自各份样品的、分离出的核酸探针混合成统一的液相。
采用适当的方法分析参与杂交的核酸探针的编码序列，就可以获知各种目标核酸片段的存在情况。可用的分析方法例如：质谱法(参见：O＇Donnell M.J.,Tang K,等，Analytical Chemistry,1997,69:2438-2443),SPR法(参见：Threil,A.J等，AnalyticalChemistry,1997,69:4948-4956)，以及其它固相杂交法。其中较好的是如下所述的固相杂交方法，它包括：
制备识别探针，并固定在固相支持物上形成列阵；
标记所述核酸探针；
所述核酸探针与所述识别探针固相杂交；
检测所述标记的位置和/或强度。
本发明的识别探针是一段与编码序列互补的核酸序列。其制备方法与核酸探针相同。
为了简化过程，实现在统一的杂交系统中完成来自多份样品的多种核酸探针与各自识别探针的固相杂交，同时提高检测的准确性，识别探针与编码序列在选定的固相杂交条件下宜具有相同或相近的解链温度(Tm)。由于一定长度核酸序列中四种碱基的排列组合方式非常多，这使核酸探针的编码序列的设计有非常大的选择余地。因此不难做到通过调节编码序列的长度和设计GC含量相同或相近的编码序列，使所有识别探针与编码序列固相杂交时的Tm趋于一致。
为了进行本发明的分析，可用本领域已知的各种标记技术标记制备好的核酸探针。如果标记核酸探针，则标记可以在液相杂交之前进行，也可以在液相杂交之后进行。所述的标记包括同位素标记，以及荧光物质、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等非放射性物质标记。
将分离后获得的来自多份样品的参与杂交的各种核酸探针混合在一起，加至适量的预杂交缓冲液中，作为固相杂交缓冲液。将识别探针有序地固定在固相支持物上，在同一固相支持物上形成由大量专一识别对应编码序列的识别探针组成的阵列。
所述的固相支持物包括：硝酸纤维素膜，尼龙膜，阳离子修饰尼龙膜，各种修饰的玻片、硅片或金属片，以及其它能够固定合适的固相支持物。根据所选的固相支持物不同，识别探针的固定方法也不同。但这些都是本领域的公知技术。或者，可参见卢圣东主编的《现代分子生物学试验技术》第6章；各公司的膜产品说明书；Drisi,J.L.等，Science,1997，第278卷，p.680-686；Zhen,G.等，Nucleic AcidReseach,1994,22(24):5456-5465；Schena,M.等，Proceedings of the National Academy ofScience USA,1996,93:10614-10619。Pease,A.C.等,Proceedings of the National Academyof Science USA,1994,91:5022-5026；Thiel,A.J.等，Analytical Chemistry,1997,69:4948-4956。
固相杂交时，将该阵列与预杂交缓冲液进行预杂交，然后与固相杂交缓冲液进行一次的固相杂交操作。然后，根据核酸探针所带标记信号在固相支持物上的位置、强度等信息获取多份被测样品中的多种目标核酸片段有关序列、含量、来源等多项信息。
所述的固相杂交按照本领域的经典方法实施。根据具体的参与杂交的序列，本领域一般技术人员凭经验很容易确定有关缓冲液组成与浓度、探针和样品浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等最适条件。或者，也可参照：李德葆，徐平主编的《重组DNA的原理和方法》第九章第三节；卢圣东主编的《现代分子生物学实验技术》；王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》。
此外，本发明的核酸检测可以以试剂盒的形式进行。试剂盒中包括含本发明核酸探针的液相杂交探针溶液系列和本发明所述固相支持物上的识别探针阵列。
本发明核酸探针中用一段编码序代替传统标志来标记待测的目标核酸片段。由于一定长度核酸序列中四种碱基的排列组合具有广泛的多样性，这使得作为标志的这段编码序列的设计有非常大的选择余地，方便地实现了核酸探针的多样性，尤其是在统一固相杂交系统中实现针对不同样品的多种探针与其互补序列的杂交。这样，仅一次液相杂交和一次固相杂交，使用一种传统检测信号标记，就可以一次性检测多样品多目标核酸片段，同时获取核酸片段序列、来源、多态性，和含量等多方面信息。此外，本发明的试剂盒极大地方便了方法的使用者。因此，本发明推动杂交方法在多样品分析中的应用。
以下将结合附图对发明作进一步的详细描述。
附图1显示了本发明的一种实施方式，体现了本发明用核酸编码检测核酸的基本原理。图中TFnm代表第n(n=1,2,3,…)份样品中的第m(m=1,2,3,…)个目的核酸片段，Bio表示生物素分子或抗原、半抗原分子：CPnm代表针对TFnm的核酸探针，
表示标记物(可以是同位素标记，也可以是荧光素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等非放射性物质标记)；SI表示链亲和素或与Bio代表的抗原、半抗原物质具有亲和性的抗体；IPnm表示对应于CPnm的识别探针；SS表示固相支持物。①代表标记的核酸探针与生物素标记的目的核酸片段进行液相杂交的过程；②代表链亲和素分子通过亲和力将带有生物素标记的杂交体捕获的过程；③代表用缓冲液洗除未参与杂交的核酸探针的过程；④代表将捕获的杂交体变性释放出参与杂交的核酸探针的过程；⑤代表释放的核酸探针与固定在固相支持物上的识别探针阵列进行固相杂交的过程。
附图2是用该方法同时检测n个样品中m个目的核酸片段时，识别探针在固相支持物上排列方式之一的示意图。图中的每个黑点表示一种识别探针在固相支持物SS上的固定位置，IP、n、m的意义及取值范围同附图1。
附图3是本实施例的检测结果。图中1-4数字表示点在杂交膜上的识别探针分别为Y1C2,Y2C1,Y1C1,Y2C2。数字5表示阴性对照
以下实施例是对本发明更详细的说明，而不是对本发明范围的限定。
实施例一
两个样品中两种组分的同时分析
材料：
购自地高辛(DIG)．寡聚3′末端标记试剂盒 BOEHRINGER MANNHEIM IncBio-16-ddUTPmRNA捕捉试剂盒(包括链霉亲和素包被的PCR试管，洗涤缓冲液等)DIG核酸检测试剂盒(包括抗DIG-AP复合物，封闭剂NBT/BCIP贮备液等)Zeta-探针GT膜 BIO-RAD Laboratories Inc:Bio-点样仪(真空点样系统)
自配TE缓冲液： 10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0(20℃)20×SSC： 88.29/L枸橼酸钠，175.39/L氯化钠，
pH7.0(20℃)预杂交缓冲液： 7％SDS,0.5M Na2HPO4,pH7.2(20℃)洗膜缓冲液Ⅰ： 5％SDS,40mM Na2HPO4,pH7.2(20℃)洗膜缓冲液Ⅱ： 1％SDS,40mM Na2HPO4,pH7.2(20℃)显色缓冲液Ⅰ： 0.1M顺丁烯二酸，1M NaCl,pH7.5(20显色缓冲液Ⅱ： ℃)显色缓冲液Ⅲ： 含0.3％(w/v)Tween-20的显色缓冲液Ⅰ显色缓冲液Ⅳ： 含1％封闭剂的显色缓冲液Ⅰ
100mM Tris-HCl,100mM NaCl,50mM
MgCl2,pH9.5(20℃)1样品的制备：
取人工合成的10D(A260吸收单位)的18mer寡核苷酸C1(序列为：5’-atc cct aggctt aag gcg-3’)和10D的26mer寡核苷酸C2(序列为：5’-cgg gcc aatttg ccg ata atttgg gc-3’)，分别加280μl和195μl水溶解，然后取C1溶液5μl，C2溶液10μl混合均匀记为样1，取C1溶液10μl，C2溶液5μl混合均匀记为样2。2探针的设计：
按要求为每个样品中的每种组份设计如下探针：组分 核酸探针 识别探针样1中的C1: 5｀-ctt aag cct agg gac cgg tta tat caa g-3｀ 5｀-ctt gat ata acc gg-3｀(Y1C1)样1中的C2: 5｀-ccc aaa tta tcg gcc cgg ttt ata caa g-3｀ 5｀-ctt gta taa acc gg-3｀(Y1C2)样2中的C1: 5｀-ctt aag cct agg gac cgg tta att caa g-3｀ 5｀-ctt gaa tta acc gg-3｀(Y2C1)样2中的C2: 5｀-ccc aaa tta tcg gcc cgg ttt taa caa g-3｀ 5｀-ctt gtt aaa acc gg-3｀(Y2C2)3探针溶液的制备：
将以上设计的探针用DNA合成仪分别合成10D，向每种核酸探针中加入180μlH2O，振摇使溶解，向各识别探针中加入180μlH2O使溶解。4样品和探针的标记：
1)样品的标记：取样1和样2各5μl，分别按照地高辛(DIG)-寡聚3′末端标记试剂盒的说明书提供的标准方法，用Bio-16-ddUTP代替方法中所用的DIG-11-ddUTP对样品中的各组分的3′末端进行生物素(Bio)标记。
2)探针的标记：取每种核酸探针各5μl，分别按照DIG-寡聚3′末端标记试剂盒的说明书提供的标准方法对核酸探针的3′末端进行地高辛(DIG)标记，获得DIG标记的各核酸探针。将样1的各种DIG标记的核酸探针混合在一起，将样2的各种DIG标记的核酸探针混合在一起。5液相杂交：
在一0.5ml的微量离心管中将样1的DIG标记的混合核酸探针溶液4μl和4μlBio标记的样1混合，在另一管中混合样2的DIG标记的混合核酸探针溶液4μl和4μlBio标记的样2，每管中分别加2μl 20×SSC，34℃保温1小时，然后加入40μl4×SSC，混匀。6分离出参与了杂交的核酸探针
将上述两管中溶液全部吸出，分别加至两支链霉亲和素包被的PCR试管中，在34℃保温3min，分别吸除两管中液体，然后分别用洗涤缓冲液洗管三次，每次50μl。再向每管中加入50μl 0.5M Na2HPO4(pH7.2,20℃)，7％SDS缓冲液，70℃保温5min。
将两管中液体全部吸出，加至一新管中混合均匀，获得参与液相杂交的混合探针溶液。7识别探针的点样：
1)将Zeta-探针GT膜在双蒸水中浸湿。
2)将湿的Zeta探针GT膜置于真空点样器上，拧紧紧固螺丝，确保各样品孔间不会产生交叉渗漏。
3)在每一点样孔中加入0.5mlTE缓冲液，真空抽尽溶液后关闭真空泵。
4)分别吸取每种识别探针溶液1μl和1μl40pmol/μl的序列为aaaattttcccggg的阴性对照，分置于5支0.5ml微量离心管中，各加入0.4mol/LNaOH,10mmol/LEDTA溶液至终体积为100μl。然后分别将上述溶液全部加入相应的点样孔，打开真空泵至溶液刚好抽干关闭泵。
5)每孔再加0.2ml 0.4mol/L NaOH,10mmol/L EDTA溶液，真空抽干后关闭泵。
6)使系统连通大气后，拆下点样器，取出膜在2×SSC缓冲液中浸一下，在空气中凉干，然后置80℃烘烤1小时，备用。8固相杂交：
1)将固定有各识别探针的Zeta-探针GT膜置于大小适当的塑料袋中。
2)向袋中加入5ml预杂交缓冲液，然后34℃水浴保温5min。
3)将袋剪去一角，倾出预杂交液。
4)向袋中加入全部的参与液相杂交的混合探针溶液。
5)将袋置34℃水浴中保温1小时。
6)取出袋，剪去一角，倾出探针溶液。
7)向袋中加入等量适量的洗膜缓冲液Ⅰ，室温洗膜30min。
8)倾出洗膜缓冲液Ⅰ，再向袋中加入等量适量的洗膜缓冲液Ⅱ，洗膜30min。9显色：
将袋剪开，取出膜作上标记，按以下步骤显色：
1)在适量显色缓冲液Ⅱ中洗膜1min。
2)在适量显色缓冲液Ⅲ中室温放置30min。
3)用显色缓冲液Ⅲ以1∶5000比例稀释Anti-DIG-AP复合物溶液(取0.5μl抗DIG-AP复合物+2.5ml显色缓冲液Ⅲ)。
4)将膜置上述溶液中室温放置30min。
5)将膜置适量显色缓冲液Ⅰ中洗2次，每次15min。
6)将膜置适量显色缓冲液Ⅳ中平衡2min。
7)取20μl NBT/BCIP贮备液加至1ml显色缓冲液Ⅳ中，混匀。
8)将膜置于上述新鲜配制的1ml显色液中暗处放置至显出斑点为止，勿振摇。
9)将膜取出，置适量TE缓冲液中1min以终止反应。
10)将膜拍照，凉干保存。
实施例二
试剂盒
本试剂盒是用于一次同时检测两个样品中是否会含有目的片段C1(序列为5’-atc cct agg ctt aag gcg-3’)和C2(序列为5’-cgg gcc aat ttg ccg ata att tgg gc-3’)的。可进行25次分析。本试剂盒应贮存于-20℃。
本试剂盒的组成：1．1号液相杂交探针溶液
100μl，含0.4μg/μl的3’末端用荧光染料Cy3标记的两种探针的水溶液，两种探针的序列分别为：5’-ctt aag cct agg gac cgg tta tat caa g-Cy3-3’和5’-cccaaa tta tcg gcc cgg ttt ata caa g-Cy3-3’。2．2号液相杂交探针溶液
100μl，含0.4μg/μl的3’末端用荧光染料Cy3标记的两种探针的水溶液，两种探针的序列分别为：5’-ctt aag cct agg gac cgg tta att caa g-Cy3-3’和5’-CCCaaa tta tcg gcc cgg ttt taa caa g-Cy3-3’。3．固定有识别探针和对照探针的载玻片
25片，每片由4(排)×6(列)共24个固定有探针的点以1mm间隔组成阵列，其中第一排的第1、2点固定识别探针5’-ctt gat ata acc gg-3’，第3、4点固定识别探针5’-ctt gta taa acc gg-3’，第5、6点固定阴性对照探针5’-aca cacaca cac ac-3’；第二排重复第一排；第三排的第1、2点固定识别探针5’-ctt gaatta acc gg-3’，第3、4点固定识别探针5’-ctt gtt aaa acc gg-3’，第5、6点固定阳性对照探针5’-tgt gtg tgt gtg tg-3’；第四排重复第三排。4．阳性对照核酸
50μl，含0.4μg/μl3’末端用荧光染料Cy3标记的核酸片段(序列为5｀-acacac aca cac ac-3｀)的水溶液。5．链霉亲和素包壁的PCR管
48只，0.2ml薄壁管。6．Bio-16-ddUTP
25μl，1mmol/L水溶液。7．末端转移酶
25μl，50U/μl的末端转移酶溶在0.2mol/L二甲基胂酸钾，1mmol/L EDTA，200mmol/L KCl,0.2mg/ml牛血清白蛋白，pH6.5(25℃)的混合溶液中。8．5×反应缓冲液
100μl，含25mmol/L CoCl2,1mol/L二甲基胂酸钾，0.125mol/L Tris-HCl，1.25mg/ml牛血清白蛋白，pH6.5(25℃)。
试剂盒使用说明：
使用本试剂盒时，还需要使用者自备以下材料：
20×SSC溶液：3mol/L NaCl,0.3mol/L柠檬酸钠，pH7.0(25℃)10％SDS(w/v)
盖玻片1．样品中目的核酸片段的标记
1)取0.5ml的微量离心管置冰上，然后加入以下组分：
4μl5×反应缓冲液
5μl样品溶液(约含100pmol3’末端)
1μlBio-16-ddUTP
1μl末端转移酶
加水至终体积为20μl
2)37℃保温15min，然后置冰上。
3)向管中加入2.5μl4mol/L LiCl和75μl-20℃乙醇，混匀。
4)-20℃放置2小时。
5)12000g离心5min，弃上清，另加50μl-20℃70％乙醇洗涤沉淀，
12000g离心5min，弃上清，晾干，加入20μl水溶解。2．液相杂交
1)在一0.5ml的微量离心管中将1号液相杂交探针溶液4μl和4μl Bio标记的样1混合，在另一管中混合2号液相杂交探针溶液4μl和4μlBio标记的样2，每管中分别加2μl20×SSC，34℃保温1小时，然后加入40μl4×SSC，混匀。
2)将上述两管中溶液全部吸出，分别加至两支链霉亲和素包壁的PCR管中，在34℃保温3min，分别吸除两管中液体，然后分别用4×SSC洗管三次，每次50μl。再向每管中加入50μl5×SSC,0.2％SDS缓冲液，70℃保温5min，将两管中液体全部吸出，加至一新管中混合均匀，获得参与液相杂交的混合探针溶液。
3．固相杂交
1)吸取参与液相杂交的混合探针溶液18μl与2μl阳性对照核酸溶液混合，加至固定有识别探针和对照探针的载玻片的标记处，小心盖上盖玻片，置湿盒中34℃保温1小时。
2)将载玻片取出，去掉盖玻片，迅速置于2×SSC，0.1％SDS缓冲液中室温洗10min，然后再置于0.1×SSC缓冲液中洗5min，取出，晾干。
4．检测
将载玻片置于激光共聚焦扫描仪的平台上，在合适的条件下检测杂交产生的荧光信号。根据荧光信号的位置来判定1号和2号样品中所含的目的核酸片段的情况。
Claims (8)
1．一种核酸探针，它包含与待检序列互补的检测序列和编码序列。
2．根据权利要求1所述的核酸探针，它还包含一段间隔序列。
3．根据权利要求1所述的核酸探针，其中所述各编码序列的解链温度相同或相近。
4．根据权利要求3所述的核酸探针，其中所述各编码序列的(C+G)％相同或相近。
5．权利要求1所述核酸探针在核酸检测中的用途，其步骤包括：
权利要求1所述核酸探针与样品液相杂交；
分离出参与杂交的核酸探针；
混合分离出的核酸探针；
分析所述的编码序列，所述的分析方法选自：质谱法、SPR法和固相杂交法。
6．根据权利要求5所述的用途，所述的液相杂交在多份样品中各自分别进行。
7．根据权利要求5所述的用途，其中所述的固相杂交包括：
制备识别探针，并固定在固相支持物上形成阵列；
标记所述核酸探针；
所述核酸探针与所述识别探针固相杂交；
检测所述标记的位置和/或强度。
8．一种试剂盒，它包括：
含权利要求1所述核酸探针的液相杂交探针溶液系列；和
权利要求7所述的固相支持物上的识别探针阵列。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 99125742 CN1120242C (zh) | 1999-12-23 | 1999-12-23 | 核酸探针,其用途及其试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| CN 99125742 CN1120242C (zh) | 1999-12-23 | 1999-12-23 | 核酸探针,其用途及其试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN1300941A true CN1300941A (zh) | 2001-06-27 |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100366739C (zh) * | 2002-07-03 | 2008-02-06 | 上海百傲科技有限公司 | 用于pcr扩增的修饰引物，其应用及其试剂盒 |
-
1999
- 1999-12-23 CN CN 99125742 patent/CN1120242C/zh not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100366739C (zh) * | 2002-07-03 | 2008-02-06 | 上海百傲科技有限公司 | 用于pcr扩增的修饰引物，其应用及其试剂盒 |
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