CN107486027A - 一种用于分离液体中肿瘤细胞的复合膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于分离液体中肿瘤细胞的复合膜及其制备方法，所述复合膜包括径迹蚀刻膜和以直接或间接方式连接在径迹蚀刻膜的膜表面上和/或孔道内的用于与肿瘤细胞进行特异性结合的一种或多种抗体分子，所述径迹蚀刻膜与抗体的连接中包括一处以上的化学连接，所述径迹蚀刻膜孔径为5～28微米，径迹蚀刻膜上尺寸均匀的孔道用于滤过液体中的组分而将肿瘤细胞截留在径迹蚀刻膜的一侧，所述径迹蚀刻膜上连接的抗体分子同样用于将肿瘤细胞免疫截留在径迹蚀刻膜上。本发明结合了免疫分离和按大小物理分选的双重截留分离作用，和现有的液体中肿瘤细胞分选方法相比，显著提高了目的肿瘤细胞分离的敏感性和效率。

Description

一种用于分离液体中肿瘤细胞的复合膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及过滤膜领域，具体涉及一种用于分离液体中肿瘤细胞的复合膜及其制备方法。
背景技术
恶性肿瘤俗称为癌症，目前已经成为我国居民死亡的首要原因，严重影响人民群众的身体健康。恶性肿瘤主要具有两个特性：一是永生性，恶性肿瘤细胞可以无限传代分裂，失去了生长的控制；二是侵袭转移的特性。肿瘤细胞从原发灶脱离经过一系列复杂的生物学过程到达远处器官并形成转移灶，这一过程称为侵袭转移，目前癌症之所以难以治愈，造成病人死亡的关键就在于其具有侵袭转移的特性。研究表明癌症致死，90％以上是由于侵袭转移引起的，而不是原发灶肿瘤对原发器官的损害。另外，在某些早期恶性肿瘤患者的外周血中就可以检测到循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)，在其区域淋巴结和骨髓中就能够检测到播散性肿瘤细胞(disseminated tumor cells，DTC)。大量证据表明恶性肿瘤细胞转移并不是晚期事件，其实肿瘤细胞的转移从肿瘤发生的早期就已经悄悄开始了。因此，我们是否能够有效的控制治愈癌症，其关键就在于能否有效的阻断或逆转肿瘤转移这一过程。
由于在血液中循环肿瘤细胞的数量极其稀少，所以先将外周血液标本中的CTC进行富集，然后再对CTC进行识别和分析。目前对CTC的富集、分离、分选主要涉及两类技术。第一类主要是采用免疫原理进行纯化、分选。这种方法根据抗原抗体反应，利用单克隆或者多克隆抗体与细胞膜表面的肿瘤相关抗原相结合，从而达到检测识别CTC的目的。例如利用能够与各种上皮特异性抗原(例如：细胞角蛋白、上皮粘附分子、生长因子受体等)相结合的单克隆抗体来检测识别CTC。目前基于这种技术的实验方法包括：CellSearch系统；CTC芯片；EPIthelialimmunoSPOT；MAINTRAC；胶原蛋白黏附基质法。第二类技术方法根据CTC的物理特性(密度和体积)进行分离。在对CTC的研究中，从细胞形态学的角度分析发现，大多数的外周血细胞的体积普遍要小于CTC，平均直径为8-11μm，而CTC的直径为29.8-33.9μm，仅只有少部分神经内分泌瘤、燕麦细胞癌等小细胞肿瘤所产生的CTC体积等于或小于正常外周血细胞。根据这一特性，使用一定孔径的聚碳酸酯膜对外周血样本进行滤过，体积较大的肿瘤细胞将会留在膜上，而较小的正常血液细胞将会通过滤膜，从而在聚碳酸酯膜上对肿瘤细胞进行富集，即膜滤过分离肿瘤细胞技术(Isolation by size of epithelial tumorcells,ISET)。
基于免疫原理的分离CTC的技术其核心在于对肿瘤细胞表面抗原的选择。一方面该抗原必须是肿瘤特异表达的，另一方面这种特异表达的抗原必须表达在细胞膜上。由于这种抗原抗体选择的局限性，造成了以免疫原理分选CTC的局限性。比如目前CTC芯片技术使用的抗体为EpCAM。EpCAM是上皮细胞表达的一种表面分子，在血液细胞中没有表达，但是EpCAM也不是在所有上皮肿瘤中都表达阳性。另一方面，肿瘤细胞的转移是一个复杂的动态过程，在这一过程中，肿瘤细胞中的一些细胞会丢失一些细胞膜上的上皮标志样分子，转而表达一些间质来源的分子。这一现象被称为上皮间质样变(EMT)。由于EMT现象的存在，部分肿瘤细胞会丢失原来表达的上皮标志分子，如丢失EpCAM表达，从而使得这类CTC不能被有效识别分离。总的说来，基于免疫原理分离CTC具有不可忽略的局限性。
如上所述的基于肿瘤大小分离的ISET技术是近年来国内外研究的一种新的肿瘤细胞富集技术，由Vona等人在2000年建立并最先使用于肿瘤研究领域。ISET技术核心在于CTC必须要大于正常血液细胞，应用纳米蚀刻技术制作的聚碳酸酯滤过膜(例如滤膜上均匀分布有直径为8μm大小的微孔)，对采集到的肿瘤患者外周血进行滤过，CTC因为较大的体积不能够通过滤膜上较小的孔径而被截留在膜上。由于滤膜上吸附的肿瘤细胞形态完整未受破坏，可以进行HE染色或者巴氏染色等常规病理染色方法，并直接于光学显微镜下对细胞进行观察，利用细胞病理学诊断方法来对CTC进行识别。而且分子生物学分析方法包括免疫荧光、RNA/DNA基因分析、荧光原位杂交等都能够在滤膜上进行，以此对CTC的生物学特性和侵袭潜力做进一步研究，甚至还可以利用激光显微切割技术将收集到的肿瘤细胞从膜上剥离下来，进行更深层次的基因测序等细胞学及分子生物学的研究。但上述方法具有如下缺陷：1、ISET对于尺寸小的CTC细胞毫无办法。目前ISET一般分离得到的都是成团的肿瘤细胞(CTM)，对单个的CTC分离效果不佳。2、因为对CTC的分离纯化是新近研究的，目前还处于十分前研的阶段，肿瘤细胞在转移穿透血管壁的时候大小会不会发生变化仍是未知数。3、聚碳酸酯滤过膜在孔径分布上会形成少量连孔(两个孔靠近融合)，间接增大孔径，过滤时肿瘤细胞也会有极少一部分穿透过滤膜。因此单纯凭借细胞大小分离CTC细胞会一定的风险，漏掉一些体积尺寸小的CTC。
专利申请CN201610878477.9公开一种循环肿瘤细胞快速检测试剂盒，包括循环肿瘤细胞吸附剂、细胞核特异性探针、肿瘤细胞荧光纳米探针、白细胞荧光纳米探针、微孔滤膜、缓冲液、裂解液、过滤装置等，且所述循环肿瘤细胞吸附剂是载体通过偶联剂与循环肿瘤细胞表面特异性单克隆抗体形成的载体-抗体复合物；所述的载体材料为聚乙烯醇、聚苯乙烯或聚丙烯酸酯类，性状为球状，粒径为10～100um。所述的微孔滤膜材料具体为聚碳酸酯或纤维素，孔径为5～10um，有很好的强度和可操作性。由此可见，该专利申请中先将循环肿瘤细胞与粒径较大的球状载体结合，以增大循环肿瘤细胞的尺寸，再将该增大尺寸后的循环肿瘤细胞用于含微孔滤膜的过滤装置，使得过滤装置对循环肿瘤细胞的截留率增大，以尽可能地筛查到循环肿瘤细胞。该专利申请中仍然是根据过滤膜的物理尺寸效应来分离目的细胞。
目前没有一种技术和材料能够克服这两类分离方法的缺点，而CTC的分离纯化又十分的重要，现有的材料方法已经不能满足目前的临床科研的需求。因此，本领域有必要开发一种CTC分离纯化的更有效方法。
发明内容
因此，本发明首先提供一种用于分离液体中肿瘤细胞的复合膜，所述复合膜包括径迹蚀刻膜和以直接或间接方式连接在径迹蚀刻膜的膜表面上和/或孔道内的用于与肿瘤细胞进行特异性结合的一种或多种抗体分子，所述径迹蚀刻膜与抗体的连接中包括一处以上的化学连接，所述径迹蚀刻膜孔径为5～28微米，径迹蚀刻膜上尺寸均匀的孔道用于滤过液体中的组分而将肿瘤细胞截留在径迹蚀刻膜的一侧，所述径迹蚀刻膜上连接的抗体分子同样用于将肿瘤细胞免疫截留在径迹蚀刻膜上。
本发明中物理分离和免疫分离两者联合使用，有效利用了这两种方法分离的优点，互为补充，克服了使用单一方法分离的缺点，显著提高对目的细胞的分离效果和敏感性。
本发明中，所述液体可以是血液，也可以是如骨髓、胸水、腹水等体液。所述液体为血液时，所述肿瘤细胞为循环肿瘤细胞即CTC。
本发明中，对于不同的肿瘤细胞相应可以选择不同的特异性结合的抗体。因此，本发明所述径迹蚀刻膜上连接的肿瘤细胞抗体可以是一种或多种。
在一种具体的实施方式中，所述径迹蚀刻膜上尺寸均匀的孔道的直径均为x±1μm，优选为x±0.5μm，且x为6～25μm中的任一值，最优选孔道直径为8±1μm。
本发明中，所述径迹蚀刻膜上尺寸均匀的孔道的直径均为x±1μm是指孔道直径的设计尺寸，事实上因加工等原因，例如会形成少量的双联孔或三联孔而使得膜上的某孔道尺寸明显变大，这种情况是被允许且属于本发明保护范畴的。
本发明中，径迹蚀刻膜具体可以是孔径为7微米、8微米、9微米、10微米、11微米、12微米和20微米等多种不同的型号。
本发明中使用的复合膜在用于从血液中分离CTC时，要几乎滤过所有的红细胞，因而径迹蚀刻膜的孔径需要大于等于5微米，同时为了能够有效截留肿瘤细胞，径迹蚀刻膜的孔径需要小于28微米。因此，最优的孔径为7-10微米。
在一种具体的实施方式中，所述抗体通过生物素和亲和素的连接而固定在径迹蚀刻膜上。
在一种具体的实施方式中，所述抗体依次通过生物素、亲和素、偶联剂GMBS(N-y-maleimidobutyryloxysuccinimide ester，羟基琥珀酰亚胺酸)以及硅烷偶联剂3-巯丙基三甲氧基硅烷连接在径迹蚀刻膜上。
在一种具体的实施方式中，所述抗体包括抗人EpCAM的单克隆抗体。该抗体能跟大多数种类的癌细胞的表面抗原(细胞膜上的蛋白质)进行特异性结合。
任何一种形式的分离都会出现截留效率和载量(最大承受能力)有限等问题，且任何一种单一的分离方法或复合分离方法都不可能做到100％的分离某种细胞。在本发明的复合膜中，待分离的目的细胞有可能从孔中穿过该膜，也可能被孔内的抗体截留而堵塞该孔，而绝大多数的待分离目的细胞会被截留在膜表面上。
在一种具体的实施方式中，所述径迹蚀刻膜的膜面上的膜孔总面积为膜面总面积的30％以下，优选1～20％，更优选5～15％。
在一种具体的实施方式中，所述径迹蚀刻膜为使用重离子加速器轰击高分子膜材料后经过化学蚀刻而得到的包含多个孔径均匀直孔道的膜，优选所述径迹蚀刻膜为聚酯膜或聚碳酸酯膜。
本发明还提供一种所述复合膜的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤A、先对径迹蚀刻膜采用硅烷偶联剂浸泡荡洗进行膜表面的硅烷预处理；
步骤B、对膜采用偶联剂GMBS处理，使GMBS附着于膜上；
步骤C、对膜采用亲和素处理，使得亲和素附着于GMBS上；
步骤D、对膜采用生物素化的抗体处理，使得生物素化的抗体与亲和素结合；且步骤A～D中的每个步骤后均包括清洗除去未结合或未反应的相应化学物质。
在一种具体的实施方式中，所述硅烷偶联剂为3-巯丙基三甲氧基硅烷。
本发明还提供一种用于分离血液中循环肿瘤细胞的方法，所述方法包括使用固定有复合膜的过滤器对血液进行过滤，所述复合膜包括径迹蚀刻膜滤膜和以直接或间接方式连接在滤膜上且能与目的肿瘤细胞进行特异性结合的一种或多种抗体分子；含有肿瘤细胞的血液在流经过滤器的复合膜时，其上的目的肿瘤细胞被位于膜面上和/或膜孔中的所述抗体截留，或目的肿瘤细胞被径迹蚀刻膜上直径均匀的孔道截留，而允许包括红细胞和白细胞的其它成分顺利通过该复合膜；所述复合膜中包含抗原抗体免疫分离和径迹蚀刻膜物理尺寸分离而共同截留所述循环肿瘤细胞。
在一种具体的实施方式中，所述过滤器为立体式过滤柱，过滤柱中包含一个或多个过滤子柱，且同一个过滤子柱中设置的不同复合膜的滤液流动方向不同或同一复合膜上不同位置的滤液流动方向不同。
本发明中使用的径迹蚀刻膜的厚度是12～30μm，膜厚跟孔道直径的尺寸相当或略大。本发明中使用的抗体是一种蛋白质，其尺寸一般为数十纳米以下，而亲和素以及生物素的尺寸比抗体更小，因而本发明中的抗体完全可以连接在径迹蚀刻膜的孔道中。
本发明中，使用GFP即绿色荧光蛋白是为了使得在待分离的目的细胞为活体细胞的情况下示踪检测。
本发明至少具有如下有益效果：
1、本发明首次将抗体化学交联至径迹蚀刻膜上，本发明提供的复合膜完美地结合了抗原抗体免疫分离以及径迹蚀刻膜物理分离的效果，膜结构稳定，分离效果稳定高效可靠。具体地，本发明所述径迹蚀刻膜的膜面上的非孔区域面积大，而膜孔一般只允许单个血细胞通过，膜面和膜孔中能大量且无死角、均匀地结合特异性抗体，使得抗体对目的细胞的免疫分离全面且无遗漏。且所述径迹蚀刻膜上膜孔尺寸均匀一致，一般仅适合单个血细胞垂直膜面通过该膜，因而在免疫分离的同时复合膜中同时会对目的细胞产生尺寸选择的物理过滤效应。
2、从实施例中用于少数癌细胞分离的灵敏度实验可见，本发明所述复合膜大幅提高了癌细胞的分离效率和可靠性。
3、该复合膜有望在血液中分离CTC领域得到实际应用。在该领域中，CTC分离越彻底对患者的身体越有利，可以预期含该复合膜的过滤器用于净化人体血液中的CTC时，能够分离得更干净彻底。同时，复合膜的分离效率比单独的径迹蚀刻膜更高，更快速，因而可以预期含该复合膜的过滤器用于净化人体血液中的CTC时，能够显著加快血液中CTC的净化速度，净化血液时血液在体外循环的遍数更少。
4、本发明所述复合膜能截留一些尺寸很小的肿瘤细胞，避免了径迹蚀刻膜不能截留小尺寸CTC的缺陷。
5、径迹蚀刻膜上难免会存在多孔融合在一起的膜缺陷，例如三个膜孔重叠在一起就可能导致正常尺寸的癌细胞从该大孔穿过径迹蚀刻膜，本发明提供的复合膜能很好地弥补该缺陷。
6、本发明实施例中使用的是EpCAM抗体交联。在实际应用中可根据具体目的肿瘤细胞表面标记物的不同，生产出交联不同种类甚至是多种抗体同时交联在一起的复合膜，满足临床工作的不同需要。
总的说来，本发明结合了免疫分离和按大小物理分选的双重截留分离作用，和现有的液体中肿瘤细胞分选方法相比，显著提高了目的肿瘤细胞分离的敏感性和效率。
附图说明
图1为径迹蚀刻聚碳酸酯过滤膜示意图。图1中，A：直径25mm、8微米孔径的径迹蚀刻聚碳酸酯过滤膜外观，B：滤器用于放置过滤膜过滤，C：显微镜下的径迹蚀刻聚碳酸酯过滤膜，8微米孔径，标尺为20微米，D：8微米孔径的径迹蚀刻圆孔。
图2为GFP-HCC827细胞株的建立及HCC827细胞表达EpCAM分子。图2中，A-B：稳定表达GFP的HCC827细胞；A：100倍放大倍数，标尺为100微米；B：200倍放大倍数，标尺为50微米；C：贴壁的HCC827细胞免疫荧光检测EpCAM分子表达，蓝色为细胞核DAPI染色，绿色为EpCAM(呈包裹在HCC827细胞外围形态)；D：悬浮细胞进行细胞免疫荧光检测EpCAM分子表达，证实HCC827细胞表面表达EpCAM。
图3为对比例1中建立肿瘤细胞血行转移动物模型以及利用ISET技术分离CTC，图3中，A：5-8F肿瘤细胞株，B：GFP蛋白标记的5-8F肿瘤细胞株，C：SCID免疫缺陷鼠(黑色箭头)，D：形成的移植肿瘤(双黑色箭头)，E：血液中用ISET技术检测到的带GFP蛋白的CTC(白色箭头)。
图4为对比例1中临床研究结肠癌转移到肺患者血液中ISET技术分离CTC及鉴定，且具体包括图4-1(A～F)和图4-2(G～L)。其中，A-B：结肠癌患者血液标本使用ISET技术分离到CTC细胞，巴氏染色；C-D：PET-CT显示该患者肺转移并骨转移(白色箭头处)；E-F：免疫荧光证实CTC细胞表达肠道特异性分子CDX2；E：使用CDX2抗体进行免疫荧光染色；F：DAPI染细胞核；G-L：免疫组化证实肺部转移灶为结肠来源，G-H：CDX2抗体检测，DAB染色.，I：CK7抗体检测，AEC染色，J：CK20抗体检测，AEC染色，K：TTF-1抗体检测，AEC染色，L：villin抗体检测，AEC染色；M-N：患者5年前原发灶CDX2抗体行免疫组化检测，DAB染色。
图5为EpCAM抗体交联过滤膜对肿瘤细胞的吸附情况；其中，A-B：EpCAM抗体交联组；C-D：未交联组；A：荧光显微镜下(488nm波长激发)观察交联了EpCAM抗体的过滤膜上吸附结合细胞情况，其中带绿色荧光的为EpCAM阳性的GFP-HCC827细胞；B：白场视野下观察交联了EpCAM抗体的过滤膜上吸附结合细胞情况，其中细箭头所指为膜上过滤孔，粗箭头所指为GFP-HCC827细胞；C：荧光显微镜下(488nm波长激发)观察未交联抗体的过滤膜上吸附结合细胞情况，其中带绿色荧光的为EpCAM阳性的GFP-HCC827细胞；D：白场视野下观察未交联抗体的过滤膜上截取细胞情况，其中细箭头所指为膜上过滤孔，粗箭头所指为GFP-HCC827细胞。
具体实施方式
本发明通过以下实施例具体说明，但本发明的保护范围并不仅限于下述实施例。
实施例1
(1)先准备径迹蚀刻聚碳酸酯过滤膜，如图1为所示。
(2)再利用普通的径迹蚀刻聚碳酸酯过滤膜建立起ISET技术分离CTC。体外实验表明ISET技术可以很好的分离截留肿瘤细胞，而让正常血液细胞顺利通过。
(3)将抗体交联至所述径迹蚀刻膜膜上。在本研究中我们使用的抗体为抗人EpCAM的单克隆抗体，因为该抗体被广泛应用于血液CTC细胞的分选中。先将上述制备的过滤膜进行烷基化处理，烷基化处理后使用交联剂将抗人EpCAM的单克隆抗体交联至过滤膜上。清洗，干燥后，抗体交联的径迹蚀刻聚碳酸酯/聚酯滤过膜制备完成。
(4)构建GFP-HCC827细胞株。我们利用Piggybac转座子系统，成功将GFP基因导入HCC827细胞内，并构建了稳定表达细胞株。该细胞株既表达GFP做为示踪蛋白，并且EpCAM表面分子表达阳性，是用来验证新型交联EpCAM抗体径迹蚀刻聚碳酸酯/聚酯过滤膜的理想细胞株。
图2为GFP-HCC827细胞株的建立及HCC827细胞表达EpCAM分子。图2中，A-B：稳定表达GFP的HCC827细胞；A：100倍放大倍数，标尺为100微米；B：200倍放大倍数，标尺为50微米；C：贴壁的HCC827细胞免疫荧光检测EpCAM分子表达，蓝色为细胞核DAPI染色，绿色为EpCAM(呈包裹在HCC827细胞外围形态)；D：悬浮细胞进行细胞免疫荧光检测EpCAM分子表达，证实HCC827细胞表面表达EpCAM。
(5)下一步将先制备得到偶联有EpCAM抗体的径迹蚀刻膜，并通过带有绿色荧光蛋白(GFP)的HCC827细胞株研究复合膜分离截留效率以及复合膜的敏感性。
对比例1
本对比例中说明仅使用径迹蚀刻膜分离(ISET技术)CTC细胞的效果。
动物模型实验表明ISET技术可以从移植瘤小鼠中分离得到CTC细胞，但是阳性率较低(9只小鼠中，3只检测到CTC，阳性率33.3％)，如图3所示。临床实验证实了ISET技术可以分离血液中的CTC细胞，但是阳性率较低，如图4所示。
图3为对比例1中建立肿瘤细胞血行转移动物模型以及利用ISET技术分离CTC，图3中，A：5-8F肿瘤细胞株，B：GFP蛋白标记的5-8F肿瘤细胞株，C：SCID免疫缺陷鼠(黑色箭头)，D：形成的移植肿瘤(双黑色箭头)，E：血液中用ISET技术检测到的带GFP蛋白的CTC(白色箭头)。
图4为对比例1中临床研究结肠癌转移到肺患者血液中ISET技术分离CTC及鉴定。其中，A-B：结肠癌患者血液标本使用ISET技术分离到CTC细胞，巴氏染色；C-D：PET-CT显示该患者肺转移并骨转移(白色箭头处)；E-F：免疫荧光证实CTC细胞表达肠道特异性分子CDX2；E：使用CDX2抗体进行免疫荧光染色；F：DAPI染细胞核；G-L：免疫组化证实肺部转移灶为结肠来源，G-H：CDX2抗体检测，DAB染色.，I：CK7抗体检测，AEC染色，J：CK20抗体检测，AEC染色，K：TTF-1抗体检测，AEC染色，L：villin抗体检测，AEC染色；M-N：患者5年前原发灶CDX2抗体行免疫组化检测，DAB染色。
临床实验研究共67例肺部恶性肿瘤患者入肿瘤组，取得67份可检测血液样本；良性肺部疾病患者29例和健康志愿者6例入非肿瘤组，取得35份可检测血液样本。其中4例Ⅳ期患者入远处转移组；63例I-Ⅲ期患者入未远处转移组。所有血液样本均通过ISET外周血筛查装置进行检测，定义CTC阳性为每5ml血液样本检出CTC数为1个及以上者，且进行单盲识别CTC，即对样本镜下观察的研究人员并不知道样本来源(因此时患者尚未行手术并且无病理诊断资料)。肿瘤组CTC的检出率为2.99％(2/67)，非肿瘤组CTC的检出率为0.00％(0/35)。远处转移组CTC的检出率为50.00％(2/4)，显著高于未远处转移组CTC的检出率0.00％(0/63)，P<0.05。具体数据见表1。67例肺部恶性肿瘤患者中有2例患者外周血中检测出CTC，1例为结肠癌肺、骨转移患者，无病生存期为5年，其术前检测到CTC；1例为结肠癌肺转移患者，无病生存期为1.5年，其术前检测到CTC。
表1各组CTC检出率
*远处转移组和未远处转移组比较(四格表的Fisher精确检验，P<0.05)
对比例1的结果说明仅使用ISET技术分离CTC时(包括动物实验和人类临床实验)，其效果有待改进。
实施例2
本实施例为CD326抗体(一种EpCAM抗体)偶联径迹蚀刻膜得到复合膜，和该复合膜结合肺癌细胞HCC827实验。
1.配制溶液：
溶液1，4％(v/v)3-巯丙基三甲氧基硅烷-酒精溶液；
溶液2，50mgGMBS溶于0.5ml DMSO(二甲亚砜)，加乙醇配置为0.28％(v/v)混合液；
溶液3，蒸馏水修复冻干中性亲和素，加PBS配制为0.1％(v/v)混合液；
溶液4，1％(w/v)BSA和0.09％(w/v)叠氮化钠的PBS溶液；
溶液5，生物素化EpCAM抗体+溶液4，配制为浓度10ug/ml。
2.实验步骤：
1)溶液1浸泡荡洗过滤膜，室温45分钟，使硅烷预处理表面；
2)乙醇洗涤除去未反应的硅烷；
3)溶液2浸泡荡洗过滤膜，反应15分钟，使GMBS附着于膜上；
4)乙醇洗涤；
5)亲和素溶液3浸泡荡洗过滤膜，存放在冰箱里过夜，使亲和素附着于GMBS；
6)溶液4，PBS洗涤，除去未反应的亲和素；
7)溶液5浸泡荡洗过滤膜，反应15-30分钟，生物素化的抗体与亲和素结合；
8)PBS洗涤过滤膜，除去未结合的抗体；空气中干燥，常温保存最多三周。
3.实验结果：
我们选取了肺癌细胞株HCC827作为实验细胞株。HCC827经免疫荧光实验证实细胞膜表面表达EpCAM蛋白(也被称为CD326分子)。我们将绿色荧光蛋白转染至HCC827细胞中，使其稳定表达GFP蛋白(HCC827-GFP细胞株)。绿色荧光蛋白可以清晰的帮助我们观察细胞。体外培养HCC827-GFP细胞株，消化计数细胞，使用5×105个细胞加入PBS缓冲液中(50ml)；同时加入上述制备的EpCAM抗体偶联的8微米孔径的径迹蚀刻过滤膜；4度孵育30分钟；彻底吸出含细胞的缓冲液上清，并加入不含细胞的PBS(50ml)置于摇床上清洗，共3次，每次10min；过滤膜经过充分洗涤后，置于荧光显微镜下检测。可以看到，没有偶联EpCAM抗体的过滤膜和HCC827-GFP共同孵育后，不能结合细胞；而偶联EpCAM抗体的过滤膜和HCC827-GFP共同孵育后，可以有效的结合捕获细胞。
图5为EpCAM抗体交联过滤膜对肿瘤细胞的吸附情况；其中，A-B：EpCAM抗体交联组；C-D：未交联组；A：荧光显微镜下(488nm波长激发)观察交联了EpCAM抗体的过滤膜上吸附结合细胞情况，其中带绿色荧光的为EpCAM阳性的GFP-HCC827细胞；B：白场视野下观察交联了EpCAM抗体的过滤膜上吸附结合细胞情况，其中细箭头所指为膜上过滤孔，粗箭头所指为GFP-HCC827细胞；C：荧光显微镜下(488nm波长激发)观察未交联抗体的过滤膜上吸附结合细胞情况，其中带绿色荧光的为EpCAM阳性的GFP-HCC827细胞；D：白场视野下观察未交联抗体的过滤膜上截取细胞情况，其中细箭头所指为膜上过滤孔，粗箭头所指为GFP-HCC827细胞。
实施例3
本实施例旨在验证本发明所述复合膜对肿瘤细胞的吸附效果。
1、配制溶液：
溶液1，4％(v/v)3-巯丙基三甲氧基硅烷-酒精溶液；
溶液2，50mgGMBS溶于0.5ml DMSO(二甲亚砜)，加乙醇配置为0.28％(v/v)混合液；
溶液3，蒸馏水修复冻干中性亲和素，加PBS配制为0.1％(v/v)混合液；
溶液4，1％(w/v)BSA和0.09％(w/v)叠氮化钠的PBS溶液；
溶液5，生物素化EpCAM抗体+溶液4，配制为浓度10ug/ml。
2、复合膜制备的实验步骤：
1)溶液1浸泡荡洗过滤膜，室温45分钟，使硅烷预处理表面；
2)乙醇洗涤除去未反应的硅烷；
3)溶液2浸泡荡洗过滤膜，反应15分钟，使GMBS附着于膜上；
4)乙醇洗涤；
5)亲和素溶液3浸泡荡洗过滤膜，存放在冰箱里过夜，使亲和素附着于GMBS；
6)溶液4，PBS洗涤，除去未反应的亲和素；
7)溶液5浸泡荡洗过滤膜，反应15-30分钟，生物素化的抗体与亲和素结合；
8)PBS洗涤过滤膜，除去未结合的抗体；空气中干燥，常温保存最多三周。
3.EpCAM(CD326)抗体偶联过滤膜效果质量检测
(1)取带绿色荧光蛋白GFP的肺癌HCC827细胞(EpCAM阳性细胞)，计数后配制成细胞密度为1.0×105个/ml的PBS细胞溶液。
(2)取交联了EpCAM抗体的过滤膜、未交联抗体的过滤膜各1张，置于六孔板中，分别往其孔中加入2ml上述细胞溶液使过滤膜被完全浸泡。
(3)将六孔板置于37℃培养箱中孵育1h，使过滤膜与细胞充分接触。
(4)1h后取出膜，分别放入含4ml PBS的小玻璃容器内，置于摇床上洗涤3次，每次5min，将膜上未与抗体结合的细胞除去。
(5)荧光显微镜下观察过滤膜上细胞分布及密度等实验结果，拍照保存。
4.实验结果
(1).荧光显微镜观察两种过滤膜上附着细胞情况：交联了EpCAM抗体的过滤膜可以十分有效的与EpCAM阳性细胞特异性结合；而未交联EpCAM抗体的过滤膜则几乎不能有效吸附EpCAM阳性细胞。
图5为EpCAM抗体交联过滤膜对肿瘤细胞的吸附情况；其中，A-B：EpCAM抗体交联组；C-D：未交联组；A：荧光显微镜下(488nm波长激发)观察交联了EpCAM抗体的过滤膜上吸附结合细胞情况，其中带绿色荧光的为EpCAM阳性的GFP-HCC827细胞；B：白场视野下观察交联了EpCAM抗体的过滤膜上吸附结合细胞情况，其中细箭头所指为膜上过滤孔，粗箭头所指为GFP-HCC827细胞；C：荧光显微镜下(488nm波长激发)观察未交联抗体的过滤膜上吸附结合细胞情况，其中带绿色荧光的为EpCAM阳性的GFP-HCC827细胞；D：白场视野下观察未交联抗体的过滤膜上截取细胞情况，其中细箭头所指为膜上过滤孔，粗箭头所指为GFP-HCC827细胞。
(2).两种过滤膜上附着细胞数目：
分别计数200倍放大倍数下两个过滤膜上随机3个视野中的细胞数，计算其平均细胞数及标准差(见表2，放大倍数为200倍)。可见抗体复合膜上细胞数目明显多余正常径迹蚀刻过滤膜。
表2随机三个视野中两种过滤膜上细胞数
膜 视野1(个) 视野2(个) 视野3(个) 平均细胞数(个) 标准差
抗体膜 150 132 144 142 7.483315
径迹蚀刻膜 1 3 0 1.33 1.246667
结论：本发明所述制备方法可将EpCAM抗体交联至径迹蚀刻膜(又称核孔膜)上，且交联EpCAM抗体的径迹蚀刻膜可以十分有效地与EpCAM阳性细胞特异性结合。
实施例4
本实施例旨在验证和比对本发明所述复合膜以及现有技术中未交联抗体的径迹蚀刻膜对肿瘤细胞的吸附分离效果。
本发明所述敏感性实验研究过滤10个HCC827-GFP细胞。
1)实验过程：
1.组装膜过滤装置，实验组为交联了EpCAM抗体的滤过膜，对照组为未交联抗体的正常径迹蚀刻滤过膜；排气后关闭三通阀，加入生理盐水至与过滤柱上口相平；
2.取培养的HCC827-GFP细胞，消化分散混匀后，取少量细胞溶液，用适量培养基稀释混匀后，置于荧光显微镜下；
3.显微镜下使用微量注射器逐个精确吸取10个HCC827-GFP单细胞，分别加入到上述两过滤柱中；
4.在过滤柱上口接一个20ml注射器管，加入15ml生理盐水，打开三通阀洗涤；重复3次；
5.将滤完时逐次加入1-2ml4％多聚甲醛过滤固定，共加入约10ml多聚甲醛使之充分固定；
6.室温充分固定15min后，加入15ml生理盐水清洗2次；
7.取出滤过膜，置小号培养皿中，PBS洗涤2次，每次5min；
8.取出滤过膜，置于干净载玻片上，加入15ul 40％甘油封片剂予以封片；
9.荧光显微镜下观察，分别记录两膜上截留的绿色荧光细胞数目。
10.实验再次重复2次，统计结果。
2)实验结果：
显微镜下使用微量注射器逐个精确吸取10个HCC827-GFP肿瘤细胞，过滤后荧光显微镜下滤过膜吸附截留肿瘤细胞数，其中交联EpCAM抗体的滤过膜吸附截留9.333±0.471个肿瘤细胞，截留率为(93.33±4.71)％；未交联抗体的正常滤过膜截留4.000±0.632个肿瘤细胞，截留率为(40.00±6.32)％。表明抗体膜在极少肿瘤细胞(10个HCC827-GFP细胞)的条件下具有很强的肿瘤特异性吸附能力，较同等条件下未交联抗体的滤过膜截留肿瘤细胞能力提高了133％；P<0.01。
表3两种滤过膜过滤10个HCC827-GFP细胞截留的细胞数目
第1次(个) 第2次(个) 第3次(个) 平均数(个) 标准差
抗体复合膜 9 9 10 9.33 0.471
径迹蚀刻膜 3 4 5 4.00 0.632
3)实验结论：
交联了EpCAM抗体的滤过膜过滤截留HCC827-GFP细胞的能力显著优于未交联抗体的正常滤过膜。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于分离液体中肿瘤细胞的复合膜，所述复合膜包括径迹蚀刻膜和以直接或间接方式连接在径迹蚀刻膜的膜表面上和/或孔道内的用于与肿瘤细胞进行特异性结合的一种或多种抗体分子，所述径迹蚀刻膜与抗体的连接中包括一处以上的化学连接，所述径迹蚀刻膜孔径为5～28微米，径迹蚀刻膜上尺寸均匀的孔道用于滤过液体中的组分而将肿瘤细胞截留在径迹蚀刻膜的一侧，所述径迹蚀刻膜上连接的抗体分子同样用于将肿瘤细胞免疫截留在径迹蚀刻膜上。
2.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于，所述径迹蚀刻膜上尺寸均匀的孔道的直径均为x±1μm，优选为x±0.5μm，且x为6～25μm中的任一值，最优选孔道直径为8±1μm。
3.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于，所述抗体通过生物素和亲和素的连接而固定在径迹蚀刻膜上。
4.根据权利要求3所述的复合膜，其特征在于，所述抗体依次通过生物素、亲和素、偶联剂GMBS以及硅烷偶联剂3-巯丙基三甲氧基硅烷连接在径迹蚀刻膜上。
5.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于，所述抗体包括抗人EpCAM的单克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于，所述径迹蚀刻膜的膜面上的膜孔总面积为膜面总面积的30％以下，优选1～20％，更优选5～15％。
7.根据权利要求1所述的复合膜，其特征在于，所述径迹蚀刻膜为使用重离子加速器轰击高分子膜材料后经过化学蚀刻而得到的包含多个孔径均匀直孔道的膜，优选所述径迹蚀刻膜为聚酯膜或聚碳酸酯膜。
8.一种如权利要求1～7中任意一项所述复合膜的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤A、先对径迹蚀刻膜采用硅烷偶联剂浸泡荡洗进行膜表面的硅烷预处理；
步骤B、对膜采用偶联剂GMBS处理，使GMBS附着于膜上；
步骤C、对膜采用亲和素处理，使得亲和素附着于GMBS上；
步骤D、对膜采用生物素化的抗体处理，使得生物素化的抗体与亲和素结合；且步骤A～D中的每个步骤后均包括清洗除去未结合或未反应的相应化学物质。
9.一种用于分离血液中循环肿瘤细胞的方法，所述方法包括使用固定有复合膜的过滤器对血液进行过滤，所述复合膜包括径迹蚀刻膜滤膜和以直接或间接方式连接在滤膜上且能与目的肿瘤细胞进行特异性结合的一种或多种抗体分子；含有肿瘤细胞的血液在流经过滤器的复合膜时，其上的目的肿瘤细胞被位于膜面上和/或膜孔中的所述抗体截留，或目的肿瘤细胞被径迹蚀刻膜上直径均匀的孔道截留，而允许包括红细胞和白细胞的其它成分顺利通过该复合膜；所述复合膜中包含抗原抗体免疫分离和径迹蚀刻膜物理尺寸分离而共同截留所述循环肿瘤细胞。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述过滤器为立体式过滤柱，过滤柱中包含一个或多个过滤子柱，且同一个过滤子柱中设置的不同复合膜的滤液流动方向不同或同一复合膜上不同位置的滤液流动方向不同。
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