JP5596568B2 - アナライトの検出 - Google Patents

Description

本発明は、誘電泳動を用いてアナライトを検出しアナライトに関するデータを得る方法に関する。該方法は、既知のアッセイ方法に比べて速度及び感度を高めることができるため有利である。

不均一捕捉プローブに基づくアッセイは、生物学的アナライト検出の分野で長年用いられている。例えば標的核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーションにより標的核酸を検出することができる。近年では基材上に固定化された複数のプローブ核酸を提示するＤＮＡチップ及びマイクロアレイを用いて標的核酸が検出されている。

捕捉プローブ或いは固体表面に対する標的アナライトの結合効率を改善するために多くの様々なアプローチが試みられている。例えば反応空間における混合条件を最適化してもよく、或いは固相としてビーズを用いることにより捕捉プローブ及び固体表面のいずれかを媒体に固定化してもよい。しかしこれら方法の速度及び効率は、混合或いは対流により除去することができない拡散境界層により制限を受ける。したがって標的アナライトを捕捉プローブ或いは固体表面に結合させる方法の改善、特にＤＮＡハイブリダイゼーション法の改善は、磁場（非特許文献１）、或いは静水圧（非特許文献２）などの更なる力の使用に主眼が置かれている。

電場を用いてＤＮＡの移動及びハイブリダイゼーションを制御できることが知られているため、マイクロチップに基づく核酸アレイには電場が用いられている（非特許文献３、非特許文献４）。

ＤＮＡは分極性が高く、電場に曝露されたときＤＮＡ骨格に沿って双極子が誘起されるので、交流電場を用いてＤＮＡを操作できることも知られている（非特許文献５）。交流を誘電泳動で用い、その印加周波数に依存して微小電極上にＤＮＡを集めることができることも知られている（非特許文献６）。

Ａｍａｒａｌ；Ｇｒａｈａｍ，Ｄ．Ｌ．；Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｈ．Ａ．；Ｆｅｌｉｃｉａｎｏ，Ｎ．；Ｆｒｅｉｔａｓ，Ｐ．Ｐ．；Ｃｌａｒｋｅ，Ｌ．Ａ．；Ａｍａｒａｌ，Ｍ．Ｄ． Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｉｅｌｄ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏｎ−ｓｉｚｅｄ ｓｐｉｎ−ｖａｌｖｅ ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ，Ｂ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ（２００５），Ｂ１０７（２），９３６−９４４ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｇｒｅｅｎ ＤＪ，Ｌｉｔｔ ＧＪ，Ｌａｕｇｈａｒｎ ＪＡ Ｊｒ．Ｕｓｅ ｏｆ ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｔｏ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｉｎ ａｎ ＨＩＶ−１ ｐ２４：ａｎｔｉ−ＨＩＶ−１ ｐ２４ ａｓｓａｙ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．１９９８ Ｆｅｂ；４４（２）：３４１−２ Ｎａｎｏｇｅｎ；Ｅｄｍａｎ ＣＦ，Ｒａｙｍｏｎｄ ＤＥ，Ｗｕ ＤＪ，Ｔｕ Ｅ，Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ ＲＧ，Ｂｕｔｌｅｒ ＷＦ，Ｎｅｒｅｎｂｅｒｇ Ｍ，Ｈｅｌｌｅｒ ＭＪ．，Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７ Ｄｅｃ １５；２５（２４）：４９０７−１４ Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ；Ｈｅａｔｏｎ ＲＪ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＡＷ，Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ ＲＭ．Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ｄｉｒｅｃｔ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｉｌｍｓ ａｎｄ ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｓｅ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００１ Ｍａｒ ２７；９８（７）：３７０１−４ Ｃ Ｗａｅｌｔｉ ｅｔ ａｌ ＡＣ ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ，２００７ Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ：Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．４０ １１４−１１８ Ｂａｋｅｗｅｌｌ ＤＪ，Ｍｏｒｇａｎ Ｈ．Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ：ｔｉｍｅ− ａｎｄ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｎ ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ．ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ Ｎａｎｏｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００６ Ｍａｒ；５（１）：１−８

しかし不均一捕捉プローブに基づくアッセイのアッセイ時間が短縮され感度が改善された改良法が依然として必要とされている。

したがって本発明は、サンプルの処理方法であって、
ａ）アナライトに結合することができる結合相と前記サンプルとを媒体の存在下で接触させる工程と、
ｂ）複数のパルスで構成され、第１の周波数、第１のパルス持続期間、及び第１のパルス立ち上がり時間を有する第１の交番電場を前記媒体に印加する工程と、
ｃ）任意的に第２の交番電場を前記媒体に印加する工程と、
ｄ）それにより前記媒体中の前記サンプル及び前記結合相の少なくともいずれかに影響を及ぼす工程と、
を含む方法を提供する。

他の実施形態では、本発明はまたサンプルの処理方法であって、
ａ）アナライトに結合することができる結合相と前記サンプルとを媒体の存在下で接触させる工程と、
ｂ）第１の周波数を有する第１の交番電場を前記媒体に印加する工程と、
ｃ）第２の交番電場を前記媒体に印加する工程と、
ｄ）それにより前記媒体中の前記サンプル及び前記結合相の少なくともいずれかに影響を及ぼす工程と、
を含む方法を提供する。

この実施形態では第１の交番電場は、複数のパルスで構成され、第１のパルス持続期間及び第１のパルス立ち上がり時間を有することが好ましい。この実施形態の第２の交番電場は、複数のパルスで構成され、第１のパルス持続期間及び第１のパルス立ち上がり時間を有することが更に好ましい。

本発明はまた、アナライトを任意的に含むサンプル処理装置であって、媒体と、前記アナライトを捕捉することができる結合相と、複数の電極と、少なくとも２つの交番電場を前記媒体に印加するための電場源とを備え、複数のパルスで構成されている少なくとも１つの交番電場に印加することができる装置を提供する。各交番電場は複数のパルスを含み、周波数、パルス持続期間、及びパルス立ち上がり時間から選択されるパラメータの独自の組み合わせを有することが好ましい。

図１は、櫛型電極構造の例を示す。 図２は、金櫛型微小電極構造の完全マスクレイアウトを示す。 図３は、チップの個々のレイアウトを示す。 図４は、マスクデザインを示す。 図５は、誘電泳動（ＤＥＰ）測定に用いられる金櫛型電極のナイキストプロットを示す。 図６は、ポリスチレンビーズ溶液中の金電極（ＩＤＥ）を示す。 図７は、ポリスチレンビーズ溶液中の金ＩＤＥ電極を示す。 図８は、ポリスチレンビーズ溶液中の金ＩＤＥ電極を示す。 図９は、ポリスチレンビーズ溶液中の金ＩＤＥ電極を示す。 図１０は、ポリスチレンビーズ溶液中の金ＩＤＥ電極を示す。 図１１は、１ｎＭのＱｄｏｔｓ蒸留水溶液中の金ＩＤＥ電極を示す。 図１２は、１ｎＭのＱｄｏｔｓ蒸留水溶液中の３つの金ＩＤＥ電極を示す。 図１３は、損傷を受けたＩＤＥの透過像を示す。 図１４は、Ｑｄｏｔｓ−３ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファの１ｎＭ溶液（ｐＨ６．９）中において相補的プローブが固定化されている金ＩＤＥ電極を示す。 図１５は、１０分間１００ｋＨｚで２．５Ｖの交流電場に接続され、相補的プローブが固定化されている２つの金ＩＤＥ電極を示す。

次に本発明をより詳細を説明する。

「交番電場」という用語は、例えば１対の電極に交番電流（交流）或いは交番電圧を印加することにより生じ得る不定値を有する電場を意味する。

「複数のパルスで構成されている交番電場」という用語は、例えば印加電場のオンとオフを切り換えることにより、或いは前記電場を低下させ次いで上昇させることにより（逆の場合も同様である）、典型的には立て続けに交番電場が１超印加されることを意味する。

「第２の交番電場を印加する」及び「１以上の更なる交番電場を印加する」という用語は、第１の交番電場と同時に第２の交番電場或いは１以上の更なる交番電場が印加されることを意味し得る。例えば２以上の交番電場は、一連の重畳電場であってもよく、該電場は異なる周波数及び正弦波或いは矩形波などの異なる形状の少なくともいずれかを各々有する。例えば高周波数正弦波交番電場及び低周波数正弦波交番電場は、重畳され且つ同時に印加されてもよい。或いは第２の交番電場或いは１以上の更なる交番電場は、第１の交番電場後連続して印加されてもよい。

本発明に係る方法の工程（ｄ）においてサンプル及び結合相の少なくともいずれかは、第１の交番電場の印加により、また任意的に第２の任意交番電場により影響を受ける。１つの実施形態では、サンプルが影響を受けて、アナライトが媒体を介して結合相へ移動する。これに代えて或いはこれに加えて、サンプル及び結合相の少なくともいずれかが影響を受け、アナライトの結合相への結合を促進する。この実施形態では、サンプルが影響を受け、アナライトの結合相への結合が促進され、例えば結合相に濃縮される。結合相は、例えばある方向に配向されることにより影響を受ける場合があり、これによってアナライトの結合が促進される。結合相が捕捉プローブを備える１つの実施形態では、捕捉プローブの位置及び配向の少なくともいずれかが影響を受け、アナライトの捕捉プローブへの結合を促進することができる。結合相が複数の電極であるこの実施形態では、アナライト及びキャプチャーの少なくともいずれかが影響を受け、電極及び電極間の少なくともいずれかに結合することができる。

好ましい実施形態では、第１の交番電場は媒体を介する結合相へのアナライトの移動を制御し、第２の交番電場はアナライトの結合相への結合を促進する。

本方法は、生体分子であるアナライトを対象とすることが好ましいが、任意の荷電アナライト或いは分極性アナライトを必要に応じてアッセイすることもできる。好ましい実施形態では、アナライトは細胞、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド断片、アミノ酸、炭水化物、脂質、合成化学物質、或いはＤＮＡ及びＲＮＡのいずれかなどの核酸から選択される１以上の化合物を含む。

本発明に係る方法は、その電気的性質に起因して、交番電場の存在下で強い誘電泳動活性を示すアナライトのアッセイに特に有利である。したがって交番電場において有効な分極性を示すアナライトが、本方法に特に適している。これに関連してアッセイ方法は、交番電場を用いて容易に操作することができるＤＮＡ或いはＲＮＡの検出に特に有用である。

サンプルは、細胞サンプルなどの生体サンプルを典型的に含む。生体サンプルは、構造によって前処理する必要がある場合もあるし、その必要がない場合もある。

本発明者らは驚くべきことに、サンプルを含む媒体に第１の交番電場及び第２の交番電場を印加すると、サンプルを処理する方法に要する時間が短縮されると共に、該方法の感度が高まることを見出した。

また本発明者らは驚くべきことに、サンプルを含む媒体に複数のパルスで構成されている第１の交番電場及び任意的に第２の交番電場を印加すると、サンプルを処理する方法にかかる時間が短縮されると共に、該方法の感度が高まることを見出した。

第２の交番電場は複数のパルスで構成され、第２の周波数、第２のパルス持続期間、及び第２のパルス立ち上がり時間を有することが好ましい。

好ましい実施形態では、第１の交番電場及び第２の交番電場が媒体に印加され、第１の交番電場及び第２の交番電場は異なる。この実施形態では、第１の交番電場及び第２の交番電場は、周波数、パルス持続期間、パルス立ち上がり時間、及び振幅の少なくともいずれかが異なっていてもよい。

本発明者らは、パルス状であってもよく、好ましくは異なる電場である１超の交番電場を用いてアナライト及び結合相の少なくともいずれかを操作し、サンプルの処理方法の速度及び効率を改善できることを予想外にも見出した。交番電場は、媒体を通じた結合相へのアナライトの移動などのバルク事象、及びアナライトの結合相への結合などの表面に限定された事象を含む、本方法の実施中に生じる様々な事象を制御することができる。したがって第１の交番電場を用いて、媒体を通じた結合相へのアナライトの移動、例えば媒体を通じた結合相へのＤＮＡの移動を制御することができる。第１の交番電場及び第２の交番電場の少なくともいずれかを用いて、アナライトの結合相への結合、例えばＤＮＡハイブリダイゼーションを制御することができる。１つの実施形態では、第１の交番電場及び第２の交番電場の少なくともいずれかを用いて、結合相に取り付けられている捕捉プローブの位置合わせ及び配向の少なくともいずれかを例えば伸長により行い（Ｗａｅｌｔｉ Ｃ．ｅｔ ａｌ ２００７に記載）、ハイブリダイゼーション効率を上昇させることができる。第１の交番電場及び第２の交番電場の少なくともいずれかはまた、アナライトが結合相に結合した後に印加され、非特異的結合アナライト及び任意の吸着アナライトを除去し、洗浄効率を改善することもできる。例えば交番電場は、バッファによる洗浄中に印加されてもよい。洗浄に用いられるバッファが高いイオン強度を有している場合、該バッファは負の誘電泳動を誘導し、ＤＮＡなどの非特異的結合アナライトを電極から低電場領域にドライブさせる。この方法は、電極から非特異的結合アナライトを除去することが容易であるため、電極が結合相として作用するとき特に有用である。

本発明者らは、印加される交番電場が複数のパルスを含む場合、アナライト及び結合相の少なくともいずれかの操作性が改善されるため、サンプルの処理方法の速度及び効率が改善されることも見出した。

交番電場の周波数及び振幅は、処理されるアナライトの極性を最適化することにより、標的アナライト及び結合相の少なくともいずれかを選択的に操作及び移動させるのに好適なレベルに設定される。各交番電場に必要な特定の周波数及び振幅は、処理されるサンプルの種類、電気特性、密度、標的アナライトの形状、及び標的アナライトの大きさに依存する。各交番電場に必要な特定の周波数及び振幅はまた、方法で用いられる媒体にも依存する。例えばアナライトがＤＮＡであり、電極が結合相として作用する場合、ＤＮＡの電極への結合は媒体のイオン強度（媒体の分極性）に強く依存する。したがって媒体の伝導性は、必要な交番電場の周波数及び振幅に影響を及ぼす。

交番電場が複数のパルスを含む実施形態では、交番電場のパルス立ち上がり時間及び周波数は、媒体を通じたアナライトの加速を最適化させる好適なレベルに設定される。複数のパルスで構成されている各交番電場に必要な特定のパルス立ち上がり時間及び周波数は、処理されるサンプルの種類、電気特性、密度、標的アナライトの形状、標的アナライトの大きさ、及び方法で用いられる媒体に依存する。理論に縛られるものではないが、アナライトを移動させるのに十分な時間十分な力を印加するために、より大きなアナライトにはより長いパルス立ち上がり時間及び低周波数が必要とされる場合がある。

交番電場が複数のパルスを含む実施形態では、交番電場のパルス持続期間は、媒体を通じたアナライトの移動速度及び移動距離を最適化させるのに好適なレベルに設定される。複数のパルスで構成されている各交番電場に必要な特定のパルス持続期間は、処理されるサンプルの種類、電気特性、密度、標的アナライトの形状、標的アナライトの大きさ、及び方法で用いられる媒体に依存する。理論に縛られるものではないが、より大きなアナライトを移動させるのに十分な力を与えるため、或いはアナライトをより長い距離移動させるために、より長いパルス持続期間が必要とされる場合がある。

第１の交番電場及び第２の交番電場は、アッセイ装置において制御される事象の種類に応じて同時に印加されてもよく、連続して印加されてもよい。１つの実施形態では、第１の交番電場及び第２の交番電場は複数のパルスで構成されている。第１の交番電場及び第２の交番電場が連続して印加される実施形態では、第２のパルス状交番電場を生じさせるために、第１の交番電場の電圧、周波数、パルス持続期間、及びパルス立ち上がり時間の少なくともいずれかを変化させてもよい。第１の交番電場及び第２の交番電場は同時に印加されることが好ましい。

第１の交番電場及び第２の交番電場は、周波数、振幅、パルス持続期間、及びパルス立ち上がり時間の少なくともいずれかが異なっていてもよい。

交番電場（１或いは複数）が複数のパルスで構成されている実施形態では、印加されるパルスの数は特に限定されず、１から交番電場印加期間において可能な総サイクル数までの範囲であってもよい。

各交番電場は、好ましくは１分間〜２０分間、好ましくは５分間〜２０分間、より好ましくは１０分間〜２０分間印加される。

第１の交番電場を用いて媒体を通じた結合相へのアナライトの移動を制御する好ましい実施形態では、第１の交番電場は好ましくは１Ｈｚ〜１０^９Ｈｚ、より好ましくは１０^４Ｈｚ〜１０^７Ｈｚの周波数を有する。この周波数範囲は、特にＤＮＡの場合、媒体全体に亘ってアナライト上で双極性電荷を誘起することによりアナライトの移動を改善することができる。１０^７Ｈｚより高い周波数を用いるとき、アナライトの移動に対する効果が減少する場合があるが、これは誘起された双極子が形成される時間、及び輸送が生じる時間が徐々に短くなるためである。

パルス状であってもよい第１の交番電場は、１０ｋＶ／ｍ〜１，０００ＭＶ／ｍの電場強度を有することが好ましい。

パルス状であってもよい第１の交番電場は、３０Ｈｚの周波数及び３５０ｍＶの電圧を有することが好ましい。

パルス状であってもよい第２の交番電場は、１０^２Ｈｚ〜１０^９Ｈｚの周波数を有することが好ましい。

パルス状であってもよい第２の交番電場は、１０ｍＶ〜５Ｖの電圧を有することが好ましい。

第２の交番電場が複数のパルスで構成されており、アナライトの結合相への結合を促進するために用いられる好ましい実施形態では、第２のパルス状交番電場は１０^−２ｓ〜１０^−８ｓのパルス持続期間を有することが好ましい。第２のパルス状交番電場はまた１０^−８ｓ〜１０^−１０ｓのパルス立ち上がり時間を有することが好ましい。このパルス持続期間及びパルス立ち上がり時間は、特にＤＮＡハイブリダイゼーションの場合、表面に限定された事象を改善することができる。

第１の交番電場及び第２の交番電場は、正弦波、矩形波、鋸歯状波、及び三角波から独立に選択される波形を有することが好ましい。

本発明に係るアッセイ方法は、１以上の更なる交番電場を印加する１以上の工程を更に含んでいてもよい。更なる交番電場を用いて、第１交番電場及び第２の交番電場から生じる異なるアッセイ事象を制御することができ、該事象は上述のように捕捉プローブを伸長させてアナライトの捕捉プローブへのハイブリダイゼーションを助長し、非特異的結合アナライトを除去することを含む。この実施形態では、各更なる交番電場が他の全ての交番電場の周波数に対して独自の周波数を有することが好ましい。各更なる交番電場が複数のパルスで構成されている実施形態では、各更なる交番電場が他の全ての交番電場の周波数、パルス持続期間及びパルス立ち上がり時間の組み合わせに対して周波数、パルス持続期間及びパルス立ち上がり時間の独自の組み合わせを有することが好ましい。したがって印加される第１の交番電場、第２の交番電場、及び各更なる交番電場は、これらパラメータの独自の組み合わせを各々有する。

更なる交番電場は１０^２Ｈｚ〜１０^９Ｈｚの周波数を有することが好ましい。更なる交番電場は、１０ｍＶ〜５Ｖの電圧範囲を有することが好ましい。更なる交番電場は、１０^−２ｓ〜１０^−８ｓのパルス持続期間を有することが好ましい。更なる交番電場は、１０^−８ｓ〜１０^−１０ｓのパルス立ち上がり時間を有することが好ましい。

第１の交番電場、並びに任意の第２の交番電場及び更なる交番電場は、複数の電極を用いて媒体に印加されることが好ましい。複数の電極は、櫛型電極構造の形態であることが好ましい。櫛型電極構造の例を図１に示す。図１は、金櫛型微小電極構造の完全マスクレイアウトを示し、４つのデバイスチップと、アラインメントマスクと、リフトオフ処理の速度を上げるためのダミー金属線とを備える。各電極のディジット数（Ｎ）は５〜１０であることが好ましい。各ディジットの長さ（Ｌ）は７５μｍ〜１５０μｍであることが好ましい。各ディジットの幅（Ｗ）及び各ディジット間のギャップ幅（Ｇ）は、それぞれ１．５μｍ〜１０μｍであることが好ましく、ＷとＧとは同じであることが好ましい。

本発明で用いることができる電極構造の例を図２、図３、及び図４にも示す。

図２は、金櫛型微小電極構造の完全マスクレイアウトを示し、４つのデバイスチップと、アラインメントマスクと、リフトオフ処理の速度を上げるためのダミー金属線とを備える。

図３は、チップの個々のレイアウトを示し、該チップは４つとも同一であり、１０μｍの櫛型電極対装置構造と、相互接続と、接着パッドと、フレームアラインメントマーカーとを備える。各電極は、ディジットの幅及びディジット間の間隔が１０μｍであり、ディジットの長さが１５０μｍである５つのディジットを有する。

図４は、マスクデザインを示し、チップのラベル及び１．５μｍの櫛型構造部分の拡大図を示す。

図５は、誘電泳動（ＤＥＰ）測定に用いられる金櫛型電極のナイキストプロットを示す。

図６は、ポリスチレンビーズ溶液中の金電極（ＩＤＥ）を示す。ＩＤＥは５０ＭＨｚにおいて７Ｖの交流電場に接続されていた。

図７は、ポリスチレンビーズ溶液中の金ＩＤＥ電極を示す。周波数１００ｋＨｚで様々な電圧を印加した場合の画像を記録した。（ａ）２Ｖ、（ｂ）４Ｖ、（ｃ）６Ｖ、及び（ｄ）８Ｖ。

図８は、ポリスチレンビーズ溶液中の金ＩＤＥ電極を示す。様々な時間間隔にて周波数１００ｋＶで８Ｖの電圧を印加した場合の画像を記録した。（ａ）Ｆｉｅｌｄ ＯＦＦリファレンス時間、（ｂ）Ｆｉｅｌｄ ＯＮ（１５秒）、（ｃ）Ｆｉｅｌｄ ＯＮ（４５秒）、及び（ｄ）Ｆｉｅｌｄ ＯＮ（２分）。

図９は、ポリスチレンビーズ溶液中の金ＩＤＥ電極を示す。様々な時間間隔にて周波数２０ｋＶで５Ｖの電圧を印加した場合の画像を記録した。（ａ）Ｆｉｅｌｄ ＯＦＦリファレンス時間、（ｂ）Ｆｉｅｌｄ ＯＮ（１５秒）、（ｃ）Ｆｉｅｌｄ ＯＮ（４５秒）、及び（ｄ）Ｆｉｅｌｄ ＯＮ（２分）。

図１０は、ポリスチレンビーズ溶液中の金ＩＤＥ電極を示す。様々な時間間隔にて周波数２０ｋＶで８Ｖの電圧を印加した場合の画像を記録した。（ａ）Ｆｉｅｌｄ ＯＦＦリファレンス時間、（ｂ）Ｆｉｅｌｄ ＯＮ（１２秒）、（ｃ）Ｆｉｅｌｄ ＯＮ（１５秒）、（ｄ）Ｆｉｅｌｄ ＯＮ（１分５秒）、（ｅ）Ｆｉｅｌｄ ＯＮ（２分）、（ｆ）Ｆｉｅｌｄ ＯＮ（１０分）、及び（ｇ）Ｆｉｅｌｄ ＯＮ（３０分）。

図１１は、１ｎＭのＱｄｏｔｓ蒸留水溶液中の金ＩＤＥ電極を示す。（ａ）Ｆｉｅｌｄ ＯＦＦ、（ｂ）ＩＤＥを６分間１ＭＨｚで２Ｖの交流電場に接続した、（ｃ）分極が逆であること以外（ｂ）と同様である、（ｄ）電場なしに蒸留水中に１２時間放置した後に電極を測定した。

図１２は、１ｎＭのＱｄｏｔｓ蒸留水溶液中の３つの金ＩＤＥ電極を示す。各電極は、（ａ）２０ｋＨｚ、（ｂ）１００ｋＨｚ、及び（ｃ）１ＭＨｚで２Ｖの交流電場に６分間接続された。

図１３は、損傷を受けたＩＤＥの透過像を示す。該像は２０ｋＨｚで５Ｖの交流電場を印加した後記録した。

図１４は、Ｑｄｏｔｓ−３ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファの１ｎＭ溶液（ｐＨ６．９）中において相補的プローブが固定されている金ＩＤＥ電極を示す。（ａ）Ｆｉｅｌｄ ｏｆｆ、（ｂ）ＩＤＥを６分間１００ｋＨｚで２Ｖの交流電場に接続した、（ｃ）ＩＤＥを更に６分間１００ｋＨｚで２．５Ｖの交流電場に接続した。

図１５は、１０分間１００ｋＨｚで２．５Ｖの交流電場に接続され、相補的プローブが固定化されている２つの金ＩＤＥ電極を示す。（ａ）１ｎＭのＱｄｏｔｓ及び１ｎＭの標的、（ｂ）１ｎＭのＱｄｏｔｓ及び１０ｎＭの標的を含有している３ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファに電極を浸漬した。（ｃ）はＳＳＣ＋ＳＤＳ溶液で洗浄した後の（ｂ）を示す。

本発明に係る方法を用いてアナライトを精製する、アナライトを単離する、或いはアナライトを選別することができる。本発明に係る方法は、サンプル中のアナライトの存在或いは非存在を検出するアッセイ方法であることが好ましい。この実施形態では、アッセイ方法はサンプルの定量を含んでもよい。

１つの実施形態では、本発明に係る方法は、アナライトを結合相に結合させた後に１以上の洗浄工程を更に含む。この実施形態では、上述のように非結合アナライト及び非特異的結合アナライトの少なくともいずれかを除去するために交番電場を印加してもよい。

サンプル中のアナライトを精製、単離、選別、及び定量する技術は当業者に周知であり、したがって本発明に係る方法は、必要なアナライトに特定の処理を施すために容易に適合させることができる。

交番電場を印加するために用いられる複数の電極が結合相である１つの実施形態では、光学的に或いは電気化学的に（例えば電気化学インピーダンス分光法、ＥＩＳにより）電極においてＤＮＡなどの結合アナライトを検出することができる。

本発明に係る方法を用いてアナライトを単離する場合、方法はアナライトが結合している結合相を媒体から分離する工程を更に含んでいてもよい。結合相を媒体から分離する方法として当業者に知られている従来の分離工程のいずれも適用可能である。本方法はまた、アナライトを結合相から溶出させる工程を更に含んでいてもよい。

本発明に係る方法は、大規模環境或いは微小規模環境で用いることができる。方法を大規模環境で用いる場合、洗浄工程後結合相にアナライトが結合したときにアナライトを検出することができる。方法を微小規模環境で用いる場合、更に下流の処理及び分析のために結合相及び媒体からアナライトを分離する必要がある場合がある。典型的には本方法は、マイクロ流体装置或いはナノ流体装置などの流体装置で用いることができる。

本発明に係る方法は、サンプルを電気化学的条件或いは化学的条件に供しサンプルを溶解させることを含む溶解工程を更に含んでいてもよい。本発明に係る方法はまた、サンプルが細胞を含むときトランスフェクション工程を更に含んでいてもよく、例えばエレクトロポレーションと呼ばれる技術を本方法で用いることができる。

結合相はアナライトに結合することができなければならないが、いずれかの特定の物質に限定されるものではない。当業者は検出されるアナライトに応じて本方法で用いるのに好適な結合相を容易に選択することができる。様々な物質がアナライトに結合することが知られており、例えば核酸に結合する固相としては、シリカ系物質、ポリマー物質、及びガラスなどの他の物質が挙げられる。固相の形態としては、シート、濾紙、篩、焼結物、ウェブ、及び繊維が挙げられる。磁性粒子或いは磁性ビーズを含む粒子或いはビーズが特に有用である。その理由は該粒子或いはビーズをカラムに充填する、或いは懸濁液に用いることができ、該粒子或いはビーズが高結合能を有するためである。

アナライトが結合相に直接結合してもよく、或いは検出されるアナライトに対して特異的であり、固相上にアナライトを捕捉するためにアナライトと反応することができる捕捉プローブを固相が含んでいてもよい。例えばＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーションにより特異的ＤＮＡ標的配列を捕捉することができる。当業者は検出されるアナライトに応じて好適な捕捉プローブを容易に使用することができる。

１つの実施形態では、結合相は交番電場を印加する１以上の電極である。この実施形態はアナライトがＤＮＡであるときに特に好適であり、この場合ＤＮＡは電極の高電場領域に集積する。

この実施形態では、アナライトが結合相に直接結合してもよく、或いはアナライトに対して特異的であり、アナライトと反応することができる捕捉プローブを電極に固定化してアナライトを捕捉させてもよい。

本発明の方法で用いられる媒体は、液体、ゲル、及び緩衝溶液を含む任意の好適な媒体であり、アナライトは媒体を通して移動し、結合相に結合することが可能になる。媒体はまた、交番電場の流れを促進する電解質を含んでいてもよく、正の誘電泳動を得るために媒体の分極性がアナライトの分極性より低いことが好ましい。

当業者は検出されるアナライトの種類に応じて好適な媒体を選択することができる。

本発明に係るアッセイ装置は、上記のように本発明の方法を実施するのに好適である。媒体及び結合相は本発明の方法に関して上記の通りである。

電場源は２つの交番電場を同時に或いは連続して印加できることが好ましく、該交番電場は周波数、パルス持続期間、及びパルス立ち上がり時間の少なくともいずれかを含むパラメータの独自の組み合わせを各々有する。交番電場の少なくとも１つは複数のパルスで構成されている。１つの実施形態では、各交番電場は複数のパルスで構成されている。交番電場は同時に或いは連続して印加され得る。１つの実施形態では、電場源は１以上の更なる交番電場を印加することもでき、各交番電場が複数のパルスで構成されており、周波数、パルス持続期間、及びパルス立ち上がり時間の少なくともいずれかを含むパラメータの独自の組み合わせを有することが好ましい。

アッセイ装置における電場源は複数の電極を備えることが好ましい。この実施形態では、複数の電極は図１〜４に示すような櫛型電極構造の形態であってもよく、本発明の方法に関して上で論じた通りであってもよい。

１つの実施形態では、本発明に係る装置は、結合相を形成するマイクロスポットのマイクロアレイを含むマイクロチップの形態であってもよく、固定化オリゴヌクレオチドなどのプローブ分子及び微小電極配置を備えることが好ましい。マイクロチップ及びマイクロアレイは当業者に周知である。

典型的には本装置は、マイクロ流体装置或いはナノ流体装置などの流体装置であってもよい。

本発明はまた、サンプルに影響を与えるための２以上の交番電場、及びアナライトに結合することができる結合相の少なくともいずれかの使用を提供する。各交番電場は複数のパルスで構成されていることが好ましい。好ましい実施形態では、各交番電場は、他の全ての交番電場の周波数、パルス持続期間及びパルス立ち上がり時間の組み合わせに対して、周波数、パルス持続期間及びパルス立ち上がり時間の独自の組み合わせを有することが好ましい。アナライトの結合相への移動、及びアナライトの結合相への結合の少なくともいずれかを制御するように、サンプル及び結合相の少なくともいずれかが影響を受けることが好ましい。

本発明はまた、１以上の交番電場の使用であって、各交番電場が複数のパルスで構成されており、サンプル及びアナライトに結合することができる結合相に影響を及ぼす使用を提供する。

上述のように本発明は、２つの交番電場の印加或いは１以上のパルス状交番電場の印加を用いて、サンプルを処理するときの特定の事象を制御できることに基づいて行われ、該事象としてはバルク溶液から検出器の結合相への標的アナライトの輸送、及びアナライトの結合相への結合が挙げられる。したがって処理方法は迅速且つ高感度である。本発明は核酸（例えばＤＮＡ）アッセイに対して特に有用であり、その理由はＤＮＡが分極可能であるため交番電場において移動するからである。しかし本発明は、当業者に周知である様々なアナライトに対する多くの様々な種類のアッセイに使用することができる。

以下の実施例では、電気化学インピーダンス分光法（ＥＩＳ）及び蛍光検出により、本発明で用いられる交流電場印加のハイブリダイゼーション効率に対する効果を調べた。

プロトコル
２種のサンプル：蛍光標識されている１μｍのポリスチレンビーズ及びＱｄｏｔ６０５−ストレプトアビジンコンジュゲートについて調べた。直径１μｍのポリスチレンビーズをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。１００μＬの２％ビーズ溶液を４．９ｍＬの蒸留水で希釈した。Ｑｄｏｔの１ｎＭ溶液も蒸留水を用いて調製した。

櫛型電極（ＩＤＥ）のインピーダンスを測定することにより実験前に電極制御を実施した。１ＭＨｚ〜０．１Ｈｚの周波数において１０ｍＶのｒｍｓ振幅電圧を定電位で電極に印加することにより、１０ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−溶液において電極制御を実施した。観察された特徴的な半円（図５）により、ＩＤＥ電極及び接続が両方共適切に機能していることが確認された。

フローセルを空にし、蒸留水で電極を十分洗浄した後、ポリスチレンビーズ溶液をフローセルに注入し、５０ＭＨｚパルス発生器（ＨＰ８１１２Ａ）により定電位を置換した。４７０ｎｍのパルス状レーザーダイオードを用いてサンプルを励起させ、１０倍の対物レンズを通して蛍光を補集し、５３５ｎｍ４０ｎｍ帯域通過フィルタを介して冷却ＥＭＣＣＤカメラ（−７０℃）に送信した。

ミクロスフィアの誘電泳動（ＤＥＰ）
５０ＭＨｚ〜２０ｋＨｚに亘る周波数範囲、及び最高８Ｖの印加ピーク電圧において観察されるＤＥＰに対する、印加される交流電圧（延いては電場）の大きさ及びＩＤＥに印加される周波数の効果を実験的に研究した。

最高周波数では、比較的高電圧が印加されたときでさえも、ビーズが視野内で均一に分布することが観察された。これは７Ｖ、５０ＭＨｚで明らかに観察された（図６）。

周波数を１００ｋＨｚに低下させると、ビーズの再編成を観察することができるようになった。図７は、様々な印加電圧に対応する一連の画像を示す。６Ｖ（図７（ｃ））では、上方の電極の頂上部が明るくなることが観察できる。８Ｖでは、ＩＤＥ全体に電場形状を示す暗領域が現れ始める。ＩＤＥにおけるビーズ濃縮は、図示されるように（図８）最初の１分で明らかになるが、この周波数においては反応が依然として比較的弱い。

５Ｖの印加ピーク電圧で周波数を２０ｋＨｚに低下させたとき、図示されるように（図９）シグナルは著しく明るくなる。図１０は８Ｖの電圧を印加したときに記録した一連の画像を示す。電極間の間隔が１０μｍであるとき、電極全体の実効値（ｒｍｓ）電場は約５．７×１０^５Ｖ／ｍであり、局所増強により電極の先端部では更に高い。図１０に示される時系列は、ビーズは先ず櫛先端部（電極の頂上部）に凝縮され始め、徐々に電極の指状部（ｆｉｎｇｅｒ）の長さ全体を広がることを示す。

量子ドット及び結合標的ＤＮＡと結合している量子ドットのＤＥＰ
金ＩＤＥにおけるＱｄｏｔのトラップについて調べるために一連の実験を実施した。比較的小さいＤＮＡ断片（１０ｋｂｐ未満）のトラップは、１０^７Ｖ ｒｍｓ ｍ^−１の桁の極めて高い電場強度を必要とする。しかし比較的大きいＱｄｏｔの反応はこれよりも大きいはずである。本アプローチではＤＥＰベクターとしてＱｄｏｔ標識を用い、電極におけるストレプトアビジン−ビオチン相互作用を介してＱｄｏｔに結合している標的ＤＮＡをトラップし、その結果より低電場強度を用いて局在化ＤＮＡ濃縮を達成する。以下の溶液を用いて３種の実験を実施した：Ｑｄｏｔの蒸留水溶液、ＱｄｏｔのＨＥＰＥＳバッファ溶液（ハイブリダイゼーションに必要）、及び最後にＱｄｏｔ標識されている標的のＨＥＰＥＳバッファ溶液。

図１１は、蒸留水に溶解させた１ｎＭのＱｄｏｔに浸漬されている電極を示す。数分間交流電場を印加したとき（ここでは１ＭＨｚ、２Ｖピーク電圧）、Ｑｄｏｔが電極の指状部周辺に濃縮しているのが見られ、これによってＩＤＥ対において誘引されている（ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ）電極の形状を明らかに示す（図１１（ｂ））。極性を逆にしたとき、予想された通り、また図１１（ｃ）に図示されているように、反対側の電極に誘引される。一旦Ｑｄｏｔが電極に濃縮されると、Ｑｄｏｔは図１１（ｄ）に示すように電極に留まる傾向があり、電極は蒸留水中に１２時間放置した後でさえも強いシグナルを発している。これは高濃度Ｑｄｏｔ凝集及び電極吸着と一致する。

次いで広範囲に亘る周波数について上記実験を繰り返した。図１２は、２０ｋＨｚ、１００ｋＨｚ、及び１ＭＨｚにおいて２Ｖの交流電場を印加したときに得られる結果を示す。最低周波数では（図１２（ａ））、電場強度が最も高い電極指状部の先端にＱｄｏｔの大部分が誘引される。高周波数では（図１２（ｂ）及び図１２（ｃ））、ナノ粒子がより均一に誘引されているのが観察された。典型的に２ボルト〜３ボルト（２×１０^５Ｖ ｒｍｓ ｍ^−１の桁の）のピーク電圧を印加した場合１００ｋＨｚで最良の結果が得られた。より高電圧にすると、気泡が形成され、図１３に示すように最終的には電極の損傷が観察された（この写真は電極が１つのみ存在し、他の電極は完全に切り離されていることを示す）。

ハイブリダイゼーションは、ＳＳＣなどのバッファ溶液中で通常実施される。しかしかかる溶液は、これらＤＥＰ実験と組み合わせて用いられるときそれ程好ましい結果をもたらさないことが示されている。この作用を避けるために、伝導率約２０μＳ ｃｍ^−１の代替ハイブリダイゼーションバッファであるＨＥＰＥＳ（３ｍＭ、１ｍＭのＮａＯＨを含む、ｐＨ６．９）中においてＱｄｏｔのＤＥＰを調べた。提示された結果（図１４）は、６分及び１２分後ＤＥＰにより誘引された電極においてＱｄｏｔが成功裏に増加することを示す。

最後に１ｎＭ及び１０ｎＭの標的濃度についてＱｄｏｔ標識標的ＤＮＡのＤＥＰを示す（図１５）。図１５（ａ）及び１５（ｂ）は、Ｑｄｏｔ標識のＤＥＰを介して電極にこの標識ＤＮＡが効率的に濃縮され得ることを示す。Ｑｄｏｔとは異なり、Ｑｄｏｔ標識ＤＮＡは電極表面に不可逆的に吸着されないように見えることは興味深い（図１５（ｃ））。

結論
上記結果は、正のＤＥＰを用いてポリスチレンビーズ及びナノクリスタルＱｄｏｔの両方を電極表面に誘引し、濃縮させ得ることを示す。ビーズ及びＱｄｏｔは官能化され、標識としてＤＮＡに結合することができるため、これら種のＤＥＰを用いて、ハイブリダイゼーション適合性溶液中で患者に近い環境に必要なタイムスケールにて電極における特異的標識標的の濃縮を検出することができる。これは蛍光検出及びＤＥＰ輸送に対してＤＮＡのＱｄｏｔ標識を用いるという可能性を開き、ハイブリダイゼーションプロセスを高速化する可能性がある。

より詳細にはプローブで改質された櫛型金微小電極に対する標的ＤＮＡのハイブリダイゼーション中に交流電場を印加することによりハイブリダイゼーション効率が実質的に上昇し、該ハイブリダイゼーション効率の上昇により非相補的ＤＮＡの非特異的結合を明らかに区別することができる。

交流電場印加後の反応は、交流電場無しのハイブリダイゼーションと比べて１桁高かった。また標的ＤＮＡの非存在下における交流電場印加の５分以内に電子移動抵抗の増加が観察された。該増加は、電子を標的分子に対してより接近可能にする表面結合プローブ層の再配向で説明することができる。

要約すると、理論に縛られるものではないが、交流電場印加中のハイブリダイゼーション効率上昇は、プローブ層の再配向により、標的オリゴヌクレオチドの交流電場誘導性誘電泳動トラップによる局所標的濃縮の増加により、或いはこれら現象の両方の組み合わせにより惹起された可能性がある。

櫛型電極の部位にアナライトを濃縮させられる可能性を更に調べるために、１μｍの大きさの蛍光ミクロスフィアの誘電泳動性トラップ、及び複合検出の設定におけるストレプトアビジン／量子ドット−コンジュゲートに対する広範囲に亘る周波数及び振幅電圧の効果を試験し、その結果をＴＩＲＦにより分析した。これら実験は、振幅５Ｖ〜８Ｖで２０ｋＨｚの交流電場を印加した櫛型電極の表面上にビーズ及びＱｄｏｔが濃縮されたことを示した。表面に固定化されているプローブの部位にＱｄｏｔ−ストレプトアビジンコンジュゲートを濃縮させられる可能性は、ビオチン化検出プローブ或いはビオチン化二次抗体を介して任意の種類の標的を濃縮させられる可能性に関連していると考えられる。

Claims (23)

1. サンプルを処理する方法であって、
   ａ）アナライトに結合することができる結合相と前記サンプルとを媒体の存在下で接触させる工程と、
   ｂ）複数のパルスで構成され、第１の周波数、第１のパルス持続期間、及び第１のパルス立ち上がり時間を有する第１の交番電場を前記媒体に印加する工程と、
   ｃ）第２の交番電場を媒体に印加する工程であって、前記第２の交番電場が複数のパルスで構成されており、第２の周波数、第２のパルス持続期間、及び第２のパルス立ち上がり時間を有する工程と、
   ｄ）それにより前記媒体中の前記サンプル及び前記結合相の少なくともいずれかに影響を及ぼす工程であって、前記サンプル及び前記結合相の少なくともいずれかに影響を及ぼす工程が、前記アナライトの前記媒体を通じた移動における加速度及び速度を最適化するために、前記交番電場における、前記パルス立ち上がり時間、前記周波数及び前記パルス持続期間を設定することを含む工程と、
   を含み、
   前記第１の交番電場が、前記媒体を通じて結合相に前記アナライトを移動させ、
   前記第２の交番電場が、前記アナライトの前記結合相への結合を促進し、
   前記第１の交番電場及び前記第２の交番電場が、異なるパルス持続期間及び異なるパルス立ち上がり時間の少なくともいずれかを有し、
   前記第２の交番電場が、１０ ^−２ ｓ〜１０ ^−８ ｓのパルス持続期間、及び１０ ^−８ ｓ〜１０ ^−１０ ｓのパルス立ち上がり時間を有することを特徴とする方法。
2. サンプルに対する影響が、媒体を通じて結合相にアナライトを移動させることを含む請求項１に記載の方法。
3. サンプル及び結合相の少なくともいずれかに対する影響が、アナライトの結合相への結合を促進することを含む請求項１から２のいずれかに記載の方法。
4. 第１の交番電場及び前記第２の交番電場の少なくともいずれかが０．１Ｈｚ〜１０ ^１０ Ｈｚの周波数を有する請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. 第１の交番電場が１０ｋＶ／ｍ〜１００ＭＶ／ｍの電場強度を有し、前記第２の交番電場が１０ｋＶ／ｍ〜１００ＭＶ／ｍの電場強度を有する請求項１から４のいずれかに記載の方法。
6. 第１の交番電場が１０ ^−２ ｓ〜１０ ^−８ ｓのパルス持続期間を有する請求項１から５のいずれかに記載の方法。
7. 第１の交番電場が１０ ^−８ ｓ〜１０ ^−１０ ｓのパルス立ち上がり時間を有する請求項１から６のいずれかに記載の方法。
8. 第１の交番電場が１０ ^２ Ｈｚ〜１０ ^９ Ｈｚの周波数を有し、前記第２の交番電場が１０ ^２ Ｈｚ〜１０ ^９ Ｈｚの周波数を有する請求項１から７のいずれかに記載の方法。
9. 第１の交番電場が１ｍＶ〜１０Ｖの電圧を有し、前記第２の交番電場が１ｍＶ〜１０Ｖの電圧を有する請求項１から８のいずれかに記載の方法。
10. 第１の交番電場及び前記第２の交番電場がそれぞれ独立して正弦波、矩形波、鋸歯状波、及び三角波から選択される波形を有する請求項１から９のいずれかに記載の方法。
11. 第１の交番電場及び前記第２の交番電場が同時に或いは連続して印加される請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
12. 更なる交番電場を印加する１以上の工程を更に含む請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
13. 更なる交番電場のそれぞれの周波数が、他の全ての交番電場の周波数のいずれとも異なる請求項１２に記載の方法。
14. 更なる交番電場のそれぞれが複数のパルスで構成されている請求項１２から１３のいずれかに記載の方法。
15. 更なる交番電場のそれぞれの周波数、パルス持続期間、及びパルス立ち上がり時間の組み合わせが、他の全ての交番電場の周波数、パルス持続期間、及びパルス立ち上がり時間の組み合わせのいずれとも異なる請求項１４に記載の方法。
16. 方法が、サンプル中にアナライトが存在するか否かを検出するアッセイ方法、サンプル中のアナライトを精製するアッセイ方法、サンプル中のアナライトを単離するアッセイ方法、或いはサンプル中のアナライトを選別するアッセイ方法である請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
17. 方法がサンプル中のアナライトの存在を検出する方法であって、前記方法が前記アナライトを定量することを含む請求項１６に記載の方法。
18. サンプルを溶解させる条件にサンプルを供することを含む溶解工程を更に含む請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
19. アナライトが細胞、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド断片、アミノ酸、或いはＤＮＡ及びＲＮＡのいずれかなどの核酸から選択される１以上の化合物を含む請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
20. 結合相が捕捉プローブを備え、前記捕捉プローブがアナライトと反応して前記結合相上に前記アナライトを捕捉することができる請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
21. 捕捉プローブの位置及び配向の少なくともいずれかが影響を受け、アナライトの捕捉プローブへの結合を促進する請求項２０に記載の方法。
22. 結合相が複数の電極である請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
23. サンプルとアナライトに結合することができる結合相との少なくともいずれかに媒体の存在下で影響を及ぼす２以上の交番電場の使用であって、
    前記２以上の交番電場が、第１の交番電場及び第２の交番電場を有し、
    各交番電場が複数のパルスで構成され、周波数、パルス持続期間、及びパルス立ち上がり時間を有し、
    前記使用が、前記アナライトの前記媒体を通じた移動における加速度及び速度を最適化するために、各交番電場における、前記パルス立ち上がり時間、前記周波数及び前記パルス持続期間を設定することを含み、
    前記第１の交番電場が、前記媒体を通じて結合相に前記アナライトを移動させ、
    前記第２の交番電場が、前記アナライトの前記結合相への結合を促進し、
    前記第１の交番電場及び前記第２の交番電場が、異なるパルス持続期間及び異なるパルス立ち上がり時間の少なくともいずれかを有し、
    前記第２の交番電場が、１０ ^−２ ｓ〜１０ ^−８ ｓのパルス持続期間、及び１０ ^−８ ｓ〜１０ ^−１０ ｓのパルス立ち上がり時間を有することを特徴とする使用。