JP5485219B2

JP5485219B2 - 粒子を運動および濃縮させるためのスコダ泳動ならびに方法および装置

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Publication number: JP5485219B2
Application number: JP2011098568A
Authority: JP
Inventors: アンドレア、マージアリ; ローン、ホワイトヘッド
Original assignee: University of British Columbia
Current assignee: University of British Columbia
Priority date: 2004-02-02
Filing date: 2011-04-26
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2025-02-02
Also published as: US20130292249A1; US20090139867A1; US8480871B2; US20120160682A1; CA2552262A1; US8133371B2; JP2011206769A; WO2005072854A1; CA2552262C; US9534304B2; EP1720636A1; JP2007526823A; EP1720636A4

Description

関連出願との相互参照

この出願は、参考のためここに組み込まれる２００４年２月２日付で出願されたＵＳ出願Ｎｏ．６０／５４０，３５２、および参考のためここに組み込まれる２００４年１２月１０日付で出願されたＵＳ６０／６３４，６０４の出願日の利益を主張している。

本発明は、粒子を運動および濃縮させるための方法および装置に関する。本発明は、例えば広範囲のタイプの粒子を運動および／または濃縮させる上で、用途を有する。本発明の態様により運動および／または濃縮させる粒子の一部例として、分子、例えば核酸、タンパク質、他の生体高分子、無機または無機イオン、および適切な磁性粒子を含めた分子サイズおよびそれ以上の他の粒子、および他の粒子がある。

背景

病原体およびある病気は、環境サンプル、体液、水または他の汚染溶液で病原体または病気に関連したＤＮＡを検出することにより、環境または患者で特定されうる。ＤＮＡは犯行現場および関連証拠からも抽出されうる。ＤＮＡが特定される前に、ＤＮＡを濃縮させておくことが通常必要である。ＤＮＡは濾過により濃縮される。しかしながら、濾過技術は非効率的である。ＤＮＡ、ウイルスなどを捕捉しうるほど目の細かいフィルターは、他のデブリで容易に詰まってしまう。汚染溶液からＤＮＡおよび類似物質を濃縮および／または比較的純粋なＤＮＡを抽出しうる技術について、一般的な必要性がある。

面倒なおよび／または費用のかかる精製方法が、生化学アッセイ用に核酸を含有したサンプルを調製する上でよく用いられている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡおよびＲＮＡのような核酸の濃度を増すために用いられる。しかしながら、特に大容量サンプルの場合、ＰＣＲは望ましくないほど高価になることがある。

電気泳動は、媒体に電場を掛けることにより、ゲルまたは液体溶液のような媒体中で荷電粒子の運動を方向づけている。電流が媒体中へ流れるように、媒体と接触して置かれた電極に電位を掛けることで、電場が発生される。媒体中における粒子の運動は、電場の大きさおよび方向、粒子の電気泳動移動度および媒体の粘度のような機械的性質により影響される。電気泳動により、媒体中に分配された粒子が媒体中で運ばれる。電気泳動は核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）をゲル基質で運ぶために常用されている。異なる種は異なる電気泳動移動度を有しているため、電気泳動は互いに異なる種を分離させるために用いられる。従来の電気泳動技術は、荷電粒子の線状分離に適用が主として限定されている。従来の電気泳動技術を用いると、媒体中の粒子が電極の方へ運ばれるように、直流（ＤＣ）電場または交互パルスフィールド電気泳動（ＰＦＧＥ）場が典型的には媒体に掛けられる。

電気泳動は、ＤＮＡまたは他の微視的な荷電粒子のフラグメントを運ぶために用いられる。様々な電気泳動法がSlater,G.W.et al.,Electrophoresis,2000,21,3873-3887で記載されている。電気泳動粒子輸送は、典型的には、適切な電気泳動ゲルの両側で電極間に直流（ＤＣ）電場を掛けることにより、一次元で行われる。電場はゲル中の荷電粒子を電極の一方へ動かせる。電気泳動は互いに異なるタイプの粒子を分離する上で典型的に用いられる。

電気泳動は、特定の箇所で粒子を濃縮させるためにも用いうる。一部の用途において粒子を濃縮させる上で電気泳動の使用成功を妨げうる問題は、粒子が濃縮される箇所に電極が存在しなければならないことである。電極と粒子との電気化学的相互作用は、ある種の粒子を分解してしまうことがある。例えば、粒子がＤＮＡを含んでなる場合、ＤＮＡは電極で電気化学的相互作用により損なわれることがある。

従来の直流電気泳動に際して存在する電場は、電流を供給または減衰させる電極以外はどこでも無発散性である。電気泳動は、典型的には、粒子が電極方向へ動かされる場合に適用される。

非対称交流（ＡＣ）波形は、粒子速さと適用電場との関係の非直線性のせいで、電気泳動粒子の真ドリフトを引き起こすことがある。この効果は、Chacron,M.J.,et al.,Phys.Rev.E.,1997,56,3446-3450；Frumin,L.L.,et al.,Phys.Chem.Commun.2000,11；Frumin,L.L.,et al.,Phys.Rev.E.,2001,64,021902で記載されているように、粒子を一次元で動かせるために用いうる。

Pohl,H.A.,Dielectrophoresis:The Behavior of Neutral Matter in Nonuniform Electric Fields Cambridge University Press,Cambridge,UK,1978；Asbury,C.L.,et al.,Electrophoresis,2002,23,2658-2666；Asbury,C.L.,et al.,Biophys.J.1998,74,1024-1030は、誘電泳動が二次元以上でＤＮＡを濃縮させるために適用しうることを開示している。しかしながら、誘電泳動の実用に際しては望ましくないほど高い電場勾配を要する。

粒子が電気泳動で運ばれた媒体の部分を切り取ることにより、電気泳動で他の粒子から分離された粒子を単離しうる。様々な精製技術を用いることで、粒子が媒体から分離される。

ＤＮＡ分離に関する方法を記載した参考文献として：Slater et al.,The theory of DNA separation by capillary electrophoresis,Current Opinion in biotechnology,2003,14:58-64；２０００年１１月１４日付で発行されたSlaterらのＵＳ６，１４６，５１１；Frunin et al.,Nonlinear focusing of DNA macromolecules,Phys.Rev.E.64:021902；Griess et al.,Cyclic capillary electrophoresis,Electrophoresis,2002,23,2610-2617,Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.Weinheim(2002)がある。粒子を分離するため場の使用について記載した参考文献として：１９９９年８月１７日付で発行されたBaderらのＵＳ５，９３８，９０４；２００１年２月２７日付で発行されたBaderらのＵＳ６，１９３，８６６；Tessier et al.,Strategies for the separation of polyelectrolytes based on non-linear dynamics and entropic rachets in a simple microfluidic device,Appl.Phys.A.75,285-291(2002)；Chacron et al.,Particle trapping and self-focusing in temporally asymmetric ratchets with strong field gradients,Phys.Rev.B.56:3,3446-3550(Sept.1997)；Dean et al.,Fluctuation driven ratchets:molecular motors,Phys.Rev.Lett.72:11,1766-1769(14 March,1994)；Bier et al.,Biasing Brownian motion in different directions in a 3-state fluctuating po
tential and an application for the separation of small particles,Phys.Rev.Lett.76:22,4277-4280(27 May,1996)；Magnasco,forced thermal ratchets,Phys.Rev.Lett.71:10,1477-1481(6 Sept.1993)がある。

従来法より良く、特定の用途で従来法の制約を回避した、粒子を運動および／または濃縮させるための方法について必要性が残されている。ゲルのような媒体からＤＮＡのような物質を抽出するために有効な方法についても必要性が残されている。

発明の要旨

本発明の一面は、媒体中で粒子の運動を引き起こすための方法を提供する。該方法は、粒子を濃縮するおよび／または互いに異なるタイプの粒子を分離するために用いられる。このような方法では時変駆動場を粒子へ掛ける。駆動場は、交互に方向転換する時変駆動力を粒子へ加える。該方法は移動度変動場も粒子に掛ける。移動度変動場は：駆動場とタイプが異なるか若しくは駆動場と配向していない、または駆動場とタイプが異なり且つ駆動場と配向していない。駆動場および移動度変動場は期間中同時に掛けられ、移動度変動場は、期間中駆動場と非ゼロ相関を有するように、媒体中粒子の移動度を期間中時間依存性にする。これらの方法はＳＣＯＤＡ法と称される。

本発明の他の面は、媒体から荷電粒子を抽出するための方法および装置を提供する。これらの方法はＳＣＯＤＡにより濃縮された粒子を媒体から抽出するために適用され、ＳＣＯＤＡにより濃縮されなかった粒子を媒体から抽出するためにも適用される。抽出リザーバー中の緩衝液が、緩衝液‐ゲル界面で抽出される粒子を含有した媒体と隣接して置かれる。電極が緩衝液‐ゲル界面の各側に用意される。パルス電圧電位を電極に掛けることにより（時間平均電場はゼロである）、粒子が集合および濃縮される抽出リザーバーへゲル中の粒子を向かわせる上でゼロ積分フィールド電気泳動（ＺＩＦＥ）が緩衝液‐ゲル界面に適用される。

本発明の一面による方法は、抽出される荷電粒子を含有したゲル溶液のそばに緩衝液抽出リザーバーを置き；粒子を抽出リザーバーへ向かわせるためにＺＩＦＥを緩衝液‐ゲル界面に適用し；抽出リザーバーに粒子を集合および濃縮させることからなる。次いで、ピペットまたは他の器具が抽出リザーバーから粒子を吸引するために用いられる。

本発明の一部態様において、装置は抽出される荷電粒子を含有したゲルを入れておくゲルボートを含んでなる。少量の緩衝液を含有したキャピラリーがゲル溶液中へ挿入される。緩衝液中で集合した粒子を吸引するために、ピペットまたは他の器具がキャピラリーに用意される。電場を発生させるために、電極が緩衝液‐ゲル界面の各側に用意される。

本発明の別な面および本発明の具体的態様の特徴が以下で記載されている。

説明

以下の説明全体を通して、具体的な詳細が本発明の更に深い理解を得るために記載されている。しかしながら、本発明はこれらの詳細なしで実施してもよい。他の場合には、本発明の不必要な不明瞭化を避けるために、周知の要素は詳細に示されまたは記載されていない。したがって、明細書および図面は、限定というより、むしろ説明の意味とみなされるべきである。

スコダ泳動（scodaphoresis）（ここでは新頭字語ＳＣＯＤＡと称されている）は、媒体中で粒子を運動および／または濃縮させるための方法を表わしている。ＳＣＯＤＡは抗力変化の同期係数に関する頭字語である。“泳動”は、輸送または運搬を意味する連結形である。スコダ泳動では、運動および／または濃縮させる粒子を２つの時変場または刺激へ曝す。場の第一のものは、媒体中で粒子の動きを駆動させる力ｆ（ｔ）となる。粒子と第一場との相互作用により生じる粒子運動の方向は同調して変わる。第一場は、第一場の整数回のサイクルで平均値がゼロとなる駆動力を供する。

場の第二のものは、関数ｇ（ｔ）に従い媒体中で粒子の移動度を変える。第一および第二場は、ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）が対象の期間にわたり非ゼロ相関を有するようなものである。このような非ゼロ相関へは様々な手法で到達しうる。一部の態様において、ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）は同周波数で各々時間変動し、ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）はｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）間で実質的に一定の位相関係にあるように同期化される。他の態様では、ｆ（ｔ）はｇ（ｔ）より２倍の周波数を有する。

粒子への場の適用は粒子の真ドリフトを引き起こす。この真ドリフトは、異なるタイプの粒子を分離させるか、選択されたエリアで粒子を濃縮させるか、または双方のために利用しうる。下記のように、第一および第二場は同タイプ（同種ＳＣＯＤＡ）でもまたは異なるタイプ（異種ＳＣＯＤＡ）でもよい。

ＳＣＯＤＡの実証として、以下のケースを考えてみる：

上記においてμ_０は媒体中における粒子の非摂動移動度であり、μ_１はｇ（ｔ）への移動度の感受性である。ｇ（ｔ）の不在下で、粒子の速度は単にμ_０ｆ（ｔ）で与えられることがわかる。ｆ（ｔ）が式（１）で与えられる場合、ｆ（ｔ）のサイクルで粒子の真転位はない。しかしながら、ｇ（ｔ）が上記で与えられる場合、１サイクルでは、以下の粒子により運ばれる距離ｄを求めるために速度が積分される。：

こうして、２つの場の同時適用が粒子に正味の運動を付与する。この例で、正味の運動はμ_０に依存していない。

“粒子”は、スコダ泳動で動けるあらゆる微視的または巨視的物体を意味するために、ここでは用いられている。

ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）の相関は、下記のような適切な相関関数に従いコンピューター計算される：

上記においてＣは相関であり、Ｔは対象の期間であり、λは定時シフトである。Ｃはλのある値のとき非ゼロ値を有しなければならない。

理想的にｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）はＳＣＯＤＡの効率的操作に大きな相関を有しているが、一部のＳＣＯＤＡ運動は選択関数ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）とλの選択値がＣの小さな値をもたらす場合でも生じうる。ＳＣＯＤＡ運動をうける粒子の速度はｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）双方の関数でなければならない。更に、粒子の速度は、ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）を一緒に適用した結果として、ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）の独立した適用から得られる速度の合計と同一であってはならない。即ち：

スコダ泳動にとり便利ではあるが、必要でない一組の条件は：

上記において、粒子が駆動場ｆ（ｔ）のみと相互作用するとき、ν（ｆ（ｔ），０）は時間の関数として粒子の速度である；粒子が移動度変動場ｇ（ｔ）のみと相互作用するとき、ν（０，ｇ（ｔ））は時間の関数として粒子の速度である；および

この場合に、独立して作用する２つの場は、粒子のいかなる正味の運動も生じない。しかしながら、第一および第二場の組合せ効果によると粒子を真速度で動かせる。

ＳＣＯＤＡを最適化するためには、ｆ（ｔ）またはｇ（ｔ）による粒子の一次速度がゼロであり（そのため粒子が真ドリフトを有さず）、ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）の組合せが粒子に作用して最大速度をもたらすように、関数ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）を選択しうる。下記積分を最大化するようにｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）と位相シフトλを選択しうる：

本プロセスはこの場合に、時間０から時間Ｔまで、または可能であればｔが各期間で０からＴまで及ぶ多数の期間で実行される。

ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）が正弦関数、同一関数でまたは周期関数でさえ表わされることは必要でない。本発明の一部態様において、ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）は異なる関数である。本発明の一部態様において、ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）は周期的でない。図１Ａ〜１Ｈは、本発明の具体的態様で用いられる関数ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）の一部例を示している。

図１Ａは、ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）が双方ともサイン関数で、ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）が同位相にあるケースを示している。図１Ｂは、ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）が双方ともサイン関数で、ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）が異位相にあるケースを示している。下記のように、粒子が動かされる方向は、ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）の相対位相を変えることで逆転される。

図１Ｃは、ｇ（ｔ）がアンバランスであるケースを示している。図１Ｃにおいて、ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）は双方とも三角関数である。図１Ｃにおいて、ｇ（ｔ）はｆ（ｔ）の場合の半分の周波数を有している。図１Ｄにおいて、ｆ（ｔ）は四角波形を有し、一方ｇ（ｔ）は正弦波形を有している。図１Ｅにおいて、ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）は双方とも実質的に四角波形を有している。図１Ｆにおいて、ｆ（ｔ）およびｇ（ｔ）は双方とも変動周波数を有している。図１Ｇにおいて、ｆ（ｔ）は本質的にランダムなノイズであり、ｆ（ｔ）が閾値７を超えるときにｇ（ｔ）は（任意の単位で）１の値を有し、それ以外では０の値を有している。図１Ｈにおいて、ｇ（ｔ）は一連の短期インパルスの形を有している。

他の例として、２ｎπ／ω＜ｔ＜（２ｎ＋１）π／ωのときｆ（ｔ）＝ｓｉｎ（ωｔ），ｇ（ｔ）＝１
上記においてｎはいずれかの整数または整数の組（例えば、ｎ∈｛１，２，３，…｝またはｎ∈｛２，４，６，…｝またはｎ∈｛１，４，７，…｝）である。整数ｎは規則的に間隔をあける必要はない。例えば、本発明の方法は、整数ｎの組が非周期的連続からなるケースで機能するようにできる。それ以外の周期的波形ｆ（ｔ）またはｇ（ｔ）は、例えば、波形の谷（またはピーク）をランダムに省くことにより非周期的にできる。

図１Ｉは、ｆ（ｔ）がｇ（ｔ）の場合の２倍の周波数を有するケースを示している。図１Ｉの波形は、例えば粒子の移動度が｜ｇ（ｔ）｜に応じて変わる、ＳＣＯＤＡ運動を生じうる。｜ｇ（ｔ）｜がｆ（ｔ）の負行ピークよりｆ（ｔ）の正行ピークの場合に大きな値を有することがわかる。

図１Ａ〜１Ｉのほとんどで示された波形が対称的である（即ち、それらは空間方向で反転されても同様の全体形状を有する）が、これは強制的ではない。ｆ（ｔ）は一般的に非対称である。
駆動場

ｆ（ｔ）は媒体中で粒子の動きを駆動しているため、それは駆動関数としてここでは称されている。本発明の異なる態様において、ｆ（ｔ）は異なるタイプの場により作られる。例えば、ｆ（ｔ）は下記のいずれかにより作られる：
・時変電場；
・時変磁場；
・媒体中の時変流；
・媒体中ある種の時変密度勾配；
・時変重力または加速場（例えば、粒子を含有した媒体を加速させて、重力または加速場の方向に対して媒体の向きを周期的に変えることにより得られる）；
・またはその他
一部の態様において、ｆ（ｔ）は交互に方向転換する力を粒子に加え、ここで力の大きさは各方向で同一である。他の態様において、ｆ（ｔ）は、粒子に加わる力の大きさが他よりも一方向で大きくなるように、交互に方向転換する成分と交互に方向転換しないバイアス成分とを組み合わせている。バイアス成分はＤＣ成分と称され、一方交互変換成分はＡＣ成分と称される。

駆動場は対象の粒子と相互作用するように選択される。例えば：
・粒子が荷電粒子（例えばイオン）である場合は、電場が駆動場に用いられる。電気的に中性の粒子は、電気的中性粒子に荷電粒子を結合させることにより、電場に応答性とさせられる。一部の場合、中性分子のような電気的中性粒子は、荷電分子のような荷電粒子に担持させられる。例えば、荷電ミセルと相互作用する中性タンパク質は、駆動場とミセルとの相互作用を介して電気駆動場により駆動される。
・粒子が媒体の場合と異なる誘電率を有している場合、時変勾配を有する電場が誘電泳動により媒体で粒子の動きを駆動しうる。
・粒子が磁性物質を含有している場合（例えば、対象の粒子が磁力より影響されるタイプの小さなビーズ、例えば強磁性ビーズと結合させうる場合）、磁場が駆動場に用いられる。
・粒子が媒体の場合と異なる磁化率を有している場合、媒体に対する粒子の動きを磁気泳動により駆動させるために磁場の勾配が用いられる。
・粒子が媒体の場合と異なる密度を有している場合、粒子に及ぼす重力または他の加速作用が媒体に対する粒子の動きを駆動させる。媒体を音響場に曝すことにより、ＡＣ加速が一部の態様で行われる。

駆動場は直接的に力を粒子に加えても、または間接的に粒子の運動を引き起こしてもよい。後者の例として、駆動場は生きた粒子（例えば移動性細菌）をそれら自身のある環境への好みに応じて動かせる。例えば、ある生物は光、化学勾配または磁場に向かって遊泳する（これらの現象は各々化学走性、光走性および走磁性として知られている）。
移動度変動場

粒子の移動度は様々なメカニズムに応じて変わる。例えば：
・媒体の温度を変える；
・駆動場と同調して変わる強度および／または偏光および／または波長を有した光または他の放射線に粒子を曝す；
・粒子が通過する媒体の部分へ電場を掛ける；
・粒子が通過する媒体へ磁場を掛ける（磁場は、例えば、粒子に伴う磁気双極子の向きを変え、それにより粒子の抗力の係数に影響を与えるか、または適切な磁気レオロジー流体を含んでなる媒体の粘度を変える）；
・粒子が通過する媒体の部分へ音響シグナルを加える；
・媒体で種の濃度に周期的変化を引き起こす；
・電気浸透効果を利用する；
・媒体で周期的化学変化を引き起こす；
・粒子を媒体中の他の粒子または媒体の成分と周期的に結合および解離させる；
・媒体によりうける静水圧を変える；
・媒体中の粒子によりうける有効抗力に変化をもたらすように媒体の物理的寸法を変える；
・磁場を媒体に掛ける。
電気泳動駆動場のような駆動場に応じて粒子の移動度を変える効果も用いうる。

本発明の一部態様において、粒子の移動度は粒子の速度と駆動場の強度との関係で非直線性を利用することにより変えられる。一部の態様では、第一駆動場の方向と垂直に作用する成分を有するが、第一駆動場の場合より半分の周波数である第二駆動場を掛ける。単独で適用すると、このような第二駆動場は主駆動場の方向と垂直方向で単に前後に粒子を振動させる。しかしながら、主駆動場と一緒に適用されると、このような第二駆動場は主駆動場の他方向よりも主駆動場の一方向で媒体に対して高い平均速さを粒子に付与しうる。これは粒子移動度と粒子速さとの非直線関係のおかげで粒子の真ドリフトをもたらす。一部の態様において、主駆動場は正弦、三角または四角波形のような対称波形を有している。

粒子が存在する媒体の温度は駆動場と同調して変えられる。温度変化は、粒子の形態、媒体の粘度、粒子と媒体との相互作用の強度、これらのある組合せなどのうち、１以上に変化をもたらす。その結果は、粒子の移動度が温度の変化により変わることである。媒体中各領域の温度は、以下を含めたいずれか適切な手法で制御しうる：
・媒体の当該部分に放射線を向けて、媒体の該部分を加熱する；
・媒体の当該部分と熱接触しているヒーターまたはクーラーを作動させる；
・吸熱または発熱化学反応を媒体の当該部分で（または媒体の当該部分と熱接触している箇所で）生じさせる；および
・その他
本発明の一部態様において、媒体は、放射線を吸収して、吸収された放射線エネルギーを熱として放出する物質を含んでなる。一部の態様において、動かされる粒子付近における媒体の局所加熱は、粒子自体により吸収され熱として放出される波長を有した電磁放射線で粒子を照射することにより行われる。このような態様では、加熱が粒子に局所的であるように、媒体の諸成分により有意に吸収または熱変換されない放射線の波長を選択することが有利である。

温度で変わる移動度を有した粒子の一部例は：温度を周期的に変えることで周期的に様々に変性されまたは折り畳まれるタンパク質；および周期的に変性されるＤＮＡである。

粒子が動き回る媒体のエリアを放射線に曝すと、粒子の形態、媒体の粘度、粒子と媒体との相互作用の強度、これらのある組合せなどのうち１以上を変える。その結果は、粒子の移動度が適用放射線の強度および／または偏光および／または波長の変化により変わることである。適用光により変化しうる移動度を有した粒子の一部例は、適用光により形態の可逆的変化をうけることがある、アゾベンゼンまたはスピロピラン類のような分子である。媒体中で粒子の移動度を変える光の使用の別な例は、ポリマーを含有した媒体中でポリマーの部分的架橋を行わせるための光の適用である。

媒体へ適用される電場の強度は駆動場と同調して変えてよい。一部の媒体では、あるタイプの粒子の移動度が適用電場で変わる。一部の媒体で、粒子速度は適用電場と非直線的に変わる。

媒体中粒子の移動度は、媒体へ適用される音響場の強度で変わることもある。一部の場合において、溶液または他の媒体中の音響定常波は、媒体中の粒子によりうける媒体の局所的性質（例えば、抵抗率）に一時的な差異を生じさせ、こうして駆動場（例えば、駆動電場）で局所的不均等性をもたらす。

粒子の移動度が種の濃度を変えることで制御される場合、様々な濃度を有する種は、例えば、粒子と結合する種、またはある他の種または表面もしくは他の隣接構造への粒子の結合に影響を与える種である。種は媒体の粘度に直接影響を与えてもよい。

粒子移動度を制御するための電気浸透効果の使用の例として、粒子が運動している媒体が１種以上のポリマーを含有した溶液であるケースを考えてみる。このような溶液で、適用電場はバルク流体流を引き起こせる。このような流動は、可能であれば電気浸透流の始めに非直線性を利用して、摂動刺激を圧力または流動誘導駆動力に、または摂動として電気駆動力に加えるように制御される。

粒子移動度を制御するために利用される化学変化は、例えば、以下のうち１以上で変化を誘導する：
・粒子の形態；
・ある他の粒子の形態；
・媒体中で互いのまたは他の種もしくは構造への粒子の結合；
・媒体中の種の互いの結合；媒体の粘度；または
・その他
化学変化は、例えば、架橋を光学的に誘導するか、あるいはフェロセンのような光活性分子の酸化または還元を光学的に誘導することにより、光学的に誘導される。化学変化は、化学種を媒体中へ導入することにより誘導してもよい。化学変化として：媒体のｐＨを変える変化；媒体中で１種以上の化学種の濃度を変える変化；またはその他のうち１以上もある。

粒子移動度は、様々なメカニズムに応じた適用磁場により影響される。例えば：
・媒体は小さな磁気ビーズを含有してもよい。ビーズはポリマーマトリックス中のポリマーと結合させてもよい。磁場を掛けることにより、ビーズは粒子路から引き離され、こうして粒子によりうける媒体の有効粘度を減らせる。
・媒体は、適用磁場で変わる粘度を有した磁気レオロジー流体でもよい。

磁場は、媒体粘度を二次元パターンで変えるために用いてもよい。磁場は、媒体の粘度が位置で変わるように同調して変わり、周期的駆動力に同期的摂動をもたらすように同調して変わる。他の例として、粒子自体が磁性である場合、粒子の輸送および濃縮は磁場により影響される。粒子は電気泳動で駆動される。抗力誘導表面の方へ粒子を駆動させるか、またはこのような表面からそれらを放出するように、磁場は周期的にスイッチオンされる。磁場は粒子を凝集させるために用いてもよい。
粒子

本発明の方法は、分子、イオンおよびそれより大きな微粒子を含めた、事実上あらゆる種の粒子に適用される。本発明の方法の使用により運動、濃縮および／または抽出させる粒子の一部非制限例は以下である：
・タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび適切な脂質のような電気的に荷電したまたは中性の生体高分子；長鎖ポリマー；ポリペプチド；
・ミセルまたは他の超分子アセンブリーのような分子の凝集体；
・磁気ビーズまたは荷電ビーズが付着しうる粒子；
・生きた微生物；および
・その他

いかなる特定タイプの粒子でも、適切な駆動場、媒体および移動度変動場を特定しうるよう試みることができる。多くの生体高分子は荷電しているため、このような粒子を運動および／または濃縮させる上で本発明を適用するときには、駆動場として時変電場を用いることが多くの場合に適切である。更に、磁気ビーズを特定の生体物質と結合させるためにうまく開発された技術がある。磁気ビーズと結合させうる物質を運動および／または濃縮させることが望まれる場合、磁場は駆動場として用いてもよい。
媒体

媒体は、粒子が動ける媒体であって、しかも粒子の移動度が適切な移動度変動場を掛けることで変えられる媒体でもあるように選択される。媒体として、例えば以下がある：
・アガロースゲルまたは性能最適化ポリマー（ＰＯＰ）ゲル（Perkin Elmer Corporationから入手可能）のようなゲル；
・水性またはその他の溶液；
・ポリマーのからみ合い液体溶液；
・粘稠または濃密溶液；
・運動が向けられている分子（または他の粒子）と特異的に結合するようなポリマーの溶液；
・アクリルアミド、直線状ポリアクリルアミド；
・対象の粒子が微小加工構造との頻繁な衝突または相互作用によりからみ合わされまたは遅延されうるような間隔をあけた、ポストの並びなどのような微小加工構造；
・エントロピー捕捉により分子と相互作用するような構造（例えば、Craighead et al.,Science,12 May 2000,Vol.288）；
・Pluronic^ＴＭF127（ＢＡＳＦから入手可能）のような高粘度流体；
・水；または
・その他
媒体は、粒子が動く上で適した特徴を有するように選択される。粒子がＤＮＡの粒子である場合、適切なポリマーゲルは本発明者らにより現在好まれている媒体である。本発明の一部具体的態様において、粒子はＤＮＡを含んでなり、媒体はアガロースゲルまたは適切な水溶液を含んでなる。一部の態様で、水溶液はアガロースゲルのようなゲルと混合された細菌増殖培地である。
２Ｄスコダ泳動

一部の態様において、粒子は二次元（２Ｄ）表面上で運動するように強いられる。一部の態様で、２Ｄ表面は平面である。２Ｄ表面は必ずしも平面でなくてよい。一部の態様で、２Ｄ表面は比較的薄い層の媒体、例えばゲルからなる。一部の態様で、媒体は自立している。媒体は基板に支持されてもよい。基板はガラスまたは適切なプラスチックのシート、例えばマイラーからなる。一部の態様で、媒体の２Ｄ層は基板２枚の表面間にはさまれている。媒体が露出面を有している場合、該表面は空気または他の気体雰囲気中で存在しても、あるいは適切な緩衝液、油などのような液体に浸されてもよい。一部の現在好ましい態様において、媒体は２層の厚いゲル間にはさまれたゲルの層からなる。例示態様において、粒子は２層の３％ｗ／ｖアガロースゲル間にはさまれた１％ｗ／ｖアガロースゲルの層中で運動する。

本発明の一部態様において、粒子が動き回る２Ｄ表面は、粒子の移動度を低下（または増加）させる非均一粘度または非均一濃度の種を有する媒体内の層で用意してもよい。粘度または濃度勾配は、媒体内の比較的薄い層中または媒体の表面上に粒子を残留させる。
３Ｄスコダ泳動

ＳＣＯＤＡは三次元で粒子を濃縮するために用いてもよい。これは様々な手法で実施しうる。一部の態様で、２ＤＳＣＯＤＡは平面で行われる。２ＤＳＣＯＤＡは、例えば下記の電気泳動ＳＣＯＤＡ法を用いて行われる。平面の上下に置かれたＺ電極は、平面外から再び平面中へ運動し始めるよう粒子を駆動させやすい電場を掛ける。

３ＤＳＣＯＤＡも電極６個を配置することで行え、各電極がゲルのような媒体の本体の表面上に置かれる。このような立方体のＸ、ＹおよびＺ軸を定めると、２ＤＳＣＯＤＡがＸＹ面の４電極で、次いでＹＺ面の４電極で、次いでＸＺ面の４電極で行われ、次いでＸＹ面その他で繰り返される。これは、三次元で放射状であるが、同電極電圧で２ＤＳＣＯＤＡ力の約１／３の強さである真ＳＣＯＤＡ力により、真３Ｄ集束効果を生じる。
制御システム

いかなる適切な制御メカニズムも、ＳＣＯＤＡで粒子を動かせられるよう、協調的に駆動場および移動度変動場を掛けるために用いられる。本発明の一部の態様では、粒子に及ぼす効果が相関するように、駆動場および移動度変動場の時間変動が共通源から直接誘導されている。本発明の他の態様では、駆動および移動度変動場がハードワイヤコントローラー、プログラム可能コントローラー、適切な界面エレクトロニクスを備えた汎用コンピューターなどのようなコントローラーの制御下で発生される。設計科学機器の当業者に知られているものを含めて、いかなる適切な制御メカニズムも適用しうる。
例

下記例は本発明の様々な具体的態様について示している。本発明のこれら態様は個々に発明性があるとみなされている。これらの例の一部は実施された実験を要約しており、その他は予言例である。
例１‐ＳＣＯＤＡによる粒子の電気泳動濃縮

により与えられる電場で電気泳動移動度μを有する荷電粒子を考えてみる。定義によると、粒子は下記式により与えられる速度で運動する：

式（９）から、νはゼロの時間平均を有している。μが時間の関数として変わり、μのフーリエ変換がｃｏｓ（ωｔ）に比例する成分を有しているならば、ν（ｔ）の時間平均はゼロでなくてもよい。簡単な例として、次のケースを考えてみる：
μ（ｔ）＝μ_０＋μ_１ｃｏｓ（ωｔ）（１０）
この場合に、ν（ｔ）の時間平均は以下である：

これは、適用電場の時間平均がたとえゼロであっても、非ゼロ電気泳動ドリフトがありうる、という基本原理を証明している。

今度は、粒子の移動度が電場強度の関数であるケースを考えてみる。事実上いかなる非直線性も用いうるが、粒子の速度が駆動電場の方向と平行であり、粒子の速さが下記式で与えられるケースを考えてみる：
ν＝ｋＥ^２（１２）
上記においてｋは定数であり、Ｅは電場の大きさである。この場合に、粒子の速さは電場の大きさの２乗に比例する。粒子の有効移動度（即ち、ドリフト速度の小さな変化ｄνと電場の小さな変化ｄＥとの関係）は適用電場の大きさで変わる。

デカルト座標では：

上記において粒子速さが式（１２）のように電場で変わる場合、式（１３）は下記式に換算される：

この解釈を助けるために、Ｅ_ｙ＝０でＥ_ｘ＝Ｅのケースを考えてみる。この場合に、式（１４）および（１５）は次のようになる：
ｄν_ｘ＝２ｋＥｄＥ_ｘおよびｄν_ｙ＝ｋＥｄＥ_ｙ（１６）
式（１６）から、電場の摂動の粒子速度に及ぼす影響が周囲場のものと比例する大きさを有していることがわかる。電場と同方向を有する摂動は、電場と垂直な摂動より２倍大きな粒子速度に及ぼす影響力を有している。

これは、粒子を濃縮させる適用電場を掛けるために利用しうる。適用電場が一定マグニチュードＥを有し、ｘおよびｙ方向における電場の成分が下記式で与えられるような角周波数ωの方向で電場が回転している平面を考えてみる：
Ｅ_ｘ＝Ｅｃｏｓ（ωｔ）およびＥ_ｙ＝Ｅｓｉｎ（ωｔ）（１７）
式（１７）から式（１４）および（１５）へ値を代入すると、定数項、角周波数ωを有するサインおよびコサイン項と角周波数２ωを有するサインおよびコサイン項との合計である、という結果を得る。２ωの角周波数を有するコサイン項のみが真粒子ドリフトに寄与するように、参照の枠が選択される。これらの項のみを求めると、次を得る：

周波数２ωで変わる四極場の形を有した摂動電場が式（１７）で定められる基本電場へ加えられると、粒子の真ドリフトが求められる。下記式で与えられる摂動電場の場合：
ｄＥ_ｘ＝−ｄＥ_ｑｘｃｏｓ（２ωｔ）およびｄＥ_ｙ＝−ｄＥ_ｑｙｃｏｓ（２ωｔ）（１９）
それは次のように示される：

式（２０）は、すべての位置ｒにおける荷電粒子で、移動度の場依存性を表わす係数ｋ、回転場の強度Ｅおよび摂動四極場の強度ｄＥ_ｑと比例する速さで原点の方へ時間平均ドリフトがあることを示している。

上記の計算は、摂動四極場が回転場と比べて小さな大きさを有しているケースに関する。これは必ずしも一般的ではない。図２は、回転電場および四極電場の大きさが類似しているケースで、粒子路の数値シミュレーションの結果を示している。運動は図２の上右手側で始まり、２００秒間かけて底部左側へ進む。適用電場は下記表１で記載されている通りである。渦巻き路の各ループは、各々１秒間適用された１２電圧パターンのサイクルに相当する。均一場振幅は原点（電極パターンの中心）で３８４５Ｖ／ｍである。同箇所で、電場の四極成分の大きさは、原点から１ｍｍの箇所で４．２×１０^５Ｖ／ｍ^２または約４２００Ｖ／ｍである。

多くの状況下において、電極のない領域で粒子を濃縮させることが有利である。電極での電気化学プロセスはＤＮＡおよび他の感受性物質に損傷を与えることがある。粒子集束効果を発揮する電場は、上記のように、粒子が濃縮されるようになる箇所で電極の必要性なしに掛けられる。

ドリフトで拡散のアインシュタイン‐スモルコフスキー式から、粒子が濃縮されうるスポットのサイズを求められる。濃縮スポットの半径に関する特徴的長さスケールＲは下記式で与えられる：

上記においてＤは粒子の拡散係数であり、μ_ｓはｋＥＥ_ｑ／４で与えられる。

図３は、本発明を実施するために用いられる、簡単な配置を有した装置１０を示している。アガロースゲルのようなゲルである媒体の層１１が、４つの対称的に配置された電極１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃおよび１２Ｄ（包括して電極１２）間に置かれている。メッシュ電極の形で電極１２を用意することが望ましいとわかった。電源１４は個別に制御可能な電位Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３およびＶ４を各々電極１２Ａ〜１２Ｄへかけている。重要なのは電極１２Ａ〜１２Ｄの相対電位であるため、電極１２Ａ〜１２Ｄのうちいずれか１つが０ボルトのような好都合な固定電圧に保たれ、その一方で他の電極に掛けられる電圧が所望であれば変えられる。

温度変化または電源特性の変化による小さな揺らぎに対して電気刺激を安定化させるために、電極に掛けられる電位を制御することが通常望まれる。適用された実際の電位を定めるコントローラーへフィードバックを掛けるために、別な電位反応電極が置かれてもよい。図３Ａは、メッシュ電極１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃおよび１２Ｄと別な電位反応電極１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄ（包括して電極１３）とを含んでなる装置の概略図である。大きな緩衝液リザーバー１５は、長期ランにわたり蒸発に対して緩衝液の十分な供給を維持する。絶縁バリヤ１６は隣接リザーバー１５を電気的に隔離している。電極１３は緩衝液リザーバー１５中に置かれて、緩衝液中の電位をモニターする。電極１３からのフィードバックは、メッシュ電極／緩衝液界面で電圧降下の変動を補うために、適切に設計されたコントローラー１４でメッシュ電極１２の電圧を自動的に調整させる。

適用電圧の大きさは、装置および分離される粒子のサイズと合うように選択される。アガロースゲルでＤＮＡ分離の場合、約５０Ｖ／ｃｍの電気駆動場が満足な性能を呈するとわかった。供給される電流は媒体の導電率および寸法に依存する。

電位の適用は、媒体１１中の荷電粒子を中央箇所１８の方へ動かせる。図３は濃縮領域１８の方へ動く粒子のグループ１７Ａおよび１７Ｂを示している。上記のように、適用電場が変わる正確な波形は本発明の操作上重要でない。本発明のプロトタイプ態様において、式（１６）および（１８）の電位偏差は、電極１２Ａ〜１２Ｄへ適用される一連の個別電圧のパターンにより概算される。プロトタイプにおいて、各サイクルは、次のパターンへ動く前に各々１秒間適用される、１２パターンから構成されていた。表Ｉは各パターンで適用される電圧を示している。

図３Ｂで略記された本発明のプロトタイプ態様において、媒体１１は、０．１ＸＴｒｉｓ‐酢酸‐ＥＤＴＡ緩衝液中アクリルベース上で３．８ｃｍ四方を形成する０．２５％アガロースゲル（Gibstown ＮＪ，ＵＳＡのＥＭＤ Chemicals製のAgarose 2125 OmniPur）８〜１１ｍｌから作られたゲルスラブの形をしていた。４電極をゲルに浸した。各電極はゲルボートの底から約２．５ｍｍ上にゲルボートの片側１／３で伸びていた。５００μｇ／ｍｌ λファージＤＮＡ（４８，５０２ｂｐ、Beverly ＭＡ，ＵＳＡのNew England Biolabs製のパートＮｏ．Ｎ３０１１Ｌ）８μＬを０．１ＸＴＡＥ１２μＬと混合することにより、ＤＮＡを調製した。ゲルが固化した後、ＤＮＡの５μＬスポットをゲル上にピペットで直接取った。ＴＡＥの薄層をゲル上に載せた。表Ｉの電圧パターンを電極に掛けた。ＤＮＡスポットはすべてゲルの中央エリアに運ばれることがわかった。

図４は、プロトタイプ態様で用いられたλ ＤＮＡに関する、適用電場の関数として測定ＤＮＡ速度のプロット例である。図４Ａは、ＤＮＡが集中した原点からの半径方向距離の関数として、ＤＮＡの時間平均ドリフト速度（１５分間の平均）を示したプロットである。図４Ａは、Ｘ軸の位置で始まる粒子の軌道の数値評価である曲線２１Ａ、および原点から位置Ｘ＝Ｙ＝１．５ｃｍで始まる粒子の軌道の数値評価である曲線２１Ｂを含んでいる。

図４Ｂは、数値および分析予想と比較して、時間の関数として原点からの測定ＤＮＡスポット距離を示したプロットである。スポット位置は、所定の時間間隔でみられる全スポットについて測定されている。原点から遠くで始まるスポットが原点に近いスポットの開始位置に到達する時間により、原点の近くで始まるスポットの開始時間が置き換えられるように、原点から異なる半径方向距離で始まるスポットのスポット軌道が同調してシフトされている。

図４Ｂで示された方式では、計算および観察されたスポット軌道間に良い一致があった。

プロトタイプで用いられたＤＮＡの場合、Ｄは実験によると２×１０^−１２ｍ^２／ｓであると測定された。μ_ｓは約１×１０^−３ｌ／ｓの値を有すると測定された。これらの値を用いると、限界スポットサイズが１００μｍ程度であると計算された。１５０〜２５０μｍ程度のスポット半径が実験では得られた。

他の実験では、１％アガロースゲル（０．０１ＸＴＡＥ）中４００ｎｇ／ｍｌ λ ＤＮＡの均質溶液をスコダ泳動に付した。１％アガロースゲル３ｍｌを５００ｎｇ／μＬ４８，５０２ｂｐ λ ＤＮＡ１．５μＬおよび１．５μｇ臭化エチジウム（５００ｎｇ／ｍｌ最終濃度）と混合することにより、ゲルを調製した。ゲルを約６５℃に冷却させ、次いでゲルボート中に注いだ。図３Ｂで示されているように、ゲルを十字形に配置した。直径０．０３ｍｍの白金電極１９を装置のオープン電極領域２０に置いた。電極領域からゲルを取り除き、そこを０．０１ＸＴＡＥ緩衝液で満たした。

対向電極間の距離は約２．４ｃｍであった。約９０分間後、λ ＤＮＡは半最大で約３００μｍの全幅を有するスポットとしてゲルボート中心の領域２１で濃縮されたことがわかった。該スポットにおけるλ ＤＮＡの濃度は、ゲルボートにおけるλ ＤＮＡの初期濃度と比較して、約３０００〜４０００倍に高められた。電極から離れたエリア２１でＤＮＡを濃縮させる能力は様々な分野で有利となる。

長さＬの辺を有する正方形ゲルスラブを用いて得られる濃縮ファクターＦは、おおよそで次のように計算される：

したがって、他のファクターが等しければ、ゲルスラブの寸法を増すと、濃縮ファクターを高められる。例えば、計算によると、３５ｃｍ×３５ｃｍ四方ゲルスラブが１０^６程度の濃縮ファクターを生じることを示している。最良濃度を得るためには、粒子を濃縮させるためにＳＣＯＤＡが用いられている２Ｄ表面から外への粒子の拡散を抑えるステップをとることが望ましい。

二次元の電気泳動ＳＣＯＤＡは、上記のように、２つの対向対で配置された４電極を用いると、都合よく行える。互いに同一線上にない３以上の電極の別な配置も用いうる。例えば、ＳＣＯＤＡは三角のかどに配置された３電極を用いて行える。ＳＣＯＤＡは媒体の領域の周囲に配置された５以上の電極を用いて行ってもよい。

電流を媒体に通すと媒体の加熱につながり、ほとんどの実用的媒体はある程度導電性であるため、実施に際しては、加熱を最少に抑えて、必要であれば加熱の影響を改善しうるＳＣＯＤＡ装置を設計することが望ましい。例えば、ＳＣＯＤＡは次のうち１以上を含めた手法で行える：
・媒体と物理的接触しているクーラーの使用で媒体を冷却し、媒体の周りを循環している緩衝液を冷却し、冷気を媒体に吹付けるかまたは媒体を蒸発で冷却する；
・媒体を非常に薄くすることで、媒体に流れる電流を減らし、媒体からの熱の放散を改善する；
・ヒートシンクとして働く熱伝導性基板に媒体を載せる；
・化学処理により、または導電性の増加を引き起こす不必要種を媒体から離すことにより、媒体の導電性を減らす；
・緩衝液のリザーバーを用意し、緩衝液が蒸発したら媒体周辺の緩衝液を補充する（例えば図３Ａ参照）；
・媒体の温度をモニターする温度センサーを１以上用意し、電極に流れる電流を制御することで許容範囲内に留まるよう媒体の温度を制御する；および
・電場以外の駆動場を用いる。
例２‐３ＤＳＣＯＤＡ

図３Ｃは図３の場合と類似した装置を示しているが、追加Ｚ電極２２Ａおよび２２Ｂの設置により改造されている。Ｚ電極２２Ａおよび２２ＢはＤＣ電圧で各々維持されている。負荷電粒子の場合、Ｚ電極２２Ａおよび２２Ｂは２ＤＳＣＯＤＡ電極１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃおよび１２Ｄより電位がマイナスに保たれている。Ｚ電極の設置は媒体１１のＺ軸で集束力およびＸＹ面で脱集束力を与える。脱集束力はＳＣＯＤＡにより打ち消される。

例３‐３ＤＳＣＯＤＡ

図３Ｄは、ＸＹ、ＸＺおよびＹＺ面の電極を用いて交互にＳＣＯＤＡを行うことにより、媒体１１の立方形ブロック中で粒子の３Ｄ濃縮を行う、本発明の態様による装置２４を示している。例えば、電極２５Ａ、２５Ｂ、２５Ｃおよび２５ＤがＸＹ面の濃縮に用いられる。電極２５Ａ、２５Ｅ、２５Ｃおよび電極２５Ｅと反対にある媒体１１の側の他の電極（図３Ｄではみえない）が、ＹＺ面の濃縮に用いられる。電極２５Ｂ、２５Ｅ、２５Ｄおよび電極２５Ｅと反対側の電極がＸＺ面の濃縮に用いられる。
例４‐ＳＣＯＤＡによるサイズ選択

所望であれば、ＳＣＯＤＡプロセスはＤＮＡおよび類似粒子をサイズで選択するために行える。これは、拡散係数Ｄ（Ｄは媒体の選択により制御しうる）および駆動場の周波数を適切に調整することにより行える。高い駆動場周波数を用いると、大きな粒子をＳＣＯＤＡで濃縮させにくくする。例えば、ある実験で、１２秒の期間を有する駆動場を掛けると、１ｋＢラダーから長いλ ＤＮＡおよび短いＤＮＡフラグメントを双方とも濃縮させることがわかった。駆動場の期間を約１０ｍｓに短縮すると、長いλ ＤＮＡフラグメントではなく、短いＤＮＡフラグメントのみの濃縮を行うことがわかった。本発明者らはいかなる特定の操作理論にも拘束されたくないが、このサイズ選択は、１０ｍｓ期間が長いλ ＤＮＡフラグメントの場合で緩和時間より短く、短いＤＮＡフラグメントの場合で緩和時間より長いためであろう。

同様の実験で、ＳＣＯＤＡは短いＤＮＡフラグメント（数百ｂｐより小さい）を濃縮しないことがわかった。小さなサイズの選択除外は、小さなフラグメントが拡散係数Ｄについて高い値を有しているせいであろう。

ＳＣＯＤＡはニックまたはそれ以外で分解されたプラスミドから超らせんプラスミドを分離させるための方法を提供する、と考えられる。
例５‐ＤＮＡの精製

ＳＣＯＤＡは適切な媒体および／または駆動および移動度変動場の組合せを選択することで異なる種の粒子について選択的にさせられるため、ＳＣＯＤＡはＤＮＡのような物質を精製するために用いうる。ＳＣＯＤＡは、スポットでまたはラインに沿いＤＮＡ（または場合により特定サイズ範囲を有するＤＮＡ）を濃縮させて、他の物質が該スポットでまたはラインで濃縮されないように適用しうる。

例えば、初期実験では、λ ＤＮＡをλ ＤＮＡおよび牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の混合物から濃縮させた。ＢＳＡ対λ ＤＮＡの濃縮比１０：１であった。上記のようにλ ＤＮＡをスポットの中に濃縮させた。ＢＳＡは該スポットの中で濃縮されなかった。

本発明の一部実験では、粒子が分離される物質の混合物へ変性剤、プロテアーゼ、ヌクレアーゼインヒビターおよび／またはＲＮＡアーゼを加える。このような剤は次のうち１以上を促進するために加えられる：
・濃縮させることが望まれるＤＮＡのフラグメントまたは他の分子への望ましくない分子の結合を減少させる；
・そのように望まれるならば、存在するＲＮＡの量を減少させる；
・ＤＮＡへの損傷を防ぐ；および／または
・ＳＣＯＤＡにより濃縮されない成分へ望ましくない分子を分解させる。

一部の場合には、媒体を高導電性にさせる塩のような物質を含む混合物から対象の粒子を分離するためにＳＣＯＤＡを用いることが望まれる。例えば、０．４Ｍ以内の程度で塩分を有する培地で細菌細胞培養物がよく培養される。大腸菌培養物のような細胞培養物から直接ＤＮＡを分離するために電気泳動ＳＣＯＤＡを用いることが望まれる場合には、高導電性が培地に高い電流を生じさせる。これは次いで培地の加熱につながる。この問題は上記の加熱制御技術のうち１つまたは一部の組合せにより取り扱われる。
例６‐選択媒体によるＳＣＯＤＡ

媒体中における粒子の移動度は、ＤＮＡが結合相互作用により相互作用する媒体を用意することにより、特定ＤＮＡ配列の粒子中における存在に依存性とさせてもよい。例えば、濃縮させることが望まれる粒子でＤＮＡに相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドをゲルに含有させてもよい。相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドをゲルと共有結合させてもよい。

粒子が相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドと結合するために必要な特徴的時間がｔ_ｏｎで、粒子がＤＮＡオリゴヌクレオチドから解離するために必要な特徴的時間がｔ_ｏｆｆであるならば、媒体中における粒子の平均ドリフト速度は下記式で与えられる：

上記においてμ（Ｅ）はレプテーション効果による場依存性粒子移動度である。典型的には、ｔ_ｏｆｆはアレニウス関係により定められ、一方ｔ_ｏｎは拡散効果により定められる。ヌクレオチド１０００以上の長さを有する粒子を選択することにより、ｔ_ｏｆｆについて１秒以下の妥当値が電場の実際値（例えば、１００〜２００Ｖ／ｃｍ範囲の電場）のときに得られる。

図５は、共有結合オリゴヌクレオチドを含む篩分けマトリックスで、３分子に関する電場強度の関数として概算粒子速度を示している。一番目の分子は共有結合オリゴヌクレオチドと完全マッチであり、二番目の分子は共有結合オリゴヌクレオチドと単一ヌクレオチドミスマッチであり、三番目の分子は共有結合オリゴヌクレオチドと非相補的である。ＤＣ速度は実線で示されている。ＳＣＯＤＡ移動度μ_ｓは点線で示されている。

他の粒子より有意に大きな共有結合オリゴヌクレオチドと結合するＤＮＡを有する粒子についてＳＣＯＤＡ移動度を示す電場に関する値があることがわかる。ライン７で示された電場のとき、共有結合オリゴヌクレオチドと完全に相補的な粒子に関するＳＣＯＤＡ移動度は、非相補的および単一ヌクレオチドミスマッチ分子の場合より２５倍大きい。
例７‐電気駆動場および熱移動度変動場

電解質中電送溶質イオンの抗力係数を熱で変えることにより、ＳＣＯＤＡの実証を行った。ＡＣ電位を電解質溶液に掛けて、溶液の温度を同期的に上昇および降下させているときに、イオンの真輸送が予想される。ＡＣ電位の振動周波数が熱振動の周波数と異なれば、イオン電流の検出成分は、ＳＣＯＤＡによる交互（ＡＣ）輸送を示す、２周波数の差に存在するはずである。

図６は電気‐熱スコダ泳動を調べるために用いられる装置３０を示している。装置３０はイオン溶液３３を入れたチャンバー３２を含んでなる。電極３４Ａおよび３４Ｂが溶液３３に浸されている。シグナル発生器３５は電極３４Ａおよび３４Ｂ間に第一周波数の電気シグナルを流す。ヒーター３６は溶液３３と熱接触している。溶液３３の温度が第一周波数と異なる第二周波数で変えられるように、電源３８でヒーター３６が駆動される。ロックイン増幅器のような検出器４０が電極３９Ａおよび３９Ｂに接続されている。検出器４０は第一および第二周波数の差に等しい周波数のシグナルを検出する。

実験プロトタイプ装置では、２．０ＭＮａＣｌ溶液３００μＬを入れるチャンバーを作るために、顕微鏡スライド、カバースリップおよびエポキシを用いた。２本の金ワイヤ電極がＮａＣｌ溶液に浸されるように１ｃｍ離して、それらを顕微鏡スライドに接着した。電極のうち一方はアースし、他方は１ｋΩ抵抗器を介してＡＣ増幅器へ接続した。溶液の加熱を行うために、ニッケル‐クロム合金ワイヤ（NIC60-015-125-25，Omega，Stamford，ＣＴ）を顕微鏡カバースリップの片側に接着した。

操作に際して、１０Ｈｚの５０％負荷サイクル、矩形波の形で、１．３２Ａの電流をヒーターに流した。ヒーターのオフサイクル中に顕微鏡スライドを冷却するため、小さなファンランニングを連続的に用いた。１２Ｈｚ、３．０Ｖ_ＲＭＳ正弦波を抵抗器と電極に掛けた。これら２つのシグナルを混合し、（２Ｈｚの）出力差周波数をロックイン増幅器（SR830DSP，Stanford Research Systems，Sunnyvale，ＣＡ）の参照入力中へ供給した。ＳＣＯＤＡによる周期的電流を測定するために、１ｋΩ抵抗器にかかる電圧をロックイン増幅器で測定し、２Ｈｚ成分を分析用に選別した。２Ｈｚで振動するイオン電流を検出した。

電極間の顕微鏡スライドに接着された熱電対（０．００５‐３６，Omega）により、サンプル溶液の駆動温度振動を直接測定した。ロックイン増幅器を用いて熱電対出力の２Ｈｚ成分も分析した。

電解質抵抗Ｒ_０の温度依存性変化が１ｋΩ電流モニタリング抵抗器および溶液のＤＣ抵抗（Ｒ_ＤＣ）の双方と比較して小さい、と我々は仮定している。電極にかかる電圧は次の通りである：

塩溶液の抵抗はＲ＝Ｒ_ＤＣ＋Ｒ_０ｃｏｓ（ω_２ｔ＋φ）であり、ここで誘導熱振動の周波数はω_２＝２π／Ｔ_２で、Ｔ_２＝１／１０ｓである。溶液に流れる総電流は次の通りである：

Ｒ_０が小さいと仮定すると、式（２４）は振幅が以下で与えられる差周波数（ω_２−ω_１）で正弦項による表式を表わす：

２Ｈｚで４μＡの大きさを有する電流を観察した。
例８‐電気駆動場および光学移動度変動場

一部の場合には、粒子を放射線に曝すことで動くことが望まれる粒子の移動度を変えられる。このような場合に、粒子の平均移動度が駆動場の２方向で異なるように、駆動場と同調して放射線の適用を制御することにより、スコダ泳動を実施しうる。例えば、以下を行える：・駆動場が粒子を一方向に押しやるときには放射線を適用し、駆動場が反対方向に粒子を押しやるときには放射線を適用しない；
・駆動場が粒子を一方向に押しやるときにはある波長または偏光の放射線を適用し、駆動場が反対方向に粒子を押しやるときには異なる波長または偏光の放射線を適用する；
・駆動場が粒子を一方向に押しやるときにはある強度の放射線を適用し、駆動場が反対方向に粒子を押しやるときには低強度の放射線を適用する；
・駆動場と非ゼロ相関を有する時変強度ｇ（ｔ）をもつ放射線を適用する；
・その他

一部の場合には、粒子自体の移動度を変えるために放射線を用いることは実際的でないかまたは望まれないが、放射線を適用することで制御されうる移動度を有した他の分子を粒子に結合させることは実際的である。他の分子は、例えば、放射線を適用することで変えられる形態を有しても、または放射線を適用することで制御しうるように媒体と結合させてもよい。

一部の態様では、スコダ泳動に付される粒子にアゾベンゼンが付けられる。アゾベンゼンはＵＶ光（３００〜４００ｎｍ）への暴露でトランスからシス形へ異性化しうる。４００ｎｍより大きな波長を有する光へ曝されたとき、アゾベンゼンはそのトランス形に戻る。一部の態様では、スピロピラン類が粒子へ付けられる。ＵＶ光への‘閉’形のスピロピラン類の暴露は異性化を誘導して、‘開’着色メロシアニン種を生じる。スピロピラン類は可視放射線への暴露で‘閉’形に戻る。これら２形間の遷移は分子の極性の変化を伴う。

粒子の移動度を変えるために放射線が用いられる場合、粒子の濃縮を達成するために異なる放射線場が異なるエリアに適用されてもよい。例えば、図７で示された装置４１を考えてみる。装置４１では、媒体１１が２つの電極４２Ａおよび４２Ｂ間に置かれている。ＡＣ電源４３は電極４２Ａおよび４２Ｂ間にＡＣ電気シグナル４４（図７Ａ）を流す。

投光器４６Ａおよび４６Ｂは媒体１１の部分４５Ａおよび４５Ｂを各々照射する。シグナル４４が第一方向に電場を形成するときのみ、コントロール４７は投光器４６Ａにエリア４５Ａを照射させる。シグナル４４が第一方向と反対の第二方向に電場を形成するときのみ、コントロール４７は投光器４６Ｂにエリア４５Ｂを照射させる。その結果として、媒体１１中の粒子がエリア４５Ａおよび４５Ｂの境界部で両側からライン４９に集中してくる。

多くの代替構造が、駆動場と同調してエリア４５Ａおよび４５Ｂを照射するために用いられる。例えば：
・エリア４５Ａおよび４５Ｂを交互に照射するために、適切な光学システムにより単一ランプから光が当てられる；
・制御可能な光伝導または反射を有する機械的または電気機械的フィルター、シャッター、マスクまたは他の器具の適切な配置により、１以上のランプからの光がエリア４５Ａおよび４５Ｂで交互に遮断される；および
・その他
Ｙ方向の集束は、媒体１１に対して９０度で光パターンおよび電場を回転させることにより行える。

電気／光学ＳＣＯＤＡは、スポットの並びでまたはいくつかのラインに沿い粒子を集合させるために用いられる。これはパターン光場を媒体１１のエリアへ掛けることにより行える。これは、例えばスポットまたはラインに沿い濃縮されたＤＮＡのサンプルを用意するために用いられる。様々な生物学的用途でＤＮＡのスポットまたはラインの並びを必要とする。

図８Ａ〜８Ｄは、１６スポットの並びに粒子を濃縮させるために用いうる、４つのマスク５０Ａ〜５０Ｄで可能な配置を示している。マスク５０Ａおよび５０Ｂは互いに相補的である。マスク５０Ｃおよび５０Ｄも互いに相補的である。マスク５０Ａが適用されると、駆動場は粒子を方向５１Ａに動かせる。駆動場が粒子を方向５１Ｂに動かせるときには、マスク５０Ｂが適用される。マスク５０Ａおよび５０Ｂが上記のように適用されて、駆動場が方向５１Ａおよび５１Ｂ間で交互変換されると、粒子は４本のライン５２Ａ、５２Ｂ、５２Ｃおよび５２Ｄに沿い濃縮されることがわかる。同様に、方向５１Ｃの駆動場でマスク５０Ｃおよび方向５１Ｄの駆動場でマスク５０Ｄを交互に適用することにより、粒子は４本のライン５３Ａ、５３Ｂ、５３Ｃおよび５３Ｄに沿い濃縮される。

最終的に、何回かのサイクル後、図８Ｅで示されているように、粒子はライン５２Ａ〜５２Ｄおよびライン５３Ａ〜５３Ｄの交点に存在するスポット５４で濃縮される。粒子は、例えば、付着アゾベンゼン基を有する所望のＤＮＡまたは他の分子である。マスク５０Ａ〜５０Ｄが（それらの対応駆動場と一緒に）適用される順序は変えられる。簡単な態様では、最初にマスク５０Ａおよび５０Ｂを用いてＸ方向の濃縮が行われ、次いでマスク５０Ｃおよび５０Ｄを用いてＹ方向の濃縮が行われる。
例９‐局所的粘度変化による光学移動度変動

ＳＣＯＤＡにより濃縮される粒子が、温度で変わる粘度を有する媒体中に入れられる。
粒子の移動度は媒体の粘度に依存する。粒子は吸収バンドを有している。吸収バンドに波長を有する放射エネルギーを吸収すると、粒子は放射されたエネルギーを熱として放出する。

いずれか適切なタイプの交互駆動場が粒子に掛けられる。吸収バンドの波長および強度ｇ（ｔ）を有する放射線で粒子が照射される。駆動場により粒子へ加えられる力ｆ（ｔ）とｇ（ｔ）が非ゼロ相関を有するように、ｇ（ｔ）が選択される。ｇ（ｔ）が大きな値を有する場合、各粒子が熱エネルギーを放出する割合は、ｇ（ｔ）が小さな値を有する場合より大きい。吸収放射線に応答して粒子により放出された熱エネルギーは周囲媒体を加熱して、その粘度、ひいては粒子移動度を局所的に変える。
例１０‐駆動場としての流体流

ＳＣＯＤＡ駆動場は、粒子が存在する媒体に交互に方向転換する速度をもたせることで形成される。例えば、媒体はパイプ内で前後に流されるパイプまたはキャピラリー管内の流体である。粒子の移動度は、粒子を外部適用場と相互作用させるか、または粒子が存在するパイプの壁とそれらを相互作用させることにより変えられる。

例えば、サイズがパイプ直径に匹敵する分子（例えば、ミクロンサイズキャピラリー中の大きなＤＮＡ）が懸濁された、パイプ内における液体の前後流を考えてみる。今度は、流れが一方向であるとき、分子がキャピラリー壁とより頻繁に相互作用して、遅れるように、（例えば、シリコーン物質の壁のような柔軟壁を有するキャピラリーを用意して、キャピラリーを外圧に付すことにより）キャピラリー直径を変えてみる。
例１１‐移動度を変える周期的希釈／濃縮の使用

特に粒子が表面でまたはその近くで動き回る場合に、粒子の移動度を変えるために周期的希釈／濃縮が用いられる。粒子が動き回る媒体の濃度または粘度が、粒度の動きを駆動する電場または他の場と相関させるために、経時的に調節される。

図９は、粒子が流体層６２に沿い移動する装置６０を示している。粒子は電極６４Ａおよび６４Ｂ間に掛けられた交互電場により駆動される。スプレー器６６は、電場が第一方向であるときに溶媒を適用することで、流体層６２を希釈する。流体層６２から溶媒を蒸発させ、こうして電場が第二方向であるときに流体層６２の濃度を増加させるために、真空バルブ６８が開かれる。バルブ６８およびスプレー器６６は、適切な制御システム（示さず）により操作される。
例１２‐病原体検出

環境サンプリングでは、ある病原体が比較的大きな容量（例えば１Ｌまたは１０Ｌ）の流体（または流体に溶解される固体物質）内に存在しているかどうかを調べることが時々必要である。このような容量は、ほとんどの場合で、ＰＣＲが費用効果的に行われるには多すぎる。フィルターもＤＮＡを濃縮するために用いてよいが、このようなフィルターは詰まりやすい。ＳＣＯＤＡは、存在するならば、サンプル中でこのような病原体を濃縮するために用いられる。サンプルは最初に粗く精製され、次いでサンプル中の対象粒子がスコダ泳動により濃縮されうる媒体中へ導入される。例えば、サンプルを緩衝液およびゲル物質と混合して大容量ゲルを形成させることにより、粒子がゲル中へ導入される。病原体の溶解を助けて、それらのＤＮＡを溶液中へ放出させるために、緩衝液は界面活性剤または他の剤を含有してもよい。

次いで、中心箇所で全部またはほとんどのＤＮＡを容量的に濃縮するために、２Ｄまたは３ＤＳＣＯＤＡが行われる。中心箇所のＤＮＡは標準手段で取り扱えるゲルの容量中に含有されている。次いで、濃縮されたＤＮＡは特定の病原体を検出するためにＰＣＲ増幅される。ＤＮＡは場合により、ＰＣＲ増幅を行う前に、例えば、市販キット（例えばQiagen^ＴＭ）を用いるか、または下記のＩ‐ＺＩＦＥ抽出法を用いて、ゲルから抽出される。代わりに、濃縮ＤＮＡを含有したゲル片をＰＣＲに付してもよい。ＰＣＲ反応に際して溶融しやすいゲルであっても、一部の用途ではＰＣＲ増幅に大きな悪影響を与えない。
例１３‐粒子移動度の磁気制御

図１０Ａはポリマーマトリックスを含んでなる媒体６０を示している。媒体は磁気ビーズ６４へ結合されたポリマー６２を含有している。磁気ビーズは現在入手しうるタイプのものであり、ＤＮＡ抽出に用いられる。適切な磁石６６により形成される磁場は、図１０Ｂで示されているように、磁気ビーズ６４および結合ポリマー６２を媒体の片側へ押しやるために適用される。結果として、媒体の領域６８が低粘稠性になる。領域６８の媒体が磁場オンの場合より粘稠である図１０Ａで示された状態を回復するために、磁場を切ることにより、磁気粒子が放出される。

媒体の粘度が媒体中で時間および位置双方の関数となるように、磁場は二次元でパターン化されて、経時的に変えられる。

図１０Ｃおよび１０Ｄで示された代替態様では、輸送される粒子自体が磁性である。駆動場は、例えば電場である。抗力誘導表面６７の方へ粒子を駆動させるように、磁場が周期的に入れられる。表面６７から粒子を放出させるには、磁場が切られる。

他の態様では、本来的に適用磁場で変わる粘度を媒体が有するように、媒体は磁気レオロジー流体を含んでなる。
例１４‐駆動場としての加速度

密度勾配下の重力誘導流が駆動場として用いられる。例えば、重いまたは軽い粒子が懸濁された溶液のような媒体で満たされた管を考えてみる。粒子が管の一端の方へ移動しやすいように、管が遠心機の中に置かれる。管の向きは周期的に逆転される。粒子が管に沿い一方向で正味の運動をさせられるように、適切な移動度変動場が向きの逆転と同調してかけられる。
例１５‐脱塩用のＳＣＯＤＡ

塩水溶液で満たされた絶縁キャピラリーを考えてみる。流体がキャピラリーに流されると、放物線状速度特性がキャピラリーで作られる。流体はキャピラリー壁近くよりもキャピラリーの中央で速く流れる。電場がキャピラリーに掛けられると、適用電場を消去するために必要とされるように、イオンはキャピラリー壁のデバイ長さ（電荷スクリーニング長さ）内で優先的に集まる。これはキャピラリー中でイオンの放射状分布を変え、ひいてはイオンの平均速度を変える。流体流が周期的に逆転され、電場が一方向の流れのみに掛けられると、キャピラリーに沿う蓄積イオン密度勾配から拡散によりＳＣＯＤＡ誘導ドリフトが打ち消されるまで、キャピラリーに沿い一方向でイオンの真輸送がある。

イオン輸送の方向と反対方向に微弱なＤＣバイアスをＡＣ流体流に加えることにより、キャピラリーから出てくる流体は減少したイオン分を有する。
ＳＣＯＤＡ方法および装置で可能な一部のバリエーション

駆動場および移動度変動場が互いに同期化されていない先の例６で記載されているように、結果として、駆動および移動度変動場の相対位相が変わるため、２箇所間で前後に粒子の流れがある。制御可能な周波数で２箇所間で前後に粒子を運動させるこの能力は、様々な場面で有用となる。

前開示から当業者に明らかなように、多くの変更および修正が本発明の実施に際してその精神または範囲から逸脱することなく可能である。例えば：
・駆動および移動度変動場のうち一方を発生させることは不必要である。ある他の目的のために既に存在する場またはノイズすらも含む適切な存在場が、ｆ（ｔ）またはｇ（ｔ）のうち一方に用いられる。この存在場は検出でき、真ドリフトを生じる駆動場と同調して粒子の移動度が変わるように、検出された場と同調して第二の場が適用されてもよい。
・一定電圧で物理的に回転する電極も、２ＤＳＣＯＤＡに用いられる回転場をシミュレートするために用いられる。
・小さなＤＣバイアスも、集束スポットの位置をシフトさせるために用いうる。
・本発明の一部態様では、粒子がＳＣＯＤＡにより濃縮されると予想される箇所で、媒体中にウェルを用意する。ウェルは適切な緩衝液で満たされる。ＳＣＯＤＡ誘導濃度勾配の結果として、粒子はウェル中に拡散しうる。粒子はピペットまたは他の移送器具でウェルから抽出される。
粒子抽出法および装置

粒子を運動および／または濃縮させるための様々な方法が上記されている。多くの場合に、粒子が濃縮された後で、それらが濃縮された媒体から粒子を取り出すことが望まれる。例えば、ＤＮＡがゲル中で濃縮される場合、後の処理のためにゲルからＤＮＡを抽出することが多くの場合に望まれる。

以下の記載では、媒体から粒子を抽出するために用いられる方法および装置を説明している。これらの方法および装置は“界面ゼロ積分フィールド電気泳動”（“ＩＺＩＦＥ”）方法および装置と称される。ＩＺＩＦＥは、ＳＣＯＤＡ法により位置へ動かされたおよび／または濃縮された粒子を抽出するために用いられる。媒体から粒子を抽出するに際しても、ＩＺＩＦＥはより一般的な用途を有している。

ＩＺＩＦＥは、異なる媒体（例えば、ゲル媒体および緩衝液媒体）中における粒子の移動性の差異を利用している。一部の荷電粒子（例えばＤＮＡの分子）は、適用電場の大きさに依存する、ゲル溶液（例えばアガロースゲル）中の電気泳動移動度を示す。このような粒子は、非対称的に時間で変わる電場を掛けることにより、このような媒体中で一方向にドリフトさせられる。しかしながら、それらの粒子が緩衝液または自由溶液中に存在する場合、それらは一定の電気泳動移動度を有するか、または少なくとも電場強度にかなり低い依存性を有する。したがって、適用される場で変わらない移動度を粒子が有する媒体中へそれらが運ばれると、それらはドリフトを止める。

荷電粒子を含有したゲルへのＺＩＦＥ（ゼロ積分フィールド電気泳動）の適用は、大きな移動度を生じる方向へ粒子をドリフトさせる。緩衝液または自由溶液を含有した領域へ粒子が入ると、それらはドリフトを止める。ゼロ時間平均電場の継続適用は、緩衝液中で粒子に真ドリフトを引き起こさない。したがって、粒子は緩衝液およびゲル間の界面近くの緩衝液中で濃縮されるようになりやすい。

ここで詳述された抽出法によれば、粒子を媒体から抽出させられる。本発明は、例えば電気泳動媒体からＤＮＡ、ＲＮＡおよびポリペプチドのような荷電バイオポリマーを抽出するために適用される。本発明の一部態様では、電気泳動ゲルのような媒体から隣接流体中へ粒子を動かせるためにＺＩＦＥを用いる。ＺＩＦＥは、適用電場の極性が周期的に逆転して時間平均電場がゼロである、交流（ＡＣ）電気泳動の形である。電場の強度は他よりも一極性で大きい。

図１１はＺＩＦＥで用いられる例示電場パルスのグラフ図である。図１１で示されているように、該パルスは、時間ｔ_１で正、即ち“前”方向へかけられる電場Ｅ_１、次いで時間ｔ_２で負、即ち“逆”方向へかけられる電場Ｅ_２を含んでなる。Ｅ_２＝−Ｅ_１／ｒ_ε（ｒ_εは場比率である）およびｔ_２＝ｔ_１ｒ_εであれば、時間平均電場はゼロである。時間平均電場が図１で陰影部によりグラフ表示されている。“正”陰影部（Ｅ_１に相当する）は“負”陰影部（Ｅ_２に相当する）を消去する。全般的に、ゼロ真電場がある。時間平均電場が正確にゼロであれば、ＺＩＦＥプロセスに偏りはない。時間平均電場がゼロからはずれると、ＺＩＦＥプロセスには偏りがある。

振幅の局所電場Ｅで運動して電気泳動移動度μを有する粒子の速度νは以下で与えられる：
ν＝μＥ（２７）
直線系の場合、μは一定である。一定の電気泳動移動度を有する粒子は、ＺＩＦＥが媒体に適用された場合に、媒体中で真移動を行わない（即ち、それらの真速度はゼロである）。対照的に、非直線系では、粒子は電場振幅に依存性の電気泳動移動度を有する。このような非直線系では、大きな移動度を生じる方向に粒子の真移動がある。このような非直線系において、粒子速度は以下で与えられる：
ν＝μ（Ｅ）Ｅ（２８）

媒体中の荷電粒子が下記式の場依存性電気泳動移動度を有すると仮定してみる：
μ（Ｅ）＝μ_０＋ｋＥ（２９）
これら粒子の移動度は電場Ｅの振幅に応じて増加することがわかる。一定電場Ｅの影響下で粒子により移動される距離ｄはｄ＝νｔで与えられる。図１１で示された形の電場パルスが適用されると、粒子はｔ_２で移動する距離よりも大きな距離をｔ_１で移動する（パルスは大きな場振幅を有する）。これは、粒子により移動される距離に式（２７）および（２９）を当てはめることで示せる。したがって、“前”方向、即ち振幅の局所電場Ｅ_１が適用された方向で粒子の真ドリフトがある。

この真ドリフト挙動はアガロースゲル中のＤＮＡ分子により証明された。このようなゲル中で、ＤＮＡ分子は式（２８）により与えられた形の電気泳動移動度を有する。移動度の場依存性はＤＮＡ分子とゲルとの相互作用から生じている。したがって、ＤＮＡからなる粒子を望ましい方向に向かわせるために、ＺＩＦＥがアガロースゲル中のＤＮＡに適用される。

対照的に、緩衝液または自由溶液中ＤＮＡ分子へのＺＩＦＥの適用はＤＮＡの真移動を生じない。これは、緩衝液中ＤＮＡ分子の移動度が場依存性ではないからである。２種媒体（例えば、緩衝液およびゲル）中におけるＤＮＡの移動性の差異は、粒子が蓄積しうる他の媒体中へある媒体内から粒子を動かせるために利用しうる。これは、２種媒体間の界面にＺＩＦＥ場を適用することで行える。

例えば、ＤＮＡ分子および緩衝液が存在しているゲル間の界面にＺＩＦＥ場を適用することを考えてみる。ゲル中ＤＮＡの分子へＺＩＦＥを適用すると、ゲル中でゲル‐緩衝液界面の方へ分子を移動させることになる。それらの分子が緩衝液へ入ると、分子は移動を止める。ＺＩＦＥ場は、緩衝液からゲルの方へ分子を動かせやすい方向に、小さなバイアスを有してもよい。このバイアスは、分子が緩衝液へ入った後で、界面からかなり遠くに分子を拡散させないような傾向をもつ。バイアスは、ＺＩＦＥ場を形成するために用いられた電極と分子を遭遇させないようにする。ゲル中の粒子が界面の方へ動き続けられる（即ち、ＺＩＦＥ速度がバイアスに基づく真ドリフトで打ち負かされない）ほど、バイアスは小さい。

本発明の一態様による装置が図１２Ａおよび１２Ｂで示されている。図１２Ａは抽出前におけるゲル中ＤＮＡの分子を示し、図１２Ｂはゲルから抽出後に緩衝液中で濃縮されたＤＮＡの分子を示している。抽出装置２００は、アガロースゲルのようなゲル１２２を含有したゲルボート１２０（角箱として成形されている）を含んでなる。ゲル１２２はゲルボート１２０の実質的容積を満たしている。好ましくは、ゲル１２２はリザーバー１２４中の緩衝液により電極１３０Ｂの各々から離されている。緩衝液が電極１３０Ｂ間で短回路を形成しないように、リザーバー１２４は互いに離されている。

図１２Ａで示されているように、抽出前に、ＤＮＡの分子１２８Ａはゲル１２２中のカラムで濃縮される。分子１２８Ａは、自然な状態で置かれているとき、典型的にはこのような形では濃縮されない。濃縮される前に、分子１２８Ａは典型的にはゲル１２２全体に分布されている。前記のように、ＳＣＯＤＡの使用により図１２Ａで示されているようなカラム中へ分子１２８Ａが濃縮される。代わりに、分子１２８Ａは他の方法で濃縮してもよい。例えば、抽出される分子は従来のＤＣ電気泳動またはＰＦＧＥにより分離されたＤＮＡのバンドの分子である。

ゲル１２２の領域における分子１２８Ａの濃縮は、抽出前に要求されない。しかしながら、分子のより効率的な抽出を促すためには濃縮が好ましい。

抽出される分子１２８Ａを包囲するように、少量の緩衝液を含有したキャピラリー１２５がゲル１２２中に挿入される。キャピラリー１２５は、挿入の位置を慎重に制御できて、ゲルの最少乱れでキャピラリーを挿入するロボット器具により挿入される。ロボット器具は、媒体中の所望の位置にキャピラリー１２５を置いて、キャピラリーを媒体中で縦方向に伸ばす多軸ポジショナー、例えばＸ‐Ｙポジショナーを含んでなる。キャピラリー１２５がゲル１２２中に挿入された後で、キャピラリー１２５の上部分は緩衝液を含有するが、キャピラリー１２５の底部分はゲル１２２を含有する。キャピラリー１２５中の緩衝液はゲル１２２の近くで抽出リザーバー１２６を形成する。抽出リザーバー１２６は緩衝液‐ゲル境界１２１でゲル１２２と出会う。キャピラリー１２５中における緩衝液およびゲルの配置は緩衝液‐ゲル界面１３１を形成する。分子１２８Ａが抽出リザーバー１２６中へ移動した後で、それらを吸引するためにピペット１２９がキャピラリー１２５上に用意される。

電気泳動に要求される電場を形成するために、電極１３０Ａがピペット１２９の先端近くに置かれる。抽出分子が電極１３０Ａと出会わずに、ＺＩＦＥ場が適用されている界面から十分離して、電極１３０Ａが好ましくは置かれる。複数の電極１３０Ｂが緩衝液リザーバー１２４に置かれる。電極は例えば白金製である。図１２Ａおよび１２Ｂで示されたものより多くの電極が用意されてもよい。

ピペットがキャピラリー１２５へ挿入されたときに、電極１３０Ａおよび１３０Ｂ間で導電性をもたらすように、ピペット１２９の先端が少量の緩衝液で満たされる。一態様では、電極１３０Ｂが固定共通電位に揃えられ（例えば、電極１３０Ｂがアースされ）、電極１３０Ａが異なる電位に設定される。電極１３０Ａの電位を変えることにより、様々な電場が緩衝液‐ゲル界面１３１に適用される。

界面‐ＺＩＦＥを行うために、ゼロ時間平均パルス電場が緩衝液‐ゲル界面１３１に掛けられる。パルス電場は、例えば図１で示された形のものである。分子１２８Ａを望ましい方向（即ち、抽出リザーバー１２６の方）へ移動させるために、振幅Ｅ_１を有する電場が抽出リザーバー１２６の方向へかけられ、振幅Ｅ_２を有する電場が反対方向へかけられる。抽出される粒子がＥ_２の影響下にあるよりもＥ_１の影響下で大きな移動度を有するように、Ｅ_１およびＥ_２が選択される。典型的分子および媒体の場合Ｅ_１＞Ｅ_２。粒子がＥ_１の影響下で界面１３１の方へ駆動されるように、極性が選択される。

緩衝液‐ゲル界面１３１への界面‐ＺＩＦＥの適用は、ゲル１２２中の分子１２８Ａを抽出リザーバー１２６の方へドリフトさせる。ある時間後、分子１２８Ａの一部は緩衝液‐ゲル界面１２１を通って、抽出リザーバー１２６内の緩衝液中へ入る。これらの分子が抽出リザーバー１２６に達すると、界面‐ＺＩＦＥは分子に真ドリフト効果を有さず、そのため分子はドリフトを止める。最終的には、すべて（ほとんど）の分子１２８Ａが緩衝液‐ゲル界面１２１を通って、抽出リザーバー１２６中へ移動する。分子１２８Ａは界面近くの緩衝液中で濃縮されるようになる。

図１２Ｂは、ゲル１２２から抽出リザーバー１２６中へ移動した分子１２８Ｂ（図２ａで分子１２８Ａに相当する）を示している。このように、界面‐ＺＩＦＥが抽出リザーバー１２６で分子１２８Ｂを集合および濃縮させるために用いうる。次いで、ピペット１２９または他の器具が抽出リザーバー１２６から分子１２８Ｂを吸引し、こうして抽出プロセスを終了する。

図１３は、液体ゲルと混合されたＤＮＡがキャピラリー管内で固化された、抽出実験におけるガラスキャピラリーを示している。緩衝液をキャピラリーの上部へ加えた。ＤＮＡを抽出するために上記の技術を用いた。緩衝液‐ゲル界面へ適用された界面‐ＺＩＦＥの効果を示すために、キャピラリーの像を様々な時間（０分、６０分、１２０分）で捉えた。緩衝液はＴＡＥ（Ｔｒｉｓ‐酢酸‐ＥＤＴＡ）緩衝液であり、ゲルはＤＮＡを含有したアガロースゲルである。この実験を行うために、λ ＤＮＡ５μＬおよびＥｔＢｒ２．５μｇと混合された液体１％アガロースゲル１００μＬを２．５ｍｍ内径ガラスキャピラリーの下部へピペットで入れ、固化させた。キャピラリーの上部を０．１ＸＴＡＥ緩衝液約５０μＬで満たし、第一白金電極を緩衝液中へ挿入した。次いで第二白金電極を入れた０．１ＸＴＡＥ緩衝液の浅いリザーバーにキャピラリーの底部を浸した。

界面‐ＺＩＦＥはこれらの条件で行った：周期的に、電圧Ｖ_１＝２００Ｖを時間ｔ_１＝８ｓで第一電極へかけ、次いで電圧Ｖ_２＝−１００Ｖを時間ｔ_２＝１６ｓで第二電極へかけた。電場を２時間かけた。電極は５ｃｍ離した。実験の過程で、キャピラリーの上半分は緩衝液で満たされたままであり、ＤＮＡは比較的少量（約２０μＬ）で残存していた。キャピラリーの像で示されるように、ゲルからＤＮＡの漸進移動と、ゲル上で少量の緩衝液中におけるＤＮＡの濃縮がある。

抽出リザーバー１２６が十分小さければ、抽出リザーバー１２６のある領域で濃縮された分子１２８Ｂは、長距離に及ぶゆっくりした拡散のみでそれらの濃縮領域から離れていく。分子１２８Ｂをそれらの濃縮領域に維持するため、分子１２８Ｂおよび抽出緩衝液１２６の対流混合は最少に抑えるべきである。対流混合を最少に抑えるため、キャピラリー１２５は好ましくは小さな直径を有しているべきである。更に、抽出緩衝液１２６およびゲル１２２は好ましくは同温度に保たれる。

一態様において、ピペット１２９は内臓電極１３０Ａ装備の機械式ピペッターである。機械式ピペッターは使い捨てピペットチップ中へ緩衝液を吸引し、次いでキャピラリー１２５内のゲルを覆って電極１３０Ａおよび１３０Ｂ間で導電性があるように緩衝液を部分的に入れる。コンピューターモニタリングは、抽出に際して電極１３０Ａおよび１３０Ｂ間の電流をモニターし、電極間で開回路を形成しうるバブルまたは蒸発のような問題を検出するために用いられる。抽出が完了した後、ピペットチップの残留緩衝液は処分され、ピペットチップは粒子の別なサンプルを抽出するためにキャピラリー２５へ戻される。濃縮粒子と周囲緩衝液との混合が最少となるように、機械式ピペッティングは不必要なピペットチップ運動を減らせる。これは抽出容量を最少に抑え、ひいては抽出される粒子の最終濃度を増す。

他の態様において、緩衝液で満たされたキャピラリーをゲル中へ挿入する代わりに、ゲルはキャビティ付きキャストでもよい。キャビティは緩衝液で満たされ、電極を有するピペットが緩衝液中に挿入される。キャビティは、抽出のために粒子を集める上で、キャピラリーと同様に機能する。ＳＣＯＤＡにより媒体およびキャビティ間で濃度勾配を形成することにより、周囲媒体からこのようなキャビティに分子を入れられる。

ゲルからＤＮＡ混合物の界面‐ＺＩＦＥ抽出は、サイズに応じてＤＮＡフラグメントを選択的に抽出するために適用される。電場パルスのサイクル時間ｔ_１およびｔ_２が十分短いように選択されると、ＤＮＡ分子の緩和または再配向時間は重要になり、分子の移動速度に長さ依存性を導入する。図１４は、フラグメント長さとサイクル時間ｔ_１およびｔ_２の関数として、実験に際するＤＮＡフラグメント速度を表わしたグラフである。その実験では、１％アガロースゲル（０．１ＸＴＡＥ）中で標準ＤＣ電気泳動を用いて、異なる長さのＤＮＡフラグメントを直線的に分離させた。次いで、フラグメントの非直線速度を観察するためにＺＩＦＥを（ＤＣ電気泳動が行われたものと垂直な方向に）適用した。

図１５は、界面‐ＺＩＦＥ抽出後における、ＤＮＡフラグメントミックスと同ミックスのフラグメント分布との比較を示している。該ミックスはλ ＤＮＡ（４８ｋｂ、５００ｎｇ／μＬ）２μＬおよび１ｋｂＤＮＡラダー（０．５〜１０ｋｂ、５００ｎｇ／μＬ）４μＬを含有しており、上記の界面‐ＺＩＦＥ抽出法を適用して１％アガロースゲル１００μＬ中でランさせた。ｔ_１＝２５ｍｓの時間でピペット中の電極にかかる電圧Ｖ_１＝２００Ｖと交互してｔ_２＝５０ｍｓの時間でゲル中の電極にかかる電圧Ｖ_２＝−１００Ｖにより発生する、パルス電場をかけた。パルス電場は３時間かけた。このプロセスでは、標準ＤＣ電気泳動で、ローディング色素と混合されて、原ミックスからのコントロールと一緒に、１％アガロースゲルのウェル中へ入れられた、０．１ＸＴＡＥ緩衝液中へＤＮＡを抽出した。λ ＤＮＡバンドおよび短い（１ｋｂ未満）フラグメントはゲルから抽出されなかった。界面‐ＺＩＦＥのサイズ選択は、長いフラグメント（１００〜２００ｋｂ）へも同様に適用される。

抽出速度、抽出効率およびＤＮＡフラグメント長さ選択性を最適にするために変えうるパラメーターとして、パルス電場の大きさ；パルス電場の周波数（サイクル時間）；抽出リザーバー１２６中緩衝液の組成；ゲル１２２の組成；操作温度；および分子１２８Ａの濃縮度がある。

ここで開示された方法および装置は、粒子が媒体の特定領域で濃縮された（例えば、ＤＮＡ分子がゲルのカラムまたはピラーで濃縮された）媒体から荷電粒子を抽出するために適用される。しかしながら、該方法および装置はこのような用途に限定されない。それらは、媒体中で均一に分散された、特定領域またはバンドで位置または濃縮された、あるいは媒体中にそれ以外で分布した荷電粒子を抽出するために用いてもよい。ここで開示された方法および装置を用いると、荷電粒子、特にバイオポリマー（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびポリペプチド）が、アクリルアミド、直線状ポリアクリルアミド、ＰＯＰ（Perkin Elmer）、アガロースゲル、ポリマーのからみ合い液体溶液、粘稠または濃密溶液、動きが向けられている分子と特異的に結合するようなポリマーの溶液、単純な水溶液などから抽出される。（ある領域でＤＮＡを濃縮するために）ＳＣＯＤＡベース電気泳動と併用された界面‐ＺＩＦＥは、細菌性人工染色体、プラスミドおよび高分子量またはゲノムＤＮＡを抽出するためにも用いうる。

ＩＺＩＦＥは媒体から選択粒子のみを抽出するために用いうる。適用駆動場の大きさと直線的のみで依存する速度を有した粒子は、ＩＺＩＦＥ駆動場へ曝されたときに、単に前後に振動する。したがって、このような粒子は媒体中に留まるが、適用場と非直線的依存性を有する速度を有した他の粒子は媒体から抽出される。一部の場合には、異なる粒子種が異なる速度で第二媒体の方へドリフトするように、ＩＺＩＦＥ駆動場が形成される。したがって、異なる種の濃度が媒体間の界面で経時的に変わっていく。ＩＺＩＦＥ下で高い真ドリフト速度を有した種が、低い真ドリフト速度を有した種の前に第一媒体から抽出される。

遅い種が第一媒体から抽出される前にＩＺＩＦＥを終えることにより、速い真ドリフト速度を有した種の相対濃度が増加させられる。遅いドリフト種が界面に到達する前に界面に蓄積した速い種を除去することにより、ＩＺＩＦＥ下で遅い真ドリフト速度を有した種の界面で相対濃度を増加させられる。
一部の可能な異なる粒子抽出方法および装置

前開示から当業者に明らかなように、多くの変更および修正が本発明の実施に際してその精神または範囲から逸脱することなく可能であり、以下に限定されない：
・非荷電または電気的中性分子の抽出も、それらの分子が荷電分子により運ばれるならば、ここで開示された方法および装置を用いて行える。例えば、荷電ミセルと相互作用する中性タンパク質が、ミセルとの相互作用により電気泳動で抽出される。
・ＺＩＦＥの実施に用いられる波形は一方向またはその他に偏ってもよい。偏向ＺＩＦＥはサイズに応じて粒子の選択的分離を促せる。

第一媒体から第二媒体中へ粒子を抽出するためにＩＺＩＦＥを用いる代わりに、第一媒体から第二媒体中へ粒子を抽出するためにＳＣＯＤＡを用いうる。一部のこのような態様では、交互に方向転換するＳＣＯＤＡ駆動場が第一および第二媒体間の界面に向けられる。ＳＣＯＤＡ駆動場は、例えば界面と実質上垂直に向けられる。移動度変動場が第一媒体中の粒子の移動度に影響を与えて、第一媒体中の粒子を第二媒体の方向へ移動させるように、ＳＣＯＤＡ移動度変動場が選択される。第一媒体中の粒子の移動度に影響を与えるよりも実質的に低い程度で第二媒体中の粒子の移動度に影響を与えるように、移動度変動場が選択される。最良の場合には、移動度変動場は第二媒体中の粒子の移動度に影響を与えない。この例において、ＳＣＯＤＡ効果は第一媒体から第二媒体中へ粒子を輸送させ、そこで粒子が第一および第二媒体間の界面で濃縮されるようになる。代わりの態様では、粒子がＳＣＯＤＡにより第二媒体中へドリフトして、第二媒体中で濃縮されるように、第一媒体内に存在する粒子のみに移動度変動場が適用される。

部品（例えば、電源、電極、アセンブリー、器具、回路など）が上記で言及されている場合、それ以外で示されていない限り、その部品への言及（“手段”への言及を含める）は、本発明の例示態様で機能を発揮する開示構造と構造的に同等でない部品を含めて、記載された部品の機能を発揮する（即ち、機能的に同等である）部品をその部品の同等物として含める、と解釈されるべきである。

したがって、本発明の範囲は下記請求項により規定される内容に従い解釈されるべきである。

本発明の非制限態様を説明している図面において、
駆動および移動度変動場について可能な波形の例である。駆動および移動度変動場について可能な波形の例である。駆動および移動度変動場について可能な波形の例である。駆動および移動度変動場について可能な波形の例である。駆動および移動度変動場について可能な波形の例である。駆動および移動度変動場について可能な波形の例である。駆動および移動度変動場について可能な波形の例である。駆動および移動度変動場について可能な波形の例である。駆動および移動度変動場について可能な波形の例である。粒子路の数値シミュレーションを示したプロットである。本発明の態様を実施するために用いられる装置の概略図である。本発明の態様を実施するために用いられる装置の概略図である。本発明の態様を実施するために用いられる装置の概略図である。本発明の態様を実施するために用いられる装置の概略図である。本発明の態様を実施するために用いられる装置の概略図である。適用電場の関数として測定ＤＮＡ速度のプロット例である。原点からの半径方向距離の関数として、図３の場合と似た装置で時間平均粒子速度を示したプロットである。時間の関数として原点からの測定ＤＮＡスポット距離を示したプロットである。共有結合オリゴヌクレオチドを含んでなる篩分けマトリックスで、３分子に関する電場強度の関数として概算粒子速度を示している。電気駆動場および熱移動度変動場を用いてスコダ泳動（scodaphoresis）を調べるために用いられる装置の概略図である。電気駆動場および光学移動度変動場を用いてスコダ泳動を調べるために用いられる装置の概略図である。図７の装置からの波形を示している。スポットの並びで粒子の濃縮を引き起こすために用いられる、光学マスクパターンを示している。スポットの並びで粒子の濃縮を引き起こすために用いられる、光学マスクパターンを示している。スポットの並びで粒子の濃縮を引き起こすために用いられる、光学マスクパターンを示している。スポットの並びで粒子の濃縮を引き起こすために用いられる、光学マスクパターンを示している。図８Ａ〜８Ｄのマスクを用いて粒子が濃縮される、スポットの並びを示している。媒体の粘度に周期的変動を生じさせる装置の概略図である。粒子の移動度を変えるために磁場を用いる装置を概略で示している。粒子の移動度を変えるために磁場を用いる装置を概略で示している。粒子の移動度を変えるために磁場を用いる装置を概略で示している。粒子の移動度を変えるために磁場を用いる装置を概略で示している。ＺＩＦＥで用いられる例示電場パルスのグラフ図である。本発明の具体的態様による抽出装置の断面立面図であって、抽出前における溶液中ＤＮＡの分子を示している。図１２Ａの装置の断面立面図であって、溶液から抽出されて少量の緩衝液中で濃縮されているＤＮＡの分子を示している。図１２Ａで示されたものと類似した抽出装置の平面図である。本発明の具体的態様による装置および方法を用いた抽出実験におけるガラスキャピラリーを示している。フラグメント長さおよびサイクル時間の関数として、実験に際するＤＮＡフラグメント速度を示した図である。抽出後における、ＤＮＡフラグメントミックスと同ミックスのフラグメント分布との比較を示している。

Claims

駆動場の強度で変わる移動度を粒子が有する第一媒体から粒子を抽出する方法であって、該方法が、
界面で第一媒体に隣接する第二媒体を用意し、
界面に向けられた成分を有する非対称時変抽出駆動場を適用し、抽出駆動場が、界面の方への第一真ドリフト速度を第一媒体中の粒子にもたせ、
粒子を界面から第二媒体中へドリフトさせる
ことからなり、
抽出駆動場の影響下で、第二媒体中の粒子が、
第一真ドリフト速度より有意に小さな、界面から離れる真ドリフト速度を有するか、または
実質的にゼロである真ドリフト速度を有するか、または
界面の方へ向けられた真ドリフト速度を有し、
第二媒体が緩衝液を含んでなる、方法。
粒子が荷電され、抽出駆動場が交互電場を含んでなる、請求項１に記載の方法。
交互電場の１サイクルでの時間積分が実質的にゼロである、請求項２に記載の方法。
交互電場が、第二媒体中の粒子のものを界面の方へ動かせる傾向をもつ方向にＤＣバイアスを有する、請求項２に記載の方法。
第一媒体がゲルを含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
ゲルがアガロースゲルを含んでなる、請求項５に記載の方法。
粒子が、抽出駆動場の強度に依存した、第一媒体中の移動度を有している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
粒子が、抽出駆動場の強度に依存していない、第二媒体中の移動度を有している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
粒子が第一粒子を構成し、第二粒子が第一媒体中に存在し、抽出駆動場の影響下で、第一媒体中の第二粒子が、
ゼロ、および
第一真ドリフト速度より有意に小さい
のうち少なくとも一方である真ドリフト速度を有している、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
粒子がＤＮＡを含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
粒子が生体高分子を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
粒子がタンパク質を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
粒子がＲＮＡを含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
粒子が脂質分子を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
粒子がポリマーを含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
粒子がポリペプチドを含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
粒子が分子の凝集物を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
凝集物がミセルを含んでなる、請求項１７に記載の方法。