CN1115174C

CN1115174C - 硅导电玻璃介质生物芯片及其制备方法

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Publication number: CN1115174C
Application number: CN 99113481
Authority: CN
Inventors: 汪进; 王世平; 黄维宁; 李爱珍; 姜国宝; 程君侠; 周鲁卫; 杭志强; 毛裕民
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 1999-02-12
Filing date: 1999-02-12
Publication date: 2003-07-23
Anticipated expiration: 2019-02-12
Also published as: CN1226446A

Abstract

本发明是一种能检测疾病，基因测序和基因表达的导电玻璃介质生物芯片。现行的生物芯片导电介质是铝和铂金，它们存在电解或电泳介质脱落现象。本发明用导电玻璃作为导电介质，经化学，生物方法处理，用集成电路制作工艺在导电膜上覆盖sio2钝化层，引出电极孔和测试孔。芯片经上述方法处理，并经蛋白质，氨基酸，核甘酸修饰，可用于疾病诊断，基因测序和基因表达。

Description

硅导电玻璃介质生物芯片及其制备方法

本发明属生物工程技术领域，是一种将DNA或蛋白质或多肽定点固定在导电玻璃介质生物芯片的方法。

现行的生物芯片导电介质一般为铝和铂金，但铝和铂金在通电均存在不同程度电解或电泳介质脱落现象，而且工艺复杂，DNA，蛋白质，多肽固定难度较大，成本昂贵。

目前美国Nanogen公司采用Pt为介质，法国CIS Bio international实验室采用金为介质，不但制作工艺复杂，可想而知其价格也是十分昂贵的。

本发明的目的是提供大规模集成化，工艺简单，准确定位，快速反应，且价格低廉的生物芯片。

本发明的硅导电玻璃介质生物芯片是一种集成电路生物芯片，是导电玻璃即掺锡的氧化铟(Tin-doped indium oxide，ITO)和SiO₂钝化层组成，在玻璃基板上形成导电玻璃膜电极陈列图形。SiO₂钝化层可以用等离子体增强化学汽相淀积(PECVD)方法在ITO导电膜上形成，厚度为1um，引出电极和测试孔。

本发明的芯片也可以是在导电膜，如掺锡氧化铟上陈列电极图形，其余同上。

本发明的电路也可以设计为Al/ITO复合电极电子束蒸发在ITO导电玻璃上淀积一层1um厚的Al膜，从而形成Al/ITO复合电极图形。测试孔从导电玻璃膜中引出，从而提高测试速度。

本发明的硅导电玻璃介质生物芯片包括采用ITO导电玻璃或ITO膜制备的生物芯片。

本发明的导电玻璃介质是：

掺锡的氧化铟，其主要化学成分为In₂O₃，它是一种透明的导电氧化膜层，薄膜电阻率在10^-3～10^-4Ω.cm，对ITO导电膜进行化学处理与DNA共价结合并采用点定位，结果表明：ITO导电膜电极与其他金属电极相比具有较强的抗电解腐蚀能力，是一种较为理想的电极材料。

本发明的硅导电玻璃介质生物芯片，其特征是该芯片用于疾病诊断，基因测序，基因表达研究或微实验室集成电路芯片。

本发明的硅导电玻璃介质生物芯片制备包括：导电玻璃电路设计，导电玻璃介质处理，寡核苷酸，蛋白质和多肽的修饰，电引导探针芯片定点固定。

导电玻璃介质选择：

例如采用ITO(Tin-doped indium oxide)玻璃，其主要化学成分为In₂O₃。

导电玻璃电路设计采用两种方案：

纯ITO导电膜电极在ITO导电玻璃上先进行光刻和腐蚀以形成ITO电极陈列图形。通过等离子体增强化学汽相淀积(PECVD)方法在ITO导电膜上覆盖一层钝化层SiO₂，厚度为1um。再用光刻和反应离子刻蚀法(RIE)开出电极引出孔和DNA测试孔。

Al/ITO复合电极电子束蒸发在ITO导电玻璃上淀积一层1um厚的Al膜，然后进行光刻和Al膜，并在ITO膜上形成Al/ITO复合电极图形。再将测试孔中的Al腐蚀，露出基底ITO层，而电极表面的Al层可以减少测试过程中的电极的电阻。PECVD方法在电极上淀积约1um厚的SiO₂钝化层，用光刻和反应离子刻蚀法(RIE)开出电极引出孔和DNA测试孔。

导电玻璃介质处理：

化学方法处理可采用APS，PDC，Pyrrole等化学物质处理，例如：

氧化铟(In₂O₃)+3-氨丙基三甲氧基硅烷：(3-aminopropyltrimethoxysilane；APS)

In₂O₃+APS+1.4-苯二异硫氰酸盐：(1.4-phenylene diisothiocyanate；PDC)

生物亲和方法

采用链霉亲和素或亲和素包被固定。

APS-PDC具体处理导电玻璃介质方法：

A.洗净导电玻璃浸入0.5％APS中2分钟后用丙酮10×5分钟，

B.烤箱干烤110℃45分钟

C.0.05％PDC浸泡45分钟

D.甲醇浸泡5分钟

E.丙酮浸泡5分钟

F.室温干燥即可。

寡核苷酸酸链的修饰：在寡核苷酸酸链的5’端或3’末端修饰氨基，醛基，吡咯基团，有的需要在末端修饰生物素基团。

蛋白质或多肽的修饰：在其末端修饰生物素基团或吡咯基团等。

附图1是APS-PDC Microarray与5’-amino-Oligos交联示意图。附图2是纯ITO导电膜电极。附图3是Al/ITO复合电极。

例1：材料与方法：a.乙肝(HBV)：

24669：5′-Amino-TTTTTTTTTTTACGAACCACTGAACAAATGGCACTAG

23296：5′-FAM-ATGCTTGGTGACTTGTTTACCGTGATC-3′b.丙肝(HCV)：

25420：5′-Amino-TTTTTTTTTTTTTTTTCTGTGAGGAACTACTGTCTTC-3′

YING：5′-Rho-GGGATAGTCGAAGACAGTAGTTCCTCACAG-3′c.对照：Probe 1A：5′-Amino-TTTTTTTTTTTTCTTTTGTCGCATCA-3′其中5’-amino group试剂为：N-trifluoroacetyl-6-aminohexyl-2-cyanoethylN’，N’-diisopropyl-phosphoroamidite(ABI)，

临床标本的预处理与荧光标记：

所有标本应预处理为DNA或cDNA，采用随机引物标记，Nick末端荧光标记，PCR掺入荧光标记等等。

电泳定点引导探针并固定

2mMOligo24669，Oligo254200.5ul于APS-PDC硅导电玻璃介质生物芯片，通电5uA 2分钟，0.5uL ProbelA作为阴性对照.再洗涤：用1％氨水洗涤5分钟，再用双蒸水洗涤干燥。

电泳趋向杂交或快速静电杂交。5uL，10-100pmol/ul荧光标记Oligo23296，37℃杂交6h，再次洗涤：用洗涤液(2×SSPE，0.1％SDS)50ul，3×5分钟，水洗干燥，再次杂交：5uL，10-100pmol/ul荧光标记Oligoying，37℃杂交6h，最后洗涤：用洗涤液(2×SSPE，0.1％SDS)50ul，3×5分钟，水洗干燥。

荧光扫描或CCD荧光成像，并采用软件分析图像结果。FAM：EX＝494 EM＝520；Rhodamine：EX＝578 EM＝604HBV阳性：显微镜下呈现黄绿色荧光点HCV阳性：显微镜下呈现红色荧光点

例2

采用链霉亲和素(SA)或吡咯(Pyrrole)处理硅导电玻璃介质生物芯片，蛋白质或多肽采用生物素或吡咯修饰。

20mM pyrrole，0.1M LiClO₄，1uM吡咯修饰的多肽在-0.35～+0.85V的电场强度下电定位与芯片进行固定，再与处理的血清进行反应，最后与荧光标记的二抗进行反应，阳性结果出现荧光亮点。

Claims

1.硅导电玻璃介质生物芯片，是一种集成电路生物芯片，主要是导电玻璃和SiO₂钝化层，其特征是玻璃基板上的导电玻璃膜陈列有电极图形，导电玻璃膜上有SiO₂钝化层，从导电玻璃膜中引出电极和测试孔。

2.根据权利要求1所述的硅导电玻璃介质生物芯片，其特征是导电玻璃膜是ITO膜，即掺锡氧化铟膜。

3.硅导电玻璃介质生物芯片，其特征是玻璃基板的导电膜上有Al膜，电极是Al和导电玻璃复合电极图形，测试孔是导电玻璃膜中引出。

4.一种硅导玻璃介质生物芯片的制备方法，其特征是导电玻璃介质的处理是化学方法，采用APS，PDC，Pyrrole(吡咯)等化学物质处理：氧化铟(In₂O₃)+3-氨丙基三甲氧基硅烷：(3-aminopropyltrimethoxysilane；APS)In₂O₃+APS+1.4-苯二异硫氰酸盐：(1.4-phenylene diisothiocyanate；PDC)

5.一种硅导电玻璃介质生物芯片的制备方法，其特征是导电玻璃介质的处理是生物亲和方法，采用链霉亲和素或亲和素包被固定硅导电玻璃介质生物芯片，与末端带生物素的寡核苷酸链，蛋白质或多肽进行反应。