JPH09510779A - 特定化あるいは混合した細胞母集団または混合細胞母集団を含む溶液内の特定標的細胞を検出する方法および装置 - Google Patents
特定化あるいは混合した細胞母集団または混合細胞母集団を含む溶液内の特定標的細胞を検出する方法および装置Info
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Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. 混合細胞母集団の細胞浮遊液内および混合細胞母集団を含む流体系内なら びに血液、骨髄の正常細胞および悪性造血細胞を除いた固形組織から調製した単 細胞浮遊液内の特定標的細胞を検出する方法であって、 1.1. それ自体公知の手順に従って常磁性粒子または常磁性ビーズを、a) 細胞混合物内の標的細胞上に特に表出し、非標的細胞上に表出しない膜構造に向 けた抗体または抗体フラグメントあるいはb)膜構造に向けた前記抗体のFc部 分に結合することのできる抗体、好ましくは、ポリクロナール・アンチマウス抗 体またはモノクロナール・ラット・アンチマウス抗体またはアンチヒューマン抗 体で被覆する段階、 1.2. 1.2.1.前記粒子またはビーズに付着した、あるいは、標的関連抗体の Fc部分を認識するアンチマウス抗体またはアンチヒューマン抗体で予め被覆し たビーズに付着した標的細胞関連抗体(ネズミまたはヒト)を標的細胞を含有す る細胞浮遊液と混合するか、もしくは、 1.2.2.遊離した標的細胞関連抗体を標的細胞を含有する細胞浮遊液と 混合し、この混合物を穏やかに回転させながら0℃から20℃の間の温度、好ま しくは、4℃の温度で5−10分間から2時間、好ましくは、30分間培養する 段階、 1.3. 細胞浮遊液と、常磁性粒子またはビーズ(1.2.1.)に取り付け た、あるいは、標的関連抗体のFc部分を認識するアンチマウス抗体またはアン チヒューマン抗体で予め被覆した常磁性粒子またはビーズに取り付けた標的関連 抗体との混合物を、培養した遊離標的関連抗体と細胞浮遊液の混合物(1.2. 2.)に培養し、培養を穏やかな回転の下に0℃から25℃の間の温度、好まし くは、4℃の温度で5−10分間から2時間、好ましくは、30分間行う段階、 1.4. 1.4.1.血液または骨髄吸引液内に標的細胞母集団が含まれている場合 には、抗体被覆粒子に伴う疎水力を減らすために適当な濃度のマイルドな洗剤、 たとえば、0.1%未満の濃度のTween20TMで抗体被覆 粒子および細胞浮遊液を4℃で30分間予備培養する段階、および/または、 1.4.2.未処理またはフォルマリン、アルコールその他の固定剤で予処 理した細胞浮遊液を培養し、標的細胞および用いられる抗体に存在する細胞外あ るいは細胞内分子に結合している他の抗体または抗体フラグメントを予めペルオ キシダーゼ、アルカリフォスファターゼあるいは添加した後に関連した基質と共 に培養することによって結合を視覚化することができる他の酵素で標識付けする 段階、または、 1.4.3.抗体フラグメントをbiotinylateし、ペルオキシダーゼ、アル カリフォスファターゼまたは他の酵素に合成したアビジンとの培養を加えたとき に結合を関連基質の添加および培養で視覚化する段階、または、 1.5. 標的細胞の密度が低いか、あるいは、細胞混合物内の標的細胞/全細 胞の比率が低い(1%未満)場合には培養した常磁性粒子・抗体・細胞混合物( 1.3)に磁界をかける段階、 1.5.1. 顕微鏡および/または適当な細胞/粒子計数装置を用いて細胞浮遊液 内の染色、未染色の粒子・標的細胞複合体を検査し、計数する段階、または、 1.5.2. 粒子/標的細胞複合体を保持するのに適した薄膜フィルタを用い、吸 引を用いるか用いずに細胞浮遊液がマイクロウェル内に適用される細胞濾過装置 または細胞分離器(20)に隔離した標的細胞浮遊液を移し、前記細胞濾過装置 から隔離標的細胞と共にフィルタを取り出し、公知の免疫組織化学方法で固定し て染色し、顕微鏡で観察するか、あるいは、フィルタ上の隔離標的細胞複合物を 増殖させて特定の生化学的、生物学的な特徴を付与するために培養液を添加する 段階、または、 1.6. 細胞浮遊液内の標的細胞/全細胞の比率が適切である(1%より大き い)場合には、常磁性粒子、抗体、細胞混合物の培養済み混合物(1.3)内の 標的細胞を検査し、計数する段階、抗体または抗体フラグメントが色あるいは酵 素活性化によって直接見ることができる非常磁性 粒子に結合した場合には、 1.6.1. 顕微鏡および/または適当な細胞/粒子計数装置を用いるか、あるい は、 1.6.2. 隔離した標的細胞浮遊液を細胞濾過装置または細胞分離器に移し、上 記1.5.2による方法を実施する ことを特徴とする方法。 2. 請求の範囲第1項記載の方法において、抗体またはそのフラグメントが、 生きている正常細胞の抗原、たとえば、肝細胞、肺のクッパー細胞、内皮細胞タ イプ1、2およびクラーラ細胞、特定器官の内皮細胞、膵臓の外分泌、内分泌細 胞、腎臓細管細胞、膀胱上皮細胞、脳グリア細胞、脳室上衣細胞、膀胱および前 立腺の上皮細胞、気道の繊毛細胞、胃腸管の粘膜細胞の種々の部分母集団、下垂 体細胞、種々のホルモン生成器官の内分泌腺細胞に向けたものであることを特徴 とする方法。 3. 請求の範囲第1、2項のうちのいずれかに記載の方法において、前記標的 細胞抗体として、正常細胞の部分母集団ならびに正常組織細胞の膜に表出する癌 生成物に存在する抗原と反応する抗体を用いることを特徴とする方法。 4. 請求の範囲第1項から第3項のうちいずれか1つに記載の方法において、 前記積極的選択抗体として、正常細胞の膜上の成長因子レセプタ、たとえば、E GFレセプタ、PDGF(A、B)レセプタ、インシュリン・レセプタ、インシ ュリン様レセプタ、トランスフェリン・レセプタ、NGF、FGFレセプタに向 けた抗体を使用することを特徴とする方法。 5. 請求の範囲第1項から第4項までのいずれか1つにきさいの方法において 、integrinその他の粘着膜分子および正常細胞のMDRタンパク質のグループに 向けた抗体を使用することを特徴とする方法。 6. 請求の範囲第1項から第5項までのいずれか1つにきさいの方法において 、抗体またはそのフラグメントが、異常発達パターンを持つ細胞、好ましくは、 一次癌細胞および転移性癌細胞内の抗原またはレセプタに向けたものであること を特徴とする方法。 7. 請求の範囲第1項から第6項までのいずれか1つにきさいの方法において 、 前記標的細胞関連抗体として、IgGイソタイプの抗体またはF(ab')2また はF(ab)フラグメントまたはIgMまたはIgMのフラグメントを使用する ことを特徴とする方法。 8. 請求の範囲第1項から第7項までのいずれか1つにきさいの方法において 、前記の細胞浮遊液を、哺乳類の組織、たとえば、ヒトの骨髄、抹消血液を含む 混合細胞浮遊液から、胸膜、腹膜の滲出液または他の体液、たとえば、尿、髄液 、精液、リンパ液から、あるいは正常組織や器官、たとえば、肝臓、リンパ節、 脾臓、肺臓、膵臓、骨組織、中枢神経系、前立腺、皮膚、粘膜の固形組織から調 製することを特徴とする方法。 9. 請求の範囲第1項から第8項までのいずれか1つにきさいの方法において 、抗体または抗体フラグメントが表1(付録参照)に記載したような抗原デター ミナントのグループに向けたものであることを特徴とする方法。 10.請求の範囲第1項から第9項までのいずれか1つにきさいの方法において 、前記標的細胞抗体として、悪性細胞の膜上に表出する成長因子レセプタ、癌生 成物、たとえば、表1(付録参照)に記載したものに加えて、インシュリン・レ セプタ、インシュリン様レセプタおよびFGFレセプタに向けた抗体または抗体 フラグメントを使用することを特徴とする方法。 11.請求の範囲第1項から第10項までのいずれか1つにきさいの方法におい て、表1(付録参照)に記載したようなintegrins、他の粘着膜分子および異常 細胞のMDRタンパク質のグループに向けた抗体または抗体フラグメントを使用 することを特徴とする方法。 12.請求の範囲第1項から第11項までのいずれか1つにきさいの方法におい て、使用される抗体、抗体フラグメントまたはそれらの組み合わせが表1(付録 参照)に記載したような抗原デターミナントに向けたものであることを特徴とす る方法。 13.請求の範囲第1項から第12項までのいずれか1つにきさいの方法におい て、前記抗体として、異常細胞、たとえば、乳房、卵巣、肺臓の癌腫細胞、黒色 腫、肉腫、神経グリア芽細胞腫、胃腸管、尿生殖路および網内系の癌細胞に存在 する抗原および/または非新生物性疾患、たとえば、心臓血管疾患、神経疾患、 肺動脈疾患、自己免疫性胃腸疾患、尿生殖器疾患、細網内皮系疾患その他の疾患 に関連した標的細胞と反応する抗体を使用することを特徴とする方法。 14.混合細胞母集団の細胞浮遊液において粒子・標的細胞複合体を非結合ビー ズ、不特定結合非標的細胞および非結合非標的細胞から分離するための細胞濾過 装置すなわち細胞分離器(20)であって、濾過液収集ボックス(22)を包含 し、この濾過液収集ボックスが、案内ピン(28)を持っているか持っておらず 、蓋(21)を持ち、案内切り欠き(29)を持つか持たない多数のマルチウェ ル・ユニット(24)を包含する低圧真空アタッチメント部(23)を持つか持 たず、さらに、細胞分離器薄膜フィルタ(25)と、マルチウェル・ユニット( 24)の底に取り外し自在に固定した膜サポート(25a)とを包含することを 特徴とする細胞濾過装置。 15.請求の範囲第14項記載の細胞濾過装置(20)において、前記薄膜フィ ルタの細孔が、たとえば、5μmから75μmまで、好ましくは、20μmの細 孔寸法のナイロン・モノフィラメント膜に見出されるような規則正しい一貫した 形状、寸法となっていることを特徴とする細胞濾過装置。 16.標的細胞の隔離のために請求の範囲第1項から第13項のうちいずれか1 つに記載の検出方法を使用する方法であり、細胞と常磁性粒子の複合物を磁界に さらし、そうしてできた磁気的に凝集した細胞および/または細胞濾過装置(2 0)を用いて隔離した細胞をさらに生物学的、生化学的および免疫学的検査にか け、これらの検査が、ポリメラーゼ・チェーン反応(PCR)および逆トランス クリプターゼPCRを含めて、DNA、mRNA、タンパク質レベルで特定遺伝 子を特徴付けることも包含していることを特徴とする方法。 17.請求の範囲第1項から第13項までのいずれか1つに記載の、特定の標的 細胞を検出する方法を使用して、分離した常磁性または非磁性粒子・標的細胞複 合物から試験官内細胞培養を行うか、および/または、免疫欠損動物へ移植を行 うか、好ましくは、前記動物においてヒト腫瘍の異種移植を行うことを特徴とす る方法。 18.請求の範囲第1項から第13項までのいずれか1つに記載の方法を実施す るためのキットであり、 18.1.望みの標的細胞上の抗原レセプタに向けた特定の抗体または抗体フラ グメントであり、抗原結合能力を除くことなく含有常磁性粒子に結合するかある いは結合することができる特定の抗体または抗体フラグメント、および/または 、18.2.特定のアンチFc抗体、好ましくは、標的細胞関連抗体のFc部分 に結合することのできるポリクロナール・アンチマウスまたはモノクロナール・ ラット・アンチマウスまたはアンチヒューマンの抗体および特定の遊離標的細胞 抗体で予め被覆した常磁性粒子、および/または、 18.3.特定のアンチFc抗体、好ましくは、標的細胞関連抗体のFc部分に 結合することのできるポリクロナール・アンチマウスまたはモノクロナール・ラ ット・アンチマウスまたはアンチヒューマンの抗体で予め被覆し、特定の遊離標 的細胞抗体に結合した常磁性粒子、および/または、 18.4.望みの標的細胞内またはその上にある抗原/レセプタに向けた他の特 定抗体または抗体フラグメントであり、ビオチン、ペルオキシダーゼ、アルカリ フォスファターゼその他の酵素に結合するか、あるいは、特定の色またはペルオ キシダーゼ、アルカリフォスファターゼのような結合酵素と共に非常磁性粒子に 結合する他の特定抗体または抗体フラグメント、および/または、 18.5.請求の範囲第14項および第15項に記載の細胞フィルタ装置、 18.6.特定標的細胞抗原または細胞フィルタ装置の使用の有る無しに係わら ず対照または標準として使用するための抗原グルーブで予め被覆した常磁性また は非常磁性の粒子 を包含することを特徴とするキット。
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