NO180658B

NO180658B - Fremgangsmåte og anordning for deteksjon av spesifikke målceller i spesialiserte eller blandede cellepopulasjoner og opplösninger som inneholder blandede cellepopulasjoner

Info

Publication number: NO180658B
Application number: NO940866A
Authority: NO
Inventors: Oeystein Fodstad; Hanne K Hoeifoedt; Philip D Rye
Original assignee: Oeystein Fodstad
Priority date: 1994-03-10
Filing date: 1994-03-10
Publication date: 1997-02-10
Also published as: JP4071824B2; NO940866D0; DE69516401D1; US6265229B1; PL177483B1; PT749580E; NO180658C; ES2147607T3; NO940866L; PL316209A1; HUT75370A; ATE191973T1; FI963533A; AU2086495A; CA2185128C; GR3033946T3; EP0749580A1; DE69516401T2; JPH09510779A; HU9602432D0

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår en immunomagnetisk fremgangsmåte for deteksjon av spesifikke målceller i cellepopulasjoner og oppløsninger av cellepopulasjoner. Oppfinnelsen angår også et sett og apparat for å utføre fremgangsmåten i forskjellige cellepopulasjoner.

I biologi, biokjemi og tilstøtende områder er det et betydelig behov for fremgangsmåter i hvilke kjemiske entiteter er bundet sammen. Slike fremgangsmåter viser en økende viktighet i forskning som angår både normale og unormale cellepopulasjoner. Spesielt når fast understøttelse anvendes kan celler immobiliseres, detekteres og isoleres og renses. Videre kan celleinnholdet undersøkes ved å benytte en serie av sofistikerte fremgangsmåter. Det er også viktig å være i stand til å isolere cellene som levende.

Affinitetsbinding er en sofistikert måte til å binde kjemiske/biokjemiske entiteter sammen. I en slik metode bindes et par bindingspartnere, som f.eks.

er festet til substansen som skal bindes, til hverandre når de bringes i kontakt. En av bindingspartnerne i en slik binding kan være representert av et molekyl på celleoverflaten. Flere slike bindingspartnersystem er kjente, såsom antigen-antistoff, ensym-reseptor, ligand-reseptor interaksjoner på celler og biotin-avidinbinding, av hvilke antigen-antistoffbinding er oftest benyttet.

Når slike fremgangsmåter blir benyttet for isolasjon av spesifikke celler som skal være gjenstand for videre undersøkelser av forskjellig art er det nødven-dig at cellene gjenvinner sin funksjon ved tilbakevending til de opprinnelige betingelser. Dette er ikke alltid tilfelle skjønt det er foreslått en fremgangsmåte for å tilveiebringe fysiologiske betingelser slik at de isolerte spesifikke celler kan utvikles i tilstrekkelig antall til å gjøre det mulig med videre karakterisering.

Fremgangsmåter er kjent hvor en av bindingspartnerne er festet til en uopp-løselig understøttelse, såsom paramagnetiske partikler og ved hjelp av hvilke isolasjon av målceller i en blandet cellepopulasjon blir utført som negativ isolasjon eller positiv isolasjon. I en negativ isoleringsfremgangsmåte kan de uønskede cellene fjernes fra cellepreparatet ved å inkubere cellene med antistoffbelagte partikler, spesifikke for de uønskede celler. Etter inkubasjonen kan celle/antistoff/partikkelkomplekset fjernes ved å benytte partiklene, og la de ønskede målcellene være tilbake. Dette resultatet er ofte ikke tilfredsstillende siden de ikke ønskede celler blir etterlatt i cellepopulasjonen mer eller mindre renset og også siden hensikten med isoleringsfremgangsmåten er å undersøke og/eller utføre ytterligere undersø-kelser på de spesifikke målceller. Det er blitt gjort forsøk på å anvende partikler for positiv isolering i hvilke de ønskede målceller blir fjernet fra den blandede cellepopulasjonen. Disse fremgangsmåter er imidlertid blitt rettet mot visse målceller og er ikke egnet for alle målcellesystemer. En positiv isolasjonsfremgangsmåte som omfatter hapten/antihaptenbindingssystem har nylig blitt foreslått (PCT/EP90/01171) som angår en fremgangsmåte til å knytte målceller til en uoppløselig understøttelse ved å benytte egenskapene til hapten, antihaptenantistoff og anticelleantistoff til å bindes til hverandre, for således å konstruere en binding mellom den uoppløselige understøttelse, dvs. partikkel, og målcellen, som består av minst hapten og antihaptenantistoff eller kombinasjoner av hapten og antihaptenantistoffer og antianti-haptenantistoffer eller sekundære anticelleantistoffer. Senere spalting av komplekset blir utført ved igjen å eksponere det til hapten eller haptenanalog. Således består den konstruerte binding alltid av hapten i tillegg til en eller flere elementer. Fremgangsmåten er rettet mot uspesifikke målceller og er rettet mot isolasjon av målceller og fjerning av den uoppløselige understøttel-se.

Det er et behov for en enkel binding som kan koble en målcelle til en uopp-løselig understøttelse som ikke omfatter forbindelser i en heller uspesifikk haptengruppe, og som er rettet mot deteksjon av spesifikke målceller, med minimal assosiasjon til uspesifikke celler og som gjør det unødvendig senere å spalte den uoppløselige understøttelsen fra den spesifikke målcelle.

To samverserende søknader av en av søkerne (PCT/NO92/00151, innsendt 14. september 1992; PCT/NO93/00136, innsendt 10. september 1993) om-handler en fremgangsmåte og forbedret fremgangsmåte til å detektere, med diagnostiske hensikter, spesifikke målceller under anvendelse på blod og benmarg, uten problemer med uspesifikk binding til normale celler. De representerer sensitive deteksjonsfremgangsmåter for en variasjon av celletyper, slik at et høyt antall celler lett kan screenes i mikroskopet og fremgangsmåten er rask og enkel. Dessuten kan fremgangsmåten anvendes for isolering av celler for biokjemisk, biologisk og immunologisk undersøkelse og for å studere spesifikke gener på nukleotid- eller proteinnivå, i tillegg til dyrking av cellene, uten behov for å spalte celle-partikkelkomplekset. Det er imidlertid et behov for forbedringer såsom isolasjon av de partikkelbundne målcellene i målcellesuspensjonen fra ubundne kuler, uspesifikt bundet ikke-målceller og ubundne ikke-målceller, som er enkel å utføre ikke tidskrevende og som gjør målcelle/partikkelkompleksene egnet til å utføre videre analyser på, såsom f.eks. mikroskopiske undersøkelser og dyrking i et kulturmedium.

Disse hensikter blir oppnådd ved den foreliggende oppfinnelsen beskrevet av fremgangsmåte, apparat og sett kjennetegnet ved de vedlagte krav.

Fremgangsmåten for immunomagnetisk deteksjon av målceller i en blandet cellepopulasjon og fysiologisk oppløsning som inneholder cellepopulasjoner er egnet for deteksjon, men kan også anvendes til positiv isolering av spesifikke typer av både normale celler og patogene celler. Fremgangsmåten skaper en forbindelse mellom en spesifikk målcelle og en uoppløselig under-støttelse, såsom paramagnetiske partikler, som består av en eller to elementer. Partikkelen er enten belagt med et anticelle antistoff av murin eller menneskelig opprinnelse, rettet mot de spesifikke antigendeterminanter i membranene til de ønskede målceller, eller partiklene er belagt med et polyklonalt antimus eller anithuman antistoff som er i stand til å bindes til Fc-delen av det spesifikke anticelle antistoffet rettet på antigendeterminantene i målcellemembranene. I stedet for å bruke det polyklonale antimus/antihumant antistoff for å belegge partiklene kan et monoklonalt rotte antimus/antihumant antistoff anvendes. Dette siste antistoff kan delvis pga. sin monoklonale opprinnelse tilveiebringe en mer spesifikk binding til anticelle antistoffet og redusere risikoen for mulige kryssreaksjoner med andre celler i oppløsningene, såsom blod. Videre vil inkubering av cellesuspensjonen med et mildt detergent og/eller et andre sett av antistoffer eller antistoffragmenter, formerket eller ikke med fluoriscerende midler, metallokolloider, radioisotoper, biotinkomplekser eller visse enzymer som tillater visualisering, dramatisk øke spesifisiteten av fremgangsmåten.

Videre i henhold til foreliggende oppfinnelse kan fremgangsmåten bli grundig forbedret og forenklet ved å overføre suspensjonen av målceller/partikkelkomplekser til en cellefiltreringsanordning eller celleseparator i henhold til den foreliggende oppfinnelse og det totale antall av målceller kan ses mikroskopisk eller dyrkes i et fysiologisk basert kulturmedium for å bli karakterisert med hensyn på nærvær av spesifikke biokjemiske og biologiske trekk.

Av tegningene viser:

Fig. 1,1 et perspektivriss av en utforming av cellefiltreringsanordningen eller celleseparatoren, delvis montert. Fig. 1,2 viser et perspektivriss av en annen utforming av celleseparatoren, delvis montert. Fig. 2 viser et perspektivriss av en versjon av celleseparator-flerbrønnan-ordning med membranfilter montert. Fig. 3 viser et perspektivriss av en versjon av celleseparator-flerbrønnan-ordning med membranfilteranordning adskilt fra flerbrønnanordningen. Fig. 4 viser et perspektivriss av en versjon av kulturskålen med lokkan-ordning for celleseparator-flerbrønnanordning og/eller membranfilteret.

Fig. 4a viser et sideoppriss av flerbrønnanordningen i kulturskålen.

Fig. 5 viser et perspektivriss av en versjon av celleseparatorfiltratopp-samlingsboks. Fig. 6 viser melanomcelle-partikkelrosetter fanget på cellefilteranordningen ved å anvende den beskrevne fremgangsmåte.

I det følgende er en mer detaljert beskrivelse av fremgangsmåten presentert ved å bruke kreftceller som målceller for deteksjon og mulig isolering. Fremgangsmåten er imidlertid ikke begrenset til kreftceller og beskrivelsen skal ikke begrense fremgangsmåten til dette spesielle anvendelsesområdet siden fremgangsmåten er egnet innenfor et stort område av cytologiske forskningsfelt.

I vurderingen av kreftpasienter er sykdommens trinn, med hensyn på om den er lokalisert eller om det har skjedd metastatisk spredning til andre vev av største viktighet for valg av terapeutisk alternativ for den individuelle pasient. Maligne celler utbres ved direkte invasjon i det omgivende vev, gjennom lymfesystemet eller ved fordeling av tumorceller i blodet til fjerne organer, inkludert benmarg og sentralnervesystem og cerebrospinalvæske.

Deteksjon av metastatiske tumorceller har inntil nylig vært basert på morfologiske fremgangsmåter som bruker lys- og elektronmikroskopi på tumor-prøver tatt ved biopsi, på utstryk av benmarg og perifert blod og på objektglass fremstilt etter cytosentrifugering av forskjellige kroppsvæsker. Siden fremkomst av monoklonale antistoffer, som gjenkjenner antigener hovedsake-lig uttrykt på overflaten av forskjellige typer maligne celler, har identifikasjonen av metastatiske celler i økende grad også omfattet immunocytokjemi og immunofluorescens. Således har objektglass preparert fra tumorbiopsier eller cytosentrifugering blitt behandlet med monoklonale antistoffer og bindingen av disse til tumorcellene blir visualisert kolorimetrisk eller ved fluorescens. Den siste fremgangsmåte krever anvendelse av et fluorescensmikroskop, alternativt å fremstille en cellesuspensjon og anvende et flowcytometer (væskestrømcytometer).

De tidligere fremgangsmåter lider alle av begrenset sensitivitet og/eller spesifisitet og er vanligvis arbeidskrevende og tidskrevende i tillegg til at de krever en høy grad av ekspertise. Flowcytometriske undersøkelser omfatter også dyrt utstyr.

De morfologiske fremgangsmåtene for deteksjon av tumorceller i blod og benmarg er mye mindre sensitive enn fremgangsmåter som omfatter immunocytokjemi og immunofluorescens. De siste fremgangsmåter er imidlertid også inadekvate i tilfeller hvor tumorcellene representerer mindre enn 1 % av det totale antall nuklerte celler. Flowcytometri kan tilveiebringe bedre sensitivitet enn fremgangsmåten som omfatter anvendelse av et mikroskop men krever tilgjengelighet av et stort antall celler og omfatter også betydelige tekniske vanskeligheter. Således kan aggregering av celler forårsake problemer og fremgangsmåten tilveiebringer ikke muligheter til å skille mellom de merkede tumorceller og uspesifikk fluoriscerende normale celler.

Oppfinnelsen tillater en meget sensitiv deteksjon av f.eks. metastatiske tumorceller siden et stort volum og et høyt antall celler lett kan screenes i mikroskopet og de tilfestede magnetiske kuler er lett gjenkjennelig. Fremgangsmåten og anordningen beskrevet tilveiebringer en fast understøttelse og varig registrering som lett kan ses i mikroskop, tillater vurdering og kvantifisering av hele prøven i stedet for små brøkdeler derav og tillater anvendelse av store prøvevolumer i analysen, anordningen kan også skannes automatisk ved hjelp av konvensjonell densitometrisk teknologi. De monoklonale antistoffer som anvendes bindes med tilstrekkelig spesifisitet til f.eks. tumorceller og ikke til andre celler enn målcellene som er til stede i den blandede cellesuspensjonen, såsom blod, benmarg og andre tumormanifisteringer, slik at alle cellene med tilfestede kuler representer målceller. I tillegg er fremgangsmåten hurtig og enkel og kan utføres av hvilken som helst forsker med tilgang til et konvensjonelt mikroskop.

Den nye fremgangsmåten omfatter binding av monoklonale antistoffer, dvs. av murin eller human opprinnelse, som spesifikt gjenkjenner antigener til stede på tumorceller og ikke på normalcellene det er snakk om, eller for andre hensikter vil spesifikke subpopulasjoner av normalceller, til paramagnetiske partikler enten direkte eller til partikler som først belegges med antistoffer som spesifikt gjenkjenner de respektive antistoffer eller Fc-delen av IgG-antistoffer, som bindes til tumorcellene. De cellebindende antistoffer kan være av IgG-typen eller IgM-typen eller være et fragment av ab IgG eller IgM. Eksempler på anvendte antimålcelle antistoffer kan være de som er rettet mot grupper av antigen determinanter, f.eks. CD56/NCAM antigen (MOC-1), Cluster 2 epitelialt antigen (MOC31), Cluster 2 (MW-40kD) antigen (NrLulO) (Myklebust et al., Br. J. Cancer Suppl. 63, 49-53, 1991), HMW-melanom-assosiert antigen (9.2, 27) (Morgan et al., Hybridoma, 1, 27-36, 1981), 80kD, sarkom-assosiert antigen (TP1 & TP3) (Cancer Res. 48, 5302-5309, 1988), mucin antigener (Diel et al., Breast Cancer Res. Treatm., 1991) eller EGF-reseptor antigen (425.3) (Merck) i tillegg til antipanhumant antistoff (Bruland et al., upublisert), som er regnet for å detektere humane celler blant dyreceller. 425.3 antistoffet er rettet mot antigener i både normale og maligne celler. Antistoffer kan videre være rettet mot vekstfaktorreseptorer, f.eks. EGF-reseptor, PDGF (A og B)-reseptor, insulinreseptor, insulinlignende reseptor, transferrinreseptor, NGF- og FGF-reseptorer, grupper av integriner, andre adhesjons membranmolekyler og MDR proteiner i både normale celler og unormale celler, og antigener til stede på subpopulasjoner av normale celler, i tillegg til onkogene produkter uttrykt på membranene til normale og maligne celler og på maligne celler alene, f.eks. Neu/erb B2/HER2. Med hensyn på de maligne celler kan disse være brystkreft-, ovariekreft- og lungekretfceller, melanom, sarkom, glioblastom, kreftceller i gastrointestinal traktus og retikuloendotelialsystemet eller målcellene kan være assosiert med ikke-neoplastiske sykdommer, såsom kardiovaskulære sykdommer, nevrologiske sykdommer, lungesykdommer, auto-immunsykdommer, gastrointestinale sykdommer, genitourinære sykdommer, retikuloendoteliale sykdommer og andre. Videre kan den maligne cellepopulasjon være lokalisert i benmarg, perifert blod, komme fra pleurale eller peritoniale effusjoner og andre kroppsvæskeavdelinger, såsom urin, cerebrospinalvæske, sæd, lymfe eller fra faste tumorer i normalt vev og organer, f.eks. lever, lymfeknuter, milt, lunge, pankreas, benvev, sentralnervesystemet, prostatakjertel, hud og mukøse membraner. En mer fullstendig liste over antigendeterminantene og de tilsvarende antistoffer eller antistoff-fragmenter anvendt i den foreliggende forbedrede fremgangsmåte er presentert i tabell 1.

METODER

Fremgangsmåten omfatter å feste antistoffene direkte til de paramagnetiske partikler, eller den kan foretas som festing til overflatebundet antistoffer, såsom polyklonale antimus antistoffer, monoklonale rotte antimus antistoffer eller monoklonale antihumane antistoffer, som spesifikt gjenkjenner Fc-delen av det nevnte individuelle antistoff. Antistoffbelagte paramagnetiske kuler blir deretter blandet med cellesuspensjonen som skal undersøkes og inkubert fra 5-10 minutter til 2h, fortrinnsvis 30 min. ved 0-25°C, fortrinnsvis ved 4°C, under forsiktig rotasjon. Den foreliggende fremgangsmåte kan også utføres i annen rekkefølge ved at de fri målcelle antistoffer blir satt til cellesuspensjonen, inkubert fra 5-10 min. til 2h, fortrinnsvis 30 min. ved 0-20°C, fortrinnsvis 4°C, under forsiktig rotasjon. De paramagnetiske partikler, forbelagt med antimus eller antihumane antistoffer blir deretter tilsatt den inkuberte cellesuspensjon, som beskrevet ovenfor, og den resulterende suspensjon utsatt for ytterligere inkubering fra 5-10 min. til 2h, fortrinnsvis 30 min., ved 0-25°C, fortrinnsvis 4°C under forsiktig risting. Den foreliggende fremgangsmåte kan også utføres i et forkortet antall trinn ved at fri målcelleantistoffer blir satt til cellesuspensjonen på samme tid og sammen med de forut belagte paramagnetiske partikler og utsatt for inkubering fra 5-10 min. til 2h, fortrinnsvis 30 min. ved 0-25°C, fortrinnsvis 4°C under forsiktig risting. Antallet antistoffbelagte kuler tilsatt cellesuspensjonen bør være mellom 0,5 -10 ganger antallet av målceller. Når dette antall er ukjent bør mengden av belagte kuler tilsatt være 1-10% av det totale antall celler. For spesifikke hensikter og i de tilfeller hvor tettheten av målcellene er lav, f.eks. maligne celler eller at målcellene representerer en meget liten brøkdel av det totale antall celler (tilnærmet 1%) kan målcellen bli positivt adskilt fra ikke-målcellene i et magnetisk felt. De isolerte målceller i cellesuspensjonen kan deretter overføres til en celletellingsanordning, og antall celler med tilheftede kuler kan bestemmes ved mikroskopi. Den foreliggende fremgangsmåte kan fortrinnsvis også utføres ved å overføre den isolerte målcellesuspensjon til cellefilteranordningen beskrevet i foreliggende søknad og det totale antall av isolerte målceller undersøkt ved mikroskopi. De isolerte målceller i filteranordningen kan være fikserte og fargede for å fasilitere undersøkelse ved hjelp av lysmikroskopi. For spesifikke hensikter i tilfelle hvor det er nødvendig at de isolerte målceller er funksjonelt aktive, kan et fysiologisk basert kulturmedium tilsettes cellefilteranordningen og utsettes for inkubering i en uspesi-fisert tid ved 37°C. De isolerte målceller kan dyrkes og derpå karakteriseres for nærvær av spesifikke biokjemiske og biologiske trekk. Videre kan målcellene karakteriseres med hensyn på nærvær av spesifikke biokjemiske og biologiske trekk. Av spesiell viktighet vil det være å anvende like celler til studier i molekylær biologi. I kontrast til de ovenfor siterte fremgangsmåter i kjent teknikk tillater foreliggende fremgangsmåte undersøkelser og vekst av målceller uten å utføre en spalting av den paramagnetiske partikkel/mål-cellebinding. Av forskjellige årsaker er det av interesse å undersøke spesifikke gener i en ren populasjon av målceller på DNA-nivå, mRNA-nivå og proteinnivå, både i tumorbiopsier såvel som i tumorceller som er til stede i blod, benmarg og andre kroppsvæsker, f.eks. urin, cerebrospinalvæske, sæd, lymfe eller fra ellers normale vev og organer, f.eks. lever, lymfeknute, milt, lunge, pankreas, benvev, sentralnervesystem, prostatakjertel, hud og mukøse membraner, og i andre områder av cytologisk forskningsaktivitet. Med fremgangsmåten i henhold til kjent teknikk vil signaler oppnådd ved hjelp av Southern, Northern og Western blots representere normalceller såvel som tumorceller i biopsien. Dersom en enkel cellesuspensjon først fremstilles fra tumormateriale og tumorcellene deretter detekteres positivt immunomagnetisk og separeres ville enhver genundersøkelse utført på dette materiale representere bare målcellene. Dette angår også f.eks. maligne celler som er til stede i pattedyrvev, f.eks. i benmarg, perifert blod, pleurale og peritoniale effusjoner, og andre kroppsvæsker, f.eks. urin, cerebrospinalvæske, sæd og lymfe. Undersøkelser som omfatter polymerasekjedereaksjon (PCR)-teknikk vil også øke i spesifisitet og reliabilitet når det utføres på rene tumorcellepopulasjoner oppnådd ved den nye fremgangsmåten.

Anvendelse av de nye fremgangsmåtetrinn kan variere avhengig av type vev som skal undersøkes. a) Vev fra fast eller nåletumorbiopsier blir fremstilt mekanisk eller ved mild enzymatisk behandling til en enkelcellesuspensjon, til hvilken de primære, spesifikke antistoffer eller antistoff-fragmenter blir satt direkte eller etter vasking av cellesuspensjonen med fosfatbuffret saltoppløsning, eller kulturmedium med eller uten serum, såsom føtalt kalveserum, bovintserum, heste-serum, griseserum, geiteserum eller humant serum.

b) Dersom materialet er en prøve av pleuralt eller ascitisk effusjon, cerebrospinalvæske, urin, lymfe eller kroppsvæsker såsom effusjoner fra leddene hos

pasienter med forskjellige former for artritt, blir de spesifikke antistoffer eller

antistoff-fragmenter enten satt til prøven direkte eller etter sentrifugering med eller uten vasking, før eller etter cellene i prøven er sentrifugert ned og bragt tilbake i suspensjonen.

c) Dersom materialet består av blod eller benmargsaspirat, blir de spesifikke antistoffer eller antistoff-fragmenter enten satt til prøvene direkte eller etter

sentrifugering med eller uten vaskinger før eller etter cellene i prøvene blir sentrifugert ned og bragt tilbake i suspensjon, eller en mononukleær cellefraksjon kan fremstilles ved gradientsentrifugering på f.eks. Lymphoprep før vasking, resuspensjon og tilsetting av passende antistoffer eller antistoff-fragmenter.

Fremgangsmåtebetingelser for a) og b) er etablert som eksemplifisert av resultater oppnådd i vellykkede ekseperimenter som de beskrevet nedenfor.

For c) er resultatene funnet å bli påvirket av et stort antall faktorer som er blitt undersøkt i detalj. Blant disse er antistoffkonsentrasjon, forholdet mellom antall paramagnetiske partikler og antall celler, inkubasjonstider og volumer, type av inkubasjonsmedium og pH-verdi. Partikkel til mononukleær cellefor-hold i alle eksperimenter bør være i området fra 0,5/1 - 2/1, avhengig av bindingsaffinitet til de primære spesifikke antistoffer eller fragmenter.

Et hovedproblem har vært uspesifikk festing til normale blod- eller benmargsceller av parikler belagt med enten sau eller rotte antimus antistoffer, alene eller i tillegg til de spesifikke antistoffer. Eksperimenter har vist at den uspesifikke binding er like høy uten nærvær av spesifikke antistoffer noe som angir at problemet ikke er forårsaket av kryssreaktivitet av de målsøkende antistoffer til normale celler. Muligheten at mindre enn optimal spesifisitet kunne forårsakes av ionebinding er blitt utelukket. En annen mulighet er at subpopulasjoner av normale celler i B-linjen kan feste seg til partikkel-antistoffkomplekser. Immunomagnetisk fjerning av B-celler fra cellesuspensjonen før tilsetting av de spesifikke antistoffer/antistoff-partikkelkomplekser forbedret imidlertid ikke spesifisiteten til de siste.

Problemet med fremgangsmåten anvendt på isolerte mononukleære fraksjoner av benmarg og perifert blod, at noen ikke-målceller også kan binde paramagnetiske partikler er blitt omgått eller overvunnet. Således når det gjelder sau antimus antistoffbelagte partikler alene eller med spesifikke antistoffer ble antall av partikler som var uspesifikt festet til en lav brøkdel av mononukleær blod eller benmargceller redusert fra et gjennomsnitt på 10 til ca 1 og i paralell falt brøkdelen av normale celler med partikler fra 1-2% til 0,5-1% eller mindre.

Det er oppnådd tegn på at problemet kan forårsakes av hydrofobe krefter assosiert med antistoffene bundet til de paramagnetiske partikler. Fremgangsmåter for å redusere denne hydrofobisitet er således krevd. I en slik fremgangsmåte er preinkubering av de antistoffbelagte partikler og cellesuspensjonen med milde detergenter i egnede konsentrasjoner, f.eks. Tween 20 i konsentrasjon på mindre enn 0,1% i 30 min. ved 4°C. Når mulig seleksjon av målceller er berettighet bør cellesuspensjonen inneholde en lav konsentrasjon av detergenten, f.eks. 0,01% av Tween 20. I flere eksperimenter har denne fremgangsmåte nesten eliminert eller dramatisk redusert problemet med uspesifikk binding sett ved mononukleære cellefraksjoner fra blod eller benmarg.

De andre forbedringene som er funnet berettiget kan anvendes sammen med detergenttrinnet som følger: Etter inkubering av cellesuspensjonen med de primære antistoffer eller antistoff-fragmenter og de antistoffbelagte paramagnetiske partikler som beskrevet tidligere blir cellesuspensjonen inkubert med et andre sett av antistoffer eller antistoff-fragmenter styrt mot andre ektstracellulære eller mot intracellulære determinanter i målcellen, med eller uten forbehandling med cellefikserende midler, såsom formaldehyd eller alkohol. Disse antistoffer eller deres fragmenter burde bli formerket med fluoriscerende midler, metallokolloider, radioisotoper, biotinkomplekser eller enzymer såsom peroksidase og alkalinsk fosfatase som tillater visualisering ved hjelp av kjente fremgangsmåter i mikroskopet eller ved hjelp av en passende tellean-ordning.

Målcellene vil både visualiseres med den siste fremgangsmåte og ha bundet partikler til sin overflate og kan således spesifiseres.

For å forenkle skillet mellom ikke-mål- og målceller kan cellesuspensjonen eller en del derav før det andre visualiseringstrinn enten utsettes for cytospin-sentrifugering eller deler av suspensjonen blir festet til belagte objektglass på hvilke de partikkelbundne celler vil spres ut i et tynt lag, og fremme gjen-kjennelsen av dobbelt-"fargede" celler.

En alternativ fremgangsmåte i henhold til foreliggende oppfinnelse for videre å forenkle adskillelsen mellom ikke-mål- og målceller omfatter cellefilteranordningen hvori hele cellesuspensjonen, etter målcelleseleksjonstrinnene kan settes direkte til cellefilteranordningen. De frie ubundne kuler, uspesifikt bundet ikke-målceller og enhver ubundet ikke-målceller vil passere gjennom filteret og etterlate de bundne målceller for visualisering på filteret. Filteret med de isolerte målceller kan fjernes fra anordningen og cellen kan fikseres og farges ved å bruke kjente immunohistokjemiske fremgangsmåter og synliggjøres ved mikroskop. Etter at filteret er blitt fjernet fra anordningen kan det behandles som et konvensjonelt mikroskopisk objektglass av den typen som er kjent og normalt anvendt i immunohistokjemi.

For spesifikke hensikter kan filteret enten fjernes fra anordningen eller forbli en helhet av anordningen og et kulturmedium tilsettes, såsom ethvert kjent kulturmedium med eller uten agarose for å formere de isolerte målceller lokalisert på filteret.

For anvendelsen i den nye fremgangsmåte vil sett inneholde f.eks. forbelagte paramagnetiske partikler fremstilt for hvert monoklonalt antistoff. I en annen utforming inneholder settet paramagnetiske partikler forbelagt med IgG isotyp spesifikk antimus eller antihumant antistoff som en del av det og forskjellige målcelleassosierte, f.eks. tumorcelle, antistoffer som en annen del. I en tredje utforming inneholder settet paramagnetiske partikler forbelagt med spesifikke anti-Fc antistoffer, såsom polyklonalt antimus eller monoklonalt rotte antimus eller antimus, eller antihumane antistoffer, i stand til å bindes til Fc-delen av de målcelleassosierende antistoffene, bundet til spesifikke antimålcelle antistoffer. I en fjerde utforming inneholder settet adskilte partikler av paramagnetisk eller ikke-magnetisk natur, som kan belegges eller ikke belegges med et målcelleantigen eller gruppe av målcelleantigener slik at ved å bearbeides med fremgangsmåten blir disse partikler fanget i cellefilteranordningen og virker derved som en kontroll som viser f.eks. at alle sider av antistoff-antigen gjensidig påvirkninger i fremgangsmåten virker korrekt. Disse partikler kan innkorporeres i cellesuspensjonen på et trinn før eller under fremgangsmåten eller partiklene kan anvendes som en separat "cellesuspensjon" som blir bearbeidet ved å benytte samme fremgangsmåte som cellesuspensjonen som omfatter målcellene som skal separeres. I en ytterligere utforming inneholder settet andre spesifikke antistoffer eller antistoff-fragmenter rettet mot antigener/reseptorer i eller på de ønskede målceller, hvor nevnte antistoffer eller antistoff-fragmenter er konjugert til peroksidase, alkalisk fosfotase eller andre enzymer sammen med relevant substrat til slike enzymer eller hvor nevnte antistoff eller antistoff-fragmenter bindes til ikke-paramagnetiske partikler med spesifikke farger eller med bundne enzymer, såsom peroksidase og alkalisk fosfatase.

Det problemet foreliggende oppfinnere sto ovenfor, var å kunne detektere

tumorceller med 100% spesifisitet med en enkel og kortvarig fremgangsmåte, og å filtrere ut disse cellene som hadde festet seg til kulene på en slik måte at målcellene ikke ble skadet og at cellene kunne dyrkes på filteret. Ingen av de eksisterende motholdene, ei heller kjent teknikk generelt, gjorde dette mulig.

Det viste seg, overraskende at for foreliggende kule-filtermetode var det først og fremst spesifisitet, temperatur, kuleratio og dyrkingsmuligheter som var de viktige aspektene.

1. SPESIFISITET

I kjent teknikk beskrives bruk av immunomagnetiske kuler til å separere celler på samme måte som i vår søknad. Forskjellen er imidlertid at mens kravet til spesifisitet for binding av kuler til sine målceller ikke er særlig stort, krever vår metode 100% spesifisitet. I motholdene er man derfor fornøyd med en oppkonsentrering av målcellene ved hjelp av immunomagnetiske kuler, og i kjent teknikk er det umulig å skille målceller fra tilsvarende celler som normalt finnes i blod og benmarg. F.eks. vil forsøk på å isolere maligne celler av hematopoetisk opprinnelse fra de normale være mislykket fordi det ikke finnes antigener som spesifikt uttrykkes i de ondarte-de cellene. I WO 92/04961 beskrives det en spesifisitet som maksimalt er ca 70%. Dette er høyst uakseptabelt for vår metode hvor kulene, som bindes som rosetter til målcellene, er den avgjørende parameteren for seleksjon og deteksjon i mikroskop. Dessuten er også filtermetoden avhengig av at det kun er tumorceller som blir holdt tilbake på overflaten av filteret, altså må spesifisiteten av binding av kuler til celler være 100%. I motsetning til kjent teknikk, har vi klart å oppnå dette ved å bruke spesielt egnede og selekterte antistoffer og ved at vi har overraskende funnet betingelser under prosedyren som hindrer uspesifikk binding av kuler til ikke-målceller. Tabell 2 viser resultater av bindingsforsøk med flere forskjellige antistoffer til cellelinjer og til normale benmarg (BM) og blodceller (PBL). Antistoff 1 er MOC-31, antistoff 2 er BM-7, antistoff 3 er C-595. Tabellen viser at antistoffene bindes i varierende grad, avhengig av type antistoff til cellelinjene men ikke til normale benmargs- og blodceller.

I foreliggende fremgangsmåte har vi vist at vi oppnår 100% spesifisitet, blant annet ved å merke tumorceller med fluorescens før de tilsettes blod eller benmarg. Når fremgangsmåten da er gjennomført kan vi i lysmikroskop observere de celler som har kulerosetter på overflaten og ved hjelp av fluorescerende lys kan vi se at alle celler med merking av de normale cellene er også utført med tilsvarende resultat.

2. TEMPERATUR

Som det fremgår av foreliggende patentsøknad er temperaturbetingelsene viktige. Dette skyldes at binding av antistoffer til celler vanligvis utføres ved værelsestemperatur eller ved 37°C. Dette ble også gjort i vårt laboratorium, men det viste seg at uspesifikk binding av kule-antistoff-komplekset til ikke-målceller skapte betydelige problemer. En av måtene vi benyttet til å forhind-re dette var bruk av detergenter. Bruk av detergenter ga en klart høyere spesifisitet, men ikke 100%». Ved en tilfeldighet fant vi imidlertid at hvis alt arbeid foregikk ved 4°C (inklusiv å holde magneten kald) unngikk vi enhver uspesifikk binding så sant vi benyttet tumorspesifikke antistoffer. Dette overraskende funnet og betydning av å arbeide ved 4°C er vist gjennom en rekke eksperimenter. Vi har også vist at hvis vi lar en cellesuspensjon hvor vi ved utgangspunktet (4°C) har en spesifikk binding av kulerosetter til cellenes overflate, blir stående med gradvis økning i temperaturen, far vi i økende grad en uspesifikk adhesjon/binding av kulekompleksene til ikke-målceller. Denne temperatureffekten er vist i tabell 3 som angir bindingsstyrke og spesifisitet ved indirekte metode og direkte metode uten mononukleære celler (MNC) og med mononukleære celler. Antall pluss angir styrken av bindingen mens antall positive celler angis i prosent. Cellelinjen er en prostatacancer-celle (PC-3) og antistoffet benyttet er MOC-31. Det skal bemerkes at dette antistoffet ikke binder seg 100% til angitte cellelinje. Det demonstreres at å utføre fremgangsmåten ved romtemperatur ga mye uspesifikk binding med mononukleære celler mens å utføre fremgangsmåtene ved 4°C ikke ga uspesifikk binding i det hele tatt. Ved den direkte metoden ved værelsestemperatur og mononukleære celler ble det igjen demonstrert mye uspesifikk binding som forsvant når temperaturen ble redusert til 4°C.

Tabell 3

Temperatur ved inkubasjon.

Angir styrken av binding av kuler til målcellene

Cellelinje: PC-3 (prostatacancer MOC-31 binder ikke 100%) Antistoff: MOC-31

Indirekte metode og direkte metode

Inkuberingstid: 30 min.

3. KULERATIO

Ved den foreliggende fremgangsmåten har det vist seg at for å oppnå en mest mulig effektiv seleksjon av målceller fra en cellepopulasjon ved bruk av immunomagnetiske kuler, er forholdet mellom antall kuler og antall celler totalt tilstede i suspensjon meget viktig. I tillegg til at kulene må ha mulighet til å bindes til antigenet på cellenes overflate er det også viktig for rosetteringen at man får bundet flere enn 1-2 kuler pr. celle. Dette er viktig både for magnetuttrekket, for påvisning av rosetter i mikroskopet og for at målcellene skal holdes tilbake på filteret under separasjonsprosessen. Vi har gjort en rekke forsøk med forskjellige forhold av kuler til målceller og kuler til totalt antall mononukleære celler. I prøver fra blod og benmarg viser det seg at et forhold på 5:1-10:1 er optimalt for fremgangsmåten (tabell 4). Vi er kjent med at forskere som har arbeidet med kuler har brukt lavere kule/celle-ratio og resultatene er da også betydelig dårligere.

Tabellen angir forskjellige cellelinjer i venstre kolonne og antistoff i høyre kolonne. Plussene angir styrken av bindingen og prosentandelen angir pro-sentvis antall positive celler. Hvis man tar utgangspunkt i kolonne med forholdet 1:1, ser vi at det å bevege seg mot venstre øker styrken i bindingen eller prosent binding. Konklusjonen på foreliggende tabell er at et forhold mellom 10:1 og 5:1 er mest adekvat for å få sterkest mulig rosetter og fange opp de tumorcellene som er tilstede.

4. CELLEVEKST

Som nevnt ovenfor i fremstillingen kan filtermetoden benyttes til selektiv vekst av målceller på toppen av filteret under inkubering med vekstmedium. Av de filtre vi har prøvd har dette vist seg bare å være mulig med det filtersystemet som er beskrevet i henhold til oppfinnelsen. Vi har med dette filtersystemet observert vekst over tid av tumorcellene på filteret. Således ser man at cellene deler seg og vokser ut fra de opprinnelige påviste rosettene. Faktisk har vi også sett at celler kan vokse ut langs filterfibrene helt ut i kanten. Denne tekniske effekt har ikke vært mulig å oppnå med noen av filtrene i henhold til kjent teknikk.

Som ytterligere bevis på metodens betydning, dvs. at vi oppnår utover det som er forventet i henhold til kjent teknikk, har vi gjort direkte sammen-lignende forsøk hvor vi har benyttet metoden i henhold til foreliggende oppfinnelse (immuno beads) med den best tilgjengelige konvensjonelle metode (immuno cytokjemi) for å detektere tumorceller som på forhånd har blitt tilsatt mononukleære celler (MNC) fra blod eller benmarg. Dette er tabulert i tabell 5 som viser forsøkene hvor det i alle forsøk er brukt samme antall mononukleære celler, nemlig 2x10<6>, og de to fremgangsmåtene er sammenlignet for tre cellelinjer ved to forskjellige konsentrasjoner av tumorceller/mononukleære celler. Vi ser at foreligende fremgangsmåte (immuno beads) gir en betydelig høyere prosentandel av gjenvunnede tumorceller enn immunocytokjemifremgangsmåten. Når det gjelder immunocytokjemifremgangsmåten så er det ikke praktisk mulig å undersøke mer enn 2x10<6> celler mens med fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelsen (immuno beads) kan 10 ganger så mange celler benyttes i undersøkelsen. Det fremgår altså av tabell 4 at foreliggende kulemetode klart gir tekniske effekter som ikke oppstår med kjent fremgangsmåte. I tillegg økes sensitiviteten av fremgangsmåten betydelig ved at det ved foreliggende fremgangsmåte minst kan undersøkes 10 ganger så mange mononukleære celler som med den kjente immunocytokjemiske fremgangsmåte. Økningen i sensitiviteten blir derfor minst 40 ganger.

Tabell 6 er en oppstilling av foreløpige resultater av undersøkelser hvor fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen ble benyttet på prøver fra pasienter. Tabellen viser at det ble oppnådd positive resultater i 45% av prøvene ved brystkarsinom, 37% av prøvene ved malignt melanom og 44% av prøvene ved cancer coli. Søkerne har dessverre ikke direkte sammenligningsresultater i disse tilfellene hvor prøvene er undersøkt både med foreliggende fremgangsmåte og fremgangsmåten i kjent teknikk, men for en fagmann på området er brøkdelen av positive prøver klart høyere enn det man normalt finner i slike undersøkelser.

APPARATUR

Det nye trekk ved fremgangsmåten angår en cellefilteranordning som også kan betegnes en mulitbrønncelleseparator og kan eller kan ikke være en del av settet som beskrevet. Anordningen angår et mikrobrønncelleseparasjons-anordning som blir brukt til å separere blandede populasjoner av celler av forskjellig størrelse såsom de funnet i blod eller benmarg. De resulterende celler kan ses direkte på membranen ved mikroskopi eller ved automatiserte skanningsanordninger. Denne oppfinnelse kan anvendes sammen med konvensjonelle magnetiskpartikkelcelleisolasjonsteknikker for å tilveiebringe en hurtig, følsom og enkel fremgangsmåte for å screene store antall av høy- eller lawolumprøver for nærvær av tumorceller på 1 til 4 timer.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en mikrobrønn-celleseparatoranordning som omfatter en åpen (uten lokk) filtratoppsamlingsboks som kan eller kan ikke ha en tilkobling for et vakuumrør og som har en multibrønnanordning som kan fjernes og kastes, med et celleseparerende membranfilter som danner basis av disse multiple brønner. Et lokk eller deksel på denne anordning kan også tilveiebringes.

Filtratoppsamlingsboksen og lokkarrangementet kan fremstilles fra et materiale som er passende for høytemperatursterilisering eller kan fremstilles fra et plast gjennomsiktig materiale eller opakt plastmateriale slik som er kjent for plastvarer i tilknytning til vevskultur.

Det celleseparerende membranfilter kan omfatte en regulær og konsistent porefasong og størrelse, såsom de som er funnet i nylon monofilament-membraner, som danner basis av de individuelle brønner. Det celleseparerende membranfilter kan være sikret til mikrobrønnene slik at det kan fjernes etter celleseparasjonsfremgangsmåten for å lette undersøkelsen. Den celleseparerende membran kan også omfatte et kort eller en plastomgivende ramme for å lette undersøkelsen etter at de er fjernet fra mikrobrønnene.

Filtratoppsamlingsboksen kan omfatte en ramme hvori strimler av mer enn en brønn, som kan fjernes, kan innsettes.

Filtratoppsamlingsboksen kan tilpasses en konvensjonell 96-brønnplate tilpasset for å huse den celleseparerende membran, oppsamlingsboks og lav-trykksvakuumtilkobling.

Oppfinnelsen kan også omfatte et øvre lokk eller deksel.

En kulturskål som kan kastes med lokk blir tilveiebragt i oppfinnelsen, som tillater mikrobrønnstrimlene og innsettes og dyrkes aseptiskt. I kulturskålen er det hakk som letter plasseringen av mikrobrønnstrimmelen på samme måte som i filtratoppsamlingsboksen og for å hindre bevegelse av mikrobrønn-strimmelen under dyrking. Hakkene som beskrevet kan eller kan ikke tilveiebringe lokalisering av den celleseparerende membran etter fjerning fra mikrobrønnstrimmelen.

Oppfinnelsen vil ytterligere klargjøres i den følgende beskrivelse med referan-se til figurene i de medfølgende tegninger, som viser, bare ved hjelp av eksempel, en form av mikrobrønncelleseperatoranordningen, som er en utforming av den samme.

Idet det refereres til figur 1 til 5 på tegningene vil det ses at mikrobrønncelle-separatoranordning 20 består av et lokk eller deksel 21 og en filtratoppsamlingsboks 22 som kan eller kan ikke ha en lavtrykksvakuumtilkoblingsport 23, med multibrønnstrimler 24 som kan fjernes og som har en avtagbar membranbase 25 med understøttelse 25a.

Fig. 1,1 og 1,2 viser to alternative utforminger av oppfinnelsen delvis montert.

Filtratoppsamlingsboks 22 kan tilsvare på noen måter konvensjonelle 96-brønners plateformater med avtagbare brønnstrimler og kan anordnes til å tilpasses en eller flere strimler av brønner.

Multibrønnene 24 kan anordnes i doble strimler som vist, eller i enkle eller multiple strimler.

Anordningen av multibrønner 24 i filtratoppsamlingsboks 22 er slik at bare en orientering er mulig, som kan bli tilveiebragt ved styrende pinner 28 eller hakk 29.

Celleseparatormembranfilter 25 er festet til bunnen av multibrønnene 24 og danner basis av brønnene. Festingen av membranfilter 25 til multibrønnene 24 er slik at de kan adskilles uten deformasjon av membranfilteret 25 eller membranfilterunderstøttelse 25a.

Membranfilteret 25 kan besiktiges ved mikroskopi eller kan skannes ved densitometriske eller lignende metoder.

Membranfilteret 25 kan omfatte en regulær og konsistent porefasong og størrelse såsom funnet i nylonmonofilamentmembraner, som danner basis av de individuelle brønner og kan være av 5-75 \ im porestørrelse, men fortrinnsvis 20um.

Mulitbrønnene 24 med eller uten filtratoppsamlingsboks 22 kan også være fremstilt av et materiale egnet for vevskulturhensikter, som også kan være passende for å besktiges ved konvensjonell 96-brønnplateskanning eller plate-lesende maskiner.

Kulturskålen 26 og kulturskållokk 27 kan også være fremstilt av et materiale passende for vevskulturhensikt. På denne måte er det mulig å tilføre kulturmedium både gjennom toppen av multibrønnene og i bunnen av kulturskålen 26.

Alle dimensjoner vist i figuren er eksemplariske og cellefilteranordning 20 skal ikke begrenses av disse dimensjoner. Videre vil det foretrekkes at det ikke er en hensikt å begrense oppfinnelsen til beskrevne eksempler idet

mange variasjoner er mulig uten å avvike fra oppfinnelsens ide. Den foreliggende fremgangsmåte vil i det følgende illustreres ved modelleksperimenter, eksempler som belyser nyttigheten av den nye fremgangsmåten og eksempler på pratktiske anvendelser. Disse eksempler skal ikke blir betraktet som på noen måte å begrense oppfinnelsen.

MODELLEKSPERIMENTER

1. Binding av antistoff- kulekomplekser til tumor cellelinjer. For å bestemme antistoffkonsentrasjoner og optimale betingelser for binding av antistoff-paramagnetiske partikkelkomplekser til tumorceller ble et stort panel av kreftcellelinjer anvendt. De paramagnetiske kulene ble bundet til cellene enten ved å belegge de spesifikke antistoffer på sau-anti-mus antistoff-(SAM)-belagte paramagnetiske partikler, eller ved først å inkubere cellene med de spesifikke antistoffer, vaske, etterfulgt av en andre inkubasjon med SAM-belagte partikler. Resultatene av disse eksperimenter er gitt i tabellene 7a og 7b, i hvilke + angir binding av flere kuler til alle celler, (+) angir enten et lavere antall kuler bundet til hver celle eller at ikke alle tumorcellene hadde kuler festet til sin overflate, mens -

reflekterer ingen binding og (-) angir meget svak binding.

2. Deteksjon av tumorceller i den mononukleære fraksjon av benmarg eller perifert blod. Modelleksperimenter ble utført hvor spesifikke antistoffer og SAM-belagte paramagnetiske partikler ble satt enten til slike mononukleære celler eller til en cellesuspensjon hvor et forskjellig antall kreftceller fra in vitro dyrkede cellelinjer ble tilsatt til nevnte mononukleære celler. I noen eksperimenter ble enten de mononukleære celler eller de maligne celler forfarget med et fluoriscerende fargestoff for å være i stand til å skille mellom de to celletyper. I alle eksperimenter ble ikke-bindende primære antistoffer og/eller sau-anti-mus antistoffbelagte kuler anvendt separat som kontroller. Ytterligere eksperimenter uten fremstilling av en mononukleær cellefraksjon i perifert blod ble utført. Det ble funnet at separasjonen av celler på denne måte reduserte mengden av uspesifikk binding sammenlignet med Lymfoprep-separerte blodfraksjoner. 3. Separasjon og visualisering av antistoff- kulekomplekser til tumor cellelinjer ved å anvende cellefilteranordningen. Tumorcellesuspensjonene og fiuorescens-merkede tumorceller blandet med blod eller benmargs-suspensjoner ble fremstilt og behandlet som beskrevet i modelleksperimenter 1 og 2 og ble utsatt for cellfilteranordningen. Etter vasking, fiksering og farging av cellene'på filteret i anordningen ble filteret besiktiget ved mikroskopi. Resultatene fra tumorcellesuspensj onen alene viste antistoff-kule-tumorcellekomplekser klart isolert på filteret. Resultatene fra de fluorescensmerkede tumorcellesuspensj oner sammen med blod eller benmarg viste også antistoff-kule-tumorcellekomplekser klart isolert på filteret (fig. 6). Ytterligere eksperimenter for å undersøke sensitiviteten til fremgangsmåten viste at 100 tumorceller kunne detekteres ved å anvende denne fremgangsmåte når de blandes med en suspensjon på IO<7 >blod- eller benmargsceller. 4. Vekst av adskilte celler isolert ved anvendelse av cellefilteranordningen. Tumorcellesuspensjoner ble behandlet og isolert som beskrevet i modelleksperimenter 1 og 2, ble utsatt for filteranordningen og filteret ble deretter inkubert i et halvfast medium som inneholdt 0,3% agarose i dyrkingsmedium som inneholder 20% kalveserum. Cellene ble inkubert i en atmosfære på 5% C02 ved 37°C. Tumorcellene viste evne til å dele seg og vokse.

I flere eksperimenter ble det observert noe uspesifikk binding til mononukleære celler som ikke ble funnet å være relatert til naturen av det spesifikke antistoff og som var like uttalt med SAM-belagte partikler alene. Størrel-sen av denne uspesfikke binding varierte fra nesten 0% til et nivå mellom 0. 5.2%. Denne uspesifikke binding ble nesten eliminert ved mild behandling med detergent (Tween 20) utført for å redusere problemet med hydrofobe celleinteraksj oner.

EKSEMPLER PÅ NYTTEN AV FREMGANGSMÅTEN

1. Deteksjon av mikrometastatisk neoplastisk sykdom i blod og marg. Tidlig og reliabel diagnose på spredning av cancerceller til blod og/eller benmarg har i økende grad blitt viktig for valget av optimal terapi, muligens kurativ i mange typer av cancer, inkludert karsinomer som beskrevet i anvendelseseksempel 1. Lignende fremgangsmåte for maligne melanom, sarkom, neuroblastom og flere andre kreftformer er blitt etablert eller er under utvikling. 2. Deteksjon av maligne celler i pleurale eller ascitiske effusjoner og urin. Naturen til slike effusjoner kan representere et viktig diagnostisk pro-blem, spesielt når et lite antall kreftceller er til stede sammen med normale reaktive eller epiteliale celler. I flere tilfeller har en definitiv diagnose hurtig blitt foretatt ved hjelp av den nye fremgangsmåten, i tilfelle hvor konvensjonell cytologisk undersøkelse har vært negativ eller inkonklusiv. En lignende fordel kan demonstreres i tilfelle med kreft i nyrer eller i urintrakten og blæren. 3. Deteksjon av neoplastiske celler i cerebrospinalvæsken. Mens den sys-temiske behandling av mange krefttyper er forbedret har frekvensen av tilfeller med symptomgivende hjernemetastaser øket signifikant og i paralell med dette øke nødvendigheten av tidlig deteksjon av slik spredning. Med anvendelse av den nye fremgangsmåten kan selv et lavt antall maligne celler lette identifiseres og tillater intervensjon med terapeutiske alternativer på et tidlig trinn i intrakranial tumormanifestasjoner. 4. Diagnose av cancer i vevsbiopsier. Ved mistanke om kreft og når vevsbiopsier oppnås ved kirurgiske fremgangsmåter eller ved f.eks. nåle-biopsier kan en mye mer enkel og hurtig diagnose foretas med den nye fremgangsmåten anvendt på fremstilte cellesuspensjoner sammenlignet med konvensjonelle morfologiske eller immunohistokjemiske eller cytokjemiske fremgangsmåter. Det kan skilles mellom flere alternative kreftformer ved anvendelse av passende antistoffer. 5. Identifikasjon av prognostiske indikatorer. Siden ekspresjonen av flere membranmolekyler er blitt vist å korreleres med utvikling av malign sykdom i flere kreftformer kan den foreliggende fremgangsmåte anvendes til å identifisere prognostiske indikatorer f.eks. som beskrevet i anvendelseseksempel 2. 6. Identifikasjon av celler som er indikative på spesifikke sykdommer eller på sykdomsutvikling eller tilstandi forskjellige typer av reumatiske sykdommer (såsom reumatoid artrit) såvel som i allergiske, autoimmune og kardiovaskulære sy dommer er identifikasjon av systemisk eller lokalt nærvær av spesifikke subpopulasjoner av celler viktig for diagnose og for å bestemme sykdommstrinnet. Hurtig deteksjon av slike cellepopulasjoner med den nye fremgangsmåten er derfor av betydelig diagnostisk og terapeutisk viktighet. 7. Deteksjon av subpopulasjoner av normale celler. Av mange grunner vil det være viktig å detektere fraksjonen av en spesiell subpopulasjon av normale celler i en populasjon. Dette anvendes f.eks. på leverbiopsier hvor identifikasjon av celler som uttrykker det billiære epiteliale antigen kan være av betydning. På samme måte kan identifikasjon og mulig isolasjon av spesifikke endoteliale celler fra en cellesuspensjon fremstilt fra forskjellige normalvev være fordelaktig. 8. Isolasjon og vekst av utvalgte celler. For mange av de ovennevnte hensikter kan det være nødvendig å ha større cellepopulasjoner å under-søke. Den foreliggende fremgangsmåte som benytter cellefilteranordningen kan tilveiebringe tilstander som tillater formering av de positivt selekterte målceller uten nærvær av frie ubundne partikler eller andre uspesifikk bundne celler.

Flere av cellemembranmolekylene nevnt ovenfor i seksjoner 1-6 kan også brukes som mål for immunoterapi med forskjellige typer av aktiverte dreper-celler eller f.eks. med immunotoksiner. Identifikasjonen med den nye fremgangsmåten av ekspresjonen av slike molekyler er derfor også av betydning for å bestemme i hvilke tilfeller slike typer av terapi bør anvendes.

EKSEMPLER PÅ PRAKTISK ANVENDELSE AV FREMGANGSMÅTEN

Eksempel 1. For å diagnostisere spredning av kreftceller i blod og/eller benmarg på et tidlig trinn har vi i den nye fremgangsmåten anvendt MOC-31, NrLulO, BM2, BM7, 12H12 og MLuCl anti-karsinom antistoff for å bestemme om mikrometastatisk sykdom fra bryst, lunge, kolorektal og prostatacancer kan følsomt identifiseres i slike kroppsvæsker. De vellykkede resultatene med disse antistoffer har betydelige kliniske implikasjoner.

Eksempel 2. Ekspressjon av mange cellemembranmolekyler er blitt vist å korreleres med utvikling av malign sykdom i flere krefttyper. Deteksjon av binding av slike molekyler til respektive antistoffer kan derfor anvendes for å oppnå informasjon av høy prognostisk verdi. Blant slike antigener er et høyt antall av adhesjonsmolekyler, karbohydratantigener, glykolipider, vektsfaktor-reseptorer og karsinommarkører ført opp nedenfor. Vi har med den nye fremgangsmåten identifisert binding av partikkel-antistoffkomplekser til CD44 varianter, E-kadherin, Le<Y>, CEA, EGF-r, transferrinreseptor, MUC-1 eptitop, LUBCRU-G7 epitop, prostatacancerantigen, UJ13A epitop, 2-mikroglobulin, HLA-antigener, og apoptosisreseptor.

Eksempel 3. To liter av pleuraleffusjon fra en pasient som var antatt å lide av malignt melanom ble oppnådd. Etter sentrifugering ble cellene suspendert i et volum på 2 ml av RPMI med 10% føtalt kalveserum, inkubert med 9.2.27 antimelanomantistoff (10 g/ml) ved 4°C i 30 min, vasket og igjen inkubert med Dynabeads SAM M450/IgG2A ved 4°C i 30 min. Cellesuspensjonen ble deretter undersøkt under et mikroskop for å bestemme fraksjonen av celler med paramagnetiske celler festet til sin overflate. Diagnosen på malignt melanom ble konfirmert idet ca 10% av cellene hadde et signifikant antall av bundne partikkelrosetter.

Eksempel 4. Vevsbiopsier ble oppnådd fra en subkutan tumor i et tilfelle med kliniske indikasjoner på enten småcellelungekreft eller et malignt melanom. En enkel cellesuspensjon ble fremstilt fra biopsien, delt i to fraksjoner, en inkubert med 9.2.27 antimelanom antistoff og den andre med MOC-31 antikarsinom antistoff (begge på 10 g/ml). Inkuberingen var lik den anvendt i eksempelet ovenfor. Ingen av cellene inkubert med melanom antistoff bandt noen kuler, mens alle tumorceller inkubert med MOC-31 var positive.

Eksempel 5. Vevsbiopsi fra en pasient som er mistenkt å ha malignt melanom ble undersøkt ved å fremstille enkeltcellesuspensjon, inkubert med 9.2.27 antimelanom antistoff, og deretter ble fremgangsmåten angitt ovenfor fulgt. De fleste av cellene var positive med et høyt antall av partikkelrosetter festet til sine membraner.

Eksempel 6. En pleural effusjon fra en brystkreftpasient ble studert for å undersøke om tumorceller kunne detekteres i væsken. En liter av væsken ble sentrifugert, cellene resuspendert og i separate beholdere inkubert med hver av 3 forskjellige antikarsinom antistoffer (MOC-31, 2E11, 12H12). Etter gjennomkjøring av fremgangsmåten som i foregående eksempel ble det funnet at flesteparten av cellene ble bundet til antistoffbelagte partikler i alle tre tilfellene.

Eksempel 7. En benmargssuspensjon oppnådd fra en brystkreftpasient ble studert for å undersøke om mikrometastatiske tumorceller kunne være til stede. Etter fremstilling av mononukleære celler ble disse inkubert med de samme tre antikarsinom anitstoffer anvendt i eksempelet ovenfor, men i dette tilfellet ble antistoffene først festet til Dynabeads SAM IgG paramagnetiske partikler. Etter en inkubasjon med disse direkte belagte partikler ble cellesuspensjonen undersøkt i mikroskopet og et høyt antall av celler ble funnet positive med et antall partikkelrosetter festet til sine membraner. Lignende eksperimenter er blitt utført i et antall av pleurale eller ascitiske effusjoner, benmarg fra pasienter med brystkreft.

Eksempel 8. T47D humane brystkarsinomceller ble inkubert i varierende tids-lengder med Hoechst fluorescens fargestoff og viabiliteten til de merkede celler ble undersøkt. Forskjellige antall av merkede brystkarsinomceller ble deretter satt til 1 x IO<6> benmargceller oppnådd fra friske frivillige givere. I forskjellige eksperimenter ble forskjellige konsentrasjoner av paramagnetiske monodisperse partikler (Dynabeads P450) belagt med individuelle anti-karsinom antistoffer (NrLulO, MOC31 eller 12H12) ble tilsatt. Etter inkubasjon i 30 min på is ble prøver fra de forskjellige reagensrør undersøkt i et tellekammer under lys og fluorescensmikroskopi. Når forholdet mellom tumorceller og totalt nuklerte celler var lavt ble cellesuspensjonen utsatt for et magnetisk felt og cellene med partikler festet til seg ble isolert før undersø-kelse i mikroskopet. Det ble funnet at et optimalt forhold på 1-10 paramagnetiske kuler pr tumorcelle i celleblandingen, alle tumorcellene hadde fra 2-15 kuler festet til sin overflate. Sensitiviteten til deteksjonsmetoden var nær en målcelle pr 10<4> nuklerte celler. I kontrolleksperiment med merkede tumorceller under anvendelse av antistoffer kjent for å ha en viss kryssreaktivitet til normale celler ble denne kryssrekativitet konfimert med antistoffbelagte paramagnetiske partikler. I eksperimenter med kuler uten kreft-assosiert antistoffbelegg bandt ingen av målcellene noen kuler.

Lignende eksperimenter er blitt utført både med andre brystkreftlinjer og ved cellelinje av småcellelungekreft. Lignende sensitivitet ble oppnådd i disse eksperimentene.

Eksempel 9. Pleural- og ascitesvæske fra pasienter med brystkreft og ovarie-karsinom ble sentrifugert, de samme belagte paramagnetiske partikler anvendt i eksempel 1 ble tilsatt, inkubert og konsentrert i et magnetisk felt før suspensjonen ble undersøkt under lysmikroskopi. Typisk hadde celler som hadde de klare morfologiske trekk til tumorceller tilfestede kuler, mens ingen av de fa normale celler ble bundet til antistoffbelagte kuler. I to tilfeller med pleural effusjon, klargjorde en uavhengig morfologisk undersøkelse ikke nærvær av noen tumorceller mens et signifikant antall maligne celler ble detektert ved anvendelse av antistoffbelagte kuler. I noen tilfeller ble tumorceller adskilt i et magnetisk felt og overført til vevskulturbeholdere som inneholder vekstmedium spesielt preparert for å dyrke brystkreftceller, i forsøk på å etablere permanente cellelinjer fra disse kulturer. Paralellt ble celler fra de maligne effusjoner dyrket direkte uten positiv selleksjon med magnetiske kuler. I de siste tilfeller kunne ingen cellelinje etableres mens i mer enn 50% av tilfellene hvor positivt selekterte tumorceller var blitt anvendt var etableringen av cellelinjene vellykket.

Eksempel 10. I noen tilfeller ble benmarg og perifert blod, oppnådd fra pasienter med brystkreft, undersøkt med foreliggende fremgangsmåte ved å tilsette antistoffbelagte paramagnetiske kuler, inkubert i 30 min ved 4°C og konsentrert i et magnetisk felt og ved å undersøke suspensjonen under lysmikroskopi. I begge tilfeller ble binding av de paramagnetiske kuler til tumorceller, som representerte 0,1-1% av de nuklerte celler i benmargen og blod, oppdaget. Dette var celler som ikke kunne identifiseres ved noen annen metode.

Eksempel 11. Antistoff mot visse vekstfaktorreseptorer eller andre gen-produkter uttrykt på overflaten av spesifikke cellepopulasjoner kan anvendes for å identifisere og postivit selektere disse celler. Kuler belagt med anti-transferrinreseptor antistoff, brukt i den nye fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse ble vist å representere en hurtig, enkel og sensitiv fremgangsmåte for identifikasjon av celler som uttrykker transferrin-reseptoren.

Eksempel 12. Av forskjellige årsaker er isolering av spesifikke populasjoner av normalceller anbefalt. Endoteliale celler som dekker kapillerveggen eller små kar i normale vev eller kreftvev kunne positivt selekteres fra cellesuspensjoner fremstilt fra de relevante vev. Fremgangsmåten omfattet anvendelse av kuler belagt med antistoff rettet mot strukturer uttrykt på endotelialcellene men ikke på de andre normalcellene i celleblandingen.

Eksempel 13. Humane celler injisert inn i immunodefekte gnagere ble vist å være til stede i cellesuspensjoner fremstilt fra tumorxenotransplantat og fra forskjellige verts organer/vev ved å anvende magnetiske partikler belagt med et anti-pan humant antistoff.

Eksempel 14. Tumorcellelinjer fra brystkarsinom- og melanompasienter ble separert fra en populasjon av blod eller benmargceller og filtrert ved å bruke den beskrevne cellefilteranordning. Etter tilsetting av dyrkingsmedium og påfølgende inkubering var de selekterte tumorceller på filteret i stand til å vokse i fravær av frie ubundne partikler eller andre uspesifikt bundne celler.

Claims

1. Fremgangsmåte til å detektere spesifikke målceller i cellesuspensjoner av blandede cellepopulasjoner og i fluidsystemer som inneholder blandede cellepopulasjoner og i enkeltcellesuspensjoner fremstilt fra faste vev, unntatt normale og maligne hematopoetiske celler i blod og benmarg, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn;

1.1 å belegge ved hjelp av en kjent fremgangsmåte, paramagnetiske partikler eller kuler med enten a) antistoffer eller antistoff-fragmenter rettet mot membranstrukturer spesifikt uttrykt på målceller og ikke på ikke-målceller i celleblandingen eller, b) antistoff, fortrinnsvis polyklonale anti-mus eller monoklonale rotte anti-mus antistoff eller antihumant antistoff, som er i stand til å bindes til Fc-delen av de nevnte antistoffer, rettet mot membranstrukturer, hvor forholdet mellom partikler og celler er fra 5:1 til 10:1; og

1.2 1.2.1 å blande målcelleassosierende antistoffer som er festet til nevnte partikler eller kuler, eller festet til kulene forbelagt anti-mus eller antihumane antistoffer som gjenkjenner Fc-delen av de målassosierende antistoffer, med cellesuspensjonen som inneholder målcellene, eller, 1.2.2 å blande fri målcelleassosierende antistoffer med cellesuspensjonen som inneholder målcellene og inkubere denne blanding i 5-10 min til 2 timer, fortrinnsvis 30 min ved en temperatur på ca. 4°C under forsiktig risting, og;

1.3 å inkubere blandingen av cellesuspensjonen og målassosierende antistoffer festet til paramagnetiske partikler eller kuler (1.2.1), eller paramagnetiske partikler eller kuler, forbelagt med anti-mus eller antihumane antistoffer som gjenkjenner Fc-delen av de målassosierende antistoffer, til blandingen av inkubert fritt målassosierende antistoff og cellesuspensjon (1.2.2) og inkubere i 5-10 min til 2 timer, fortrinnsvis 30 min ved en temperatur på ca. 4°C, under forsiktig risting, og;

1.4 1.4.1 hvis målcellepopulasjonen er inneholdt i blod eller benmarg-aspirater blir de hydrofobe krefter assosiert med antistoffbelagte partikler redusert ved å preinkubere de antistoffbelagte partikler og cellesuspensjonen med milde detergenter i egnede konsentrasjoner, f.eks. Tween 20 i konsentrasjoner mindre enn 0,1%, i 30 min ved 4°C, og/eller; 1.4.2 ved å inkubere cellesuspensjonene, ubehandlet eller forbehandlet med formalin, alkohol eller andre fikseringsmidler med andre antistoffer eller antistoff-fragmenter som bindes til ekstracellulære eller intracellulære molekyler til stede i målcellen og de anvendte antistoffer er merket på forhånd ved peroksidase, alkalisk fosfatase eller andre enzymer som tillater visualisering av bindingen ved tilsetting og inkubasjon med relevante substrater, eller; 1.4.3 antistoff-fragmentene blir biotinylerte og bindingen visualisert når inkubasjonen tilsettes med avidin kompleksert til peroksidase, alkalisk fosfatase eller andre enzymer med tilsetting og inkubasjon med relevante substrater, eller;

1.5 å utsette de inkuberte paramagnetiske partikkel-antistoffer-celleblanding (1.3) til et magnetisk felt dersom tettheten av målceller er lav, eller hvis forholdet mellom målceller og totalt antall celler i celleblandingen er lav (mindre enn 1 %) og deretter 1.5.1 undersøke og telle de fargede og ufargede partikkel-målcelle-komplekser i cellesuspensjonen ved å anvende et mikroskop og/eller en egnet celle/partikkeltellende anordning, eller, 1.5.2 overføre den isolerte målcellesuspensjon til cellefilteranordningen eller celleseparatoren (20) i hvilken cellesuspensjonen blir applisert i mikrobrønnen, ved å anvende et membranfilter egnet til å holde tilbake partikkel/målcellekompleksene under bruk eller ikke bruk av sug, fjerning av filtrene med de isolerte målceller fra nevnte cellefiltreringsanordning for å bli fiksert og farget ved kjente immunohistokjemiske fremgangsmåter og besiktiget ved mikroskop eller tilsetning av et dyrkingsmedium med hensikt å formere de isolerte målcellekompleksene plassert på filteret for at de skal karakteriseres med hensyn på spesifikke biokjemiske og biologiske trekk, eller;

1.6 hvis forholdet mellom målceller og totale celler i cellesuspensjonen er adekvat (større enn 1%) undersøkes og telles målcellene i den inkuberte blanding av paramagnetiske partikler, antistoffer og celleblanding (1.3) eller i det tilfellet hvor antistoffer eller antistoff-fragmenter er konjugert til ikke-paramagnetiske partikler som kan visualiseres direkte pga. farge eller gjennom ensymatisk aktivering, 1.6.1 ved å anvende et mikroskop og/eller en egnet celle/partikkeltellende anordning eller, 1.6.2 overføre den isolerte målcellesuspensjon til cellefilteranordningen eller celleseparatoren og utføre fremgangsmåten i henhold til 1.5.2 ovenfor.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at antistoffet eller fragmentet derav rettes mot antigener i normale, levende celler, såsom leverhepatocyter, Kuppferceller og endoteliale celler type 1 og 2 og Claraceller i lungen, endoteliale celler av spesifikke organer, pankreatiske eksokrine og endokrine celler, nyrekanal-celler, blæreepiteliale celler, gliale og ependymale celler fra hjernen, blære og prostataepiteliale celler, cilierte celler fra luftveiene, forskjellige subpopulasjoner av mukosaceller i gastrointestinaltraktus, hypofyseceller, og andre endokrine celler i forskjellige hormonproduserende organer.

3. Fremgangsmåte som angitt i ett av de foregående krav, karakterisert ved å anvende som de nevnte målcelle antistoffer et antistoff som er reaktivt med antigener til stede på subpopulasjoner av normale celler og onkogene produkter uttrykt på membranen av normale vevceller.

4. Fremgangsmåte som angitt i ett av de foregående krav, karakterisert ved å anvende som det nevnte positivt selekterende antistoff et antistoff som er rettet mot vekstfaktorreseptorer på membranen til normale celler, f.eks. EGF-reseptoren, PDGF (A og B) reseptor, insulin-reseptorer, insulinlignende reseptorer, transferinreseptor, NGF- og FGF-reseptor.

5. Fremgangsmåte som angitt i ett av de foregående krav, karakterisert ved å anvende et antistoff som er rettet mot gruppen av integriner og andre adhesjonsmembranmolekyler og MDR-proteiner i normale celler.

6. Fremgangsmåte som angitt i ett av de foregående krav, karakterisert ved å rette antistoffet eller fragmentene derav mot antigen eller reseptorer i celler med unormale utviklingsmønstre, fortrinnsvis slike som primære og metastatiske kreftceller.

7. Fremgangsmåte som angitt i ett av de foregående krav, karakterisert ved å anvende som de nevnte målcelleassosierende antistoffer, antistoffer av IgG-isotype, eller F(ab')2 eller F(ab) fragmenter, eller IgM eller fragmenter av IgM.

8. Fremgangsmåte som angitt i ett av de foregående krav, karakterisert ved å fremstille den nevnte cellesuspensjon fra blandede cellepopulasjoner som omfatter pattedyrvev, f.eks. menneskelig benmarg og perifert blod, fra pleurale og peritoneale effusjoner, andre kroppsvæsker, f.eks. urin, cerebrospinalvæske, sæd, lymfe eller fra faste tumorer i normale vev og organer, f.eks. lever, lymfeknuter, milt, lunge, pankreas, benvev, sentralnervesystemet, prostatakjertel, hud og mukøse membraner.

9. Fremgangsmåte som angitt i ett av de foregående krav, karakterisert ved at antistoffet eller antistoff-fragmentene er rettet mot grupper av antigendeterminanter såsom de oppført i tabell 1 i beskrivelsen.

10. Fremgangsmåte som angitt i ett av de foregående krav, karakterisert ved at det anvendes som nevnte målcelleantistoff et antistoff eller antistoff-fragment som er rettet mot vekstfaktorresptorer og onkogene produkter uttrykt på membranen til maligne celler, f.eks. insulin-reseptorer, insulinlignende reseptorer og FGF-reseptorer i tillegg til de oppført i tabell 1 i beskrivelsen.

11. Fremgangsmåte som angitt i ett av de foregående krav, karakterisert ved at det anvendes et antistoff eller antistoff-fragment rettet mot gruppen av integriner, andre adhesjonmembranmolekyler og MDR-proteiner i unormale celler som oppført i tabell 1 i beskrivelsen.

12. Fremgangsmåte som angitt i ett av de foregående krav, karakterisert ved at de anvendte antistoffer, antistoff-fragmenter eller kombinasjoner av disse er rettet på antigendeterminantene som oppført i tabell 1 i beskrivelsen.

13. Fremangsmåte som angitt i ett av de foregående krav, karakterisert ved å anvende som det nevnte antistoff, et antistoff som er reaktivt med antigener til stede på unormale celler, f.eks. bryst, ovarie og lungekarsinomceller, melanom, sarkom, glioblastom og kreftceller i gastrointestinaltraktus og genitourinaltraktus og i det retikuloendoteliale system og/eller målceller assosiert med ikke-neoplastiske sykdommer, såsom kardiovaskulære, neurologiske, pulmonære, autoimmune, gastrointestinale, geni-tourinale, retikuloendoteliale og andre sykdommer.

14. Cellefilteranordning eller celleseparator (20) for å separere partikkelmålcellekomplekser fra ubundne kuler, uspesifikt bundne ikke-målceller og ubundne ikke-målceller i en cellesuspensjon av blandede cellepopulasjoner, karakterisert ved at det omfatter en filtratoppsamlingsboks (22) med eller uten styrepinner (28), med lokk (21), med/uten lavtrykksvakuumtil-koblingsdel (23) som inneholder et antall av multibrønnenheter (24) med/uten styrehakk (29), med celleseparatormembranfilter (25) og membranunder-støttelse (25a) avtagbar festet til bunnen av multibrønnenheten (24).

15. Cellefilteranordning (20) som angitt i krav 14, karakterisert ved at porene i nevnte membranfilter er regulære og konsistente i fasong og størrelse, såsom de funnet f.eks. i nylonmonofilamentmembraner med porestørrelser som varierer fra 5 um til 75 um, fortrinnsvis 20 um.

16. Anvendelse av deteksjonsfremgangsmåten i henhold til ett av de foregående krav for isolering av målceller, hvorved komplekset av celler og de paramagnetiske partikler blir eksponert til et magnetisk felt og de resulterende magnetisk aggregerte celler og/eller celler isolert ved å anvende cellefilteranordningen (20) blir videre utsatt for biologisk, biokjemisk og immuno-logiske undersøkelser, også inkludert karakterisering av spesifikke gener på DNA, mRNA og proteinnivå, inkludert polymerase kjedereaksjon (PCR) og reverstranskriptase PCR.

17. Anvendelse av fremgangsmåten for deteksjon av spesifikke målceller til å etablere cellelinjer, i henhold til en av de foregående krav, hvorved det blir etablert cellekulturer fra de separerte paramagnetiske/eller ikke-magnetiske partikkelmålcellekomplekser.

18. Sett for å utføre fremgangsmåten i henhold til ett av de foregående krav, karakterisert ved at det omfatter; 18.1 spesifikke antistoffer eller antistoff-fragmenter rettet på antigen-reseptorene på de ønskede målceller, hvor nevnte antistoff eller antistoff-fragment er bundet eller kan være bundet til inkluderte paramagnetiske partikler, uten å fjerne deres antigenbindende evne, og/eller 18.2 paramagnetiske partikler forbelagt med spesifikk anti-Fc-antistoffer, fortrinnsvis polyklonale anti-mus eller monoklonale rotte anti-mus eller antihumane antistoffer, som er istand til å bindes til Fc-delen av de målcelle-assosiere antistoffer og spesifikke fri målcelle antistoffer og/eller 18.3 paramagnetiske partikler forbelagt med spesifikke anti-Fc-antistoffer, fortrinnsvis polyklonale anti-mus eller monoklonale rotte anti-mus eller antihumane antistoffer, som er istand til å bindes til Fc-deler av de målcelleassosierende antistoffer bundet til spesifikk anti-målcelle antistoffer, og/eller, 18.4 andre spesifikke antistoffer eller antistoff-fragmenter rettet mot antigener/reseptorer i eller på de ønskede målceller, hvor de nevnte antistoffer eller antistoff-fragmenter er konjugert til biotin, peroksidase, alkalisk fosfatase eller andre ensymer, eller hvor nevnte antistoffer eller antistoff-fragmenter er bundet til ikke-paramagnetiske partikler med spesifikke farger eller bundende ensymer, såsom peroksidase og alkalisk fosfatase og/eller 18.5 cellefilteranordning i henhold til krav 14 eller 15, og 18.6 paramagnetiske eller ikke-paramagnetiske partikler forbelagt med spesifikt målcelleantigen eller gruppe av antigener for anvendelse som en kontroll eller standard med eller uten anvendelse av cellefilteranordningen.