JP4470310B2 - 誘電泳動力を用いた物質の分離方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の利用分野】
本発明は、誘電泳動力を利用した２種以上の分子の分離方法に関するものである。
【０００２】
【発明の背景】
近年、半導体技術の進歩によりフォトリソグラフィー等の微細加工技術によってｎｍからμm単位での物質加工技術が確立され、現在もその微細加工技術は進歩しつづけている。
【０００３】
化学・生化学分野に於いては、この微細加工技術を利用して、生体試料からの分析対象成分の抽出（抽出工程），化学・生化学反応を用いる当該成分の分析（分析工程），並びにそれに続く分離処理（分離工程）及び検出（検出工程）といった一連の化学的・生化学的分析工程の全てを一辺数cm〜数十cmのチップ上に集積化等した極小の分析装置をもちいて行う、微細総分析システム〔Micro TotalAnalysis System（μ-TAS）、Laboratory on a chip〕と呼ばれる新技術が発展しつつある。
【０００４】
このμ-TASの手法は、化学的・生化学的分析工程全てを通じて、分析時間の短縮化、使用するサンプル量や化学・生化学反応に必要な試薬量の低減化、分析機器や分析スペースの縮小化に大きく貢献するものと期待されている。
【０００５】
特に、μ-TASに於ける分離工程については、テフロン（登録商標）やシリカ等を材料として作製された内径１mm以下のキャピラリー（細管）を分離カラムとして使用して高電界中で物質の持つ電荷の差を利用して分離を行うキャピラリー電気泳動法や、同様のキャピラリーを用いてカラム担体と物質との相互作用の差を利用して分離を行うキャピラリーカラムクロマトグラフィー法が開発されている。
【０００６】
しかしながら、キャピラリー電気泳動法は、分離に高電圧が必要であることや、検出領域でのキャピラリ容量が制約されるため検出感度が低いという問題、更には、チップ上のキャピラリチップでは、分離のためのキャピラリ長に制約があり、高分子の分離に充分なキャピラリ長が得られないため、低分子の物質の分離には適しているが高分子の物質の分離には適さないという問題を有している。また、キャピラリーカラムクロマトグラフィー法は、分離処理の高速化に限界があり、処理時間の短縮化が困難であるという問題を有している。
【０００７】
そこで、近年、上記した如き問題を解決する手段の一つとして、物質を不均一な電界内に置くと、物質内に正と負の分極が起こり、物質が移動する力が働く現象、いわゆる誘電泳動力〔H.A.Pohl: ”Dielectrophoresis”, Cambridge Univ.Press (1978)、T.B.Jones: ”Electromechanics of Particles”, Cambridge Univ. Press(1995)等〕を利用した分離方法が、注目されている。
【０００８】
この分離方法は、（１）誘電泳動力の大きさは、物質（粒子）の大きさ・誘電的性質に依存し、電界傾度に比例するため、微細加工電極を用いれば、電界および電界傾度をきわめて大きくとることができるので、キャピラリー電気泳動のように高電圧を必要とせず、低い印加電圧で高速な分離が期待できる、（２）電界の強い場所が微小領域に極限されるため、電界印加による温度上昇も最小限にとどめることができ、また、高電界場の形成が可能となる、（３）誘電泳動は、電界傾度に比例する力であることからわかるように、印加電圧の極性に依存しないので、交流電界下でも直流同様に力が働く。従って、高周波交流を用いれば水溶液での電極反応（電気分解反応）は抑えられるので、電極自体をチャネル（サンプル流路）中に集積化することが可能となる、（４）キャピラリー電気泳動のように検出部分のチャンバ容量に制約がないことから検出感度の向上も望める、等の点から、現在ではμ-TASに於ける最も適した分離方法と考えられている。
【０００９】
一方、上記した如き誘電泳動力を利用した分離方法として、現在までに種々の方法が報告されている〔M. Washizu, et al., IEEE Transaction IA, Vol.30, No.4 p.835-843(1994) 、M. Washizu, et al., Conf. Rec. The Institute ofElectrostatics Japan, ’93 Ａnn. Meet. (Int’l Session),p27-32 (1993)、Y. Huang, et al., Biophys. J., Vol.73,p.1118-1129 (1997)及びN.G. Green et al., J. Phys. D.:Appl. Phys., Vol31, 25-30 (1998)等〕。
【００１０】
例えば、ジャーナル オブ フィジックス Ｄ，ブリティッシュ ジャーナルオブ アプライド フィジックス（J. Phys. D: Appl. Phys.） 27, 2659-2662(1994)には、HL-６０細胞と、正常の血液細胞とを含有する懸濁液から、夫々の細胞を分離し得ることが、マイクロバイオロジー, 140, 585-591(1994)には、各種微生物を含有する懸濁液から、酵母や細菌種の違いにより微生物を分離し得ることが、ジャーナルオブバイオテクノロジー, 32, 29-37(1994)には、酵母の生菌と死菌とを含有する懸濁液から、両者を分離し得ることが、また、J. Phys. D: Appl. Phys., 31, 25-30(1998)には、直径93nmのラテックス粒子と216nmのラテックス粒子とを含有する懸濁液から、両者を誘電泳動力及び電気流体力により分離し得ることが夫々報告されている。
【００１１】
また、M. Washizu, et al., IEEE TransactionIA, Vol.30, No.4 p.835-843(1994)には、単一の生体成分を含む溶液を試料として用い、当該成分が誘電泳動力により電極に捕集されること〔例えばアビジン（68kDa），コンカナバリンＡ（52kDa），キモトリプシノーゲンＡ（25kDa）又はリボヌクレアーゼＡ（13.7kDa）〕、並びに単一の生体成分を含む溶液を試料として用い、当該成分を誘電泳動力により捕集し得ること〔48.5kbDNA単独試料を用いた場合の捕集率100％、15kbDNA単独試料を用いた場合の捕集率約60％、９kb環状DNA単独試料を用いた場合の捕集率約50％、アビジン（68KＤa）単独試料を用いた場合の捕集率数％〕が報告されている。
【００１２】
しかしながら、上記した如き従来の誘電泳動力を利用した分離方法についての報告は、各種細胞やラテックス粒子といった、DNAやタンパク等に比べて溶液への溶解性が極めて低い粒子の分離、或いは単一（１種類）のDNAやタンパクの単なる捕集に限られており、２種以上の分子、特に、例えばDNAやタンパク等の生体成分分子が溶解している溶液からの、夫々の分子の分離を行うことの報告は未だなされていない。
【００１３】
これは、誘電泳動力の強さは、物質の持つ物理的な大きさに依存し、大きな体積を持つ物質ほど大きな誘電泳動力を受けるため、細胞やラテックス粒子に比べてその物理的大きさが非常に小さいタンパクやDNA等の、２種以上の分子が溶解している溶液から、誘電泳動力を利用して夫々の分子の大きさの違いに基づいて、これらを相互に分離することは困難であると考えられていたためであることと、従来は、電界強度500KV／mよりも弱い電界強度で分離していたので、分離できなかったからである。
【００１４】
【発明が解決すべき課題】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、２種以上の分子を、誘電泳動力を利用して相互に分離することができる方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決する目的でなされたものであり、下記二種類の方法によって、従来できなかった２種以上の分子を、誘電泳動力を利用して相互に分離することに初めて成功したものである。
【００１６】
その方法は、「特定分子」を含有する試料と『そこに含まれる「特定分子」と結合する「特定分子」の誘電泳動特性を変化させ得る物質』とを接触させて、これらの複合体物質を形成させ、次いで該複合体物質を含む反応物を誘電泳動に付し、不均一電界により生ずる誘電泳動力を利用して、前記複合体物質を移動させ、該複合体物質と前記試料中に含まれる「特定分子」以外の分子とを異なる移動速度とするか、または該複合体物質と分離すべき分子とを異なる電解領域に夫々移動させることによって、該特定分子と特定分子以外の分子とを分離することからなるものであり、従来、誘電泳動力による分離方法において、このような複合体物質を形成させることによって、分離を促進させることは全く行われていないし、このような発想も全く知られていない。
【００１７】
即ち、本発明は、（１）(a)試料中の「特定分子」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質を含む反応物を誘電泳動に付し、不均一電界により生ずる誘電泳動力を利用して、前記複合体物質を移動させ、該複合体物質と前記試料中に含まれる「特定分子」以外の分子とを異なる移動速度とするか、または該複合体物質と「特定分子」以外の分子とを異なる電解領域に夫々移動させることによって、該複合体物質と前記試料中に含まれる「特定分子」以外の分子とを分離する方法、及び、
【００１８】
前記複合体物質中の「特定分子」若しくは複合体形成に関与しない「特定分子」以外の分子を測定する方法、
【００１９】
(b)試料中の「特定分子」と、「特定分子と結合する物質」と、「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質を含む反応物を誘電泳動に付し、不均一電界により生ずる誘電泳動力を利用して、前記複合体物質を移動させ、該複合体物質と前記試料中に含まれる「特定分子と結合する物質」とを異なる移動速度とするか、または該複合体物質と「特定分子と結合する物質」とを異なる電解領域に夫々移動させることによって、該複合体物質と前記複合体物質形成に関与しなかった「特定分子と結合する物質」とを分離する方法、
【００２０】
(C)かくして分離された前記複合体物質中の「特定分子と結合する物質」を測定し、その結果に基づいて試料中の特定分子の存在の有無を検出することを特徴とする試料中の特定分子の検出方法、及び前記分離された前記複合体物質中の「特定分子」若しくは「特定分子と結合する物質」、或いは前記複合体物質形成に関与しなかった「特定分子と結合する物質」を測定することを特徴とする試料中の成分含有量測定方法、
【００２１】
(d)「特定分子」を含有する試料と、「標識物質により標識された特定分子」と、「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とを接触させて、これら「標識された特定分子」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との標識複合体物質を形成させ、次いで誘電泳動に付し、不均一電界により生ずる誘電泳動力を利用して、前記複合体物質を移動させ、該複合体物質と前記試料中に含まれる「特定分子と結合する物質」とを異なる移動速度とするか、または該複合体物質と「特定分子と結合する物質」とを異なる電解領域に夫々移動させることによって、該標識された「特定分子」を含む標識複合体物質と遊離の標識された「特定分子」とを分離し、分離した前記標識複合体物質中の標識された「特定分子」若しくは遊離の標識された「特定分子」を測定し、その結果に基づいて試料中の成分の量を求める試料中の成分含有量測定方法に関する。
尚、「異なる電解領域に夫々移動させる」ことには、一方のみが誘電泳動電極に捕捉され、他方が捕捉されないようにすることも含まれる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施の形態を説明する。
【００２３】
誘電泳動力とは、以下に示す如き現象により生じる力である。
【００２４】
即ち、電界内に置かれた中性分子には、図１に示すように電界の下流側に正極性の分極電荷＋ｑが、上流側には負極性の分極電荷−ｑが夫々誘導され、＋ｑには電界Ｅにより大きさ＋ｑＥの力が働き、この部分を電界の下流側へと引くのに対し、−ｑには電界Ｅにより大きさ−ｑＥの力が働き、この部分を電界の上流へと引く。分子が中性ならば、＋ｑと−ｑの絶対値は等しく、もし電界が場所によらず一定であるならば、両者に働く力は釣り合って分子は動かない。しかし、電界が一様でない場合を図１に示すが、この場合には、強い電界側へ引く力の方が大きくなり、分子は電界の強い側へと駆動されることとなる。このように不均一な電界内で中性粒子が移動する現象を誘電泳動（Dielectrophoresis,DEP）と呼び、この際に分子に働く力を誘電泳動力と呼ぶ。尚、分子が荷電分子である場合は、該誘電泳動力に加えて、電気泳動力を併せた移動様式となる。
【００２５】
本発明が適用される試料としては、例えば血清、血漿、髄液、滑液、リンパ液等の体液、又は尿、糞便のような排泄物等の生体由来試料及びその処理物等が挙げられる。また、処理物としては、例えばこれら生体由来試料を水や緩衝液等で適宜希釈等したもの、或いはこれら生体由来試料に由来する後述する如き分子を水や緩衝液等に適宜溶解又は懸濁させ、再構成して得られたもの等が挙げられる。尚、本発明に係る試料には、化学的に合成された上記した如き分子を含有するものも包含される。
【００２６】
本発明第一の方法（態様１）は、これら試料中の特定の分子を共存するその他の分子と分離し、更にはその分離された分子を測定する方法に関するものである。
【００２７】
かかる本発明の態様としては、(a)「試料中の特定分子」と「特定分子」と結合する「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体を形成させることを特徴とするもの、(b)「試料中の特定分子」と「特定分子と結合する物質」と、該「特定分子」と結合する「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体を形成させることを特徴とするもの、及び(c)試料中の「特定分子」と「標識された特定分子」の何れかと、「特定分子」と結合する「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体を形成させることを特徴とするもの等が含まれる。
【００２８】
これらの各態様において、「特定分子」としては試料中の分子の中の測定したい分子（測定対象分子と略称することがある）と測定したい分子以外の分子（測定対象外分子と略称することがある）が含まれる。
【００２９】
特定分子（測定対象分子）としては、例えばヌクレオチド鎖（オリゴヌクレオチド鎖、ポリヌクレオチド鎖）、染色体、ペプチド鎖（例えばＣ−ペプチド、アンジオテンシンＩ等）、蛋白質（例えば免疫グロブリンＡ（IgA）、免疫グロブリンＥ（IgE）、免疫グロブリンＧ（IgG）、β2−ミクログロブリン、アルブミン、フェリチン等の血清蛋白質、例えばアミラーゼ、アルカリホスファターゼ、γ−グルタミルトランスファラーゼ等の酵素蛋白、例えばルベラウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、ＡＴＬウイルス、ＡＩＤＳウイルス等のウイルスに対する抗ウイルス抗体やこれらウイルスに由来する抗原性物質、例えば各種アレルゲンに対する抗体、例えばリポ蛋白質等の脂質、例えばトリプシン、プラスミン、セリンプロテアーゼ等のプロテアーゼ等）、糖鎖（例えばα−フェトプロテイン、ＣＡ１９−９、前立腺特異抗原、癌胎児性抗原、癌細胞の産生する特殊な糖鎖を有する物質等が有する糖鎖）、レクチン（例えばコンカナバリンＡ、レンズマメレクチン、インゲンマメレクチン、ダツラレクチン、小麦胚芽レクチン等）等が挙げられる。
【００３０】
また、いわゆるアイソザイムやホルモン等の同一の作用を有する２種以上の物質が存在する分子又は類似した構造を有するが異なる作用を有する２種以上の物質が存在する分子、例えばアミラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ-GTP）、リパーゼ、クレアチンキナーゼ（CK）、乳酸脱水素酵素（LDH）、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）、レニン、プロテインキナーゼ、チロシンキナーゼ等の酵素類、例えばステロイドホルモン、ヒト繊毛性ゴナドトロピン（hCG）、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、黄体形成ホルモン（LH）等の生理活性物質、例えば前立腺特異抗原（PSA）、α２-マクログロブリン、癌胎児性抗原（CEA）、α-フェトプロテイン等の癌関連抗原等も特定分子（測定対象分子）に包含される。
【００３１】
本発明に於ける「誘電泳動特性を変化させ得る物質」（分離向上物質と略称することがある。）としては、特定分子（測定対象分子）と結合して、特定分子との複合体を形成することによって、当該特定分子と、それ以外の共存物質（測定対象外分子、例えば、該複合体の形成に関与しなかった１種又はそれ以上の物質）が誘電泳動操作に対応する挙動に差を生ぜしめ得る物質、即ち、１）例えばこれら両者の何れか一方のみが誘電泳動電極に捕捉され他方が捕捉されないという結果を生ぜしめ得る物質、より具体的には、例えば後述するように電界により分子に発生する誘電泳動力と分子の移動との相互作用によって分離を行う、いわゆる誘電泳動クロマトグラフィー装置（Field Flow Fractionation装置）を用いる場合等に於いて、「特定分子」と、それ以外の共存物質との移動速度に変化をもたらし得る物質、より好ましくは何れか一方のみが電極上に補足され、それ以外の共存物質は電極に補足されず誘電泳動電極上を素通りさせ得る物質、或いは２）両者の何れか一方が負の誘電泳動力を受け、他の一方が正の誘電泳動力を受けるという結果を生ぜしめ得る物質、より具体的には、例えば特定分子のみを誘電泳動電極上の特定の位置に集合させ得る物質、より好ましくは何れか一方を正の誘電泳動力によって誘電泳動電極上の電界強度の強い領域に集合させ、他方を負の誘電泳動力によって誘電泳動電極上の電界強度の弱い領域に集合させ得る物質等が含まれる。
【００３２】
かかる物質としては、例えばシリカ、アルミナ等の無機金属酸化物、例えば金、チタン、鉄及びニッケル等の金属及び、無機金属酸化物等にシランカップリング処理等の操作で官能基を導入したもの、例えば各種微生物、真核生物細胞等の生物、例えばアガロース、セルロース、不溶性デキストラン等の多糖類、例えばポリスチレンラテックス、スチレン‐ブタジエン共重合体、スチレン‐メタクリル酸共重合体、アクロレイン‐エチレングリコールジメタクリレート共重合体、スチレン‐スチレンスルホン酸ラテックス、ポリアクリルアミド、ポリグリシジルメタクリレート、ポリアクロレイン被覆粒子、架橋ポリアクリロニトリル、アクリル酸またはアクリル酸エステル系重合体、アクリロニトリル‐ブタジエン、塩化ビニル‐アクリル酸エステル、ポリ酢酸ビニル‐アクリレート等の合成高分子化合物、例えば赤血球、糖、核酸、タンパク質、脂質等の生体分子等が挙げられる。
【００３３】
これらの物質は通常微粒子乃至粒状のかたちで使用される。
【００３４】
本発明に使用する「特定分子と結合する物質」というのは、試料中の「特定分子」から、該「特定分子」と「特定分子と結合する物質」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質を形成し得、「特定分子以外の分子」と「特定分子と結合する物質」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質は実質的に形成しないものであれば良く、特に限定されない。要するに、「特定分子」以外の分子と結合しても上記三者の複合体物質を形成しなければ良いが、実際には「特定分子と特異的に結合する物質」を使用するのが好ましい。
【００３５】
「特定分子と結合する物質」としては、例えば「抗原」−「抗体」間反応、「糖鎖」−「レクチン」間反応、「酵素」−「インヒビター」間反応、「タンパク質」−「ペプチド鎖」間反応又は「染色体又はヌクレオチド鎖」−「ヌクレオチド鎖」間反応等の相互反応によって「特定分子」と結合するもの等を言い、上記各組合せに於いて何れか一方が特定分子（測定対象分子）である場合、他の一方がこの「特定分子（測定対象分子）と結合する物質」である。例えば、特定分子（測定対象分子）が「抗原」であるときは「特定分子（測定対象分子）と結合する物質」は「抗体」であり、特定分子（測定対象分子）が「抗体」であるときは「特定分子（測定対象分子）と結合する物質」は「抗原」である（以下、その他の上記各組合せにおいても同様である）。
【００３６】
尚、これら「特定分子（測定対象分子）と結合する物質」は、少なくとも「特定分子」に結合するものであればよく、必ずしも「特定分子」のみに特異的に結合するものである必要はないが、「特定分子（測定対象分子）と結合する物質」が、「特定分子」と特異的に結合するものではない場合、組み合わせて用いられる「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」は、「特定分子」に特異的に結合するか、若しくは「特定分子」が「特定分子（測定対象分子）と結合する物質」との複合体物質が形成されたことによって新たに生じる部位に特異的に結合する性質を有するものである。
【００３７】
また、これら「特定分子（測定対象分子）と結合する物質」としてはそれ自身が何らかの方法により測定（検出）可能であるか、又は標識物質により標識可能なものが一般的である。このような性質のものを用いることによって試料中の特定分子（測定対象分子）を測定（検定）することが可能となる。尚、特定分子（測定対象分子）自身が何らかの方法により検出可能なものである場合（例えば酵素等）、或いは特定分子（測定対象分子）が、「特定分子と結合する物質」を用いずに（介さずに）直接標識物質と結合し得るものである場合には、該「特定分子と結合する物質」が上記した如き性質を有していなくても、或いは「特定分子と結合する物質」自体を用いなくとも、試料中の特定分子（測定対象分子）を測定（検出）することができる。それら自身が何らかの方法により検出可能なものの例としては、酵素、色素、蛍光物質、発光物質、紫外部に吸収を有する物質等がある。
【００３８】
本発明に於いて用いられる標識物質としては、酵素免疫測定法（EIA）、放射免疫測定法（RIA）、蛍光免疫測定法（FIA）、ハイブリダイゼーション法等、通常この分野で用いられるものであればよく、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ），β-ガラクトシダーゼ（β-Ｇａl），パーオキシダーゼ（ＰＯＤ），マイクロパーオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ），グルコース-6-リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ），リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例えばクーマシーブリリアントブルーR250，メチルオレンジ等の色素、例えば99mＴｃ，131Ｉ，125Ｉ，14Ｃ，3Ｈ，32Ｐ，35Ｓ，等の放射性同位元素、例えばフルオレセイン，ローダミン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミン或はこれらの誘導体，ユウロピウム（Eu）等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス(2,4,6-トリフロロフェニル）オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル，2,6-ジ-t-ブチル-α-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン)-p-トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられる。
【００３９】
標識物質により、特定分子（測定対象物質）又は「特定分子と結合する物質」を標識するには、通常この分野で用いられる常法、例えば自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ或いはハイブリダイゼーション法等に於いて一般的に行われている自体公知の標識方法［例えば、医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、1971；図説 蛍光抗体、川生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス社、1983；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、宮井潔編、第３版、医学書院、1987、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル セカンド エディション、Ｊ．サムブルック，Ｅ．Ｆ．フリッシュ，Ｔ．マニアティス、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー プレス等］や、アビジン（又はストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用した常法等何れの方法により行ってもよい。
【００４０】
前記(a)の態様において、「試料中の特定分子」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体を形成させるには、「特定分子」を含有する試料及び「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」を、それぞれ例えば水あるいは緩衝液
、例えばトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液、グッド緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等、に溶解、分散若しくは懸濁させて液状物とし、これら液状物を互いに混合接触させればよい。尚、これらそれぞれの液状物を先ず調整して一挙にこれらを混合してもよい。また、「特定分子」を含有する試料が液状物である場合には、該試料に、直接「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」を混合させてもよい。
【００４１】
本発明の前記態様(b)及び(c)における複合体の形成も上記と同様にして行われる。
【００４２】
即ち、上記（ｂ）の態様においては、「試料中の特定分子」と「特定分子と結合する物質」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体を形成させるには、「特定分子」を含有する試料、「特定分子と結合する物質」及び「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」を、それぞれ例えば水あるいは緩衝液、例えばトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液、グッド緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等、に溶解、分散若しくは懸濁させて液状物とし、これら液状物を互いに混合接触させればよい。尚、これらそれぞれの液状物を先ず調整して一挙にこれらを混合してもよく、また、先ず「特定分子と結合する物質」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体を上記と同様にして形成させ、この複合体を含有する液状物をさらに上記の様に液状物とした特定分子含有試料とを混合接触させても良い。更にまた、「特定分子」を含有する試料と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とを接触させてこれらの複合体を形成させ、更にこれに「特定分子と結合する物質」を接触させてもよい。
【００４３】
尚、「特定分子」を含有する試料が液状物である場合には、上記したように例えば水或いは緩衝液等に溶解、分散若しくは懸濁させなくともよい。
【００４４】
また、上記（ｃ）の態様においては、「試料中の特定分子」又は「標識により標識された特定分子」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体を形成させるには、先ず、「特定分子」を含有する試料及び「標識により標識された特定分子」を、それぞれ例えば水あるいは緩衝液、例えばトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液、グッド緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等、に溶解、分散若しくは懸濁させて液状物とし、これら液状物を互いに混合接触させる。次いでこの混合液状物と、「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」を例えば水あるいは緩衝液、例えばトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液、グッド緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等に溶解、分散若しくは懸濁させた液状物とを互いに混合接触させれば良い。尚、これらそれぞれの液状物を先ず調製して一挙にこれらを混合してもよい。
【００４５】
尚、「特定分子」を含有する試料が液状物である場合には、上記したように例えば水或いは緩衝液、例えばトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液、グッド緩衝液等に溶解、分散若しくは懸濁させなくともよい。
【００４６】
かくして得られた、複合体含有液状物を次に誘電泳動に付す。
【００４７】
（誘電泳動力の一般式）等価双極子法（Equivalent dipole
moment method）は誘導電荷を等価的な電気双極子に置き換えて、誘電泳動力を解析する手法である。これによれば、電界Eの中に置かれた半径aの球体粒子に働く誘電泳動力Ｆdは、
【数１】
で与えられる。ここで
【外１】
は、ω：印加電圧の角周波数、j：虚数単位を用いて、
【数２】
【数３】
ただし、
【外２】
は粒子と溶液の誘電率と導電率であり、上の式で複素量には＊をつけた。
【００４８】
式（1）は
【数４】
であれば粒子を電界が強い方へと引き付ける力が働き（正の誘電泳動,PositiveDEP）、
【数５】
であれば粒子を電界の弱い方へと押しやる力が働く（負の誘電泳動力,NegativeDEP）ことを示している。
【００４９】
上記誘電泳動力の一般式から、誘電泳動力を受ける物質の誘電泳動力に関与するパラメーターは、概ね物質及び媒質の誘電率及び導電率、物質の持つ大きさ、印可する電界の周波数であることがわかる。これらのパラメーターは検出複合体物質が結合した分離向上物質と特定分子（測定対象分子）の検出に用いられる標識分子の種類により適宜設定すべきものであり一概には言えないが、用いられる媒質の導電率は通常13mS/cm（PBS濃度とした）以下、好ましくは1mS/cm以下である。分離向上物質の大きさは粒子の場合通常その平均粒子径が1mm以下、好ましくは0.025〜100μmであり、生体分子としてはその大きさが通常10nm以上（通常のタンパク分子が数〜数十nmということから類推）、好ましくは500nｍ以上である。
【００５０】
（分離向上物質を用いた誘電泳動分離に使用する電界）上記誘電泳動の一般式から、印加する電界の誘電泳動力に関与するパラメーターは印加電界強度及び印加周波数であると言える。特に同一物質であっても印加する周波数によって正負の誘電泳動特性が変化することがあるから、特定分子（測定対象分子）に応じて適宜設定されるものである。これらのパラメーターは検出複合体物質が結合した分離向上物質と特定分子（測定対象分子）の検出に用いられる標識分子の種類により適宜設定すべきものであり一概には言えないが、誘電泳動分離向上物質が正の誘電泳動を示す場合、印加電界強度は通常3.5MV/m以下、好ましくは1.0MV/m以下である。分離向上物質が負の誘電泳動を示す場合では、3.5MV/m以下の電界強度である。印加周波数は通常100Hz〜10MHz、好ましくは1kHz〜10MHzである。
【００５１】
尚、本発明に於いて印加する電界は、直流電界及び交流電界のいずれでも良いが、交流電界が好ましい。
【００５２】
（誘電泳動分離向上物質を用いた分離法）分離向上物質を用いた特定分子の分離法としては、以下の２つに大別される。
【００５３】
（分離法−１）第１に、分離向上物質が特定分子以外の分子（測定対象外分子）〔例えば特定分子の検出に用いられる遊離の標識物質等〕と同一の正又は負の誘電泳動力を示すものであって、特定分子以外の分子（測定対象外分子）よりも大きな誘電泳動力を示す物質である場合、実質的に分離向上物質及び分離向上物質に結合した特定分子のみが大きな誘電泳動力を受けて分離されることとなる。
【００５４】
即ち、（１）例えば、分離向上物質及び分離向上物質に結合した分子は誘電泳動力によって誘電泳動電極上の特定の部分に集合するが、特定分子以外の分子（測定対象外分子）〔例えば特定分子の検出に用いられる遊離の標識物質等〕は集合しないような電界強度及び媒質条件を適宜設定して、これら特定分子と特定分子以外の分子を分離することができる。
【００５５】
また、（２）例えば後述するように電界により分子に発生する誘電泳動力と分子の移動との相互作用によって分離を行う、いわゆる誘電泳動クロマトグラフィー装置（Field Flow Fractionation装置）を用いて分離を行ってもよい。この場合には、分離向上物質及び分離向上物質に結合した分子のみが誘電泳動力によって誘電泳動分離電極上に捕集されるか、又は分離向上物質及び分離向上物質に結合した分子の移動速度とそれ以外の分子移動速度に差が生じるので、これら特定分子を特定分子以外の分子（測定対象外分子）から容易に分離することができる。
【００５６】
（分離法−２）第２に、分離向上物質が特定分子以外の分子（例えば特定分子の検出に用いられる標識物質）と異なる正又は負の誘電泳動力を示す物質である場合、即ち、分離向上物質が正の誘電泳動力を示し、特定分子以外の分子が負の電気泳動力を示す場合、或いは分離向上物質が負の誘電泳動力を示し、特定分子以外の分子が正の電気泳動力を示す場合、分離向上物質及び分離向上物質に結合した特定分子と、特定分子以外の分子とは異なる電解領域に夫々移動するので、特定分子を特定分子以外の分子と分離することが出来る。
【００５７】
即ち、（１）例えば、実質的に分離向上物質及び分離向上物質に結合した特定分子と特定分子以外の分子は、誘電泳動力によって誘電泳動電極上の異なる電解領域に移動するので、特定分子と特定分子以外の分子（例えば特定分子の検出に用いられる遊離の標識物質等）とを分離することができる。
【００５８】
また、（２）例えば、誘電泳動クロマトグラフィー装置（Field FlowFractionation装置）を用いて分離を行ってもよく、この場合、分離向上物質及び分離向上物質に結合した特定分子が正の誘電泳動力を示し、特定分子以外の分子が負の誘電泳動力を示す条件に於いては、分離向上物質及び分離向上物質に結合した特定分子は誘電泳動力によって誘電泳動分離電極上に捕集されるが、特定分子以外の分子は負の誘電泳動力によって電極に捕集されない。一方、特定分子以外の分子が正の誘電泳動力を示し、分離向上物質及び分離向上物質に結合した特定分子が負の誘電泳動力を示す条件に於いては、特定分子以外の分子は誘電泳動力によって誘電泳動分離電極上に捕集されるが、分離向上物質及び分離向上物質に結合している特定分子は負の誘電泳動力によって電極に捕集されない。従って、これら特定分子と特定分子以外の分子とを分離することが出来る。
【００５９】
尚、本発明に於いて用いられる、誘電泳動電極及び誘電泳動クロマトグラフィー装置としては、この分野で通常用いられるものは全て使用可能であるが、具体的には後述するような水平及び垂直方向に不均一電解を形成し得る構造を有する電極及びこれを有するものが挙げられる。
【００６０】
「分離向上物質」は、通常は「特定分子と結合する物質」に結合させて用いられ、このようにすることによって試料中の「特定分子」に結合させ得るが、例えば分離向上物質表面に官能基を導入した後、この官能基を介して特定分子に結合させる方法、分離向上物質と「特定分子」をリンカーを介して結合させる方法等の化学的結合法等により「特定分子」に直接「分離向上物質」を結合させてもよい。尚、ここで用いられる「特定分子と特異的に結合する物質」としては、先に述べた「特定分子と特異的に結合する物質」と同じもの［但し、それ自身が何らかの方法により測定（検出）可能であるか、又は標識物質により標識可能なものである必要はない。］、或いは「特定分子」が「特定分子と結合する物質」との複合体が形成されたことによって、新たに生じる部位に特異的に結合する性質を有するもの等が用いられる。尚、「特定分子と結合する物質」との複合体が形成されたことによって、新たに生じる部位に特異的に結合する性質を有するものとしては、例えば「特定分子」と「特定分子と結合する物質」との複合体を認識してこれに結合し得る抗体、ペプチド鎖、ヌクレオチド鎖等が挙げられる。
【００６１】
また、「分離向上物質」と「特定分子と結合する物質」とを結合させるには、先に述べた如き標識物質により「特定分子」を標識する方法と同様の方法により行えばよい。
【００６２】
尚、「分離向上物質」として、直接「特定分子」と特異的に結合し得る性質を有するものを用いる場合には、上記した如き操作は不要である。
【００６３】
このような「分離向上物質」としては、例えば核酸、タンパク質、脂質等が挙げられる。
【００６４】
本発明に於いて、『複合体物質と試料中に含まれる「特定分子」以外の分子とを分離する』とは、必ずしも「複合体物質」（特定分子と分離向上物質との複合体物質）のみを分離（単離）することを意味するものではなく、目的に応じて試料中に共存する１種又はそれ以上の「複合体物質」以外の物質と「特定分子」とを分離することを意味する。この場合、適宜条件を設定して本発明の分離方法を繰返し実施すれば、「特定分子」をこれと分離向上物質との複合体物質として単離することが可能である。要は、試料中の「特定分子」若しくは「特定分子」以外の分子の含有量が測定できれば良い。
【００６５】
上記した如き本発明の分離方法によれば、試料中から「特定分子」（特定分子と分離向上物質との複合体として分取される場合を含む。）又は「特定分子」以外の分子を分取することができる。
【００６６】
即ち、前記した如き〔分離法−１〕の（１）に於いては、例えば特定分子は分離向上物質との複合体として電極の特定部分に捕集され、それ以外の分子は電極の特定部分に捕集されないような条件の電界を印加したまま、通常この分野で用いられる適当な緩衝液又は水等を用いて電極を洗浄することにより特定分子以外の分子が分取でき、次いで、電界の印加を中止して適当な緩衝液又は水等を用いて電極を洗浄すれば、特定分子（特定分子と分離向上物質との複合体）を分取することができる。
【００６７】
また、前記した如き〔分離法−２〕の（１）に於いては、実質的に分離向上物質及び分離向上物質に結合した分子と特定分子以外の分子は、誘電泳動力によって誘電泳動電極上の異なる電解領域に移動するので、これら移動した分子を夫々別々に分取することができる。
【００６８】
更に、前記した如き〔分離法−１〕の（２）の方法で分離を行った場合には、先ず、電極の特定部分に捕集されずに移動してきた小さい誘電泳動力を受ける特定分子以外の分子を含有する移動溶液を分取し、次いで、電界の印加を中止して適当な緩衝液又は水等を用いて電極を洗浄することにより、電荷印加時に電極の特定部分に捕集されていた大きい誘電泳動力を受ける特定分子を移動させて当該分子を含有する洗浄液を分取すれば、特定分子又はそれ以外の分子を夫々分取することができる。
【００６９】
また、〔分離法−２〕の（２）の方法で分離を行った場合、分離向上物質及び分離向上物質に結合した特定分子が正の誘電泳動力を示し、特定分子以外の分子が負の誘電泳動力を示す条件に於いては、先ず、電極の特定部分に捕集されずに移動してきた負の誘電泳動力を示す特定分子以外の分子を含有する移動溶液を分取し、次いで、電界の印加を中止して適当な緩衝液又は水等を用いて電極を洗浄することにより、電荷印加時に電極の特定部分に捕集されていた正の誘電泳動力を示す特定分子を移動させて当該分子を含有する洗浄液を分取すれば、特定分子を分取することができる。また、特定分子以外の分子が正の誘電泳動力を示し、分離向上物質及び分離向上物質に結合した特定分子が負の誘電泳動力を示す条件に於いては、先ず、電極の特定部分に捕集されずに移動してきた負の誘電泳動力を示す特定分子を含有する移動溶液を分取し、次いで、電界の印加を中止して適当な緩衝液又は水等を用いて電極を洗浄することにより、電荷印加時に電極の特定部分に捕集されていた正の誘電泳動力を示す特定分子以外の分子を移動させて当該分子を含有する洗浄液を分取すれば、特定分子又はそれ以外の分子を夫々分取することができる。
【００７０】
尚、用いられる緩衝液としては、例えばトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液、グッドの緩衝液、リン酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液等、通常この分野で使用されるものが挙げられる。
【００７１】
尚、上記二者（「特定分子」及び「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」）の複合体物質と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とは、誘電泳動によっては通常分離し得ず、また、上記三者（「特定分子」、「特定分子と結合する物質」及び「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」）の複合体物質と、「特定分子と結合する物質」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質及び「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とは、誘電泳動によっては通常分離し得ずないが、分離されなくとも、後述する試料中の「特定分子」の測定には特に支障はない。
【００７２】
また、試料中の「特定分子」と結合する「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」を「特定分子と結合する物質」との複合体としてではなく、単独で使用する場合は、「特定分子と結合する物質」を過剰量使用するので、「特定分子と結合する物質」が残存するが、これは「特定分子」以外の分子と一緒に分離すれば良い。
【００７３】
先ず、本発明の態様２の分離方法を利用する場合について述べれば、以下の如くである。
【００７４】
即ち、特定分子（測定対象分子）と該特定分子と結合する「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との相互作用の結果生じる複合体物質と、試料中に含まれる特定分子以外の分子との分離を、本発明の態様１の分離方法により行った後、当該複合体物質中の特定分子（測定対象分子）若しくは「特定分子」以外の分子を測定することにより、試料中の成分（測定対象分子）若しくは「特定分子」以外の分子を測定することにより、試料中の成分［特定分子（測定対象分子）又は／及び特定分子以外の分子］を測定することができる。
【００７５】
尚、上記方法に於いて、「特定分子」としてはそれ自体が何らかの方法により測定（検出）可能であるか、又は標識物質により標識可能なもの、或いはそれ自体が測定（検出）可能であるか、標識物質により標識可能な「特定分子と結合する物質」と結合したものである。尚、標識物質、「特定分子と結合する物質」及び標識方法は先に述べた通りである。
【００７６】
また、特定分子（測定対象分子）と該特定分子と結合する物質と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との相互作用の結果生じる複合体物質（複合体物質１）と、複合体物質形成に関与しなかった（遊離の）該特定分子と結合する物質との分離、いわゆるＢ／Ｆ分離を、本発明の態様１の分離方法により行った後、当該複合体物質１、又は複合体物質１中の特定分子（測定対象分子）若しくは「特定分子と結合する物質」、或いは複合体物質形成に関与しなかった（遊離の）該特定分子と結合する物質を測定することにより、試料中の特定分子（測定対象分子）を迅速且つ容易に測定し得る。
【００７７】
尚、上記方法に於いて、「特定分子と結合する物質」としては、それ自体が何らかの方法により測定（検出）可能であるか、又は標識物質により標識可能な「特定分子と結合する物質」を使用するのが一般的である。
【００７８】
更に、特定分子（測定対象分子）と該特定分子と結合する物質〔又は標識物質により標識された特定分子と結合する分子〕と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とを反応させ生じた特定分子（測定対象分子）と該特定分子と結合する物質〔又は標識物質により標識された特定分子と結合する分子〕と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質（複合体物質１）と、遊離の特定分子と結合する物質（又は遊離の標識された特定分子と結合する分子）とを、前述した如き本発明の態様１の分離方法により分離する。次いで、分離された複合体物質１を、複合体物質１中の特定分子と結合する物質（又は該複合体物質１中の特定分子と結合する物質に結合した標識物質）の性質に基づいて検出することにより、試料中の特定分子（測定対象分子）の存在の有無を測定することが出来る。
【００７９】
更に、例えば以下の如き方法によれば、試料中の特定分子（測定対象分子）の存在を測定し得るのみでなく、試料中の特定分子（測定対象分子）の量を定量的に測定し得る。
【００８０】
即ち、特定分子（測定対象分子）と特定分子と結合する物質（又は標識された特定分子と結合する物質）と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質（複合体物質１）と、遊離の特定分子と結合する物質（又は遊離の標識された特定分子と結合する物質）とを、前述した如き本発明の態様１の分離方法により分離する。次いで、分離された該複合体物質１中の特定分子と結合する物質（又は該複合体物質１中の特定分子と結合する物質に結合した標識物質）の量、又は遊離の特定分子と結合する物質（又は遊離の標識された特定分子と結合する物質に結合した標識物質）の量を、特定分子と（特異的に）結合する物質又は標識物質の性質に応じた測定方法により求め、これらの量に基づいて、試料中の特定分子（測定対象分子）の量を求めることができる。
【００８１】
また、標識された特定分子を用いて、これと試料中の特定分子との競合反応を利用する、いわゆる競合法によっても、試料中の特定分子を測定することが出来る。
【００８２】
即ち、特定分子を含む試料と標識物質により標識された特定分子（標識特定分子）と、「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とから、標識特定分子と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との標識複合体物質及び特定分子と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質を形成させ、次いで誘電泳動に付して、該標識特定分子を含む複合体物質と遊離の標識特定分子とを分離し、分離した前記標識複合体物質中の標識特定分子に結合した標識物質の量若しくは遊離の標識特定分子に結合した標識物質の量を、標識物質の性質に応じた測定方法により求め、これらの量に基づいて、試料中の特定分子の量を求めることができる。
【００８３】
尚、これら上記の方法に於いて、得られた特定分子、特定分子と結合する物質又は標識物質の量に基づいて、試料中の特定分子の量を求めるには、例えば特定分子濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行い、得られた特定分子量と、複合体物質中の標識物質量，複合体物質中の特定分子と結合する物質（又は標識された特定分子と結合する物質）の量，遊離の標識特定分子の標識物質の量又は遊離の特定分子と結合する物質（又は標識された特定分子と結合する物質中の標識物質）の量との関係を示す検量線を、夫々用いて試料中の特定分子の量を算出すればよい。
【００８４】
また、試料中に濃度既知の検出可能な物質を内部標準として添加し、内部標準として添加した当該物質の量と、複合体物質中の標準物質の量、複合体物質中の特定分子と結合する物質の量（又は標識された特定分子と結合する物質中の標識物質の量）、遊離の標識特定分子中の標識物質の量、又は遊離の特定分子と結合する物質の量（又は遊離の標識された特定分子と結合する物質中の標識物質の量）とを比較することによって、相対的な試料中の特定分子の量の算出が可能となる。また、このようにすることによって、誘電泳動分離デバイス間の誤差を補正することも可能となる。
【００８５】
上記した如き方法に於いて、検出可能な物質は、誘電泳動力を受ける物質であって、それ自体が何らかの方法により測定（検出）可能であるか、又は標準物質により標識可能なものであるが、通常試料中に存在する成分以外のものであって、且つ測定対象分子に結合し得ないものが一般的である。より具体的には、例えば、上記した如き性質を有する、先に述べた「特定分子」及び「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」等が挙げられる。
【００８６】
尚、標識物質、標識方法は先に述べた通りである。
【００８７】
次に、本発明の態様２の分離方法を利用する場合について述べれば以下の如くである。
【００８８】
尚、本発明の態様２の分離方法を利用した測定方法に於ける測定対象分子（対象分子Ａ）としては、前述した如き分離の対象となり且つ前述した如き溶液に溶解し得るものであって、１該対象分子Ａと互いに相互作用を及ぼしあい、複合体物質を形成し得る分子（分子Ｂ）が存在し、該分子Ｂがそれ自身何らかの方法により測定（検出）し得る性質を有しているか、又は標識物質により標識可能なもの、であるか、２該対象分子Ａが標識物質により標識可能であって、該対象分子Ａと互いに相互作用を及ぼしあい、標識複合体物質を形成し得る分子（分子Ｂ）が存在するもの、であればよい。
【００８９】
即ち、測定対象分子（対象分子Ａ）と該測定対象分子に特異的に結合する物質（分子Ｂ）との相互作用の結果生じる複合体物質（複合体物質２）と、遊離の分子Ｂとの分離、いわゆるＢ／Ｆ分離を、本発明の態様２の分離方法により行った後、当該複合体物質２，複合体物質２中の対象分子Ａ又は分子Ｂ（又は該複合体物質２の分子Ｂに結合した標識物質）、或いは遊離の分子Ｂ（又は遊離の分子Ｂに結合した標識物質）を測定することにより、試料中の対象分子Ａを迅速且つ容易に測定し得る。
【００９０】
即ち、対象分子Ａを含む試料と分子Ｂ〔又は標識物質により標識された分子Ｂ（標識分子Ｂ）〕とを反応させ生じた対象分子Ａと分子Ｂ（又は標識分子Ｂ）との複合体物質２と、遊離の分子Ｂ（又は標識分子Ｂ）とを、前述した如き本発明の態様２の分離方法により分離する。次いで、分離された該複合体物質２を、該複合体物質２中の分子Ｂ（又は該複合体分子中の分子Ｂに結合した標識物質）の性質に基づいて検出することにより、試料中の対象分子Ａの存在の有無を測定することができる。
【００９１】
更に、例えば以下の如き方法によれば、試料中の対象分子Ａの存在を測定し得るのみでなく、試料中の対象分子Ａの量を定量的に測定し得る。
【００９２】
即ち、対象分子Ａを含む試料と、分子Ｂ〔又は標識物質により標識された分子Ｂ（標識分子Ｂ）〕とを反応させ、生じた対象分子Ａと分子Ｂ（又は標識分子Ｂ）との複合体物質２と、遊離の分子Ｂ（又は遊離の標識分子Ｂ）とを、前述した如き本発明の態様２の分離方法により分離する。次いで、分離された該複合体物質２中の分子Ｂ（又は該複合体物質２中の分子Ｂに結合した標識物質）の量、又は遊離の分子Ｂ（又は遊離の標識分子Ｂに結合した標識物質）の量を、分子Ｂ又は標識物質の性質に応じた測定方法により求め、これらの量に基づいて、試料中の対象分子Ａの量を求めることができる。
【００９３】
また、標識された対象分子Ａを用いて、これと試料中の対象分子Ａとの競合反応を利用する、いわゆる競合法によっても、試料中の対象分子Ａを測定することが出来る。
【００９４】
即ち、対象分子Ａを含む試料、標識物質により標識された対象分子Ａ（標識対象分子Ａ）及び分子Ｂを反応させ、標識対象分子Ａと分子Ｂとの標識複合体物質と、対象分子Ａと分子Ｂとの複合体物質を形成させた後、標識複合体物質と、遊離の標識特定分子Ａとを、前述した如き本発明の分離方法により分離する。次いで、分離された該標識複合体物質中の標識対象分子Ａに結合した標識物質の量又は遊離の標識対象分子Ａに結合した標識物質の量を、標識物質の性質に応じた測定方法により求め、これらの量に基づいて、試料中の対象分子Ａの量を求めることができる。
【００９５】
尚、これら上記の方法に於いて、得られた分子Ｂ又は標識物質の量に基づいて、試料中の対象分子Ａの量を求めるには、例えば対象分子Ａ濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行い、得られた対象分子Ａ量と、複合体物質中の標識物質量，複合体物質中の分子Ｂ（又は標識物質）の量，遊離の標識対象分子Ａの標識物質又は遊離の分子Ｂ（又は標識分子Ｂ中の標識物質）の量との関係を示す検量線を、夫々用いて試料中の対象分子Ａの量を算出すればよい。
【００９６】
また、試料中に濃度既知の検出可能な物質を内部標準として添加し、内部標準として添加した当該物質の量と、複合体物質中の標準物質の量、複合体物質中の分子Ｂ（又は標識物質）の量、遊離の標識対象分子Ａ中の標識物質の量、又は遊離の分子Ｂの量（又は標識分子Ｂ中の標識物質の量）とを比較することによって、相対的な試料中の特定分子の量の算出が可能となる。また、このようにすることによって、誘電泳動分離デバイス間の誤差を補正することも可能となる。
【００９７】
上記した如き方法に於いて、検出可能な物質は、誘電泳動力を受ける物質であって、それ自体が何らかの方法により測定（検出）可能であるか、又は標準物質により標識可能なものであるが、通常試料中に存在する成分以外のものであって、且つ測定対象分子に結合し得ないものが一般的である。より具体的には、例えば、上記した如き性質を有する、先に述べた「特定分子」及び「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」等が挙げられる。
【００９８】
尚、標識物質、標識方法は先に述べた通りである。
【００９９】
尚、上記方法に於いて、これら対象分子Ａに特異的に結合する分子（分子Ｂ）は、先に述べた「特定分子と特異的に結合する物質」と同じものである。
【０１００】
本発明に於いて用いられる標識物質としては、酵素免疫測定法（EIA）、放射免疫測定法（RIA）、蛍光免疫測定法（FIA）、ハイブリダイゼーション法等、通常この分野で用いられるものであればよく、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ），β-ガラクトシダーゼ（β-Ｇａl），パーオキシダーゼ（ＰＯＤ），マイクロパーオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ），グルコース-6-リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ），リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例えばクーマシーブリリアントブルーR250，メチルオレンジ等の色素、例えば99mＴｃ，131Ｉ，125Ｉ，14Ｃ，3Ｈ，32Ｐ，35Ｓ，等の放射性同位元素、例えばフルオレセイン，ローダミン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミン或はこれらの誘導体，ユウロピウム（Ｅｕ）等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス(2,4,6-トリフロロフェニル）オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル，2,6-ジ-t-ブチル-α-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン)-p-トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられる。
【０１０１】
標識物質により、対象分子Ａ又は分子Ｂを標識するには、通常この分野で用いられる常法、例えば自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ或いはハイブリダイゼーション法等に於いて一般的に行われている自体公知の標識方法［例えば、医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、1971；図説 蛍光抗体、川生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス社、1983；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、宮井潔編、第３版、医学書院、1987、モレキュラー クローニングア ラボラトリー マニュアル セカンド エディション、Ｊ．サムブルック，Ｅ．Ｆ．フリッシュ，Ｔ．マニアティス、コールドスプリング ハーバーラボラトリー プレス等］や、アビジン（又はストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用した常法等何れの方法により行ってもよい。
【０１０２】
本発明の測定方法（本発明の第二の方法：態様２）に於いて、対象分子Ａと分子Ｂ（又は標識分子Ｂ）とを反応させて、複合体物質２を形成する際の反応条件、或いは、対象分子Ａ、又は標識対象分子Ａ）及び分子Ｂを反応させて、標識複合体物質を形成させる際の反応条件としては、当該複合体物質２（又は標識複合体物質）が形成されるのを妨げるような条件でなければよく、常法、例えば自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ或いはハイブリダイゼーション法等に於いて複合体物質２（標識複合体物質）を形成させる際の反応条件に準じて行えばよい。また、本発明の第一の方法において、特定分子（又は標識特定分子）と該特定分子と結合する物質と「誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質１［又は特定分子（又は標識特定分子）と「誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質］を形成する際の反応条件、又は、標識特定分子と「誘電泳動特性を変化させ得る物質」との標識複合体物質を形成する際の反応条件も、上記反応条件に準じて行えば良い。
【０１０３】
本発明の態様２（第二）の方法に於いて、対象分子Ａと分子Ｂ（又は標識分子Ｂ）とを反応させて、複合体物質２を形成する際の分子Ｂ（又は標識分子Ｂ）の使用濃度としては、対象分子Ａの検量限界等により変動するため一概には言えないが、通常、反応液中に於いて、設定された検量限界濃度に相当する対象分子Ａ全てと結合し得る濃度以上、好ましくはその２倍濃度以上、より好ましくは５倍濃度以上が反応液中に存在していることが望ましい。尚、本発明の態様１（第一）の方法における「特定分子」及び「特定分子と結合する物質」（又は標識された「特定分子と結合する物質」）或いは「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」の使用濃度もこの条件に準じて設定すればよい。
【０１０４】
また、本発明の態様２（第二）の方法に於いて、対象分子Ａ、標識対象分子Ａ及び分子Ｂを反応させて、標識複合体物質を形成させる際の標識対象分子Ａの使用濃度及び分子Ｂの使用濃度は、対象分子Ａの検量限界や測定感度等をどの程度に設定するかにより適宜設定すればよいが、標識分子Ａの使用濃度は、少なくとも反応液中に存在する分子Ｂ全てと結合し得る濃度以上である。尚、本発明の態様１（第一）の方法における「標識特定分子」及び「特定分子と結合する物質」（又は標識された「特定分子と結合する物質」）の使用濃度もこの条件に準じて設定すればよい。
【０１０５】
本発明の態様２（第二）の方法に於いて、反応時のｐＨや温度は、対象分子Ａと分子Ｂの性質により異なるため一概には言えないが、複合体物質２（又は標識複合体物質）が形成されるのを妨げない範囲であればよく、ｐＨは、通常２〜10、好ましくは５〜９であり、温度は、通常０〜90℃、好ましくは20〜80℃である。また、反応時間は、複合体物質２（又は標識複合体物質）が形成されるのに要する時間が、対象分子Ａと分子Ｂの性質により異なるので、夫々の性質に応じ、通常数秒乃至数時間適宜反応させればよい。本発明の態様１（第一）の方法に於ける、反応時のｐＨや温度及び反応時間についても、上記に準じて行えば良い。
【０１０６】
本発明の測定方法に於いて、分離された複合体物質２中の分子Ｂ（又は該複合体物質２中の分子Ｂに結合した標識物質），遊離の分子Ｂ（又は遊離の標識分子Ｂに結合した標識物質）、複合体物質１中の特定分子に結合する物質（又は該複合体物質１中の特定分子に結合する物質に結合した標識物質），遊離の特定分子に結合する物質（又は遊離の標識された特定分子に結合する物質）、標識複合体物質中の標識対象分子Ａに結合した標識物質，遊離の標識対象分子Ａに結合した標識物質、標識複合体物質中の標識特定分子に結合した標識物質，又は遊離の標識特定分子に結合した標識物質を測定するには、これらの種類に応じて夫々所定の方法に従って行えばよい。例えば、その性質が酵素活性の場合にはＥＩＡやハイブリダイゼーション法等の常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質核酸 酵素別冊 No.31、北川常廣・ 南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、51〜63頁、共立出版（株）、1987年９月10日発行」等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、検出物質が放射性物質の場合にはＲＩＡやハイブリダイゼーション法等の常法に従い、該放射性物質の出す放射線の種類及び強さに応じて液浸型ＧＭカウンター，液体シンチレーションカウンター，井戸型シンチレーションカウンター等の測定機器を適宜選択して使用し、測定を行えばよい（例えば医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、1971，生化学実験講座２ トレーサー実験法下、竹村彰祐，本庶佑、501〜525頁、（株）東京化学同人、1977年2月25日発行等参照。）。また、その性質が蛍光性の場合には蛍光光度計や共焦点レーザー顕微鏡等の測定機器を用いるＦＩＡやハイブリダイゼーション法等の常法、例えば「図説蛍光抗体、川生明著、第１版、( 株)ソフトサイエンス社、1983」、「生化学実験講座２ 核酸の化学III、実吉峯郎、299〜318頁、（株）東京化学同人、1977年12月15日発行等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、その性質が発光性の場合にはフォトンカウンター等の測定機器を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、252〜263頁、共立出版（株）、1987年９月10日発行」等に記載された方法に準じて測定を行えばよい。更に、その性質が紫外部に吸収を有する性質の場合には分光光度計等の測定機器を用いる常法によって測定を行えばよく、その性質が発色性の場合には分光光度計や顕微鏡等の測定機器を用いる常法によって測定を行えばよい。また、検出物質がスピンの性質を有する物質の場合には電子スピン共鳴装置を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質核酸酵素 別冊 No.31、北川 常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、264〜271頁、共立出版（株）、1987年９月10日発行」等に記載された方法に準じて夫々測定を行えばよい。
【０１０７】
また、本発明の測定方法に於いて、前述した如き本発明の分離方法により分離された各分子を測定するには、例えば、電極の特定部分（電界の強い領域又は／及び電界の弱い領域）に於いて、複合体分子若しくは複合体物質又は／及び遊離の分子Ｂ若しくは遊離の「特定分子と結合する物質」が分離・捕集されているか否かを、複合体物質２中の分子Ｂ（又は該複合体物質２中の分子Ｂに結合した標識物質），遊離の分子Ｂ（又は遊離の標識分子Ｂに結合した標識物質）、複合体物質１中の特定分子に結合する物質（又は該複合体物質１中の特定分子に結合する物質に結合した標識物質），又は遊離の特定分子に結合する物質（又は遊離の標識された特定分子に結合する物質）を直接観察することにより測定してもよい。尚、この場合、分子Ｂ、特定分子又は標識物質は、放射性，蛍光性，発光性，発色性，スピンの性質等を有するものが好ましい。
【０１０８】
また、例えば前述した如き電極基板からの流出液をそのまま検出部に導き、流出液中の，複合体物質２中の分子Ｂ（又は該複合体物質２中の分子Ｂに結合した標識物質），遊離の分子Ｂ（又は遊離の標識分子Ｂに結合した標識物質）、複合体物質１中の特定分子に結合する物質（又は該複合体物質１中の特定分子に結合する物質に結合した標識物質），遊離の特定分子に結合する物質（又は遊離の標識された特定分子に結合する物質）、標識複合体物質中の標識対象分子Ａに結合した標識物質，遊離の標識対象分子Ａに結合した標識物質、標識複合体物質中の標識特定分子に結合した標識物質，又は遊離の標識特定分子に結合した標識物質を直接測定しても、また、検出部を有する電極基板を用いて、同様に測定してもよい。尚、これらの方法によれば、測定がより迅速に行える点で有利である。
【０１０９】
この場合に、分子Ｂ、特定分子と結合する物質、特定分子又は標識物質が有している、何らかの方法により測定（検出）し得る性質が、例えば酵素活性であれば、電極基板の電極の下流末端と検出部との間に、酵素活性測定用の試薬を添加し流出液と反応させる、反応部を設ける必要がある。該反応部に於いて用いられる酵素活性測定用の試薬は、常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質核酸 酵素別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川 榮治編集、51〜63頁、共立出版（株）、1987年９月10日発行」等に記載された方法に準じて調製したものを用いても、市販されている臨床検査用キットの試薬を適宜選択して利用してもよい。また、分子Ｂ又は標識物質の性質が酵素活性以外の場合に於いても、検出感度を増加させる目的等で所定の試薬を添加、反応させるために、電極基板の電極の下流末端と検出部との間に適当な反応部を設けることは任意である。
【０１１０】
尚、上記２つの測定方法の内、後述の方法、即ち、電極上で分離した後、夫々の分子を検出部分に導く方法に於いては、例えば溶出溶液の流速、溶出流路形状、検出部に移動中の各分子の溶出溶液への拡散等の影響により、分離効率が低下したり、一旦分離した各分子の検出感度が低下する等する可能性がある。そのため、単に特定の分子を検出するだけであれば、前述の方法、即ち、電極上で分離した後に、直接電極上を観察して分離された各分子を観察するという方法の方が、上記した如き拡散等の影響により生じる諸問題を解決でき、しかも分離された各分子を検出部分に導く必要がないので分離から検出までの時間を短縮できる、等の点で有利である。また、この方法は、電極基板上で反応、分離、検出が行えるため、反応部分、分離部分、検出部分を一体化できるので基板の省スペース化にもつながり、更には、溶出用の溶液を送流させる必要がなくなるため検出装置自体の小型化も望める等の点でも有利である。
【０１１１】
本発明の測定方法は、本発明の分離方法を利用する以外は、上記した如き自体公知の方法に準じて実施すればよく、使用される試薬類もこれら自体公知の方法に準じて適宜選択すればよい。
【０１１２】
上記本発明の実施に使用する試薬類等を誘電泳動用測定キットとしておくと、上記本発明の方法を実施するのに好都合である。
【０１１３】
具体的には、誘電泳動用測定キットは、「特定分子と結合する物質」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とからなり、これらの物質が試料中の「特定分子」と複合体物質を形成し得る物質を含むものである。また、「標識物質により標識された特定分子」と「特定分子と結合する物質」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とからなり、これらの物質が試料中の「特定分子」と複合体物質を形成し得る物質を含むものである。
【０１１４】
上記キットに於いて、「特定分子と結合する物質」、「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」及び「標識物質により標識された特定分子」の好ましい態様及び具体例は、先に述べた通りであるが、「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」としては、好ましくは「特定分子」と「特定分子と結合する物質」のいずれか若しくは双方と結合する物質である。また、上記誘電泳動用測定キットに、更に、誘電泳動装置を組み合わせても良い。
【０１１５】
尚、これら以外、上記した如き通常この分野で用いられる試薬類や特定分子又は対象分子Ａからなる標準品等を含んでいてもよい。
【０１１６】
本発明の測定方法を、特定の遺伝子配列を検出するためのハイブリダイゼーション法に用いる場合を例に取り、以下により具体的に説明する。
【０１１７】
即ち、先ず、検出したい遺伝子配列と相補的な配列を持ち、且つ標識物質で標識された適当な長さのヌクレオチドプローブと、変性１本鎖化された未知の遺伝子を、適当な緩衝液中で混合・反応させてアニーリングさせ、該ヌクレオチドプローブと変性１本鎖化未知遺伝子との複合体を形成させる。次いで、得られた反応液を、前述した如き誘電泳動力を利用した本発明の分離方法に供し、該複合体と遊離のヌクレオチドプローブとを分離する。分離後、該複合体中の標識物質を、上記した如き方法により測定すれば、該未知遺伝子がヌクレオチドプローブと相補的な配列を含むのか否か、即ち、ヌクレオチドプローブと相補的な配列の存在の有無を測定することができる。
【０１１８】
上記した如き方法に於いて、ヌクレオチドプローブや緩衝液等は、自体公知の方法に準じて適宜選択すればよい。また、ヌクレオチドプローブの調製方法、変性１本鎖化遺伝子の調製方法及びアニーリング条件等は、自体公知の方法に準じて実施すればよい。
【０１１９】
以下に実施例、参考例及び実験例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
【０１２０】
【実施例】
参考例 １ 誘電泳動電極基板の作製最小ギャップ7μm 、電極ピッチ20μm、電極数2016（1008対）の多段電極列を設計し、それに基づいて、電極作製用のフォトマスクを作製した。
【０１２１】
即ち、アルミ蒸着し、レジストを塗布したガラス基板に、電子ビーム描画装置にて上記設計通りの電極パターンを描画した後、レジストを現像し、アルミをエッチングすることによってフォトマスクを作製した。
【０１２２】
電極基板の作製は、図解フォトファブリケーション、橋本貴夫著、総合電子出版、（1985）に記載の方法に準じて以下の如く行った。
【０１２３】
即ち、上記の如くして作製したフォトマスクと、レジストを塗布したアルミ蒸着ガラス基板を密着させたのち、水銀ランプで電極パターンを露光した。露光後の電極用ガラス基板はレジストの現像、アルミ面のエッチングに続き、アルミ面に残ったレジストを除去することによって電極基板を作製した。アルミ表面は電気化学的に活性であり、希釈したフォトレジストをスピンコートすることによって、厚さ５ｎｍの有機薄膜コーティングを施した。
【０１２４】
図４に、作製した電極基板の模式図を、また、図５に電極の模式図を夫々示す。尚、図４に於いて１は電極を示す。
【０１２５】
参考例 ２ 流路を有する電極基板の作製不均一交流電界中に分子を移動させることによる分子の分離を行うため、参考例 １で作製した電極基板上にシリコンゴムを用いて流路を作製した。
【０１２６】
電極上に分子が溶解した溶液を送流するためのシリコンゴム流路は、深さ２５μm、幅４００μmで、電極基板上の電極が配置されている領域を通るように設計した。
【０１２７】
作製は、図解フォトファブリケーション、橋本貴夫著、総合電子出版、1985に記載の方法に準じて行った。先ず、ガラス板上に厚さ２５μmのシート状ネガレジストを貼り付け、流路作製用に設計したフォトマスクを用いて露光した後、ネガレジストの現像を行った。このネガレジスト基板を鋳型として未硬化のシリコンゴムを流し込んだ後、硬化させることによって電極が配置されている部分に高さ２５μmの凹面を持つシリコンゴムを作製した。
【０１２８】
電極基板とシリコンゴム流路を、電極基板上の電極が配置されている領域にシリコンゴム凹面があうように２液硬化型シリコンゴムで接着し、流路上流部に、溶液注入用のシリンジを差し込み、該電極基板に、電極上を分子が溶解している溶液を送流させる装置を付加した。
【０１２９】
図６」に、作製した流路を有する電極基板の模式図を、また、図７に、そのａ−ａ’断面の模式図を夫々示す。尚、図６に於いて、１は電極を示し、矢印は２種以上の分子が溶解した溶液が移動する方向を示す。
【０１３０】
実施例１ 誘電泳動クロマトグラフィー装置（Field-Flowfracttionation装置）を用いたビオチン分子の検出誘電泳動分離向上物質としてλDNAを用いてビオチン分子をλDNAに結合させたビオチン化λDNAに、フルオレセイン標識した抗ビオチン抗体を混合して抗原抗体反応を行った後、誘電泳動クロマトグラフィー装置を用いてビオチン分子の定量検出を行った。
【０１３１】
（試料）フォトビオチンラベリングキット（ニッポンジーン社）を用い、添付の作製手順にしたがって、λDNAにビオチンを結合させたビオチン化λDNAを作製後、次表１に示すような割合で各種成分を50mM PBS（pH7.5）中で混合し、抗原抗体反応を行なった。また、各種試料の全λDNA濃度は、ビオチン濃度128nMサンプル(試料番号5)のビオチン化λDNA濃度である0.32nMになるように、ビオチン化されていないλDNAを加えることによって調製を行った。
【０１３２】
【表１】
上記抗原抗体反応後、分子量5万の限外ろ過フィルターを用いて媒質を2.5mM炭酸緩衝液（ｐH10）に置換して試料とした。
【０１３３】
（操作）上記反応溶液を、参考例 ２で作製した流路を有する電極基板に、マイクロシリンジポンプ（（株）アイシス製、KSD100）を用いてサンプル導入口から流速800μm／secで送流した。印加する電界は周波数１MHzで、電界強度（＝印加電圧：最小ギャップ7μmで定義）は0.9MV/mを用いた。
【０１３４】
当該電極基板上のサンプル導入口から、上記分子試料を夫々導入し、導入後30秒〜80秒まで所定の電界を印加して流路出口付近での蛍光量を測定した。
【０１３５】
尚、測定は、共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス工業(株)製、LSM-GB200）を用いて流路出口付近での流路部分の蛍光画像を約5秒毎に取り込み、全ピクセルの輝度値の総和により測定した（以下、単に蛍光量と呼ぶ。）。尚、当該測定では、完全な共焦点像を用いると、流路の深さ方向に蛍光強度の分布があった場合、正確な結果が得られないため、レーザー顕微鏡のフォトマル側のオリフィスを全開にし、深さ方向の蛍光も積分して観察できるようにした。
【０１３６】
捕集率は、以下の式１から算出した。
【０１３７】
即ち、当該測定に於いて、蛍光標識された分子試料はシリンジポンプにより電極構造上を移動するので、電界を印加しない場合、電極出口で測定される蛍光量は入口での蛍光量に等しいが、電界を印加し、
分子が誘電泳動力によって電極に引き付けられれば蛍光量は低下する。従って、この蛍光量の低下分を電極に捕集された分子の量とみなし、元の分子の総量を100とした時の電極部分に引き付けられた分子の量を示すものとした。
【０１３８】
【式１】
（結果）図８にその結果を示す。この実験で用いた電界強度0.9MV/mにおけるそれぞれの分子の捕集率はλDNAで約100%、Fluorescein標識抗ビオチン抗体では0%であった。ビオチン濃度0pMの時、Fluorescein標識抗ビオチン抗体が認識するビオチン化λDNA分子がないため、電極に標識抗体がトラップされず捕集率はほぼ０％を示している。ビオチン化λDNAを添加した場合、Fluorescein標識抗ビオチン抗体がビオチンと抗原抗体反応によって結合するため、電極にトラップされたビオチン化λDNAと共に複合体形成した標識抗体も電極上にトラップされることとなる。よって、ここで示される捕集率は試料に含まれる全標識抗ビオチン抗体の内、ビオチン化λDNAに結合した抗体の割合を示しているといえる。ここでビオチン濃度0〜3.2nMにおいてはビオチン濃度の上昇に比例して捕集率が上昇しており、抗原を定量的に検出しているといえる。また、ビオチン濃度を3.2nM以上添加した試料では捕集率の上昇が殆ど見られず約30%程度であった。この理由として、今回用いたFluorescein標識抗ビオチン抗体の抗体価が低く、ビオチンに結合し得る抗体が全抗体の内30%程度しかなかったからではないかと考えている。
【０１３９】
現在まで誘電泳動クロマトグラフィーによるビオチン‐フルオレセイン標識抗ビオチン抗体複合体と未反応のフルオレセイン標識抗ビオチン抗体の分離は、複合体と未反応の抗体との間に誘電泳動分離に十分な大きさの差がない事から不可能であり、ビオチンの複合体を検出することは出来なかった。上記の結果は、分離向上物質を適用することにより、今まで検出出来なかった分子を誘電泳動クロマトグラフィーにより定量検出することを可能にし得ることを示している。
【０１４０】
実施例２ 抗体結合ラテックスビーズを分離向上物質として用いたαフェトプロテイン（AFP）の検出抗α-フェトプロテイン（AFP）抗体A4-4を吸着させたラテックスビーズに、AFPを反応させ、更にA4-4とはエピトープを異にするフルオレセイン標識抗AFP抗体WA1 Ｆａｂ′を反応させた複合体を形成させた後、この複合体と複合体を形成していないフルオレセイン標識抗AFP抗体WA1を電極上にて分離することによってAFPの検出を行った。
【０１４１】
２−１ バッファ中AFPの検出（試薬）
抗AFP抗体結合ラテックスビーズの作製：自製の抗AFP抗体A4-4 1.2mgと直径120nmラテックスビーズ（積水化学工業（株）試薬用ラテックスN-100）10mgをクエン酸（pH3）溶液中で混合した後、遠心分離によってビーズを沈殿として回収した。回収したビーズを2.5％ BSA溶液に懸濁させることによってラテックス表面のブロッキングを行い抗AFP抗体A4-4を吸着させたラテックスビーズの作製を行った。これにより、1mg ラテックスビーズに123μgの抗AFP抗体A4-4の吸着したラテックスビーズを作製した。
【０１４２】
フルオレセイン標識抗AFP抗体WA1Ｆａｂ′の作製：抗AFP抗体WA1 40mgをペプシン消化した後、2-アミノエタンチオール（和光純薬（株）にて還元し、15mgのＦａｂ′を作製した。15mgの抗AFP抗体WA1Ｆａｂ′と150μgのフルオレセインイソチオシアネート（和光純薬工業（株）社）を10mlの炭酸緩衝液（pH9）溶液中で混合した後、NAP-25カラム(アマシャムファルマシアバイオテク社)を用いてフルオレセイン標識抗AFP抗体WA1Fabを作製した。
【０１４３】
反応：次表２に示すように各種成分を50mM PBS（pH7.5）中で混合し、室温2時間放置することによって抗原抗体反応を行なった。
【０１４４】
【表２】
抗原抗体反応後、この溶液を蒸留水で100倍に希釈して誘電泳動分離を行った。
【０１４５】
（操作）上記の溶液20μlを参考例1記載の誘電泳動電極に滴下して22mm角のカバーガラスで覆い、電界印加前と電界印加中の蛍光画像を共焦点レーザー顕微鏡を用いて取りこんだ。印加電界は周波数100ｋHz、電界強度1.4MV/mとした。
【０１４６】
蛍光画像の解析は画像解析ソフトScion Imageを用いて行った。電界印加前及び電界印加中の蛍光画像の色調階調を平均化した後、電界印加中の画像から電界印加前の画像の色調を引く事によって、電界印加によって蛍光が増加した部分のみを表示した。蛍光増加した部分のデンシトグラムを取ることによって蛍光増加量を画像出力濃度値としてあらわした。
【０１４７】
（結果）電極上での誘電泳動の結果ビーズは負の誘電泳動力を受けるため電界強度の低い領域に移動し、未反応のフルオレセイン標識抗AFP抗体WA1 Fab'を含む他の生体分子は正の誘電泳動を受けて電界強度の高い領域に移動することによって、抗AFP抗体結合ラテックスビーズ‐AFP‐フルオレセイン標識抗AFP抗体WA1 Fab'複合体と未反応のフルオレセイン標識抗AFP抗体WA1 Fab'を電極上で分離することができた。
【０１４８】
図９はAFP0.35μM添加時の電極上での電界印加前と電界印加中のレーザー顕微鏡から取りこんだ蛍光画像である。AFPが存在するサンプルでは電界印加時に負の誘電泳動力によってアルミ電極上に蛍光が集まっているが、AFP無添加サンプルでは電界印社製)にストレプトアビジンを固定化した。プローブDNAとしては、5'ビオチン標識した5'-CTATGACTGTACGCCACTGTCC-3'プライマー及び、5'-CAATCACCAACCCAGAAAACAATG-3'プライマーを用いてλDNAのほぼ中間の2kbの配列をPCRによって増幅したものを用い、これをストレプトアビジン固定化ビーズと反応させることによって、2kb DNA結合ラテックスビーズを作製した。
加前と電界印加中の画像に変化は見られない。この画像をScion Imageを用いて処理し、蛍光増加したバンド部分のデンシトグラムを取り、蛍光増加量を画像出力濃度値としてあらわした。図１０はAFP濃度と蛍光増加量の関系を示したものである。
【０１４９】
図１０の結果から、AFP添加濃度と画像出力濃度値に良好なDose responseが見られ、AFPの定量検出が可能となることが分った。
【０１５０】
２−２ 血清中のAFPの検出（試薬）2‐1と同じ試薬を用いた。
【０１５１】
反応：前記表２に示すように各種成分をAFPの存在しない正常血清を用いて調製した後、室温2時間放置することによって抗原抗体反応を行なった。
【０１５２】
抗原抗体反応後、この溶液を蒸留水で100倍希釈して誘電泳動分離を行った。
【０１５３】
（操作）2‐1と同様の操作を行った。
【０１５４】
（結果）図１１にその結果を示す。図１１から、AFP存在範囲内で良好な定量性が得られているといえる。このことから、サンプルを血清にしても誘電泳動に大きな影響を与えず血清中の目的タンパクの検出が行えることが分った。
【０１５５】
以上の結果から、ラテックスビーズのように負の誘電泳動を示す物質を分離向上物質として用いることによって、正の誘電泳動を示す生体成分を誘電泳動電極上で分離することができ、現在まで誘電泳動では不可能であったタンパク分子レベルの定量的な分離検出が可能となった。
【０１５６】
実施例３ プローブDNA結合ラテックスビーズを分離向上物質として用いたλDNAの検出（試料）
2kbDNAプローブ結合ラテックスビーズの作製：プローブDNAを固定化するストレプトアビジンビーズを作製するためにCarbodiimideKit for Carboxylated Microparticles(Polysciences社製)を用いて直径2μmのカルボキシレートラテックスビーズ(PolySciences社製)を用いて直径2μmのカルボキシレートラテックスビーズ(PolyScience社製)にストレプトアビジンを固定化した。プローブDNAとしては、5'ビオチン標識した5'-CTATGACTGTACGCCACTGTCC-3'プライマー及び、5'-CAATCACCAACCCAGAAAACAATG-3'プライマーを用いてλDNAのほぼ中間の2kbの配列をPCRによって増幅したものを用い、これをストレプトアビジン固定化ビーズと反応させることによって、2kb DNA結合ラテックスビーズを作製した。
【０１５７】
作製した2kb DNA結合ラテックスビーズを0.3N ＮａＯＨで室温5分静置して2kbDNAを変性1本鎖化し、遠心分離によってビーズを沈殿させた後、再度ビーズを0.3NＮａＯＨ溶液に懸濁させた。最終濃度0.3NになるようにＨＣｌ溶液を添加することによって中和を行い2kb DNAプローブ結合ラテックスビーズとした。
【０１５８】
λDNA及びT7DNAの標識と変性1本鎖化：λDNA及びλDNAと異なる配列を有するT7DNAをLabel IT Nucleic Acid Labeling Kitを用いて夫々フルオレセイン(緑色蛍光)およびCy3（モレキュラープローブ社製：赤色蛍光)標識した。標識されたDNAは0.3NNaOHで室温5分静置することによって変性1本鎖化した後、最終濃度0.3NになるようにHCl溶液を添加することによって中和を行った。
【０１５９】
ハイブリダイゼーション反応：SSCバッファー中にて0.05％(ｗ/v)の2kb DNAプローブ結合ラテックスビーズに最終濃度20μg/ml濃度になるように標識1本鎖化λDNA及びT7DNAを添加し、68℃18時間ハイブリダイゼーション反応を行なった。ハイブリダイゼーション反応後のサンプル溶液は蒸留水にて100倍希釈後、誘電泳動分離を行った。
（操作）実施例２の2-1と同様の操作を行った。但し、この時の電界は周波数3MHz、電界強度0.9MV/mとした。
（結果）図１２にその結果を示す。
【０１６０】
ハイブリダイゼーション後の溶液を蛍光顕微鏡観察したところλDNA標識を行ったCy3の蛍光のみがビーズ上に観察された。この溶液を誘電泳動電極上に滴下した後電界印加したところ、ラテックスビーズが負の誘電泳動力を受けて電界強度の低い領域に移動するため、2kb DNAプローブ結合ビーズに結合したCy3標識λDNAの蛍光が電界強度の低い領域に観察され、2kb DNAプローブ結合ビーズに結合していないフルオレセイン標識T7 DNAの蛍光は正の誘電泳動によって電界強度の高い領域に移動するため、電極エッジ部分に観察された。即ち、ラテックスビーズを誘電泳動分離向上物質として用いることによって、多数の分子種の中から特定のDNA分子を分離検出出来ることが証明された。
【０１６１】
以上の結果より誘電泳動分離向上物質が物質検出のための誘電泳動分離に有用である事がわかる。
【０１６２】
実験例 １ 電極上に於ける分子の観察（１）DNA分子の観察ハンドブック・オブ・フルオレッセント・プローブス・アンド・リサーチ・ケミカルズ、リチャードＰ．ホーグランド、シックス・エディション、モレキュラー・プローブ社、（1996）に記載の方法に準じて、蛍光試薬YO-PRO-1（モレキュラー・プローブ社製商品名）で標識したλDNA（48.5kb、2本鎖DNA）0.001mgを含有する超純水溶液１ml、及び常法により短鎖DNAとして合成時に末端を蛍光色素フルオロセインにより標識したオリゴヌクレオチド（22base、1本鎖DNA：自製品）0.002mgを含有する超純水溶液１mlを、夫々DNA試料として用いた。
【０１６３】
参考例 １で作製した電極基板上で、DNA分子が誘電泳動されるか否かを調べるため、上記DNA試料（標識λDNA又は標識オリゴヌクレオチド）を夫々当該電極基板上に10μl滴下し、電極に周波数１MHzの交流電圧を徐々に印加し、蛍光顕微鏡下でDNA試料の蛍光を観察した。
【０１６４】
その結果、電極と電極の最小ギャップ間の電界強度が500KV/m付近からλDNAが誘電泳動によって強電界部分に集まり始めるのが観察されたが、この電界強度では、オリゴヌクレオチドが誘電泳動によって強電界部分に集合する様子は観察されなかった。
【０１６５】
（２）タンパク分子の観察ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、H．マエダ、65、777、（1969）に記載の方法に準じて、蛍光試薬FITC（フルオレセインイソチオシアネート、和光純薬工業（株）製）で標識したIgM（分子量約900kDa）0.1mg含有する超純水溶液、及びジャーナル・オブ・バイオケミストリー、H．マエダ、65、777、（1969）に記載の方法に準じて、蛍光試薬TRITC（テトラメチルローダミンイソチオシアネート、和光純薬工業（株）製）で標識したBSA（分子量約65kDa）0.1mgを含有する超純水溶液を、夫々タンパク試料として用いた。
【０１６６】
当該電極上で、タンパク分子が誘電泳動されるか否かを調べるため、上記タンパク試料（標識IgM又は標識BSA）を夫々電極基板上に10μl滴下し、電極に周波数１MHzの交流電圧を徐々に印加し、蛍光顕微鏡下でタンパク試料の蛍光を観察した。
【０１６７】
その結果、電極と電極の最小ギャップ間の電界強度が1.0MV/m付近からFITC標識IgMが電界の強い部分に集まり始めるのが観察されたが、この電界強度では、TRITC標識したBSAは誘電泳動によって強電界部分に集合する様子は殆ど観察されなかった。
【０１６８】
実験例 ２ 流路を有する電極基板を用いた分子の分析（試料）実験例 １で用いた標識λDNA溶液及び標識オリゴヌクレオチド溶液を分子試料とした。
【０１６９】
（操作）上記分子溶液を、参考例 ２で作製した流路を有する電極基板に、マイクロシリンジポンプ（（株）アイシス製、KSD100）を用いてサンプル導入口から流速800μm／secで送流した。印加する電界は周波数１MHzで、電界強度（＝印加電圧：最小ギャップ7μmで定義）は数百k〜数MV/m を用いた。
【０１７０】
当該電極基板上のサンプル導入口から、上記分子試料（標識λDNA 10μg／ml又は標識オリゴヌクレオチド 0.56pg／ml）を夫々導入し、導入後30秒〜80秒まで所定の電界を印加して流路出口付近での蛍光量を測定した。
【０１７１】
尚、測定は、共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス工業(株)製、LSM-GB200）を用いて流路出口付近での流路部分の蛍光画像を約5秒毎に取り込み、全ピクセルの輝度値の総和により測定した（以下、単に蛍光量と呼ぶ。）。尚、当該測定では、完全な共焦点像を用いると、流路の深さ方向に蛍光強度の分布があった場合、正確な結果が得られないため、レーザー顕微鏡のフォトマル側のオリフィスを全開にし、深さ方向の蛍光も積分して観察できるようにした。
【０１７２】
捕集率は、前記式１から算出した。
【０１７３】
即ち、当該測定に於いて、蛍光標識された分子試料はシリンジポンプにより電極構造上を移動するので、電界を印加しない場合、電極出口で測定される蛍光量は入口での蛍光量に等しいが、電界を印加し、
分子が誘電泳動力によって電極に引き付けられれば蛍光量は低下する。従って、この蛍光量の低下分を電極に捕集された分子の量とみなし、元の分子の総量を100とした時の電極部分に引き付けられた分子の量を示すものとした。
【０１７４】
（結果）標識?DNA溶液を用いて、電界強度0.60MV／m又は1.04MV／mを印加した場合の流路出口での蛍光量の時間変化を図１３に、また、標識オリゴヌクレオチド溶液を用いて、電界強度1.4MV／mを印加した場合の流路出口での蛍光量の時間変化を図１４に夫々示す。尚、図１３に於いて、−○−は、電界強度0.60MV／mを印加した場合の結果を、また、−●−は、電界強度1.04MV／mを印加した場合の結果を夫々示す。
【０１７５】
図１３から明らかなように、標識?DNA溶液を用いて、電界強度1.04MV/m を印加した場合には、電界が十分に強く、全ての?DNAが電極に捕集されるため、流路出口での蛍光量は、ほぼ0にまで低下することが判る。尚、80秒後に一時的に蛍光量が増加するのは、電界を切ったために、それまで電極部分に蓄積されていたDNA分子が放出されるため、一時的に初期状態よりも大きな蛍光量を示すようになるからであり、捕集されていたDNAが流出し終わるともとの蛍光量に戻っている。また、標識?DNA溶液を用いて、電界強度0.60MV／mを印加した場合も、同様の傾向がみられるが、電界印加時（30秒〜80秒の間）で蛍光量が0にはならないこと、換言すれば、電界強度が十分でないため、完全にDNAが捕集されていないことが判る。尚、実験例 １では、電界強度0.5MV/mでλDNAは強電界領域に強く捕集されていたが、本実験では流路内の流れによる抗力が加わるため電極上で同様の分子の捕集能を得ようとした場合、流れのないときよりもより強い電界強度が必要となることが判る。
【０１７６】
また、図１４から明らかなように、標識オリゴヌクレオチド溶液を用いて、電界強度1.4MV/mを印加した場合には、蛍光量の低下が全く見られないこと、即ち、当該電界強度では、当該オリゴヌクレオチドが全く捕集されないことが判る。
【０１７７】
以上の結果から、λDNAとオリゴヌクレオチドとを分離できることが示唆された。
【０１７８】
実施例 ４ 溶液中のDNA分子の分離λDNA（48.5kb、2本鎖DNA）及びオリゴヌクレオチド（22 base、1本鎖DNA）が溶解した溶液から、夫々の成分の分離を行った。
【０１７９】
（試料）蛍光試薬YO-PRO-1で標識したλDNA（48.5kb、2本鎖DNA）５μg／mlと、短鎖DNAとして合成時に末端を蛍光色素フルオロセインにより標識したオリゴヌクレオチド（22base、1本鎖DNA）2.3pg／mlとが、互いに等しい蛍光量を発することを、予め蛍光強度測定により確認した。この結果に基づいて、次表３に示すように、標識オリゴヌクレオチド及び標識λDNAを所定濃度含有する超純水溶液を夫々試料とした。
【０１８０】
【表３】
【０１８１】
（操作）試料を、参考例 ２で作製した流路を有する電極基板に、マイクロシリンジポンプ（（株）アイシス製、KSD100）を用いてサンプル導入口から流速800μm／secで送流した。印加する電界は周波数１MHzで、電界強度0.86MV/m又は1.02MV/mを用い、試料導入後30秒〜80秒まで所定の電界を印加して流路出口付近での標識λDNAの蛍光量を測定した。尚、測定及び捕集率は、実験例 ２と同様に求めた。
【０１８２】
（結果）結果を図１５に示す。尚、図１５に於いて、−○−は、標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が０：１の試料を用いた結果を、−□−は標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が１：１の試料を用いた結果を、−＋−は、標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が５：１の試料を用いた結果を、また、−×−は、標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が１：０の試料を用いた結果を夫々示す。
【０１８３】
本実施例に於いて、全ての?-DNAが捕集され、オリゴヌクレオチドが全く捕集されない場合を考えると、捕集率は、試料全体の蛍光量に占める?DNAに由来する蛍光量の割合に等しくなる。即ち、試料1（標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が０：１の試料）では捕集率が100%、試料2（標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が１：１の試料）では1/(1+1)=50%、試料3（標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が５：１の試料）では1/(1+5)=16.7%、試料4（標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が１：０の試料）では0となるはずである。
【０１８４】
図１５の結果から、電界強度 0.86MV/mを印加した場合、?DNAの捕集率（試料１）は53%であり、オリゴヌクレオチド（試料４）は全く捕集されないことが判る。また、試料２（?DNA：オリゴヌクレオチド＝１：１のサンプル）で約半分の20％強、試料３（?DNA：オリゴヌクレオチド＝１：５のサンプル）で10％弱の捕集率が得られており、試料１の捕集率53％から計算される理論値（試料２：53％÷1／(1+1)＝26.5％、試料３：53％÷1／(1+5)＝8.8％）とほぼ一致していることが判る。
【０１８５】
また、電界強度1.02MV/mを印加した場合、?DNAのみ（試料１）では100%の捕集率、オリゴヌクレオチドのみ（試料４）ではほとんど捕集されないことが判る。また、試料２では捕集率が60%、試料３では約20%となり、上記の理論値50%、16.7%とほぼ一致していることが判る。このことから、本発明の方法により、?DNAとオリゴヌクレオチドとを、数十秒という短時間で分離し得ることが判る。
【０１８６】
以上の結果から、分離したい分子と、共存する分子との組み合わせにより、適切な電界強度を選択することによって、２種以上の分子を分離することができるようになることが判る。
【０１８７】
実施例 ５ 溶液中のタンパク分子の分離IgM（分子量約900kDa）及びBSA（分子量約65kDa）が溶解した溶液から、夫々の成分の分離を行った。
【０１８８】
（試料）蛍光試薬FITCで標識したＩｇＭ（分子量約900kDa）0.1mg／ml及び、蛍光試薬TRITCで標識したBSA（分子量約65kDa）0.1mg／mlを含有する超純水溶液を試料とした。
【０１８９】
（操作）流速を400μm/sec、印加する電界強度を1.42MV／m、1.78MV／m又は2.14MV／mとした以外は、実施例
１と同様にして、標識ＩｇＭ及び標識BSAの蛍光量を同時に測定し夫々の捕集率を求めた。
【０１９０】
（結果）結果を図１６に示す。尚、図１６に於いて、−○−は、標識IgMの捕集率を、また、−●−は、標識BSAの捕集率を夫々示す。
【０１９１】
図１６の結果から明らかなように、ＩｇＭ、BSAともに電界強度を上昇させるにしたがって捕集率が上昇し、2.14MV/mの電界強度でＩｇＭでは捕集率約68.5％、BSAでは捕集率38％となり、明らかにその分子量の違いによって捕集率に違いが見られることが判る。
【０１９２】
尚、今回用いた電界強度では完全にタンパク分子を捕集することはできなかったが、タンパク分子の違いにより捕集率に有意差が見られたことから、分離電極部分をさらに延長することによって、ＩｇＭとBSAとの分離が可能になることが容易に予測できる。これによりタンパク分子レベルの大きさの違いによっても本発明の方法により分離が可能であることが示唆される。
【０１９３】
実施例 ６ 抗原抗体反応後のB/F分離ビオチン標識したλDNAとフルオレセイン標識した抗ビオチン抗体を混合して抗原抗体反応を行った溶液から、ビオチン標識λDNA−フルオレセイン標識抗ビオチン抗体複合体分子とビオチン標識λDNAに結合していない遊離のフルオレセイン標識抗ビオチン抗体の分離を行った。
【０１９４】
（試料）フォトビオチンラベリングキット（ニッポンジーン社製）を用い、添付の作製手順にしたがってビオチン標識λDNAを作製後、次表４に示すような比率で各種成分を50mM PBS（pH7.5）中で混合し、抗原抗体反応を行わせた。抗原抗体反応後、分子量5万の限外ろ過フィルターを用いて媒質を2.5mM 炭酸緩衝液（ｐH10）に置換し、これを試料とした。
【０１９５】
尚、21μg/mlのフルオレセイン標識抗ビオチン抗体（コスモバイオ（株））濃度は10μg/mlビオチン標識λDNA中のビオチンモル数と等しい量である。
【０１９６】
【表４】
【０１９７】
（操作）電界強度を1.07MV/mとして実施例2と同様の操作を行い、複合体分子中のフルオレセイン標識抗ビオチン抗体及び遊離のフルオレセイン標識抗ビオチン抗体の蛍光量を測定し、複合体分子の捕集率を求めた。
【０１９８】
（結果）結果を図１７に示す。図１７の結果から明らかなように、複合体分子の捕集率が、ビオチンλDNA濃度10μg/mlでは捕集率36％、5μg/mlでは捕集率25％、2.5μg/mlでは捕集率8.9％、0μg/mlでは捕集率６％となり、ビオチン標識λDNAの濃度低下とともにその捕集率も低下することが判る。また、λDNAを100％捕集するのに十分な誘電泳動条件において、試料１のビオチン標識されていないλDNAを添加した場合の捕集率が6％であるのに対し、試料2、3、4のビオチン標識λDNAを添加したものでは有意にそれよりも高い捕集率を示したことから、フルオロセイン標識抗ビオチン抗体とビオチン標識λDNAの抗原抗体反応による複合体分子と、ビオチン標識λDNAに結合していない遊離のフルオレセイン標識抗ビオチン抗体の分離が、ある程度の濃度依存性を持って行えることが判る。
【０１９９】
【発明の効果】
以上述べた如く、本発明の第一の方法によれば、分離向上物質を含む複合体物質を形成させるという従来行われていなかった方法によって、従来分離し得なかった溶液中に溶解する２種以上の分子を誘電泳動力によって分離することに初めて成功したものであり、それ故極めて画期的な発明である。
【０２００】
また本発明の第二の方法は、従来行われていなかった強電界強度の誘電泳動力を利用して、従来分離し得なかった溶液中に溶解する２種以上の分子を、相互に分離することに初めて成功したものである。
【０２０１】
上記本発明によれば、従来誘電泳動力によって分離し得なかった２種以上の分子、例えばDNAやタンパク等の生体成分分子が溶解している溶液から、夫々の分子を迅速且つ容易に分離し得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】誘電泳動の原理を示す図である。
【図２】本発明に使用する電極の具体例を示す図である。
【図３】本発明に使用する流路を有する電極基板の一例を示す図である。
【図４】参考例 １で作製した誘電泳動電極基板の模式図である。
【図５】参考例 １で作製した電極の模式図である。
【図６】図６は、参考例
２で作製した流路を有する電極基板の模式図である。
【図７】図６のａ−ａ’断面の模式図である。
【図８】図８は、実施例１で得た、ビオチン濃度と捕集率との関係を示すグラフである。
【図９】実施例２で得た、電極上での電界印加前と電界印加中のレーザー顕微鏡から取り込んだ蛍光画像を示すものである。
【図１０】実施例２で得た、ＡＦＰ濃度と画像出力濃度との関係を示すグラフである。
【図１１】実施例２で得た、血清中のＡＦＰ濃度と画像解析濃度との関係を示すグラフである。
【図１２】実施例 ３で得た、電界印加前と電界印加中の電極基板の模式図及び電界印加中の蛍光顕微鏡写真を示すものである。
【図１３】実験例 ２で得た、標識?DNA溶液を用いて実施した流路出口での蛍光量の時間変化を示すグラフである。
【図１４】実験例 ２で得た、標識オリゴヌクレオチド溶液を用いて実施した流路出口での蛍光量の時間変化を示すグラフである。
【図１５】実施例 ４で得た、電界強度と標識λDNAの捕集率との関係を示すグラフである。
【図１６】実施例 ５で得た、電界強度と標識ＩｇＭ又は標識BSAの捕集率との関係を示すグラフである。
【図１７】実施例 ６で得た、ビオチン標識λDNA濃度と捕集率との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
図３に於いて、矢印は２種以上の分子が溶解した溶液が移動する方向を示す。図４に於いて、１は電極を示す。図６に於いて、１は電極を示し、矢印は２種以上の分子が溶解した溶液が移動する方向を示す。図７に於いて、各数字は夫々以下のものを示す。
１：流路
２：ガラス板
３：電極図１３に於いて、−○−は、電界強度0.60MV／mを印加した場合の結果を、また、−●−は、電界強度1.04MV／mを印加した場合の結果を夫々示す。図１５に於いて、−○−は、標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が０：１の試料を用いた結果を、−□−は標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が１：１の試料を用いた結果を、−＋−は、標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が５：１の試料を用いた結果を、また、−×−は、標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が１：０の試料を用いた結果を夫々示す。図１６に於いて、−○−は、標識ＩｇＭの捕集率を、また、−●−は、標識BSAの捕集率を夫々示す。
【発明の利用分野】
本発明は、誘電泳動力を利用した２種以上の分子の分離方法に関するものである。
【０００２】
【発明の背景】
近年、半導体技術の進歩によりフォトリソグラフィー等の微細加工技術によってｎｍからμm単位での物質加工技術が確立され、現在もその微細加工技術は進歩しつづけている。
【０００３】
化学・生化学分野に於いては、この微細加工技術を利用して、生体試料からの分析対象成分の抽出（抽出工程），化学・生化学反応を用いる当該成分の分析（分析工程），並びにそれに続く分離処理（分離工程）及び検出（検出工程）といった一連の化学的・生化学的分析工程の全てを一辺数cm〜数十cmのチップ上に集積化等した極小の分析装置をもちいて行う、微細総分析システム〔Micro TotalAnalysis System（μ-TAS）、Laboratory on a chip〕と呼ばれる新技術が発展しつつある。
【０００４】
このμ-TASの手法は、化学的・生化学的分析工程全てを通じて、分析時間の短縮化、使用するサンプル量や化学・生化学反応に必要な試薬量の低減化、分析機器や分析スペースの縮小化に大きく貢献するものと期待されている。
【０００５】
特に、μ-TASに於ける分離工程については、テフロン（登録商標）やシリカ等を材料として作製された内径１mm以下のキャピラリー（細管）を分離カラムとして使用して高電界中で物質の持つ電荷の差を利用して分離を行うキャピラリー電気泳動法や、同様のキャピラリーを用いてカラム担体と物質との相互作用の差を利用して分離を行うキャピラリーカラムクロマトグラフィー法が開発されている。
【０００６】
しかしながら、キャピラリー電気泳動法は、分離に高電圧が必要であることや、検出領域でのキャピラリ容量が制約されるため検出感度が低いという問題、更には、チップ上のキャピラリチップでは、分離のためのキャピラリ長に制約があり、高分子の分離に充分なキャピラリ長が得られないため、低分子の物質の分離には適しているが高分子の物質の分離には適さないという問題を有している。また、キャピラリーカラムクロマトグラフィー法は、分離処理の高速化に限界があり、処理時間の短縮化が困難であるという問題を有している。
【０００７】
そこで、近年、上記した如き問題を解決する手段の一つとして、物質を不均一な電界内に置くと、物質内に正と負の分極が起こり、物質が移動する力が働く現象、いわゆる誘電泳動力〔H.A.Pohl: ”Dielectrophoresis”, Cambridge Univ.Press (1978)、T.B.Jones: ”Electromechanics of Particles”, Cambridge Univ. Press(1995)等〕を利用した分離方法が、注目されている。
【０００８】
この分離方法は、（１）誘電泳動力の大きさは、物質（粒子）の大きさ・誘電的性質に依存し、電界傾度に比例するため、微細加工電極を用いれば、電界および電界傾度をきわめて大きくとることができるので、キャピラリー電気泳動のように高電圧を必要とせず、低い印加電圧で高速な分離が期待できる、（２）電界の強い場所が微小領域に極限されるため、電界印加による温度上昇も最小限にとどめることができ、また、高電界場の形成が可能となる、（３）誘電泳動は、電界傾度に比例する力であることからわかるように、印加電圧の極性に依存しないので、交流電界下でも直流同様に力が働く。従って、高周波交流を用いれば水溶液での電極反応（電気分解反応）は抑えられるので、電極自体をチャネル（サンプル流路）中に集積化することが可能となる、（４）キャピラリー電気泳動のように検出部分のチャンバ容量に制約がないことから検出感度の向上も望める、等の点から、現在ではμ-TASに於ける最も適した分離方法と考えられている。
【０００９】
一方、上記した如き誘電泳動力を利用した分離方法として、現在までに種々の方法が報告されている〔M. Washizu, et al., IEEE Transaction IA, Vol.30, No.4 p.835-843(1994) 、M. Washizu, et al., Conf. Rec. The Institute ofElectrostatics Japan, ’93 Ａnn. Meet. (Int’l Session),p27-32 (1993)、Y. Huang, et al., Biophys. J., Vol.73,p.1118-1129 (1997)及びN.G. Green et al., J. Phys. D.:Appl. Phys., Vol31, 25-30 (1998)等〕。
【００１０】
例えば、ジャーナル オブ フィジックス Ｄ，ブリティッシュ ジャーナルオブ アプライド フィジックス（J. Phys. D: Appl. Phys.） 27, 2659-2662(1994)には、HL-６０細胞と、正常の血液細胞とを含有する懸濁液から、夫々の細胞を分離し得ることが、マイクロバイオロジー, 140, 585-591(1994)には、各種微生物を含有する懸濁液から、酵母や細菌種の違いにより微生物を分離し得ることが、ジャーナルオブバイオテクノロジー, 32, 29-37(1994)には、酵母の生菌と死菌とを含有する懸濁液から、両者を分離し得ることが、また、J. Phys. D: Appl. Phys., 31, 25-30(1998)には、直径93nmのラテックス粒子と216nmのラテックス粒子とを含有する懸濁液から、両者を誘電泳動力及び電気流体力により分離し得ることが夫々報告されている。
【００１１】
また、M. Washizu, et al., IEEE TransactionIA, Vol.30, No.4 p.835-843(1994)には、単一の生体成分を含む溶液を試料として用い、当該成分が誘電泳動力により電極に捕集されること〔例えばアビジン（68kDa），コンカナバリンＡ（52kDa），キモトリプシノーゲンＡ（25kDa）又はリボヌクレアーゼＡ（13.7kDa）〕、並びに単一の生体成分を含む溶液を試料として用い、当該成分を誘電泳動力により捕集し得ること〔48.5kbDNA単独試料を用いた場合の捕集率100％、15kbDNA単独試料を用いた場合の捕集率約60％、９kb環状DNA単独試料を用いた場合の捕集率約50％、アビジン（68KＤa）単独試料を用いた場合の捕集率数％〕が報告されている。
【００１２】
しかしながら、上記した如き従来の誘電泳動力を利用した分離方法についての報告は、各種細胞やラテックス粒子といった、DNAやタンパク等に比べて溶液への溶解性が極めて低い粒子の分離、或いは単一（１種類）のDNAやタンパクの単なる捕集に限られており、２種以上の分子、特に、例えばDNAやタンパク等の生体成分分子が溶解している溶液からの、夫々の分子の分離を行うことの報告は未だなされていない。
【００１３】
これは、誘電泳動力の強さは、物質の持つ物理的な大きさに依存し、大きな体積を持つ物質ほど大きな誘電泳動力を受けるため、細胞やラテックス粒子に比べてその物理的大きさが非常に小さいタンパクやDNA等の、２種以上の分子が溶解している溶液から、誘電泳動力を利用して夫々の分子の大きさの違いに基づいて、これらを相互に分離することは困難であると考えられていたためであることと、従来は、電界強度500KV／mよりも弱い電界強度で分離していたので、分離できなかったからである。
【００１４】
【発明が解決すべき課題】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、２種以上の分子を、誘電泳動力を利用して相互に分離することができる方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決する目的でなされたものであり、下記二種類の方法によって、従来できなかった２種以上の分子を、誘電泳動力を利用して相互に分離することに初めて成功したものである。
【００１６】
その方法は、「特定分子」を含有する試料と『そこに含まれる「特定分子」と結合する「特定分子」の誘電泳動特性を変化させ得る物質』とを接触させて、これらの複合体物質を形成させ、次いで該複合体物質を含む反応物を誘電泳動に付し、不均一電界により生ずる誘電泳動力を利用して、前記複合体物質を移動させ、該複合体物質と前記試料中に含まれる「特定分子」以外の分子とを異なる移動速度とするか、または該複合体物質と分離すべき分子とを異なる電解領域に夫々移動させることによって、該特定分子と特定分子以外の分子とを分離することからなるものであり、従来、誘電泳動力による分離方法において、このような複合体物質を形成させることによって、分離を促進させることは全く行われていないし、このような発想も全く知られていない。
【００１７】
即ち、本発明は、（１）(a)試料中の「特定分子」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質を含む反応物を誘電泳動に付し、不均一電界により生ずる誘電泳動力を利用して、前記複合体物質を移動させ、該複合体物質と前記試料中に含まれる「特定分子」以外の分子とを異なる移動速度とするか、または該複合体物質と「特定分子」以外の分子とを異なる電解領域に夫々移動させることによって、該複合体物質と前記試料中に含まれる「特定分子」以外の分子とを分離する方法、及び、
【００１８】
前記複合体物質中の「特定分子」若しくは複合体形成に関与しない「特定分子」以外の分子を測定する方法、
【００１９】
(b)試料中の「特定分子」と、「特定分子と結合する物質」と、「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質を含む反応物を誘電泳動に付し、不均一電界により生ずる誘電泳動力を利用して、前記複合体物質を移動させ、該複合体物質と前記試料中に含まれる「特定分子と結合する物質」とを異なる移動速度とするか、または該複合体物質と「特定分子と結合する物質」とを異なる電解領域に夫々移動させることによって、該複合体物質と前記複合体物質形成に関与しなかった「特定分子と結合する物質」とを分離する方法、
【００２０】
(C)かくして分離された前記複合体物質中の「特定分子と結合する物質」を測定し、その結果に基づいて試料中の特定分子の存在の有無を検出することを特徴とする試料中の特定分子の検出方法、及び前記分離された前記複合体物質中の「特定分子」若しくは「特定分子と結合する物質」、或いは前記複合体物質形成に関与しなかった「特定分子と結合する物質」を測定することを特徴とする試料中の成分含有量測定方法、
【００２１】
(d)「特定分子」を含有する試料と、「標識物質により標識された特定分子」と、「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とを接触させて、これら「標識された特定分子」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との標識複合体物質を形成させ、次いで誘電泳動に付し、不均一電界により生ずる誘電泳動力を利用して、前記複合体物質を移動させ、該複合体物質と前記試料中に含まれる「特定分子と結合する物質」とを異なる移動速度とするか、または該複合体物質と「特定分子と結合する物質」とを異なる電解領域に夫々移動させることによって、該標識された「特定分子」を含む標識複合体物質と遊離の標識された「特定分子」とを分離し、分離した前記標識複合体物質中の標識された「特定分子」若しくは遊離の標識された「特定分子」を測定し、その結果に基づいて試料中の成分の量を求める試料中の成分含有量測定方法に関する。
尚、「異なる電解領域に夫々移動させる」ことには、一方のみが誘電泳動電極に捕捉され、他方が捕捉されないようにすることも含まれる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施の形態を説明する。
【００２３】
誘電泳動力とは、以下に示す如き現象により生じる力である。
【００２４】
即ち、電界内に置かれた中性分子には、図１に示すように電界の下流側に正極性の分極電荷＋ｑが、上流側には負極性の分極電荷−ｑが夫々誘導され、＋ｑには電界Ｅにより大きさ＋ｑＥの力が働き、この部分を電界の下流側へと引くのに対し、−ｑには電界Ｅにより大きさ−ｑＥの力が働き、この部分を電界の上流へと引く。分子が中性ならば、＋ｑと−ｑの絶対値は等しく、もし電界が場所によらず一定であるならば、両者に働く力は釣り合って分子は動かない。しかし、電界が一様でない場合を図１に示すが、この場合には、強い電界側へ引く力の方が大きくなり、分子は電界の強い側へと駆動されることとなる。このように不均一な電界内で中性粒子が移動する現象を誘電泳動（Dielectrophoresis,DEP）と呼び、この際に分子に働く力を誘電泳動力と呼ぶ。尚、分子が荷電分子である場合は、該誘電泳動力に加えて、電気泳動力を併せた移動様式となる。
【００２５】
本発明が適用される試料としては、例えば血清、血漿、髄液、滑液、リンパ液等の体液、又は尿、糞便のような排泄物等の生体由来試料及びその処理物等が挙げられる。また、処理物としては、例えばこれら生体由来試料を水や緩衝液等で適宜希釈等したもの、或いはこれら生体由来試料に由来する後述する如き分子を水や緩衝液等に適宜溶解又は懸濁させ、再構成して得られたもの等が挙げられる。尚、本発明に係る試料には、化学的に合成された上記した如き分子を含有するものも包含される。
【００２６】
本発明第一の方法（態様１）は、これら試料中の特定の分子を共存するその他の分子と分離し、更にはその分離された分子を測定する方法に関するものである。
【００２７】
かかる本発明の態様としては、(a)「試料中の特定分子」と「特定分子」と結合する「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体を形成させることを特徴とするもの、(b)「試料中の特定分子」と「特定分子と結合する物質」と、該「特定分子」と結合する「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体を形成させることを特徴とするもの、及び(c)試料中の「特定分子」と「標識された特定分子」の何れかと、「特定分子」と結合する「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体を形成させることを特徴とするもの等が含まれる。
【００２８】
これらの各態様において、「特定分子」としては試料中の分子の中の測定したい分子（測定対象分子と略称することがある）と測定したい分子以外の分子（測定対象外分子と略称することがある）が含まれる。
【００２９】
特定分子（測定対象分子）としては、例えばヌクレオチド鎖（オリゴヌクレオチド鎖、ポリヌクレオチド鎖）、染色体、ペプチド鎖（例えばＣ−ペプチド、アンジオテンシンＩ等）、蛋白質（例えば免疫グロブリンＡ（IgA）、免疫グロブリンＥ（IgE）、免疫グロブリンＧ（IgG）、β2−ミクログロブリン、アルブミン、フェリチン等の血清蛋白質、例えばアミラーゼ、アルカリホスファターゼ、γ−グルタミルトランスファラーゼ等の酵素蛋白、例えばルベラウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、ＡＴＬウイルス、ＡＩＤＳウイルス等のウイルスに対する抗ウイルス抗体やこれらウイルスに由来する抗原性物質、例えば各種アレルゲンに対する抗体、例えばリポ蛋白質等の脂質、例えばトリプシン、プラスミン、セリンプロテアーゼ等のプロテアーゼ等）、糖鎖（例えばα−フェトプロテイン、ＣＡ１９−９、前立腺特異抗原、癌胎児性抗原、癌細胞の産生する特殊な糖鎖を有する物質等が有する糖鎖）、レクチン（例えばコンカナバリンＡ、レンズマメレクチン、インゲンマメレクチン、ダツラレクチン、小麦胚芽レクチン等）等が挙げられる。
【００３０】
また、いわゆるアイソザイムやホルモン等の同一の作用を有する２種以上の物質が存在する分子又は類似した構造を有するが異なる作用を有する２種以上の物質が存在する分子、例えばアミラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ-GTP）、リパーゼ、クレアチンキナーゼ（CK）、乳酸脱水素酵素（LDH）、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）、レニン、プロテインキナーゼ、チロシンキナーゼ等の酵素類、例えばステロイドホルモン、ヒト繊毛性ゴナドトロピン（hCG）、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、黄体形成ホルモン（LH）等の生理活性物質、例えば前立腺特異抗原（PSA）、α２-マクログロブリン、癌胎児性抗原（CEA）、α-フェトプロテイン等の癌関連抗原等も特定分子（測定対象分子）に包含される。
【００３１】
本発明に於ける「誘電泳動特性を変化させ得る物質」（分離向上物質と略称することがある。）としては、特定分子（測定対象分子）と結合して、特定分子との複合体を形成することによって、当該特定分子と、それ以外の共存物質（測定対象外分子、例えば、該複合体の形成に関与しなかった１種又はそれ以上の物質）が誘電泳動操作に対応する挙動に差を生ぜしめ得る物質、即ち、１）例えばこれら両者の何れか一方のみが誘電泳動電極に捕捉され他方が捕捉されないという結果を生ぜしめ得る物質、より具体的には、例えば後述するように電界により分子に発生する誘電泳動力と分子の移動との相互作用によって分離を行う、いわゆる誘電泳動クロマトグラフィー装置（Field Flow Fractionation装置）を用いる場合等に於いて、「特定分子」と、それ以外の共存物質との移動速度に変化をもたらし得る物質、より好ましくは何れか一方のみが電極上に補足され、それ以外の共存物質は電極に補足されず誘電泳動電極上を素通りさせ得る物質、或いは２）両者の何れか一方が負の誘電泳動力を受け、他の一方が正の誘電泳動力を受けるという結果を生ぜしめ得る物質、より具体的には、例えば特定分子のみを誘電泳動電極上の特定の位置に集合させ得る物質、より好ましくは何れか一方を正の誘電泳動力によって誘電泳動電極上の電界強度の強い領域に集合させ、他方を負の誘電泳動力によって誘電泳動電極上の電界強度の弱い領域に集合させ得る物質等が含まれる。
【００３２】
かかる物質としては、例えばシリカ、アルミナ等の無機金属酸化物、例えば金、チタン、鉄及びニッケル等の金属及び、無機金属酸化物等にシランカップリング処理等の操作で官能基を導入したもの、例えば各種微生物、真核生物細胞等の生物、例えばアガロース、セルロース、不溶性デキストラン等の多糖類、例えばポリスチレンラテックス、スチレン‐ブタジエン共重合体、スチレン‐メタクリル酸共重合体、アクロレイン‐エチレングリコールジメタクリレート共重合体、スチレン‐スチレンスルホン酸ラテックス、ポリアクリルアミド、ポリグリシジルメタクリレート、ポリアクロレイン被覆粒子、架橋ポリアクリロニトリル、アクリル酸またはアクリル酸エステル系重合体、アクリロニトリル‐ブタジエン、塩化ビニル‐アクリル酸エステル、ポリ酢酸ビニル‐アクリレート等の合成高分子化合物、例えば赤血球、糖、核酸、タンパク質、脂質等の生体分子等が挙げられる。
【００３３】
これらの物質は通常微粒子乃至粒状のかたちで使用される。
【００３４】
本発明に使用する「特定分子と結合する物質」というのは、試料中の「特定分子」から、該「特定分子」と「特定分子と結合する物質」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質を形成し得、「特定分子以外の分子」と「特定分子と結合する物質」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質は実質的に形成しないものであれば良く、特に限定されない。要するに、「特定分子」以外の分子と結合しても上記三者の複合体物質を形成しなければ良いが、実際には「特定分子と特異的に結合する物質」を使用するのが好ましい。
【００３５】
「特定分子と結合する物質」としては、例えば「抗原」−「抗体」間反応、「糖鎖」−「レクチン」間反応、「酵素」−「インヒビター」間反応、「タンパク質」−「ペプチド鎖」間反応又は「染色体又はヌクレオチド鎖」−「ヌクレオチド鎖」間反応等の相互反応によって「特定分子」と結合するもの等を言い、上記各組合せに於いて何れか一方が特定分子（測定対象分子）である場合、他の一方がこの「特定分子（測定対象分子）と結合する物質」である。例えば、特定分子（測定対象分子）が「抗原」であるときは「特定分子（測定対象分子）と結合する物質」は「抗体」であり、特定分子（測定対象分子）が「抗体」であるときは「特定分子（測定対象分子）と結合する物質」は「抗原」である（以下、その他の上記各組合せにおいても同様である）。
【００３６】
尚、これら「特定分子（測定対象分子）と結合する物質」は、少なくとも「特定分子」に結合するものであればよく、必ずしも「特定分子」のみに特異的に結合するものである必要はないが、「特定分子（測定対象分子）と結合する物質」が、「特定分子」と特異的に結合するものではない場合、組み合わせて用いられる「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」は、「特定分子」に特異的に結合するか、若しくは「特定分子」が「特定分子（測定対象分子）と結合する物質」との複合体物質が形成されたことによって新たに生じる部位に特異的に結合する性質を有するものである。
【００３７】
また、これら「特定分子（測定対象分子）と結合する物質」としてはそれ自身が何らかの方法により測定（検出）可能であるか、又は標識物質により標識可能なものが一般的である。このような性質のものを用いることによって試料中の特定分子（測定対象分子）を測定（検定）することが可能となる。尚、特定分子（測定対象分子）自身が何らかの方法により検出可能なものである場合（例えば酵素等）、或いは特定分子（測定対象分子）が、「特定分子と結合する物質」を用いずに（介さずに）直接標識物質と結合し得るものである場合には、該「特定分子と結合する物質」が上記した如き性質を有していなくても、或いは「特定分子と結合する物質」自体を用いなくとも、試料中の特定分子（測定対象分子）を測定（検出）することができる。それら自身が何らかの方法により検出可能なものの例としては、酵素、色素、蛍光物質、発光物質、紫外部に吸収を有する物質等がある。
【００３８】
本発明に於いて用いられる標識物質としては、酵素免疫測定法（EIA）、放射免疫測定法（RIA）、蛍光免疫測定法（FIA）、ハイブリダイゼーション法等、通常この分野で用いられるものであればよく、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ），β-ガラクトシダーゼ（β-Ｇａl），パーオキシダーゼ（ＰＯＤ），マイクロパーオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ），グルコース-6-リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ），リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例えばクーマシーブリリアントブルーR250，メチルオレンジ等の色素、例えば99mＴｃ，131Ｉ，125Ｉ，14Ｃ，3Ｈ，32Ｐ，35Ｓ，等の放射性同位元素、例えばフルオレセイン，ローダミン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミン或はこれらの誘導体，ユウロピウム（Eu）等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス(2,4,6-トリフロロフェニル）オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル，2,6-ジ-t-ブチル-α-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン)-p-トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられる。
【００３９】
標識物質により、特定分子（測定対象物質）又は「特定分子と結合する物質」を標識するには、通常この分野で用いられる常法、例えば自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ或いはハイブリダイゼーション法等に於いて一般的に行われている自体公知の標識方法［例えば、医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、1971；図説 蛍光抗体、川生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス社、1983；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、宮井潔編、第３版、医学書院、1987、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル セカンド エディション、Ｊ．サムブルック，Ｅ．Ｆ．フリッシュ，Ｔ．マニアティス、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー プレス等］や、アビジン（又はストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用した常法等何れの方法により行ってもよい。
【００４０】
前記(a)の態様において、「試料中の特定分子」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体を形成させるには、「特定分子」を含有する試料及び「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」を、それぞれ例えば水あるいは緩衝液
、例えばトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液、グッド緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等、に溶解、分散若しくは懸濁させて液状物とし、これら液状物を互いに混合接触させればよい。尚、これらそれぞれの液状物を先ず調整して一挙にこれらを混合してもよい。また、「特定分子」を含有する試料が液状物である場合には、該試料に、直接「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」を混合させてもよい。
【００４１】
本発明の前記態様(b)及び(c)における複合体の形成も上記と同様にして行われる。
【００４２】
即ち、上記（ｂ）の態様においては、「試料中の特定分子」と「特定分子と結合する物質」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体を形成させるには、「特定分子」を含有する試料、「特定分子と結合する物質」及び「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」を、それぞれ例えば水あるいは緩衝液、例えばトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液、グッド緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等、に溶解、分散若しくは懸濁させて液状物とし、これら液状物を互いに混合接触させればよい。尚、これらそれぞれの液状物を先ず調整して一挙にこれらを混合してもよく、また、先ず「特定分子と結合する物質」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体を上記と同様にして形成させ、この複合体を含有する液状物をさらに上記の様に液状物とした特定分子含有試料とを混合接触させても良い。更にまた、「特定分子」を含有する試料と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とを接触させてこれらの複合体を形成させ、更にこれに「特定分子と結合する物質」を接触させてもよい。
【００４３】
尚、「特定分子」を含有する試料が液状物である場合には、上記したように例えば水或いは緩衝液等に溶解、分散若しくは懸濁させなくともよい。
【００４４】
また、上記（ｃ）の態様においては、「試料中の特定分子」又は「標識により標識された特定分子」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体を形成させるには、先ず、「特定分子」を含有する試料及び「標識により標識された特定分子」を、それぞれ例えば水あるいは緩衝液、例えばトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液、グッド緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等、に溶解、分散若しくは懸濁させて液状物とし、これら液状物を互いに混合接触させる。次いでこの混合液状物と、「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」を例えば水あるいは緩衝液、例えばトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液、グッド緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等に溶解、分散若しくは懸濁させた液状物とを互いに混合接触させれば良い。尚、これらそれぞれの液状物を先ず調製して一挙にこれらを混合してもよい。
【００４５】
尚、「特定分子」を含有する試料が液状物である場合には、上記したように例えば水或いは緩衝液、例えばトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液、グッド緩衝液等に溶解、分散若しくは懸濁させなくともよい。
【００４６】
かくして得られた、複合体含有液状物を次に誘電泳動に付す。
【００４７】
（誘電泳動力の一般式）等価双極子法（Equivalent dipole
moment method）は誘導電荷を等価的な電気双極子に置き換えて、誘電泳動力を解析する手法である。これによれば、電界Eの中に置かれた半径aの球体粒子に働く誘電泳動力Ｆdは、
【数１】
で与えられる。ここで
【外１】
は、ω：印加電圧の角周波数、j：虚数単位を用いて、
【数２】
【数３】
ただし、
【外２】
は粒子と溶液の誘電率と導電率であり、上の式で複素量には＊をつけた。
【００４８】
式（1）は
【数４】
であれば粒子を電界が強い方へと引き付ける力が働き（正の誘電泳動,PositiveDEP）、
【数５】
であれば粒子を電界の弱い方へと押しやる力が働く（負の誘電泳動力,NegativeDEP）ことを示している。
【００４９】
上記誘電泳動力の一般式から、誘電泳動力を受ける物質の誘電泳動力に関与するパラメーターは、概ね物質及び媒質の誘電率及び導電率、物質の持つ大きさ、印可する電界の周波数であることがわかる。これらのパラメーターは検出複合体物質が結合した分離向上物質と特定分子（測定対象分子）の検出に用いられる標識分子の種類により適宜設定すべきものであり一概には言えないが、用いられる媒質の導電率は通常13mS/cm（PBS濃度とした）以下、好ましくは1mS/cm以下である。分離向上物質の大きさは粒子の場合通常その平均粒子径が1mm以下、好ましくは0.025〜100μmであり、生体分子としてはその大きさが通常10nm以上（通常のタンパク分子が数〜数十nmということから類推）、好ましくは500nｍ以上である。
【００５０】
（分離向上物質を用いた誘電泳動分離に使用する電界）上記誘電泳動の一般式から、印加する電界の誘電泳動力に関与するパラメーターは印加電界強度及び印加周波数であると言える。特に同一物質であっても印加する周波数によって正負の誘電泳動特性が変化することがあるから、特定分子（測定対象分子）に応じて適宜設定されるものである。これらのパラメーターは検出複合体物質が結合した分離向上物質と特定分子（測定対象分子）の検出に用いられる標識分子の種類により適宜設定すべきものであり一概には言えないが、誘電泳動分離向上物質が正の誘電泳動を示す場合、印加電界強度は通常3.5MV/m以下、好ましくは1.0MV/m以下である。分離向上物質が負の誘電泳動を示す場合では、3.5MV/m以下の電界強度である。印加周波数は通常100Hz〜10MHz、好ましくは1kHz〜10MHzである。
【００５１】
尚、本発明に於いて印加する電界は、直流電界及び交流電界のいずれでも良いが、交流電界が好ましい。
【００５２】
（誘電泳動分離向上物質を用いた分離法）分離向上物質を用いた特定分子の分離法としては、以下の２つに大別される。
【００５３】
（分離法−１）第１に、分離向上物質が特定分子以外の分子（測定対象外分子）〔例えば特定分子の検出に用いられる遊離の標識物質等〕と同一の正又は負の誘電泳動力を示すものであって、特定分子以外の分子（測定対象外分子）よりも大きな誘電泳動力を示す物質である場合、実質的に分離向上物質及び分離向上物質に結合した特定分子のみが大きな誘電泳動力を受けて分離されることとなる。
【００５４】
即ち、（１）例えば、分離向上物質及び分離向上物質に結合した分子は誘電泳動力によって誘電泳動電極上の特定の部分に集合するが、特定分子以外の分子（測定対象外分子）〔例えば特定分子の検出に用いられる遊離の標識物質等〕は集合しないような電界強度及び媒質条件を適宜設定して、これら特定分子と特定分子以外の分子を分離することができる。
【００５５】
また、（２）例えば後述するように電界により分子に発生する誘電泳動力と分子の移動との相互作用によって分離を行う、いわゆる誘電泳動クロマトグラフィー装置（Field Flow Fractionation装置）を用いて分離を行ってもよい。この場合には、分離向上物質及び分離向上物質に結合した分子のみが誘電泳動力によって誘電泳動分離電極上に捕集されるか、又は分離向上物質及び分離向上物質に結合した分子の移動速度とそれ以外の分子移動速度に差が生じるので、これら特定分子を特定分子以外の分子（測定対象外分子）から容易に分離することができる。
【００５６】
（分離法−２）第２に、分離向上物質が特定分子以外の分子（例えば特定分子の検出に用いられる標識物質）と異なる正又は負の誘電泳動力を示す物質である場合、即ち、分離向上物質が正の誘電泳動力を示し、特定分子以外の分子が負の電気泳動力を示す場合、或いは分離向上物質が負の誘電泳動力を示し、特定分子以外の分子が正の電気泳動力を示す場合、分離向上物質及び分離向上物質に結合した特定分子と、特定分子以外の分子とは異なる電解領域に夫々移動するので、特定分子を特定分子以外の分子と分離することが出来る。
【００５７】
即ち、（１）例えば、実質的に分離向上物質及び分離向上物質に結合した特定分子と特定分子以外の分子は、誘電泳動力によって誘電泳動電極上の異なる電解領域に移動するので、特定分子と特定分子以外の分子（例えば特定分子の検出に用いられる遊離の標識物質等）とを分離することができる。
【００５８】
また、（２）例えば、誘電泳動クロマトグラフィー装置（Field FlowFractionation装置）を用いて分離を行ってもよく、この場合、分離向上物質及び分離向上物質に結合した特定分子が正の誘電泳動力を示し、特定分子以外の分子が負の誘電泳動力を示す条件に於いては、分離向上物質及び分離向上物質に結合した特定分子は誘電泳動力によって誘電泳動分離電極上に捕集されるが、特定分子以外の分子は負の誘電泳動力によって電極に捕集されない。一方、特定分子以外の分子が正の誘電泳動力を示し、分離向上物質及び分離向上物質に結合した特定分子が負の誘電泳動力を示す条件に於いては、特定分子以外の分子は誘電泳動力によって誘電泳動分離電極上に捕集されるが、分離向上物質及び分離向上物質に結合している特定分子は負の誘電泳動力によって電極に捕集されない。従って、これら特定分子と特定分子以外の分子とを分離することが出来る。
【００５９】
尚、本発明に於いて用いられる、誘電泳動電極及び誘電泳動クロマトグラフィー装置としては、この分野で通常用いられるものは全て使用可能であるが、具体的には後述するような水平及び垂直方向に不均一電解を形成し得る構造を有する電極及びこれを有するものが挙げられる。
【００６０】
「分離向上物質」は、通常は「特定分子と結合する物質」に結合させて用いられ、このようにすることによって試料中の「特定分子」に結合させ得るが、例えば分離向上物質表面に官能基を導入した後、この官能基を介して特定分子に結合させる方法、分離向上物質と「特定分子」をリンカーを介して結合させる方法等の化学的結合法等により「特定分子」に直接「分離向上物質」を結合させてもよい。尚、ここで用いられる「特定分子と特異的に結合する物質」としては、先に述べた「特定分子と特異的に結合する物質」と同じもの［但し、それ自身が何らかの方法により測定（検出）可能であるか、又は標識物質により標識可能なものである必要はない。］、或いは「特定分子」が「特定分子と結合する物質」との複合体が形成されたことによって、新たに生じる部位に特異的に結合する性質を有するもの等が用いられる。尚、「特定分子と結合する物質」との複合体が形成されたことによって、新たに生じる部位に特異的に結合する性質を有するものとしては、例えば「特定分子」と「特定分子と結合する物質」との複合体を認識してこれに結合し得る抗体、ペプチド鎖、ヌクレオチド鎖等が挙げられる。
【００６１】
また、「分離向上物質」と「特定分子と結合する物質」とを結合させるには、先に述べた如き標識物質により「特定分子」を標識する方法と同様の方法により行えばよい。
【００６２】
尚、「分離向上物質」として、直接「特定分子」と特異的に結合し得る性質を有するものを用いる場合には、上記した如き操作は不要である。
【００６３】
このような「分離向上物質」としては、例えば核酸、タンパク質、脂質等が挙げられる。
【００６４】
本発明に於いて、『複合体物質と試料中に含まれる「特定分子」以外の分子とを分離する』とは、必ずしも「複合体物質」（特定分子と分離向上物質との複合体物質）のみを分離（単離）することを意味するものではなく、目的に応じて試料中に共存する１種又はそれ以上の「複合体物質」以外の物質と「特定分子」とを分離することを意味する。この場合、適宜条件を設定して本発明の分離方法を繰返し実施すれば、「特定分子」をこれと分離向上物質との複合体物質として単離することが可能である。要は、試料中の「特定分子」若しくは「特定分子」以外の分子の含有量が測定できれば良い。
【００６５】
上記した如き本発明の分離方法によれば、試料中から「特定分子」（特定分子と分離向上物質との複合体として分取される場合を含む。）又は「特定分子」以外の分子を分取することができる。
【００６６】
即ち、前記した如き〔分離法−１〕の（１）に於いては、例えば特定分子は分離向上物質との複合体として電極の特定部分に捕集され、それ以外の分子は電極の特定部分に捕集されないような条件の電界を印加したまま、通常この分野で用いられる適当な緩衝液又は水等を用いて電極を洗浄することにより特定分子以外の分子が分取でき、次いで、電界の印加を中止して適当な緩衝液又は水等を用いて電極を洗浄すれば、特定分子（特定分子と分離向上物質との複合体）を分取することができる。
【００６７】
また、前記した如き〔分離法−２〕の（１）に於いては、実質的に分離向上物質及び分離向上物質に結合した分子と特定分子以外の分子は、誘電泳動力によって誘電泳動電極上の異なる電解領域に移動するので、これら移動した分子を夫々別々に分取することができる。
【００６８】
更に、前記した如き〔分離法−１〕の（２）の方法で分離を行った場合には、先ず、電極の特定部分に捕集されずに移動してきた小さい誘電泳動力を受ける特定分子以外の分子を含有する移動溶液を分取し、次いで、電界の印加を中止して適当な緩衝液又は水等を用いて電極を洗浄することにより、電荷印加時に電極の特定部分に捕集されていた大きい誘電泳動力を受ける特定分子を移動させて当該分子を含有する洗浄液を分取すれば、特定分子又はそれ以外の分子を夫々分取することができる。
【００６９】
また、〔分離法−２〕の（２）の方法で分離を行った場合、分離向上物質及び分離向上物質に結合した特定分子が正の誘電泳動力を示し、特定分子以外の分子が負の誘電泳動力を示す条件に於いては、先ず、電極の特定部分に捕集されずに移動してきた負の誘電泳動力を示す特定分子以外の分子を含有する移動溶液を分取し、次いで、電界の印加を中止して適当な緩衝液又は水等を用いて電極を洗浄することにより、電荷印加時に電極の特定部分に捕集されていた正の誘電泳動力を示す特定分子を移動させて当該分子を含有する洗浄液を分取すれば、特定分子を分取することができる。また、特定分子以外の分子が正の誘電泳動力を示し、分離向上物質及び分離向上物質に結合した特定分子が負の誘電泳動力を示す条件に於いては、先ず、電極の特定部分に捕集されずに移動してきた負の誘電泳動力を示す特定分子を含有する移動溶液を分取し、次いで、電界の印加を中止して適当な緩衝液又は水等を用いて電極を洗浄することにより、電荷印加時に電極の特定部分に捕集されていた正の誘電泳動力を示す特定分子以外の分子を移動させて当該分子を含有する洗浄液を分取すれば、特定分子又はそれ以外の分子を夫々分取することができる。
【００７０】
尚、用いられる緩衝液としては、例えばトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液、グッドの緩衝液、リン酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液等、通常この分野で使用されるものが挙げられる。
【００７１】
尚、上記二者（「特定分子」及び「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」）の複合体物質と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とは、誘電泳動によっては通常分離し得ず、また、上記三者（「特定分子」、「特定分子と結合する物質」及び「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」）の複合体物質と、「特定分子と結合する物質」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質及び「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とは、誘電泳動によっては通常分離し得ずないが、分離されなくとも、後述する試料中の「特定分子」の測定には特に支障はない。
【００７２】
また、試料中の「特定分子」と結合する「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」を「特定分子と結合する物質」との複合体としてではなく、単独で使用する場合は、「特定分子と結合する物質」を過剰量使用するので、「特定分子と結合する物質」が残存するが、これは「特定分子」以外の分子と一緒に分離すれば良い。
【００７３】
先ず、本発明の態様２の分離方法を利用する場合について述べれば、以下の如くである。
【００７４】
即ち、特定分子（測定対象分子）と該特定分子と結合する「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との相互作用の結果生じる複合体物質と、試料中に含まれる特定分子以外の分子との分離を、本発明の態様１の分離方法により行った後、当該複合体物質中の特定分子（測定対象分子）若しくは「特定分子」以外の分子を測定することにより、試料中の成分（測定対象分子）若しくは「特定分子」以外の分子を測定することにより、試料中の成分［特定分子（測定対象分子）又は／及び特定分子以外の分子］を測定することができる。
【００７５】
尚、上記方法に於いて、「特定分子」としてはそれ自体が何らかの方法により測定（検出）可能であるか、又は標識物質により標識可能なもの、或いはそれ自体が測定（検出）可能であるか、標識物質により標識可能な「特定分子と結合する物質」と結合したものである。尚、標識物質、「特定分子と結合する物質」及び標識方法は先に述べた通りである。
【００７６】
また、特定分子（測定対象分子）と該特定分子と結合する物質と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との相互作用の結果生じる複合体物質（複合体物質１）と、複合体物質形成に関与しなかった（遊離の）該特定分子と結合する物質との分離、いわゆるＢ／Ｆ分離を、本発明の態様１の分離方法により行った後、当該複合体物質１、又は複合体物質１中の特定分子（測定対象分子）若しくは「特定分子と結合する物質」、或いは複合体物質形成に関与しなかった（遊離の）該特定分子と結合する物質を測定することにより、試料中の特定分子（測定対象分子）を迅速且つ容易に測定し得る。
【００７７】
尚、上記方法に於いて、「特定分子と結合する物質」としては、それ自体が何らかの方法により測定（検出）可能であるか、又は標識物質により標識可能な「特定分子と結合する物質」を使用するのが一般的である。
【００７８】
更に、特定分子（測定対象分子）と該特定分子と結合する物質〔又は標識物質により標識された特定分子と結合する分子〕と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とを反応させ生じた特定分子（測定対象分子）と該特定分子と結合する物質〔又は標識物質により標識された特定分子と結合する分子〕と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質（複合体物質１）と、遊離の特定分子と結合する物質（又は遊離の標識された特定分子と結合する分子）とを、前述した如き本発明の態様１の分離方法により分離する。次いで、分離された複合体物質１を、複合体物質１中の特定分子と結合する物質（又は該複合体物質１中の特定分子と結合する物質に結合した標識物質）の性質に基づいて検出することにより、試料中の特定分子（測定対象分子）の存在の有無を測定することが出来る。
【００７９】
更に、例えば以下の如き方法によれば、試料中の特定分子（測定対象分子）の存在を測定し得るのみでなく、試料中の特定分子（測定対象分子）の量を定量的に測定し得る。
【００８０】
即ち、特定分子（測定対象分子）と特定分子と結合する物質（又は標識された特定分子と結合する物質）と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質（複合体物質１）と、遊離の特定分子と結合する物質（又は遊離の標識された特定分子と結合する物質）とを、前述した如き本発明の態様１の分離方法により分離する。次いで、分離された該複合体物質１中の特定分子と結合する物質（又は該複合体物質１中の特定分子と結合する物質に結合した標識物質）の量、又は遊離の特定分子と結合する物質（又は遊離の標識された特定分子と結合する物質に結合した標識物質）の量を、特定分子と（特異的に）結合する物質又は標識物質の性質に応じた測定方法により求め、これらの量に基づいて、試料中の特定分子（測定対象分子）の量を求めることができる。
【００８１】
また、標識された特定分子を用いて、これと試料中の特定分子との競合反応を利用する、いわゆる競合法によっても、試料中の特定分子を測定することが出来る。
【００８２】
即ち、特定分子を含む試料と標識物質により標識された特定分子（標識特定分子）と、「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とから、標識特定分子と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との標識複合体物質及び特定分子と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質を形成させ、次いで誘電泳動に付して、該標識特定分子を含む複合体物質と遊離の標識特定分子とを分離し、分離した前記標識複合体物質中の標識特定分子に結合した標識物質の量若しくは遊離の標識特定分子に結合した標識物質の量を、標識物質の性質に応じた測定方法により求め、これらの量に基づいて、試料中の特定分子の量を求めることができる。
【００８３】
尚、これら上記の方法に於いて、得られた特定分子、特定分子と結合する物質又は標識物質の量に基づいて、試料中の特定分子の量を求めるには、例えば特定分子濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行い、得られた特定分子量と、複合体物質中の標識物質量，複合体物質中の特定分子と結合する物質（又は標識された特定分子と結合する物質）の量，遊離の標識特定分子の標識物質の量又は遊離の特定分子と結合する物質（又は標識された特定分子と結合する物質中の標識物質）の量との関係を示す検量線を、夫々用いて試料中の特定分子の量を算出すればよい。
【００８４】
また、試料中に濃度既知の検出可能な物質を内部標準として添加し、内部標準として添加した当該物質の量と、複合体物質中の標準物質の量、複合体物質中の特定分子と結合する物質の量（又は標識された特定分子と結合する物質中の標識物質の量）、遊離の標識特定分子中の標識物質の量、又は遊離の特定分子と結合する物質の量（又は遊離の標識された特定分子と結合する物質中の標識物質の量）とを比較することによって、相対的な試料中の特定分子の量の算出が可能となる。また、このようにすることによって、誘電泳動分離デバイス間の誤差を補正することも可能となる。
【００８５】
上記した如き方法に於いて、検出可能な物質は、誘電泳動力を受ける物質であって、それ自体が何らかの方法により測定（検出）可能であるか、又は標準物質により標識可能なものであるが、通常試料中に存在する成分以外のものであって、且つ測定対象分子に結合し得ないものが一般的である。より具体的には、例えば、上記した如き性質を有する、先に述べた「特定分子」及び「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」等が挙げられる。
【００８６】
尚、標識物質、標識方法は先に述べた通りである。
【００８７】
次に、本発明の態様２の分離方法を利用する場合について述べれば以下の如くである。
【００８８】
尚、本発明の態様２の分離方法を利用した測定方法に於ける測定対象分子（対象分子Ａ）としては、前述した如き分離の対象となり且つ前述した如き溶液に溶解し得るものであって、１該対象分子Ａと互いに相互作用を及ぼしあい、複合体物質を形成し得る分子（分子Ｂ）が存在し、該分子Ｂがそれ自身何らかの方法により測定（検出）し得る性質を有しているか、又は標識物質により標識可能なもの、であるか、２該対象分子Ａが標識物質により標識可能であって、該対象分子Ａと互いに相互作用を及ぼしあい、標識複合体物質を形成し得る分子（分子Ｂ）が存在するもの、であればよい。
【００８９】
即ち、測定対象分子（対象分子Ａ）と該測定対象分子に特異的に結合する物質（分子Ｂ）との相互作用の結果生じる複合体物質（複合体物質２）と、遊離の分子Ｂとの分離、いわゆるＢ／Ｆ分離を、本発明の態様２の分離方法により行った後、当該複合体物質２，複合体物質２中の対象分子Ａ又は分子Ｂ（又は該複合体物質２の分子Ｂに結合した標識物質）、或いは遊離の分子Ｂ（又は遊離の分子Ｂに結合した標識物質）を測定することにより、試料中の対象分子Ａを迅速且つ容易に測定し得る。
【００９０】
即ち、対象分子Ａを含む試料と分子Ｂ〔又は標識物質により標識された分子Ｂ（標識分子Ｂ）〕とを反応させ生じた対象分子Ａと分子Ｂ（又は標識分子Ｂ）との複合体物質２と、遊離の分子Ｂ（又は標識分子Ｂ）とを、前述した如き本発明の態様２の分離方法により分離する。次いで、分離された該複合体物質２を、該複合体物質２中の分子Ｂ（又は該複合体分子中の分子Ｂに結合した標識物質）の性質に基づいて検出することにより、試料中の対象分子Ａの存在の有無を測定することができる。
【００９１】
更に、例えば以下の如き方法によれば、試料中の対象分子Ａの存在を測定し得るのみでなく、試料中の対象分子Ａの量を定量的に測定し得る。
【００９２】
即ち、対象分子Ａを含む試料と、分子Ｂ〔又は標識物質により標識された分子Ｂ（標識分子Ｂ）〕とを反応させ、生じた対象分子Ａと分子Ｂ（又は標識分子Ｂ）との複合体物質２と、遊離の分子Ｂ（又は遊離の標識分子Ｂ）とを、前述した如き本発明の態様２の分離方法により分離する。次いで、分離された該複合体物質２中の分子Ｂ（又は該複合体物質２中の分子Ｂに結合した標識物質）の量、又は遊離の分子Ｂ（又は遊離の標識分子Ｂに結合した標識物質）の量を、分子Ｂ又は標識物質の性質に応じた測定方法により求め、これらの量に基づいて、試料中の対象分子Ａの量を求めることができる。
【００９３】
また、標識された対象分子Ａを用いて、これと試料中の対象分子Ａとの競合反応を利用する、いわゆる競合法によっても、試料中の対象分子Ａを測定することが出来る。
【００９４】
即ち、対象分子Ａを含む試料、標識物質により標識された対象分子Ａ（標識対象分子Ａ）及び分子Ｂを反応させ、標識対象分子Ａと分子Ｂとの標識複合体物質と、対象分子Ａと分子Ｂとの複合体物質を形成させた後、標識複合体物質と、遊離の標識特定分子Ａとを、前述した如き本発明の分離方法により分離する。次いで、分離された該標識複合体物質中の標識対象分子Ａに結合した標識物質の量又は遊離の標識対象分子Ａに結合した標識物質の量を、標識物質の性質に応じた測定方法により求め、これらの量に基づいて、試料中の対象分子Ａの量を求めることができる。
【００９５】
尚、これら上記の方法に於いて、得られた分子Ｂ又は標識物質の量に基づいて、試料中の対象分子Ａの量を求めるには、例えば対象分子Ａ濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行い、得られた対象分子Ａ量と、複合体物質中の標識物質量，複合体物質中の分子Ｂ（又は標識物質）の量，遊離の標識対象分子Ａの標識物質又は遊離の分子Ｂ（又は標識分子Ｂ中の標識物質）の量との関係を示す検量線を、夫々用いて試料中の対象分子Ａの量を算出すればよい。
【００９６】
また、試料中に濃度既知の検出可能な物質を内部標準として添加し、内部標準として添加した当該物質の量と、複合体物質中の標準物質の量、複合体物質中の分子Ｂ（又は標識物質）の量、遊離の標識対象分子Ａ中の標識物質の量、又は遊離の分子Ｂの量（又は標識分子Ｂ中の標識物質の量）とを比較することによって、相対的な試料中の特定分子の量の算出が可能となる。また、このようにすることによって、誘電泳動分離デバイス間の誤差を補正することも可能となる。
【００９７】
上記した如き方法に於いて、検出可能な物質は、誘電泳動力を受ける物質であって、それ自体が何らかの方法により測定（検出）可能であるか、又は標準物質により標識可能なものであるが、通常試料中に存在する成分以外のものであって、且つ測定対象分子に結合し得ないものが一般的である。より具体的には、例えば、上記した如き性質を有する、先に述べた「特定分子」及び「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」等が挙げられる。
【００９８】
尚、標識物質、標識方法は先に述べた通りである。
【００９９】
尚、上記方法に於いて、これら対象分子Ａに特異的に結合する分子（分子Ｂ）は、先に述べた「特定分子と特異的に結合する物質」と同じものである。
【０１００】
本発明に於いて用いられる標識物質としては、酵素免疫測定法（EIA）、放射免疫測定法（RIA）、蛍光免疫測定法（FIA）、ハイブリダイゼーション法等、通常この分野で用いられるものであればよく、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ），β-ガラクトシダーゼ（β-Ｇａl），パーオキシダーゼ（ＰＯＤ），マイクロパーオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ），グルコース-6-リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ），リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例えばクーマシーブリリアントブルーR250，メチルオレンジ等の色素、例えば99mＴｃ，131Ｉ，125Ｉ，14Ｃ，3Ｈ，32Ｐ，35Ｓ，等の放射性同位元素、例えばフルオレセイン，ローダミン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミン或はこれらの誘導体，ユウロピウム（Ｅｕ）等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス(2,4,6-トリフロロフェニル）オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル，2,6-ジ-t-ブチル-α-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン)-p-トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられる。
【０１０１】
標識物質により、対象分子Ａ又は分子Ｂを標識するには、通常この分野で用いられる常法、例えば自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ或いはハイブリダイゼーション法等に於いて一般的に行われている自体公知の標識方法［例えば、医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、1971；図説 蛍光抗体、川生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス社、1983；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、宮井潔編、第３版、医学書院、1987、モレキュラー クローニングア ラボラトリー マニュアル セカンド エディション、Ｊ．サムブルック，Ｅ．Ｆ．フリッシュ，Ｔ．マニアティス、コールドスプリング ハーバーラボラトリー プレス等］や、アビジン（又はストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用した常法等何れの方法により行ってもよい。
【０１０２】
本発明の測定方法（本発明の第二の方法：態様２）に於いて、対象分子Ａと分子Ｂ（又は標識分子Ｂ）とを反応させて、複合体物質２を形成する際の反応条件、或いは、対象分子Ａ、又は標識対象分子Ａ）及び分子Ｂを反応させて、標識複合体物質を形成させる際の反応条件としては、当該複合体物質２（又は標識複合体物質）が形成されるのを妨げるような条件でなければよく、常法、例えば自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ、ＦＩＡ或いはハイブリダイゼーション法等に於いて複合体物質２（標識複合体物質）を形成させる際の反応条件に準じて行えばよい。また、本発明の第一の方法において、特定分子（又は標識特定分子）と該特定分子と結合する物質と「誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質１［又は特定分子（又は標識特定分子）と「誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質］を形成する際の反応条件、又は、標識特定分子と「誘電泳動特性を変化させ得る物質」との標識複合体物質を形成する際の反応条件も、上記反応条件に準じて行えば良い。
【０１０３】
本発明の態様２（第二）の方法に於いて、対象分子Ａと分子Ｂ（又は標識分子Ｂ）とを反応させて、複合体物質２を形成する際の分子Ｂ（又は標識分子Ｂ）の使用濃度としては、対象分子Ａの検量限界等により変動するため一概には言えないが、通常、反応液中に於いて、設定された検量限界濃度に相当する対象分子Ａ全てと結合し得る濃度以上、好ましくはその２倍濃度以上、より好ましくは５倍濃度以上が反応液中に存在していることが望ましい。尚、本発明の態様１（第一）の方法における「特定分子」及び「特定分子と結合する物質」（又は標識された「特定分子と結合する物質」）或いは「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」の使用濃度もこの条件に準じて設定すればよい。
【０１０４】
また、本発明の態様２（第二）の方法に於いて、対象分子Ａ、標識対象分子Ａ及び分子Ｂを反応させて、標識複合体物質を形成させる際の標識対象分子Ａの使用濃度及び分子Ｂの使用濃度は、対象分子Ａの検量限界や測定感度等をどの程度に設定するかにより適宜設定すればよいが、標識分子Ａの使用濃度は、少なくとも反応液中に存在する分子Ｂ全てと結合し得る濃度以上である。尚、本発明の態様１（第一）の方法における「標識特定分子」及び「特定分子と結合する物質」（又は標識された「特定分子と結合する物質」）の使用濃度もこの条件に準じて設定すればよい。
【０１０５】
本発明の態様２（第二）の方法に於いて、反応時のｐＨや温度は、対象分子Ａと分子Ｂの性質により異なるため一概には言えないが、複合体物質２（又は標識複合体物質）が形成されるのを妨げない範囲であればよく、ｐＨは、通常２〜10、好ましくは５〜９であり、温度は、通常０〜90℃、好ましくは20〜80℃である。また、反応時間は、複合体物質２（又は標識複合体物質）が形成されるのに要する時間が、対象分子Ａと分子Ｂの性質により異なるので、夫々の性質に応じ、通常数秒乃至数時間適宜反応させればよい。本発明の態様１（第一）の方法に於ける、反応時のｐＨや温度及び反応時間についても、上記に準じて行えば良い。
【０１０６】
本発明の測定方法に於いて、分離された複合体物質２中の分子Ｂ（又は該複合体物質２中の分子Ｂに結合した標識物質），遊離の分子Ｂ（又は遊離の標識分子Ｂに結合した標識物質）、複合体物質１中の特定分子に結合する物質（又は該複合体物質１中の特定分子に結合する物質に結合した標識物質），遊離の特定分子に結合する物質（又は遊離の標識された特定分子に結合する物質）、標識複合体物質中の標識対象分子Ａに結合した標識物質，遊離の標識対象分子Ａに結合した標識物質、標識複合体物質中の標識特定分子に結合した標識物質，又は遊離の標識特定分子に結合した標識物質を測定するには、これらの種類に応じて夫々所定の方法に従って行えばよい。例えば、その性質が酵素活性の場合にはＥＩＡやハイブリダイゼーション法等の常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質核酸 酵素別冊 No.31、北川常廣・ 南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、51〜63頁、共立出版（株）、1987年９月10日発行」等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、検出物質が放射性物質の場合にはＲＩＡやハイブリダイゼーション法等の常法に従い、該放射性物質の出す放射線の種類及び強さに応じて液浸型ＧＭカウンター，液体シンチレーションカウンター，井戸型シンチレーションカウンター等の測定機器を適宜選択して使用し、測定を行えばよい（例えば医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、1971，生化学実験講座２ トレーサー実験法下、竹村彰祐，本庶佑、501〜525頁、（株）東京化学同人、1977年2月25日発行等参照。）。また、その性質が蛍光性の場合には蛍光光度計や共焦点レーザー顕微鏡等の測定機器を用いるＦＩＡやハイブリダイゼーション法等の常法、例えば「図説蛍光抗体、川生明著、第１版、( 株)ソフトサイエンス社、1983」、「生化学実験講座２ 核酸の化学III、実吉峯郎、299〜318頁、（株）東京化学同人、1977年12月15日発行等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、その性質が発光性の場合にはフォトンカウンター等の測定機器を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、252〜263頁、共立出版（株）、1987年９月10日発行」等に記載された方法に準じて測定を行えばよい。更に、その性質が紫外部に吸収を有する性質の場合には分光光度計等の測定機器を用いる常法によって測定を行えばよく、その性質が発色性の場合には分光光度計や顕微鏡等の測定機器を用いる常法によって測定を行えばよい。また、検出物質がスピンの性質を有する物質の場合には電子スピン共鳴装置を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質核酸酵素 別冊 No.31、北川 常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、264〜271頁、共立出版（株）、1987年９月10日発行」等に記載された方法に準じて夫々測定を行えばよい。
【０１０７】
また、本発明の測定方法に於いて、前述した如き本発明の分離方法により分離された各分子を測定するには、例えば、電極の特定部分（電界の強い領域又は／及び電界の弱い領域）に於いて、複合体分子若しくは複合体物質又は／及び遊離の分子Ｂ若しくは遊離の「特定分子と結合する物質」が分離・捕集されているか否かを、複合体物質２中の分子Ｂ（又は該複合体物質２中の分子Ｂに結合した標識物質），遊離の分子Ｂ（又は遊離の標識分子Ｂに結合した標識物質）、複合体物質１中の特定分子に結合する物質（又は該複合体物質１中の特定分子に結合する物質に結合した標識物質），又は遊離の特定分子に結合する物質（又は遊離の標識された特定分子に結合する物質）を直接観察することにより測定してもよい。尚、この場合、分子Ｂ、特定分子又は標識物質は、放射性，蛍光性，発光性，発色性，スピンの性質等を有するものが好ましい。
【０１０８】
また、例えば前述した如き電極基板からの流出液をそのまま検出部に導き、流出液中の，複合体物質２中の分子Ｂ（又は該複合体物質２中の分子Ｂに結合した標識物質），遊離の分子Ｂ（又は遊離の標識分子Ｂに結合した標識物質）、複合体物質１中の特定分子に結合する物質（又は該複合体物質１中の特定分子に結合する物質に結合した標識物質），遊離の特定分子に結合する物質（又は遊離の標識された特定分子に結合する物質）、標識複合体物質中の標識対象分子Ａに結合した標識物質，遊離の標識対象分子Ａに結合した標識物質、標識複合体物質中の標識特定分子に結合した標識物質，又は遊離の標識特定分子に結合した標識物質を直接測定しても、また、検出部を有する電極基板を用いて、同様に測定してもよい。尚、これらの方法によれば、測定がより迅速に行える点で有利である。
【０１０９】
この場合に、分子Ｂ、特定分子と結合する物質、特定分子又は標識物質が有している、何らかの方法により測定（検出）し得る性質が、例えば酵素活性であれば、電極基板の電極の下流末端と検出部との間に、酵素活性測定用の試薬を添加し流出液と反応させる、反応部を設ける必要がある。該反応部に於いて用いられる酵素活性測定用の試薬は、常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質核酸 酵素別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川 榮治編集、51〜63頁、共立出版（株）、1987年９月10日発行」等に記載された方法に準じて調製したものを用いても、市販されている臨床検査用キットの試薬を適宜選択して利用してもよい。また、分子Ｂ又は標識物質の性質が酵素活性以外の場合に於いても、検出感度を増加させる目的等で所定の試薬を添加、反応させるために、電極基板の電極の下流末端と検出部との間に適当な反応部を設けることは任意である。
【０１１０】
尚、上記２つの測定方法の内、後述の方法、即ち、電極上で分離した後、夫々の分子を検出部分に導く方法に於いては、例えば溶出溶液の流速、溶出流路形状、検出部に移動中の各分子の溶出溶液への拡散等の影響により、分離効率が低下したり、一旦分離した各分子の検出感度が低下する等する可能性がある。そのため、単に特定の分子を検出するだけであれば、前述の方法、即ち、電極上で分離した後に、直接電極上を観察して分離された各分子を観察するという方法の方が、上記した如き拡散等の影響により生じる諸問題を解決でき、しかも分離された各分子を検出部分に導く必要がないので分離から検出までの時間を短縮できる、等の点で有利である。また、この方法は、電極基板上で反応、分離、検出が行えるため、反応部分、分離部分、検出部分を一体化できるので基板の省スペース化にもつながり、更には、溶出用の溶液を送流させる必要がなくなるため検出装置自体の小型化も望める等の点でも有利である。
【０１１１】
本発明の測定方法は、本発明の分離方法を利用する以外は、上記した如き自体公知の方法に準じて実施すればよく、使用される試薬類もこれら自体公知の方法に準じて適宜選択すればよい。
【０１１２】
上記本発明の実施に使用する試薬類等を誘電泳動用測定キットとしておくと、上記本発明の方法を実施するのに好都合である。
【０１１３】
具体的には、誘電泳動用測定キットは、「特定分子と結合する物質」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とからなり、これらの物質が試料中の「特定分子」と複合体物質を形成し得る物質を含むものである。また、「標識物質により標識された特定分子」と「特定分子と結合する物質」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とからなり、これらの物質が試料中の「特定分子」と複合体物質を形成し得る物質を含むものである。
【０１１４】
上記キットに於いて、「特定分子と結合する物質」、「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」及び「標識物質により標識された特定分子」の好ましい態様及び具体例は、先に述べた通りであるが、「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」としては、好ましくは「特定分子」と「特定分子と結合する物質」のいずれか若しくは双方と結合する物質である。また、上記誘電泳動用測定キットに、更に、誘電泳動装置を組み合わせても良い。
【０１１５】
尚、これら以外、上記した如き通常この分野で用いられる試薬類や特定分子又は対象分子Ａからなる標準品等を含んでいてもよい。
【０１１６】
本発明の測定方法を、特定の遺伝子配列を検出するためのハイブリダイゼーション法に用いる場合を例に取り、以下により具体的に説明する。
【０１１７】
即ち、先ず、検出したい遺伝子配列と相補的な配列を持ち、且つ標識物質で標識された適当な長さのヌクレオチドプローブと、変性１本鎖化された未知の遺伝子を、適当な緩衝液中で混合・反応させてアニーリングさせ、該ヌクレオチドプローブと変性１本鎖化未知遺伝子との複合体を形成させる。次いで、得られた反応液を、前述した如き誘電泳動力を利用した本発明の分離方法に供し、該複合体と遊離のヌクレオチドプローブとを分離する。分離後、該複合体中の標識物質を、上記した如き方法により測定すれば、該未知遺伝子がヌクレオチドプローブと相補的な配列を含むのか否か、即ち、ヌクレオチドプローブと相補的な配列の存在の有無を測定することができる。
【０１１８】
上記した如き方法に於いて、ヌクレオチドプローブや緩衝液等は、自体公知の方法に準じて適宜選択すればよい。また、ヌクレオチドプローブの調製方法、変性１本鎖化遺伝子の調製方法及びアニーリング条件等は、自体公知の方法に準じて実施すればよい。
【０１１９】
以下に実施例、参考例及び実験例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
【０１２０】
【実施例】
参考例 １ 誘電泳動電極基板の作製最小ギャップ7μm 、電極ピッチ20μm、電極数2016（1008対）の多段電極列を設計し、それに基づいて、電極作製用のフォトマスクを作製した。
【０１２１】
即ち、アルミ蒸着し、レジストを塗布したガラス基板に、電子ビーム描画装置にて上記設計通りの電極パターンを描画した後、レジストを現像し、アルミをエッチングすることによってフォトマスクを作製した。
【０１２２】
電極基板の作製は、図解フォトファブリケーション、橋本貴夫著、総合電子出版、（1985）に記載の方法に準じて以下の如く行った。
【０１２３】
即ち、上記の如くして作製したフォトマスクと、レジストを塗布したアルミ蒸着ガラス基板を密着させたのち、水銀ランプで電極パターンを露光した。露光後の電極用ガラス基板はレジストの現像、アルミ面のエッチングに続き、アルミ面に残ったレジストを除去することによって電極基板を作製した。アルミ表面は電気化学的に活性であり、希釈したフォトレジストをスピンコートすることによって、厚さ５ｎｍの有機薄膜コーティングを施した。
【０１２４】
図４に、作製した電極基板の模式図を、また、図５に電極の模式図を夫々示す。尚、図４に於いて１は電極を示す。
【０１２５】
参考例 ２ 流路を有する電極基板の作製不均一交流電界中に分子を移動させることによる分子の分離を行うため、参考例 １で作製した電極基板上にシリコンゴムを用いて流路を作製した。
【０１２６】
電極上に分子が溶解した溶液を送流するためのシリコンゴム流路は、深さ２５μm、幅４００μmで、電極基板上の電極が配置されている領域を通るように設計した。
【０１２７】
作製は、図解フォトファブリケーション、橋本貴夫著、総合電子出版、1985に記載の方法に準じて行った。先ず、ガラス板上に厚さ２５μmのシート状ネガレジストを貼り付け、流路作製用に設計したフォトマスクを用いて露光した後、ネガレジストの現像を行った。このネガレジスト基板を鋳型として未硬化のシリコンゴムを流し込んだ後、硬化させることによって電極が配置されている部分に高さ２５μmの凹面を持つシリコンゴムを作製した。
【０１２８】
電極基板とシリコンゴム流路を、電極基板上の電極が配置されている領域にシリコンゴム凹面があうように２液硬化型シリコンゴムで接着し、流路上流部に、溶液注入用のシリンジを差し込み、該電極基板に、電極上を分子が溶解している溶液を送流させる装置を付加した。
【０１２９】
図６」に、作製した流路を有する電極基板の模式図を、また、図７に、そのａ−ａ’断面の模式図を夫々示す。尚、図６に於いて、１は電極を示し、矢印は２種以上の分子が溶解した溶液が移動する方向を示す。
【０１３０】
実施例１ 誘電泳動クロマトグラフィー装置（Field-Flowfracttionation装置）を用いたビオチン分子の検出誘電泳動分離向上物質としてλDNAを用いてビオチン分子をλDNAに結合させたビオチン化λDNAに、フルオレセイン標識した抗ビオチン抗体を混合して抗原抗体反応を行った後、誘電泳動クロマトグラフィー装置を用いてビオチン分子の定量検出を行った。
【０１３１】
（試料）フォトビオチンラベリングキット（ニッポンジーン社）を用い、添付の作製手順にしたがって、λDNAにビオチンを結合させたビオチン化λDNAを作製後、次表１に示すような割合で各種成分を50mM PBS（pH7.5）中で混合し、抗原抗体反応を行なった。また、各種試料の全λDNA濃度は、ビオチン濃度128nMサンプル(試料番号5)のビオチン化λDNA濃度である0.32nMになるように、ビオチン化されていないλDNAを加えることによって調製を行った。
【０１３２】
【表１】
上記抗原抗体反応後、分子量5万の限外ろ過フィルターを用いて媒質を2.5mM炭酸緩衝液（ｐH10）に置換して試料とした。
【０１３３】
（操作）上記反応溶液を、参考例 ２で作製した流路を有する電極基板に、マイクロシリンジポンプ（（株）アイシス製、KSD100）を用いてサンプル導入口から流速800μm／secで送流した。印加する電界は周波数１MHzで、電界強度（＝印加電圧：最小ギャップ7μmで定義）は0.9MV/mを用いた。
【０１３４】
当該電極基板上のサンプル導入口から、上記分子試料を夫々導入し、導入後30秒〜80秒まで所定の電界を印加して流路出口付近での蛍光量を測定した。
【０１３５】
尚、測定は、共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス工業(株)製、LSM-GB200）を用いて流路出口付近での流路部分の蛍光画像を約5秒毎に取り込み、全ピクセルの輝度値の総和により測定した（以下、単に蛍光量と呼ぶ。）。尚、当該測定では、完全な共焦点像を用いると、流路の深さ方向に蛍光強度の分布があった場合、正確な結果が得られないため、レーザー顕微鏡のフォトマル側のオリフィスを全開にし、深さ方向の蛍光も積分して観察できるようにした。
【０１３６】
捕集率は、以下の式１から算出した。
【０１３７】
即ち、当該測定に於いて、蛍光標識された分子試料はシリンジポンプにより電極構造上を移動するので、電界を印加しない場合、電極出口で測定される蛍光量は入口での蛍光量に等しいが、電界を印加し、
分子が誘電泳動力によって電極に引き付けられれば蛍光量は低下する。従って、この蛍光量の低下分を電極に捕集された分子の量とみなし、元の分子の総量を100とした時の電極部分に引き付けられた分子の量を示すものとした。
【０１３８】
【式１】
（結果）図８にその結果を示す。この実験で用いた電界強度0.9MV/mにおけるそれぞれの分子の捕集率はλDNAで約100%、Fluorescein標識抗ビオチン抗体では0%であった。ビオチン濃度0pMの時、Fluorescein標識抗ビオチン抗体が認識するビオチン化λDNA分子がないため、電極に標識抗体がトラップされず捕集率はほぼ０％を示している。ビオチン化λDNAを添加した場合、Fluorescein標識抗ビオチン抗体がビオチンと抗原抗体反応によって結合するため、電極にトラップされたビオチン化λDNAと共に複合体形成した標識抗体も電極上にトラップされることとなる。よって、ここで示される捕集率は試料に含まれる全標識抗ビオチン抗体の内、ビオチン化λDNAに結合した抗体の割合を示しているといえる。ここでビオチン濃度0〜3.2nMにおいてはビオチン濃度の上昇に比例して捕集率が上昇しており、抗原を定量的に検出しているといえる。また、ビオチン濃度を3.2nM以上添加した試料では捕集率の上昇が殆ど見られず約30%程度であった。この理由として、今回用いたFluorescein標識抗ビオチン抗体の抗体価が低く、ビオチンに結合し得る抗体が全抗体の内30%程度しかなかったからではないかと考えている。
【０１３９】
現在まで誘電泳動クロマトグラフィーによるビオチン‐フルオレセイン標識抗ビオチン抗体複合体と未反応のフルオレセイン標識抗ビオチン抗体の分離は、複合体と未反応の抗体との間に誘電泳動分離に十分な大きさの差がない事から不可能であり、ビオチンの複合体を検出することは出来なかった。上記の結果は、分離向上物質を適用することにより、今まで検出出来なかった分子を誘電泳動クロマトグラフィーにより定量検出することを可能にし得ることを示している。
【０１４０】
実施例２ 抗体結合ラテックスビーズを分離向上物質として用いたαフェトプロテイン（AFP）の検出抗α-フェトプロテイン（AFP）抗体A4-4を吸着させたラテックスビーズに、AFPを反応させ、更にA4-4とはエピトープを異にするフルオレセイン標識抗AFP抗体WA1 Ｆａｂ′を反応させた複合体を形成させた後、この複合体と複合体を形成していないフルオレセイン標識抗AFP抗体WA1を電極上にて分離することによってAFPの検出を行った。
【０１４１】
２−１ バッファ中AFPの検出（試薬）
抗AFP抗体結合ラテックスビーズの作製：自製の抗AFP抗体A4-4 1.2mgと直径120nmラテックスビーズ（積水化学工業（株）試薬用ラテックスN-100）10mgをクエン酸（pH3）溶液中で混合した後、遠心分離によってビーズを沈殿として回収した。回収したビーズを2.5％ BSA溶液に懸濁させることによってラテックス表面のブロッキングを行い抗AFP抗体A4-4を吸着させたラテックスビーズの作製を行った。これにより、1mg ラテックスビーズに123μgの抗AFP抗体A4-4の吸着したラテックスビーズを作製した。
【０１４２】
フルオレセイン標識抗AFP抗体WA1Ｆａｂ′の作製：抗AFP抗体WA1 40mgをペプシン消化した後、2-アミノエタンチオール（和光純薬（株）にて還元し、15mgのＦａｂ′を作製した。15mgの抗AFP抗体WA1Ｆａｂ′と150μgのフルオレセインイソチオシアネート（和光純薬工業（株）社）を10mlの炭酸緩衝液（pH9）溶液中で混合した後、NAP-25カラム(アマシャムファルマシアバイオテク社)を用いてフルオレセイン標識抗AFP抗体WA1Fabを作製した。
【０１４３】
反応：次表２に示すように各種成分を50mM PBS（pH7.5）中で混合し、室温2時間放置することによって抗原抗体反応を行なった。
【０１４４】
【表２】
抗原抗体反応後、この溶液を蒸留水で100倍に希釈して誘電泳動分離を行った。
【０１４５】
（操作）上記の溶液20μlを参考例1記載の誘電泳動電極に滴下して22mm角のカバーガラスで覆い、電界印加前と電界印加中の蛍光画像を共焦点レーザー顕微鏡を用いて取りこんだ。印加電界は周波数100ｋHz、電界強度1.4MV/mとした。
【０１４６】
蛍光画像の解析は画像解析ソフトScion Imageを用いて行った。電界印加前及び電界印加中の蛍光画像の色調階調を平均化した後、電界印加中の画像から電界印加前の画像の色調を引く事によって、電界印加によって蛍光が増加した部分のみを表示した。蛍光増加した部分のデンシトグラムを取ることによって蛍光増加量を画像出力濃度値としてあらわした。
【０１４７】
（結果）電極上での誘電泳動の結果ビーズは負の誘電泳動力を受けるため電界強度の低い領域に移動し、未反応のフルオレセイン標識抗AFP抗体WA1 Fab'を含む他の生体分子は正の誘電泳動を受けて電界強度の高い領域に移動することによって、抗AFP抗体結合ラテックスビーズ‐AFP‐フルオレセイン標識抗AFP抗体WA1 Fab'複合体と未反応のフルオレセイン標識抗AFP抗体WA1 Fab'を電極上で分離することができた。
【０１４８】
図９はAFP0.35μM添加時の電極上での電界印加前と電界印加中のレーザー顕微鏡から取りこんだ蛍光画像である。AFPが存在するサンプルでは電界印加時に負の誘電泳動力によってアルミ電極上に蛍光が集まっているが、AFP無添加サンプルでは電界印社製)にストレプトアビジンを固定化した。プローブDNAとしては、5'ビオチン標識した5'-CTATGACTGTACGCCACTGTCC-3'プライマー及び、5'-CAATCACCAACCCAGAAAACAATG-3'プライマーを用いてλDNAのほぼ中間の2kbの配列をPCRによって増幅したものを用い、これをストレプトアビジン固定化ビーズと反応させることによって、2kb DNA結合ラテックスビーズを作製した。
加前と電界印加中の画像に変化は見られない。この画像をScion Imageを用いて処理し、蛍光増加したバンド部分のデンシトグラムを取り、蛍光増加量を画像出力濃度値としてあらわした。図１０はAFP濃度と蛍光増加量の関系を示したものである。
【０１４９】
図１０の結果から、AFP添加濃度と画像出力濃度値に良好なDose responseが見られ、AFPの定量検出が可能となることが分った。
【０１５０】
２−２ 血清中のAFPの検出（試薬）2‐1と同じ試薬を用いた。
【０１５１】
反応：前記表２に示すように各種成分をAFPの存在しない正常血清を用いて調製した後、室温2時間放置することによって抗原抗体反応を行なった。
【０１５２】
抗原抗体反応後、この溶液を蒸留水で100倍希釈して誘電泳動分離を行った。
【０１５３】
（操作）2‐1と同様の操作を行った。
【０１５４】
（結果）図１１にその結果を示す。図１１から、AFP存在範囲内で良好な定量性が得られているといえる。このことから、サンプルを血清にしても誘電泳動に大きな影響を与えず血清中の目的タンパクの検出が行えることが分った。
【０１５５】
以上の結果から、ラテックスビーズのように負の誘電泳動を示す物質を分離向上物質として用いることによって、正の誘電泳動を示す生体成分を誘電泳動電極上で分離することができ、現在まで誘電泳動では不可能であったタンパク分子レベルの定量的な分離検出が可能となった。
【０１５６】
実施例３ プローブDNA結合ラテックスビーズを分離向上物質として用いたλDNAの検出（試料）
2kbDNAプローブ結合ラテックスビーズの作製：プローブDNAを固定化するストレプトアビジンビーズを作製するためにCarbodiimideKit for Carboxylated Microparticles(Polysciences社製)を用いて直径2μmのカルボキシレートラテックスビーズ(PolySciences社製)を用いて直径2μmのカルボキシレートラテックスビーズ(PolyScience社製)にストレプトアビジンを固定化した。プローブDNAとしては、5'ビオチン標識した5'-CTATGACTGTACGCCACTGTCC-3'プライマー及び、5'-CAATCACCAACCCAGAAAACAATG-3'プライマーを用いてλDNAのほぼ中間の2kbの配列をPCRによって増幅したものを用い、これをストレプトアビジン固定化ビーズと反応させることによって、2kb DNA結合ラテックスビーズを作製した。
【０１５７】
作製した2kb DNA結合ラテックスビーズを0.3N ＮａＯＨで室温5分静置して2kbDNAを変性1本鎖化し、遠心分離によってビーズを沈殿させた後、再度ビーズを0.3NＮａＯＨ溶液に懸濁させた。最終濃度0.3NになるようにＨＣｌ溶液を添加することによって中和を行い2kb DNAプローブ結合ラテックスビーズとした。
【０１５８】
λDNA及びT7DNAの標識と変性1本鎖化：λDNA及びλDNAと異なる配列を有するT7DNAをLabel IT Nucleic Acid Labeling Kitを用いて夫々フルオレセイン(緑色蛍光)およびCy3（モレキュラープローブ社製：赤色蛍光)標識した。標識されたDNAは0.3NNaOHで室温5分静置することによって変性1本鎖化した後、最終濃度0.3NになるようにHCl溶液を添加することによって中和を行った。
【０１５９】
ハイブリダイゼーション反応：SSCバッファー中にて0.05％(ｗ/v)の2kb DNAプローブ結合ラテックスビーズに最終濃度20μg/ml濃度になるように標識1本鎖化λDNA及びT7DNAを添加し、68℃18時間ハイブリダイゼーション反応を行なった。ハイブリダイゼーション反応後のサンプル溶液は蒸留水にて100倍希釈後、誘電泳動分離を行った。
（操作）実施例２の2-1と同様の操作を行った。但し、この時の電界は周波数3MHz、電界強度0.9MV/mとした。
（結果）図１２にその結果を示す。
【０１６０】
ハイブリダイゼーション後の溶液を蛍光顕微鏡観察したところλDNA標識を行ったCy3の蛍光のみがビーズ上に観察された。この溶液を誘電泳動電極上に滴下した後電界印加したところ、ラテックスビーズが負の誘電泳動力を受けて電界強度の低い領域に移動するため、2kb DNAプローブ結合ビーズに結合したCy3標識λDNAの蛍光が電界強度の低い領域に観察され、2kb DNAプローブ結合ビーズに結合していないフルオレセイン標識T7 DNAの蛍光は正の誘電泳動によって電界強度の高い領域に移動するため、電極エッジ部分に観察された。即ち、ラテックスビーズを誘電泳動分離向上物質として用いることによって、多数の分子種の中から特定のDNA分子を分離検出出来ることが証明された。
【０１６１】
以上の結果より誘電泳動分離向上物質が物質検出のための誘電泳動分離に有用である事がわかる。
【０１６２】
実験例 １ 電極上に於ける分子の観察（１）DNA分子の観察ハンドブック・オブ・フルオレッセント・プローブス・アンド・リサーチ・ケミカルズ、リチャードＰ．ホーグランド、シックス・エディション、モレキュラー・プローブ社、（1996）に記載の方法に準じて、蛍光試薬YO-PRO-1（モレキュラー・プローブ社製商品名）で標識したλDNA（48.5kb、2本鎖DNA）0.001mgを含有する超純水溶液１ml、及び常法により短鎖DNAとして合成時に末端を蛍光色素フルオロセインにより標識したオリゴヌクレオチド（22base、1本鎖DNA：自製品）0.002mgを含有する超純水溶液１mlを、夫々DNA試料として用いた。
【０１６３】
参考例 １で作製した電極基板上で、DNA分子が誘電泳動されるか否かを調べるため、上記DNA試料（標識λDNA又は標識オリゴヌクレオチド）を夫々当該電極基板上に10μl滴下し、電極に周波数１MHzの交流電圧を徐々に印加し、蛍光顕微鏡下でDNA試料の蛍光を観察した。
【０１６４】
その結果、電極と電極の最小ギャップ間の電界強度が500KV/m付近からλDNAが誘電泳動によって強電界部分に集まり始めるのが観察されたが、この電界強度では、オリゴヌクレオチドが誘電泳動によって強電界部分に集合する様子は観察されなかった。
【０１６５】
（２）タンパク分子の観察ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、H．マエダ、65、777、（1969）に記載の方法に準じて、蛍光試薬FITC（フルオレセインイソチオシアネート、和光純薬工業（株）製）で標識したIgM（分子量約900kDa）0.1mg含有する超純水溶液、及びジャーナル・オブ・バイオケミストリー、H．マエダ、65、777、（1969）に記載の方法に準じて、蛍光試薬TRITC（テトラメチルローダミンイソチオシアネート、和光純薬工業（株）製）で標識したBSA（分子量約65kDa）0.1mgを含有する超純水溶液を、夫々タンパク試料として用いた。
【０１６６】
当該電極上で、タンパク分子が誘電泳動されるか否かを調べるため、上記タンパク試料（標識IgM又は標識BSA）を夫々電極基板上に10μl滴下し、電極に周波数１MHzの交流電圧を徐々に印加し、蛍光顕微鏡下でタンパク試料の蛍光を観察した。
【０１６７】
その結果、電極と電極の最小ギャップ間の電界強度が1.0MV/m付近からFITC標識IgMが電界の強い部分に集まり始めるのが観察されたが、この電界強度では、TRITC標識したBSAは誘電泳動によって強電界部分に集合する様子は殆ど観察されなかった。
【０１６８】
実験例 ２ 流路を有する電極基板を用いた分子の分析（試料）実験例 １で用いた標識λDNA溶液及び標識オリゴヌクレオチド溶液を分子試料とした。
【０１６９】
（操作）上記分子溶液を、参考例 ２で作製した流路を有する電極基板に、マイクロシリンジポンプ（（株）アイシス製、KSD100）を用いてサンプル導入口から流速800μm／secで送流した。印加する電界は周波数１MHzで、電界強度（＝印加電圧：最小ギャップ7μmで定義）は数百k〜数MV/m を用いた。
【０１７０】
当該電極基板上のサンプル導入口から、上記分子試料（標識λDNA 10μg／ml又は標識オリゴヌクレオチド 0.56pg／ml）を夫々導入し、導入後30秒〜80秒まで所定の電界を印加して流路出口付近での蛍光量を測定した。
【０１７１】
尚、測定は、共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス工業(株)製、LSM-GB200）を用いて流路出口付近での流路部分の蛍光画像を約5秒毎に取り込み、全ピクセルの輝度値の総和により測定した（以下、単に蛍光量と呼ぶ。）。尚、当該測定では、完全な共焦点像を用いると、流路の深さ方向に蛍光強度の分布があった場合、正確な結果が得られないため、レーザー顕微鏡のフォトマル側のオリフィスを全開にし、深さ方向の蛍光も積分して観察できるようにした。
【０１７２】
捕集率は、前記式１から算出した。
【０１７３】
即ち、当該測定に於いて、蛍光標識された分子試料はシリンジポンプにより電極構造上を移動するので、電界を印加しない場合、電極出口で測定される蛍光量は入口での蛍光量に等しいが、電界を印加し、
分子が誘電泳動力によって電極に引き付けられれば蛍光量は低下する。従って、この蛍光量の低下分を電極に捕集された分子の量とみなし、元の分子の総量を100とした時の電極部分に引き付けられた分子の量を示すものとした。
【０１７４】
（結果）標識?DNA溶液を用いて、電界強度0.60MV／m又は1.04MV／mを印加した場合の流路出口での蛍光量の時間変化を図１３に、また、標識オリゴヌクレオチド溶液を用いて、電界強度1.4MV／mを印加した場合の流路出口での蛍光量の時間変化を図１４に夫々示す。尚、図１３に於いて、−○−は、電界強度0.60MV／mを印加した場合の結果を、また、−●−は、電界強度1.04MV／mを印加した場合の結果を夫々示す。
【０１７５】
図１３から明らかなように、標識?DNA溶液を用いて、電界強度1.04MV/m を印加した場合には、電界が十分に強く、全ての?DNAが電極に捕集されるため、流路出口での蛍光量は、ほぼ0にまで低下することが判る。尚、80秒後に一時的に蛍光量が増加するのは、電界を切ったために、それまで電極部分に蓄積されていたDNA分子が放出されるため、一時的に初期状態よりも大きな蛍光量を示すようになるからであり、捕集されていたDNAが流出し終わるともとの蛍光量に戻っている。また、標識?DNA溶液を用いて、電界強度0.60MV／mを印加した場合も、同様の傾向がみられるが、電界印加時（30秒〜80秒の間）で蛍光量が0にはならないこと、換言すれば、電界強度が十分でないため、完全にDNAが捕集されていないことが判る。尚、実験例 １では、電界強度0.5MV/mでλDNAは強電界領域に強く捕集されていたが、本実験では流路内の流れによる抗力が加わるため電極上で同様の分子の捕集能を得ようとした場合、流れのないときよりもより強い電界強度が必要となることが判る。
【０１７６】
また、図１４から明らかなように、標識オリゴヌクレオチド溶液を用いて、電界強度1.4MV/mを印加した場合には、蛍光量の低下が全く見られないこと、即ち、当該電界強度では、当該オリゴヌクレオチドが全く捕集されないことが判る。
【０１７７】
以上の結果から、λDNAとオリゴヌクレオチドとを分離できることが示唆された。
【０１７８】
実施例 ４ 溶液中のDNA分子の分離λDNA（48.5kb、2本鎖DNA）及びオリゴヌクレオチド（22 base、1本鎖DNA）が溶解した溶液から、夫々の成分の分離を行った。
【０１７９】
（試料）蛍光試薬YO-PRO-1で標識したλDNA（48.5kb、2本鎖DNA）５μg／mlと、短鎖DNAとして合成時に末端を蛍光色素フルオロセインにより標識したオリゴヌクレオチド（22base、1本鎖DNA）2.3pg／mlとが、互いに等しい蛍光量を発することを、予め蛍光強度測定により確認した。この結果に基づいて、次表３に示すように、標識オリゴヌクレオチド及び標識λDNAを所定濃度含有する超純水溶液を夫々試料とした。
【０１８０】
【表３】
【０１８１】
（操作）試料を、参考例 ２で作製した流路を有する電極基板に、マイクロシリンジポンプ（（株）アイシス製、KSD100）を用いてサンプル導入口から流速800μm／secで送流した。印加する電界は周波数１MHzで、電界強度0.86MV/m又は1.02MV/mを用い、試料導入後30秒〜80秒まで所定の電界を印加して流路出口付近での標識λDNAの蛍光量を測定した。尚、測定及び捕集率は、実験例 ２と同様に求めた。
【０１８２】
（結果）結果を図１５に示す。尚、図１５に於いて、−○−は、標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が０：１の試料を用いた結果を、−□−は標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が１：１の試料を用いた結果を、−＋−は、標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が５：１の試料を用いた結果を、また、−×−は、標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が１：０の試料を用いた結果を夫々示す。
【０１８３】
本実施例に於いて、全ての?-DNAが捕集され、オリゴヌクレオチドが全く捕集されない場合を考えると、捕集率は、試料全体の蛍光量に占める?DNAに由来する蛍光量の割合に等しくなる。即ち、試料1（標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が０：１の試料）では捕集率が100%、試料2（標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が１：１の試料）では1/(1+1)=50%、試料3（標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が５：１の試料）では1/(1+5)=16.7%、試料4（標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が１：０の試料）では0となるはずである。
【０１８４】
図１５の結果から、電界強度 0.86MV/mを印加した場合、?DNAの捕集率（試料１）は53%であり、オリゴヌクレオチド（試料４）は全く捕集されないことが判る。また、試料２（?DNA：オリゴヌクレオチド＝１：１のサンプル）で約半分の20％強、試料３（?DNA：オリゴヌクレオチド＝１：５のサンプル）で10％弱の捕集率が得られており、試料１の捕集率53％から計算される理論値（試料２：53％÷1／(1+1)＝26.5％、試料３：53％÷1／(1+5)＝8.8％）とほぼ一致していることが判る。
【０１８５】
また、電界強度1.02MV/mを印加した場合、?DNAのみ（試料１）では100%の捕集率、オリゴヌクレオチドのみ（試料４）ではほとんど捕集されないことが判る。また、試料２では捕集率が60%、試料３では約20%となり、上記の理論値50%、16.7%とほぼ一致していることが判る。このことから、本発明の方法により、?DNAとオリゴヌクレオチドとを、数十秒という短時間で分離し得ることが判る。
【０１８６】
以上の結果から、分離したい分子と、共存する分子との組み合わせにより、適切な電界強度を選択することによって、２種以上の分子を分離することができるようになることが判る。
【０１８７】
実施例 ５ 溶液中のタンパク分子の分離IgM（分子量約900kDa）及びBSA（分子量約65kDa）が溶解した溶液から、夫々の成分の分離を行った。
【０１８８】
（試料）蛍光試薬FITCで標識したＩｇＭ（分子量約900kDa）0.1mg／ml及び、蛍光試薬TRITCで標識したBSA（分子量約65kDa）0.1mg／mlを含有する超純水溶液を試料とした。
【０１８９】
（操作）流速を400μm/sec、印加する電界強度を1.42MV／m、1.78MV／m又は2.14MV／mとした以外は、実施例
１と同様にして、標識ＩｇＭ及び標識BSAの蛍光量を同時に測定し夫々の捕集率を求めた。
【０１９０】
（結果）結果を図１６に示す。尚、図１６に於いて、−○−は、標識IgMの捕集率を、また、−●−は、標識BSAの捕集率を夫々示す。
【０１９１】
図１６の結果から明らかなように、ＩｇＭ、BSAともに電界強度を上昇させるにしたがって捕集率が上昇し、2.14MV/mの電界強度でＩｇＭでは捕集率約68.5％、BSAでは捕集率38％となり、明らかにその分子量の違いによって捕集率に違いが見られることが判る。
【０１９２】
尚、今回用いた電界強度では完全にタンパク分子を捕集することはできなかったが、タンパク分子の違いにより捕集率に有意差が見られたことから、分離電極部分をさらに延長することによって、ＩｇＭとBSAとの分離が可能になることが容易に予測できる。これによりタンパク分子レベルの大きさの違いによっても本発明の方法により分離が可能であることが示唆される。
【０１９３】
実施例 ６ 抗原抗体反応後のB/F分離ビオチン標識したλDNAとフルオレセイン標識した抗ビオチン抗体を混合して抗原抗体反応を行った溶液から、ビオチン標識λDNA−フルオレセイン標識抗ビオチン抗体複合体分子とビオチン標識λDNAに結合していない遊離のフルオレセイン標識抗ビオチン抗体の分離を行った。
【０１９４】
（試料）フォトビオチンラベリングキット（ニッポンジーン社製）を用い、添付の作製手順にしたがってビオチン標識λDNAを作製後、次表４に示すような比率で各種成分を50mM PBS（pH7.5）中で混合し、抗原抗体反応を行わせた。抗原抗体反応後、分子量5万の限外ろ過フィルターを用いて媒質を2.5mM 炭酸緩衝液（ｐH10）に置換し、これを試料とした。
【０１９５】
尚、21μg/mlのフルオレセイン標識抗ビオチン抗体（コスモバイオ（株））濃度は10μg/mlビオチン標識λDNA中のビオチンモル数と等しい量である。
【０１９６】
【表４】
【０１９７】
（操作）電界強度を1.07MV/mとして実施例2と同様の操作を行い、複合体分子中のフルオレセイン標識抗ビオチン抗体及び遊離のフルオレセイン標識抗ビオチン抗体の蛍光量を測定し、複合体分子の捕集率を求めた。
【０１９８】
（結果）結果を図１７に示す。図１７の結果から明らかなように、複合体分子の捕集率が、ビオチンλDNA濃度10μg/mlでは捕集率36％、5μg/mlでは捕集率25％、2.5μg/mlでは捕集率8.9％、0μg/mlでは捕集率６％となり、ビオチン標識λDNAの濃度低下とともにその捕集率も低下することが判る。また、λDNAを100％捕集するのに十分な誘電泳動条件において、試料１のビオチン標識されていないλDNAを添加した場合の捕集率が6％であるのに対し、試料2、3、4のビオチン標識λDNAを添加したものでは有意にそれよりも高い捕集率を示したことから、フルオロセイン標識抗ビオチン抗体とビオチン標識λDNAの抗原抗体反応による複合体分子と、ビオチン標識λDNAに結合していない遊離のフルオレセイン標識抗ビオチン抗体の分離が、ある程度の濃度依存性を持って行えることが判る。
【０１９９】
【発明の効果】
以上述べた如く、本発明の第一の方法によれば、分離向上物質を含む複合体物質を形成させるという従来行われていなかった方法によって、従来分離し得なかった溶液中に溶解する２種以上の分子を誘電泳動力によって分離することに初めて成功したものであり、それ故極めて画期的な発明である。
【０２００】
また本発明の第二の方法は、従来行われていなかった強電界強度の誘電泳動力を利用して、従来分離し得なかった溶液中に溶解する２種以上の分子を、相互に分離することに初めて成功したものである。
【０２０１】
上記本発明によれば、従来誘電泳動力によって分離し得なかった２種以上の分子、例えばDNAやタンパク等の生体成分分子が溶解している溶液から、夫々の分子を迅速且つ容易に分離し得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】誘電泳動の原理を示す図である。
【図２】本発明に使用する電極の具体例を示す図である。
【図３】本発明に使用する流路を有する電極基板の一例を示す図である。
【図４】参考例 １で作製した誘電泳動電極基板の模式図である。
【図５】参考例 １で作製した電極の模式図である。
【図６】図６は、参考例
２で作製した流路を有する電極基板の模式図である。
【図７】図６のａ−ａ’断面の模式図である。
【図８】図８は、実施例１で得た、ビオチン濃度と捕集率との関係を示すグラフである。
【図９】実施例２で得た、電極上での電界印加前と電界印加中のレーザー顕微鏡から取り込んだ蛍光画像を示すものである。
【図１０】実施例２で得た、ＡＦＰ濃度と画像出力濃度との関係を示すグラフである。
【図１１】実施例２で得た、血清中のＡＦＰ濃度と画像解析濃度との関係を示すグラフである。
【図１２】実施例 ３で得た、電界印加前と電界印加中の電極基板の模式図及び電界印加中の蛍光顕微鏡写真を示すものである。
【図１３】実験例 ２で得た、標識?DNA溶液を用いて実施した流路出口での蛍光量の時間変化を示すグラフである。
【図１４】実験例 ２で得た、標識オリゴヌクレオチド溶液を用いて実施した流路出口での蛍光量の時間変化を示すグラフである。
【図１５】実施例 ４で得た、電界強度と標識λDNAの捕集率との関係を示すグラフである。
【図１６】実施例 ５で得た、電界強度と標識ＩｇＭ又は標識BSAの捕集率との関係を示すグラフである。
【図１７】実施例 ６で得た、ビオチン標識λDNA濃度と捕集率との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
図３に於いて、矢印は２種以上の分子が溶解した溶液が移動する方向を示す。図４に於いて、１は電極を示す。図６に於いて、１は電極を示し、矢印は２種以上の分子が溶解した溶液が移動する方向を示す。図７に於いて、各数字は夫々以下のものを示す。
１：流路
２：ガラス板
３：電極図１３に於いて、−○−は、電界強度0.60MV／mを印加した場合の結果を、また、−●−は、電界強度1.04MV／mを印加した場合の結果を夫々示す。図１５に於いて、−○−は、標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が０：１の試料を用いた結果を、−□−は標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が１：１の試料を用いた結果を、−＋−は、標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が５：１の試料を用いた結果を、また、−×−は、標識オリゴヌクレオチドとλDNAとの混合比が１：０の試料を用いた結果を夫々示す。図１６に於いて、−○−は、標識ＩｇＭの捕集率を、また、−●−は、標識BSAの捕集率を夫々示す。
Claims (15)
- 試料中の「特定分子」から、該「特定分子」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質を形成させ、次いで該複合体物質を含む反応物を誘電泳動に付し、不均一電界により生ずる誘電泳動力を利用して、前記複合体物質を移動させ、該複合体物質と前記試料中に含まれる「特定分子」以外の分子とを異なる移動速度とするか、または該複合体物質と「特定分子」以外の分子とを異なる電解領域に夫々移動させることによって、該複合体物質と前記試料中に含まれる「特定分子」以外の分子とを誘電泳動力によって分離する方法。
- 前記複合体物質と前記「特定分子」以外の分子とを異なる移動速度として、該複合体物質と「特定分子」以外の分子とを異なる電解領域に夫々移動させる請求項１記載の誘電泳動力によって分離する方法。
- 試料中の「特定分子」から、該「特定分子」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質を形成させ、次いで該複合体物質を含む反応物を不均一電界を用いる誘電泳動に付し、不均一電界により生ずる誘電泳動力を利用して、前記複合体物質を移動させ、該複合体物質と前記試料中に含まれる「特定分子」以外の分子とを異なる移動速度とするか、または該複合体物質と「特定分子」以外の分子とを異なる電解領域に夫々移動させることによって、該複合体物質と前記試料中に含まれる「特定分子」以外の分子とを誘電泳動力によって分離し、分離した前記複合体物質中の「特定分子」若しくは「特定分子」以外の分子を測定する試料中の成分含有量測定方法。
- 前記複合体物質と前記「特定分子」以外の分子とを異なる移動速度として、該複合体物質と分離すべき分子とを異なる電解領域に夫々移動させる請求項３記載の試料中の成分含有量測定方法。
- 前記「特定分子」が「測定対象分子」であり、前記複合体物質中の「測定対象分子」の含有量を測定する請求項３又は４記載の測定方法。
- 「特定分子」を含む試料と、「特定分子と結合する物質」と、「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とを接触させ、次いで得られた「特定分子」と「特定分子と結合する物質」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質を含む反応物を不均一電界を用いる誘電泳動に付し、不均一電界により生ずる誘電泳動力を利用して、前記複合体物質を移動させ、該複合体物質と前記試料中に含まれる「特定分子と結合する物質」とを異なる移動速度とするか、または該複合体物質と「特定分子と結合する物質」とを異なる電解領域に夫々移動させることによって、該複合体物質と前記複合体物質形成に関与しなかった「特定分子と結合する物質」とを誘電泳動力によって分離する方法。
- 前記複合体物質と前記「特定分子と結合する物質」とを異なる移動速度として、該複合体物質と分離すべき分子とを異なる電解領域に夫々移動させる請求項６記載の誘電泳動力によって分離する方法。
- 「特定分子」を含有する試料と、「特定分子と結合する物質」と、「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とを接触させ、次いで得られた「特定分子」と「特定分子と結合する物質」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質を含む反応物を不均一電界を用いる誘電泳動に付し、不均一電界により生ずる誘電泳動力を利用して、前記複合体物質を移動させ、該複合体物質と前記試料中に含まれる「特定分子と結合する物質」とを異なる移動速度とするか、または該複合体物質と「特定分子と結合する物質」とを異なる電解領域に夫々移動させることによって、該複合体物質と前記複合体物質形成に関与しなかった「特定分子と結合する物質」とを誘電泳動力によって分離し、分離された前記複合体物質中の「特定分子と結合する物質」を測定し、その結果に基づいて試料中の特定分子の存在の有無を検出することを特徴とする試料中の特定分子の検出方法。
- 前記複合体物質と前記「特定分子と結合する物質」とを異なる移動速度として、該複合体物質と分離すべき分子とを異なる電解領域に夫々移動させる請求項８記載の試料中の特定分子の検出方法。
- 「特定分子」を含有する試料と、「特定分子と結合する物質」と、「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とを接触させ、次いで得られた「特定分子」と「特定分子と結合する物質」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との複合体物質を含む反応物を不均一電界を用いる誘電泳動に付し、不均一電界により生ずる誘電泳動力を利用して、前記複合体物質を移動させ、該複合体物質と前記試料中に含まれる「特定分子と結合する物質」とを異なる移動速度とするか、または該複合体物質と「特定分子と結合する物質」とを異なる電解領域に夫々移動させることによって、該複合体物質と前記複合体物質形成に関与しなかった「特定分子と結合する物質」とを誘電泳動力によって分離し、分離された前記複合体物質中の「特定分子」若しくは「特定分子と結合する物質」、又は前記複合体物質形成に関与しなかった「特定分子と結合する物質」を測定することを特徴とする試料中の成分含有量測定方法。
- 前記複合体物質と前記「特定分子と結合する物質」とを異なる移動速度として、該複合体物質と分離すべき分子とを異なる電解領域に夫々移動させる請求項１０記載の試料中の成分含有量測定方法。
- 「特定分子」を含む試料と、「標識物質により標識された特定分子」と、「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」とから、「標識された特定分子」と「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」との標識複合体物質を形成させ、次いで不均一電界を用いる誘電泳動に付し、不均一電界により生ずる誘電泳動力を利用して、前記「特定分子」を含む標識複合体物質を移動させ、該複合体物質と前記試料中に含まれる遊離の標識された「特定分子」とを異なる移動速度とするか、または該複合体物質と遊離の標識された「特定分子」とを異なる電解領域に夫々移動させることによって、分離した前記標識複合体物質中の標識された「特定分子」若しくは遊離の標識された「特定分子」を測定する試料中の成分測定方法。
- 前記「特定分子」を含む試料が、生体由来試料又は該生体由来試料の処理物である請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。
- 前記「特定分子の誘電泳動特性を変化させ得る物質」が、前記「特定分子」との結合により、「特定分子」をそれと共存する物質から誘電泳動処理により分離可能ならしめるような誘電泳動特性を「特定分子」に与え得るものである請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
- 前記「特定分子と結合する物質」が、「抗原」−「抗体」間反応、「糖鎖」−「レクチン」間反応、「酵素」−「インヒビター」間反応、「蛋白質」−「ペプチド鎖」間反応又は「染色体又はヌクレオチド鎖」−「ヌクレオチド鎖」間反応により特定分子と結合するものである請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
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