PT1552017E - Mecanismos e métodos para a detecção de dna em amostras biológicas - Google Patents

Description

ΡΕ1552017 1

DESCRIÇÃO

"MECANISMOS E MÉTODOS PARA A DETECÇÃO DE DNA EM AMOSTRAS BIOLÓGICAS"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção está relacionada com mecanismos e métodos para a detecção de DNA em amostras biológicas. Em particular a presente invenção relaciona-se com novos mecanismos para a detecção de sequências de DNA utilizando hibridização de ácidos nucleicos electricamente assistida e com métodos para optimização da performance de tais mecanismos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A utilização da hibridização de ácidos nucleicos electricamente assistida é uma técnica conhecida na análise de amostras biológicas contendo DNA, por exemplo, o sangue, o plasma, a urina etc. Convencionalmente, um chip para a detecção de DNA é formado a partir de uma variedade de materiais incluindo vidro, silica, e metal. São formados na superfície do chip um número de contactos eléctricos utilizando técnicas conhecidas. Para detectar uma sequência de DNA particular numa amostra biológica, são ligadas à superfície do chip sondas de captura constituídas por 2 ΡΕ1552017 fragmentos de DNA complementar. Se uma amostra biológica contiver o DNA alvo, o DNA alvo irá ligar-se aos fragmentos de DNA complementar através da hibridização, e podem ser utilizadas várias técnicas de imagem para detectar tal hibridização e consequentemente a presença na amostra do DNA alvo. Através da aplicação de uma corrente eléctrica às sondas de captura, o processo de hibridização pode ser acelerado e assim o processo de detecção é também acelerado. Esta técnica básica de hibridização está descrita, por exemplo, na US 5849486.

TÉCNICA ANTERIOR

Em tais mecanismos e técnicas, os principais problemas relacionados são a ligação das sondas de captura à superfície do chip, e a imagiologia e a visualização da hibridização quando esta ocorra. No que concerne a esta última, um método de detecção tradicional é a fluorescência, mas mais recentemente Taton et al, ("Science") Vol. 289, 8 September 2000, pp 1757 - 1760) descreve a utilização de nanopartículas de ouro revestidas com estrepta-vidina para a detecção. Em tal técnica as nanopartículas de ouro são revestidas com uma sequência de oligonucleótido complementar à sequência de DNA alvo. Uma solução contendo tais nanopartículas de ouro revestidas é passada através da superfície do chip e as partículas de ouro serão seguidamente ligadas a qualquer sonda para a qual o DNA alvo é ligada. As próprias partículas de ouro são muito pequenas para serem detectadas, mas a superfície do chip 3 ΡΕ1552017 pode seguidamente ser incubada com uma solução contendo iões de prata. Os iões de prata são depositados na superfície das nanopartículas de ouro para formar uma camada de prata visível, que possa ser detectada através de mecanismos de imagiologia convencional.

No que respeita à ligação das sondas de captura à superfície do chip, uma dificuldade é a de que a ligação dos oligonucleótidos do DNA numa superfície de chip (por exemplo, um wafer de silicone) é um passo crítico que é altamente sensível aos distúrbios nas condições experimentais. Em particular quando uma corrente eléctrica é aplicada durante o processo da hibridização electricamente assistida, a electrolise pode ocorrer o que pode afectar adversamente as reacções e as detecções subsequentes. É sabido que por exemplo para revestir a superfície do chip com um gel de agarose e para os oligonucleótidos de DNA serem utilizados como sondas de captura são marcados numa extremidade com biotina e embutidos na camada de agarose em virtude da interacção de elevada afinidade entre a biotina e a estreptavidina que é dissolvida na agarose antes do revestimento da superfície do chip.

No entanto, existe um número de problemas com a utilização da agarose. Primeiramente é muito difícil manipular um gel de agarose fundido assim como para manter e mesmo revestir o chip. Adicionalmente a densidade e a concentração do gel de agarose têm de ser controladas com precisão. Assim a manufactura de um chip com uma camada de agarose adequada é muito difícil. Além disso uma vez 4 ΡΕ1552017 aplicado o gel, este tem de ser mantido húmido para prevenir que fique demasiado seco e quebradiço, e a agarose é muito instável e degrada-se a elevadas temperaturas, e assim o chip tem de ser refrigerado após a aplicação da camada de agarose. A camada de agarose é também muito delicada e susceptível ao stress mecânico, e assim é difícil o armazenamento e o transporte do chip finalizado. Em qualquer evento, a utilização de um gel de agarose não supera os potenciais problemas causados pela electrólise.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção é fornecido um mecanismo para a detecção de DNA alvo numa amostra biológica utilizando hibridização eléctrica, que compreende um substrato formado com pelo menos uma célula de reacção contendo uma camada de óxido de alumínio fornecendo uma superfície na qual as sondas de captura de DNA estão acopladas; e meios para a utilização da hibridização electricamente assistida entre o referido DNA alvo e as referidas sondas de captura.

Utilizando esta técnica alguns dos problemas das técnicas anteriores são superados ou pelo menos mitigados devido ao óxido de alumínio fornecer uma superfície de ligação estável que é fácil de formar e de manipular, facilita o manuseamento e o armazenamento subsequente do mecanismo, e pode superar ou pelo menos mitigar os problemas com a electrólise. 5 ΡΕ1552017 A superfície de ligação do óxido de alumínio pode ser formada através da oxidação de uma camada de alumínio previamente formada, ou corrigida, por exemplo através da pulverização catódica.

Um método de ligação das sondas de captura à camada do óxido de alumínio, deverá aumentar a facilidade do fabrico. Uma camada de ligação adsorvida ao óxido de alumínio deve efectuar esta função. É também importante ser capaz de orientar correctamente as sondas de captura no que diz respeito à camada de ligação. Uma proteína pode efectuar estas duas actividades.

Preferencialmente esta proteína pode ser um anticorpo para uma proteína utilizada para marcar as sondas de captura de DNA, tal que as sondas de captura possam estar ligadas à superfície de ligação através de um par de ligação anticorpo-proteína numa orientação definida. Alternativamente, no entanto, a superfície pode estar revestida com qualquer proteína e as sondas de captura podem ser marcadas com uma proteína que contenha uma elevada afinidade com a primeira proteína, por exemplo a estreptavidina e/ou a biotina.

Para reduzir o sinal de fundo, a superfície de ligação pode estar coberta com um reagente tal como a albumina, o DNA de esperma de salmão, o Ficoll, ou outra proteína. Visto ainda de um outro aspecto a invenção estende-se também a um método de detecção de DNA alvo numa amostra biológica, compreendendo os seguintes passos: 6 ΡΕ1552017 (a) fornecer uma célula de reacção formada com uma superfície de óxido de alumínio que é revestida com um primeiro composto para assegurar a correcta orientação da sonda de captura, (b) adicionar a essa célula uma solução contendo sondas de captura formadas com uma sequência de DNA complementar ao referido DNA alvo e marcadas com um segundo composto contendo elevada afinidade com o referido primeiro composto, (c) fornecer a referida amostra à referida célula, (d) adicionar à referida célula uma solução contendo sondas de detecção do DNA alvo formadas com uma sequência de DNA complementar ao referido DNA alvo para hibridização eléctrica com o DNA alvo, (e) fornecer uma corrente eléctrica para utilização na hibridização electricamente assistida entre o referido DNA alvo e as referidas sondas de captura; (f) adicionar à referida célula formas para criar um sinal detectável numa célula onde o DNA alvo tenha sido capturado pelas referidas sondas de captura e detectado pelas referidas sondas de detecção, e (g) detectar o referido sinal. 7 ΡΕ1552017

Visto ainda de um outro aspecto a presente invenção fornece um chip de DNA para a detecção de DNA alvo numa amostra utilizando hibridização eléctrica, compreendendo um substrato incluindo pelo menos uma célula de reacção, referida pelo menos uma célula de reacção contendo uma camada de óxido de alumínio com uma superfície na qual as sondas de captura se encontram ligadas, e formas para a utilização da hibridização electricamente assistida entre o referido alvo e as referidas sondas de captura em que a referida hibridização é acelerada e a performance do mecanismo para detectar o DNA alvo é optimizada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Algumas versões da presente invenção irão ser agora descritas através de exemplos e com referência às figuras anexas, mas quais:

Fig. 1 é uma apresentação esquemática ilustrando um chip de acordo com uma versão da invenção e ilustrando também o esquema de hibridização e de detecção,

Figs. 2 (a) a (d) apresentam as células de reacção obtidas experimentalmente que demonstram que a presença da sonda de captura permite que o DNA alvo seja detectado,

Figs. 3 (a) a (d) apresentam as células de reacção obtidas experimentalmente que demonstram que a presença do ΡΕ1552017 DNA alvo é necessária antes da formação dos depósitos de prata,

Figs. 4 (a) a (d) apresentam as células de reacção obtidas experimentalmente que demonstram que a intensidade dos depósitos de prata aumenta com o aumento da concentração do DNA alvo na amostra, e

Fig. 5 apresenta as células de reacção obtidas experimentalmente que demonstra, que a intensidade dos depósitos de prata varia com a concentração da sonda de captura.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE VERSÕES PREFERENCIAIS

Referindo-nos primeiramente à Fig. 1 é apresentado esquematicamente um novo mecanismo para a detecção de DNA em amostras biológicas de acordo com uma versão da presente invenção. 0 chip compreende um wafer de silicone 1 no qual uma camada 2 de aluminio é fabricada, e uma camada de óxido de aluminio 3 é formada na camada de aluminio 2. A camada de óxido de aluminio 3 é a superfície de acoplação para as sondas de DNA como se descreve abaixo. A camada de óxido de aluminio 3 pode ser formada quer por oxidação da camada de aluminio, quer por deposição directa de alumina na superfície do chip sem a necessidade de uma camada de alumínio. Estas possibilidades irão ser seguidamente descritas em maior detalhe. 9 ΡΕ1552017

Num primeiro método para formar a camada de óxido de alumínio, o alumínio é colocado numa superfície de alumínio limpa que é exposta ao oxigénio e à água. Os chips de sílica que são fabricados com uma camada de alumínio na superfície são primeiro enxaguados com água destilada, limpos através da sua introdução numa solução de NaOH a 5% (p/v) durante cerca de 30 s, e seguidamente lavados diversas vezes com água destilada de acordo com a técnica descrita em Sharma CP & Sunny MC "Albumin adsorption on to aluminum oxide and polyurethane surfaces" Biomaterials, 1990; 11: 255 - 257. Os chips são então aquecidos durante a noite a 37 °C num forno com alguma água num recipiente para manter a humidade. Sob estas condições a superfície do alumínio oxida para a alumina com uma espessura de cerca de 50 Â. Numa modificação deste processo os chips podem ser lavados simplesmente com água destilada e seguidamente aquecidos a 60 °C durante 48 horas.

Como uma alternativa à formação de alumina através da oxidação de uma camada de alumínio, a alumina pode ser depositada directamente num wafer de silicone de acordo com as seguintes condições de pulverização catódica:

Equipamento:

Potência RF:

Pressão de base: Pressão do processo:

ARC-12M Sistema de pulverização catódica 120 W 1,04 x 10“5 torr 5 x 10~3 torr 10 ΡΕ1552017

Ar/C>2 = 30,2/7,5 sccm 8 rpm 45 minutos 100 Â 5 mm x 5 mm

Fluxo de Gás: Nível de rotação:

Tempo de pulverização catódica: Espessura mínima:

Tamanho do chip: O chip revestido com a alumina pode ser padronizado através de técnicas fotolitográficas convencionais. Adicionalmente, seja qual for o método utilizado para formar a camada de alumina, antes da hibridização o chip revestido é lavado uma vez com PBS a 1 X (tampão fosfato salino, pH 7,4) à temperatura ambiente através da pipetagem da solução repetidamente sobre a superfície do chip. Dos métodos alternativos para formar a camada de alumina, a pulverização catódica pode ser preferível tal como nos estudos que demonstram que é produzido o mais baixo sinal de fundo. Seja qual for a técnica utilizada para formar a camada de alumínio, a espessura deve ser de pelo menos 50 Â. O óxido de alumínio é preferido para a ligação à superfície da sonda porque quando comparado, por exemplo, à agarose é mais barato, mais estável e mais duradouro. Adicionalmente o óxido de alumínio pode ser armazenado seco e à temperatura ambiente. De grande importância, o óxido de alumínio também elimina os problemas associados com a elec-trólise. Adicionalmente, enquanto que a agarose é difícil de manusear para formar camadas controladas, o tamanho do poro e a espessura da camada de alumina pode facilmente ser 11 ΡΕ1552017 controlada (por exemplo, através da alteração das condições da pulverização catódica ou o conteúdo de humidade no ar) . 0 óxido de alumínio pode também ser facilmente padronizado utilizando técnicas de fotolitografia convencionais. A utilização de uma camada de óxido de alumínio padronizada é vantajosa porque reduz o sinal de fundo devido à reduzida ligação não específica, e através do aumento do contraste da área a ser registada pelo detector e pelo fundo.

Referindo-nos novamente à Fig. 1 é também apresentado esquematicamente o esquema de hibridização básico utilizando um mecanismo e um método de acordo com uma versão da presente invenção. Em particular, na Fig. 1 a superfície de ligação é uma camada de óxido de alumínio formada sobre o alumínio. Um poço de reacção circular pode ser definido através da deposição de Óxido de silício na superfície de ligação do óxido de alumínio. Em cada poço de reacção, as sondas de captura estão ligadas à camada de óxido de alumínio. No entanto, as sondas de captura não estão ligadas directamente, mas através de uma ligação formada por anticorpos digoxigenina (DIG) e anti-digoxi-genina (anti-DIG) . Em particular, os anticorpos anti-DIG são adsorvidos pela superfície de óxido de alumínio, e as sondas de captura são formadas com uma camada DIG enquanto que as sondas de captura podem ser ligadas, via os anticorpos anti-DIG à superfície de ligação do óxido de alumínio. A superfície do óxido alumínio é bastante porosa e tem a capacidade de ligar bastantes moléculas diferentes. 0 revestimento anti-DIG funciona como uma camada de ligação 12 ΡΕ1552017 para assegurar que as sondas de captura do DNA imobilizadas estão correctamente orientadas. Se não for aplicado nenhum revestimento, existe o perigo de a sonda de detecção (a ser descrita em abaixo) se ligar à superfície do óxido de alumínio e causar interferência na detecção do DNA alvo. Adicionalmente, se não for aplicado nenhum revestimento, a sonda de captura poderá ligar-se ao óxido de alumínio na orientação incorrecta. Em princípio, a ligação anti-DIG/DIG pode ser substituída por qualquer par de compostos similares, por exemplo, um anticorpo e uma proteína alvo, ou um par de proteínas com elevada afinidade uma com a outra, ou qualquer para de moléculas não proteicas que são capazes de interagir uma com a outra. Deve também ser entendido que a ordem da ligação do anticorpo/proteína ou da proteína/proteina pode ser invertida. Por exemplo enquanto que na versão preferida aqui descrita o anti-DIG é utilizado como o revestimento limitante da reactividade e as sondas de captura são marcadas com DIG isto pode ser invertido. No entanto, em termos práticos é mais fácil ligar uma pequena molécula tal como a DIG a uma sonda de captura do que ligar um anticorpo à sonda de captura. Adicionalmente, deve registar-se que a sonda de captura pode ser directamente ligada à camada de óxido de alumínio através da adição de uma amina terminal ou de um grupo aldeído.

Deve também ser entendido que as sondas de captura são formadas com uma sequência de DNA complementar ao DNA alvo a ser detectado numa amostra. Assim, quando a 13 ΡΕ1552017 amostra é colocada na superfície do chip ao qual a sonda de captura está ligada, se o DNA alvo estiver presente ficará ligado à sequencia de DNA complementar da sonda de captura através do processo conhecido por hibridização de DNA. A hibridização pode preferencialmente ser acelerada através da aplicação de uma corrente eléctrica tal como conhecido na técnica.

Assim que a amostra tiver sido aplicada na superfície do chip, é então necessário detectar qualquer DNA alvo da amostra que se tenha ligado às sondas de captura. Para isto ser alcançado é adicionada uma solução contendo sondas de detecção biotiniladas. As sondas de detecção incluem sequências de DNA que são complementares ao DNA alvo e assim irão ligar-se a qualquer DNA alvo que tenha previamente sido capturado pelas sondas de captura. Para permitir que o DNA alvo capturado seja visualmente detectado, são adicionadas nanopartículas de ouro revestidas com estreptavidina e devido à afinidade da estrepta-vidina com a biotina as nanopartículas de ouro irão ligar-se às sondas de detecção. As próprias nanopartículas de ouro são demasiado pequenas para serem vistas com clareza, mas pode então ser adicionada uma solução contendo iões de prata a qual irá ser reduzida na superfície das nanopartículas de ouro revestidas com estreptavidina para formar uma camada de prata, que é visível como um depósito escuro.

Para reduzir o sinal de fundo o chip pode preferencialmente ser tratado com DNA de esprema de salmão. Como 14 ΡΕ1552017 uma alternativa ao DNA de esperma de salmão, podem ser utilizadas, a albumina, ou outras proteínas, ou o Ficoll. A visibilidade dos depósitos de prata pode adicionalmente ser aumentada através da utilização de uma solução de fixação, tal como o tiossulfato de sódio. 0 equipamento e as técnicas de imagiologia convencionais podem então ser utilizadas para detectar os depósitos escuros na célula de reacção, os quais poderão resultar da presença do DNA alvo na amostra.

Exemplo 0 seguinte exemplo é de um protocolo para detectar o DNA da β-actina numa amostra. Os passos da hibri-dização são assistidos electronicamente, preferencialmente através da hibridização pulsada utilizando a aplicação de impulsos, embora a aplicação de corrente contínua também seja possível. A hibridização pulsada, no entanto limita os danos no chip e resulta num sinal mais elevado. As condições de hibridização normais incluem para a hibridização da amostra de DNA com as sonda de captura a aplicação de impulsos de 10 segundos (13 microamps) seguida por uma pausa de 3 segundos repetida durante 8 minutos (isto é um total de 48 impulsos) . Para a hibridização da sonda de detecção com a amostra de DNA capturada, podem ser utilizadas as mesmas condições, mas apenas durante 3 minutos (isto é 18 impulsos) . 15 ΡΕ1552017 1. 0 anti-DIG é diluído 100 vezes com PBS a 1 x (tampão fosfato salino), pH 7,4. 2. São adicionados 50 μΐ de anti-DIG diluído a um chip revestido de alumina e este é incubado a 41 °C durante 2 horas. 3. A solução de anti-DIG é excluída e o chip é lavado 3 x com 80 μΐ de PBS a 1 X, pH 7,4 (pipetado para cima e para baixo durante cada lavagem). 4. É adicionado 1 μΐ de sondas de captura marcadas com DIG a 10 μΜ juntamente com 0,2 pg de DNA de esperma de salmão em 50 μΐ de PBS a 1 x no chip e incubado a 41 °C durante 30 minutos. O DNA do esperma de salmão é primeiramente desnaturado através do aquecimento a 95 °C para formar cadeias simples e é seguidamente misturado com as sondas de captura marcadas com DIG. 5. A solução da sonda de captura marcada com DIG e a solução do DNA de esperma de salmão são descartadas lavadas três vezes com 80 μΐ de PBS a 1 x e uma vez com SSPE a 1 x. 6. Adicionar 5 μΐ da amostra da sequência da β-actina a 11 μΜ (um alvo de cadeia simples de 91 nucleótidos) em SSPE a 1 x e aplicar corrente de impulso eléctrico como descrito durante 8 min. Após a hibridização, lavar o chip 3 x com SSPE a 0,1 x. 16 ΡΕ1552017 7. Adicionar a sonda de detecção (1 μΐ, 10 μΜ) ao chip. Aplicar corrente de impulso eléctrico como descrito durante 3 min. Lavar o chip 3 x com SSPE a 0,1 x e uma vez com PBS a 1 x. 8. As nanoparticulas de ouro revestidas com estreptavidina (obtidas da Sigma Chemical Co., Ltd, St. Louis, Missouri, USA) são diluídas 10 vezes com PBS a 1 x, pH 7,4. 9. As nanoparticulas de ouro revestidas com estreptavidina diluídas são adicionadas à superfície do chip e incubadas a 41 °C durante 15 minutos. 10. A solução de nanoparticulas de ouro revestidas com estreptavidina diluídas são excluídas e o chip é lavado duas vezes com 80 μΐ de PBS a 1 x, pH 7,4 (pipetadas para cima e para baixo durante cada lavagem) e 3 x com 80 μΐ de água milli-Q autoclavada (pipetada para cima e para baixo durante cada lavagem). 11. É preparada uma mistura de 1:1 das soluções A e B enriquecidas em prata (obtidas a partir da Sigma Chemical Co., Ltd, St. Louis, Missouri, USA) imediatamente antes da sua utilização e são efectuados os seguintes passos numa câmara escura. São adicionados 50 μΐ da solução enriquecida em prata ao chip e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. 17 ΡΕ1552017 12. A solução enriquecida com prata é excluída e o chip é lavado uma vez com a água milli-Q autoclavada antes de serem adicionados 50 μΐ de tiossulfato de sódio a 2 % no chip. Pipetado para cima e para baixo uma vez para remover os resíduos e para fixar a cor. 13. Excluir a solução de tiossulfato de sódio após 2 min de incubação e lavar com 50 μΐ de água milli-Q antes de se adicionarem 50 μΐ de água milli-Q autoclavada ao chip. 14. Observar o aparecimento de pontos negros no chip com sistema de detecção de sinal óptico.

Resultados experimentais

Os seguintes resultados experimentais apresentados nas Figs. 2 a 5 foram obtidos utilizando o protocolo de hibridização anterior com a variação de certos parâmetros como se compreenderá a partir do descrito seguidamente. Em todos os casos, o esquema base de detecção do DNA é o seguinte: uma camada de ligação de óxido de alumínio fornecida com anti-DIG, sondas de captura marcadas com DIG contendo um fragmento de DNA complementar a uma cadeia simples do ácido nucleico alvo, sondas de detecção marcadas com biotina para se ligarem aos alvos capturados, e nano-partículas de ouro revestidas com estreptavidina com enriquecimento em prata para visualização do DNA alvo detec-tado. 18 ΡΕ1552017

As Figs. 2 (a) - (d) ilustram a eficácia da sonda de captura marcada com DIG na detecção do DNA alvo. As Figs. 2 (a) e (c) apresentam ambas o chip anteriormente à hibridização. As células de reacção são brancas devido a não se terem formado depósitos de prata. As Figs. 2 (b) e (d) apresentam o chip após a hibridização com a sonda de captura marcada com DIG presente na Fig. 2 (b) mas ausente na Fig. 2 (d). As células de reacção aparentam ser mais escuras na Fig. 2 (b) do que na Fig. 2 (d) apresentando o depósito de prata.

As Figs. 3 (a) - (d) mostram que os depósitos de prata mais escuros se formam apenas nas células de reacção na presença do DNA alvo. Similarmente à Fig. 2, as Figs. 3 (a) e (c) apresentam o chip antes da hibridização, enquanto que as Figs. 3 (b) e (d) apresentam o chip após a hibridização com o DNA alvo presente apenas na Fig. 3 (b) e não na Fig. 3 (d) . Pode ser novamente observado que os depósitos de prata escuros se formam nas células de reacção apenas no caso da Fig. 3 (b) onde o DNA alvo está presente.

As Figs. 4 (a) - (d) demonstram adicionalmente a eficácia da presente invenção demonstrando que os depósitos de prata se tornam mais escuros com o aumento da concentração do DNA alvo e que assim o sinal óptico aumenta em proporção à concentração do DNA alvo. As Figs. 4 (a) - (c) apresentam o chip após a hibridização e a detecção com (a) DNA alvo não diluído, (b) DNA alvo diluído 5 vezes, e (c) 19 ΡΕ1552017 DNA alvo diluído 10 vezes. Observa-se que as células de reacção na Fig. 4 (a) são mais escuras do que as da Fig. 4 (b) que por seu turno são mais escuras do que as da Fig. 4 (c) . A Fig. 4 (d) por comparação apresenta o chip sem a presença de DNA alvo e consequentemente com células de reacção brancas sem depósito de prata.

Finalmente, a Fig. 5 demonstra que a intensidade do sinal óptico varia com a concentração da sonda de captura de DIG. Na Fig. 5 a variação da concentração da sonda de captura de DIG decresce da esquerda para a direita e as células de reacção tornam-se correspondentemente mais leves e é depositada menos prata.

Lisboa, 25 de Março de 2010

Claims (15)

1. ΡΕ1552017 1 REIVINDICAÇÕES 1. Mecanismo para a detecção de DNA alvo numa amostra biológica utilizando hibridização eléctrica, compreendendo um substrato formado com pelo menos uma célula de reacção contendo uma camada de óxido de alumínio com uma superfície na qual as sondas de captura de DNA se ligam; e meios para a utilização da hibridização electricamente assistida entre o referido DNA alvo e as referidas sondas de captura. 2. 0 mecanismo como reivindicado na reivindicação 1, em que a referida superfície de óxido de alumínio é formada pela oxidação de uma camada de alumínio. 3. 0 mecanismo como reivindicado na reivindicação 1, em que a referida superfície de óxido de alumínio é formada por uma técnica de pulverização catódica. 4. 0 mecanismo como reivindicado em qualquer uma das reivindicações de 1 - 3, em que a referida superfície de óxido de alumínio é revestida com um primeiro composto para actuar como uma camada de ligação para a sonda de captura. 5. 0 mecanismo como reivindicado na reivindicação 4, em que o referido mecanismo compreende adicionalmente sondas de captura ligadas à referida 2 ΡΕ1552017 superfície de óxido de alumínio, e em que as referidas sondas de captura são marcadas com um segundo composto que se pode ligar ao referido primeiro composto. 6. 0 mecanismo como reivindicado na reivindicação 5, em que os referidos primeiro e segundo compostos compreendem um par anticorpo-proteína. 7. 0 mecanismo como reivindicado na reivindicação 6, em que o referido primeiro composto compreende anticorpos anti-digoxigenina, e em que o referido segundo composto compreende digoxigenina. 8. 0 mecanismo como reivindicado na reivindicação 5, em que os referidos primeiro e segundo compostos compreendem a estreptavidina e a biotina, ou vice-versa. 9. 0 mecanismo como reivindicado em qualquer uma das reivindicações de 1 - 3, em que a referida superfície de óxido de alumínio é revestida com uma primeira molécula para actuar como uma camada de ligação para a sonda de captura.
2. 10. O mecanismo como reivindicado na reivindicação 9, em que o referido mecanismo compreende adicionalmente sondas de captura ligadas à referida superfície de óxido de alumínio, e em que as referidas sondas de captura são marcadas com uma segunda molécula contendo uma afinidade com a referida primeira molécula. 3 ΡΕ1552017 11. 0 mecanismo como reivindicado em qualquer uma das reivindicações de 1 - 10, em que a referida camada de óxido de aluminio possui uma espessura de pelo menos 50 Â.
3. 12. O mecanismo como reivindicado em qualquer uma das reivindicações de 1 - 11 em que a referida superfície de óxido de alumínio é revestida com um reagente para reduzir o sinal de fundo num processo de detecção.
4. 13. O mecanismo como reivindicado na reivindicação 12, em que o referido reagente compreende DNA de esperma de salmão.
5. 14. O mecanismo como reivindicado na reivindicação 12, em que o referido reagente compreende albumina, ou outra proteína, ou o Ficoll.
6. 15. Um método para detectar DNA alvo numa amostra biológica, compreendendo os seguintes passos: a) fornecer uma célula de reacção livre de qualquer camada de gel ou de agarose e deformada com uma superfície de óxido de alumínio que é revestida com um primeiro composto para assegurar a correcta orientação da sonda de captura, b) adicionar a essa célula uma solução contendo sondas de captura formadas com uma sequência de DNA com- 4 ΡΕ1552017 plementar ao referido DNA alvo e marcadas com um segundo composto contendo elevada afinidade com o referido primeiro composto, c) fornecer a referida amostra à referida célula, d) adicionar à referida célula uma solução contendo sondas de detecção do DNA alvo formadas com uma sequência de DNA complementar ao referido DNA alvo para hibridização eléctrica com o DNA alvo, e) fornecer uma corrente eléctrica para utilização na hibridização electricamente assistida entre o referido DNA alvo e as referidas sondas de captura; f) adicionar à referida célula formas para criar um sinal detectável numa célula onde o DNA alvo tenha sido capturado pelas referidas sondas de captura e detectado pelas referidas sondas de detecção, e g) detectar o referido sinal.
7. 16. Um método como reivindicado na reivindicação 15, em que os referidos primeiro e segundo compostos compreendem um par anticorpo-proteína.
8. 17. Um método como reivindicado na reivindicação 16, em que os referidos primeiro e segundo compostos compreendem a anti-digoxigenina e a digoxigenina. 5 ΡΕ1552017
9. 18. Um método como reivindicado na reivindicação 16, em que os referidos primeiro e segundo compostos compreendem um par de proteínas interactuantes ou moléculas não proteicas com afinidade umas com as outras.
10. 19. Um método como reivindicado na reivindicação 16, em que os referidos primeiro e segundo compostos compreendem a estreptavidina e a biotina, ou vice-versa.
11. 20. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações de 15 - 19 compreendendo adicionalmente a adição de um reagente para reduzir o sinal de fundo.
12. 21. Um método como reivindicado na reivindicação 21, em que o reagente redutor do sinal de fundo é a albumina ou deriva do DNA do esperma de salmão.
13. 22. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações de 15 - 21, em que no referido passo (f) as formas para criar o referido sinal incluem uma solução de nanopartícuias de ouro revestidas com estreptavidina que se ligam à referida sonda de detecção, e uma solução de iões de prata que se reduzem na superfície das referidas nanopartículas de ouro para formar depósitos de prata.
14. 23. Um chip de DNA para detectar DNA alvo numa amostra utilizando hibridização eléctrica, compreendendo um substrato incluindo pelo menos uma célula de reacção, que 6 ΡΕ1552017 contenha pelo menos uma camada de óxido de alumínio com suma superfície na qual as sondas de captura do DNA estejam ligadas, e formas para utilização na hibridização elec-tricamente assistida entre o referido alvo e as referidas sondas de captura.
15. 24. Um método como reivindicado na reivindicação 23, em que a referida corrente eléctrica é uma corrente eléctrica alternada. Lisboa, 25 de Março de 2010 ΡΕ1552017 1/5

    LG. 1 ΡΕ1552017 2/5 Com sonda de captura Antes da hibridização Após o sinal de formação

    Sem sonda de captura Antes da hibridização Após o sinal de formação

    3/5 ΡΕ1552017 Com ácido nucleico alvo Antes da hibridização Após hibridização

    Sem ácido nucleico alvo Antes da hibridização Após hibridização

    4/5 ΡΕ1552017 Com ácido nucleico alvo (não diluído) Com ácido nucleico alvo (diluição a 5 vezes)

    Sem ácido nucleico alvo Com ácido nucleico alvo (diluído 10 vezes)

    Ffd 4(e)

    ΡΕ1552017 5/5 Concentração da captura da DIG

    1 ΡΕ1552017 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e ο IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição Literatura que não é de patentes citada na Descrição * Tsíorf., Scfess»,. Sapíesrte' 2DD8, vqk .,28¾. » Shatírsa CP: SaftBy MC. te: 17S7--176D ísfiíss. iSSS. vsL H.ilsS-iSí