CZ265296A3 - Detection method of specific target cells and apparatus for making the same - Google Patents

Description

Způsob detekce specifických cílových buněk^, zařízení pro jeho provádění a použití tohoto způsobu

Vynález se týká způsobu detekce specifických cílových buněk v buněčných suspenzích smíšených buněčných populací a v tekutých soustavách obsahujících smíšeně buněčné populace a v jednotlivých buněčných suspenzích připravených z pevných tkání, s výjimkou normálních a zhoubných hematopoietických buněk v krvi a kostní dřeni. Vynález se rovněž týká sady nástrojů a zařízení na provádění způsobu podle vynálezu v různých populacích buněk. Vynález co dál-o.-tsý-k-á použití uvedeného—způr&efe-u-r

Hosavadnl^X.aiot^chnihy

V biologii, v biochemii, a v příbuzných, odvětvích je . . > značná potřeba způsobů, kterými jsou chemické jednotky společně vázány. Tyto způsoby mají vzrůstající důležitost ve '*** “W* III* ·»' ' IŇIII n inmili «Μ fdi '« *«ÉI

výzkumu týkajícím se normálních i abnormálních populací buněk. Zejména při použití pevných podkladů lze buňky imobilizovat, zjišťovat, izolovat a umýt. Navíc lze obsah ^; buněk zkoušet použitím řady vysoce náročných způsobů. Je také důležité mít možnost izolovat buňky v životaschopných formách. Vzájemná vazba tvoří vysoce náročný způsob spojení chemických nebo biologických jednotek. U této metody se pár vazebních partnerů, který je např. připojen k látce, která má být vázána,_ váže vzájemně na sebe při uvedení do styku. Jeden, z vazebních partnerů takového spojení může být zastoupen molekulou na povrchu buňky. Je známo několik takovýchto vazebně partnerských systémů jako např. antigen-protilátkové,

- # 2

enzym-receptor ové, ligahd-receptorové interakce ;na buňkách a biotin-avidinova vazba, ze kterých/antigen-protilátková vazba je používána*nej častěji. Když-jsou^takové způsoby používány pro izolacicspecifických buněk, které.jsou předmětem-různých dalších zkoušek, je· nezbytné, aby buňky obnovily svou-,funkci při návratu/do-původních ·podmínek·. .-Tak tomu není vždy, „i když j e. navrhován·-způsob,, zaj ištění takových'fyziologických, podmínek,.že izolované specifické „buňky.. se „mohour.vvvíj et v_ť postačujících· počtech, aby umožnily: další„charakterizaci ,

Jsou známy; způsoby, u kterých je jeden»z vazebních, partnerů ' připojen na 'nerozpustný' podklady''jakoňápřVpái~ámágňetičke •„částice·,, pomocí-něhož; se provádí^izolace cílových buněk ze ./'smíšené/populace buněk) jako budýnegativní,nebo jako pozitivní'·,izolace¹.. U postupu'negativní izolace lze*nežádoucí,., buňky odstranit .z buňkového „preparátu inkubací buněk ,. -ní protilátkou^obalenými .Částicemi„specifickými pro tyto / „ /£ .nežádoucí buňky. Po inkubaci lze odstranit· komplex * \pozůstávající z buňky, 'protilátky a'částice, ponechává j e^za- sebou,/žádané; cílové buňky. Tento výsledek ..j e. často/ nedostatečný;/ j,e 1 ikož. žádané buňky./, zůstáyaχί..ν_Λpopulaci ._ _ -buněk-,vyícé^nebo »méně j-vy čištěné- a»-také*protožef záměr*’^'-*·¹··^· ·· -··· izolačního.postupu je zkoušeť a/neboprovádět další»studie yspecif ických ící lových buněk* Pokusy byly* provedeny s použitím •částic. přOýpožitivní izolaci, při,které žádané cílové buňky byly odstraněny^ze '.smíšené „populace;-buněkTyto-póstupy byly ale zaměřeny · na zuř či té'cílové buňky, -.ale - nejsou vhodné- pro všechny cílově/buňkové . systémy,. Nedávno byl<navržen?;pozitivní postupj izolace· využívaj ícíthapťen/ántihaptennýjvazební'systém (WO .91/01368) ,/který se týká,.způsobvpřipoj ení -‘cílových buněk na na. nerozpustný,’podklad využitím¹' schopností , haptenných,'. antihaptenných protilátek .a.antibuňkových protilátek pro.-. ... vzáj emnou;·vazbu, . čímžcsetvytvoří spoj ení .mezi{.nerozpustným

'.podkladem, ;tj ..''částicí,:a'cílovou¹ buňkou), pozůstávající nejméně z„.haptenné a .antihaptenné .protilátky tnebo ,z kombinace -haptenných a;antihaptenných protilátek nebo ze sekundárních

- # 4 buněk. Dále nejsou filtry navrženy pro vystavení vícero zkouškám zadržených buněk bez jejich odstranění z filtračního media. Existuje potřeba jednoduché vazby pro spojení cílové buňky s nerozpustným podkladem, který nevyžaduje směs poněkud nespecifických haptenných skupin a který je zaměřen na detekci specifických cílových buněk při minimálním přidružení nespecifických buněk a který činí nepotřebným pozdější štěpení nerozpustného základu od specifické cílové buňky. V související přihlášce jednoho z přihlašovatelů. (WO 94//07139, podané ICLzáří 1993) je popsán způsob detekce specifických cílových buněk pro. diagnostické účely bez problému s neurčitou vazbou na mormální buňky. Představují citlivé detekční způsoby pro rozličné typy buněk, takže může být zobrazeno na mikroskopu velkémnožství buněk a postup je . rychlý a jednoduchý. Dále mohou být použity způsoby pro izolaci buněk pro biochemická, biologická a imunologická vyšetření, a pro studium specifických genů na neukleotidech nebo proteinové úrovni dodatečně k pěstování buněk, bez potřeby štěpení souboru buněčných částic. Je však zapotřebí

- .. zlepšení izolace cílových buněk vázaných na částice v cílovém buněčném roztoku od nevázaných okrajů, nespecificky vázaných necílových buněk a nevázaných necílových buněk, které je jednoduše proveditelné, časově nenáročné a dává cílové buňky/soubory částic vhodné pro provádění další analýzy jako je mikroskopické vyšetření a růst v kultivačním prostředí.

Nedostatky dosavadního stavu techniky odstraňuje a uvedené_.cíle»,vynálezu^splňuje způsob detekce specifických cílových buněk v buněčných suspenzích smíšených buněčných populací a v tekutých soustavách obsahujících smíšené buněčné' populace a v jednotlivých buněčných suspenzích připravených z pevných tkání, s vyjímkou normálních a zhoubných

- # 5 hematopoietických buněk v krvi a kostní dřeni podle vynálezu., jehož podstata spočívá v následujících krocích: 1.1. obalení paramagnetickch částici nebo kuliček samo osobě známým způsobem buď a) protilátkami nebo fragmenty protilátek zaměřených proti membránovým strukturám specificky vyjádřeným na cílových buňkách a ne na necílových buňkách ve směsi buněk, nebo b) protilátkami, přednostně polyklonními protimyššími nebo monoklonními krysími protimyššími protilátkami nebo lidskými protilátkami schopnými vazby na Fc-části uvedených protilátek, zaměřených proti membránovým strukturám, ' a 1.2. Γ.2.Ι. 'smísení protilátek sdružujících cílové buňky (myšší nebo lidské) nebo připojených k uvedeným částicím nebo kuličkám se suspenzí buněk obsahující cílové buňky nebo 1.2.2. smísení buněčné suspenze obsahující cílové buňky s protilátkami sdružujícími volné cílové buňky a inkubace této směsi 5-10 minut až 2 hodiny,, s výhodou 30 minut, při teplotě, mezi 0°C. a 20°C s výhodou 4°C za mírného otáčení, promytí a přidání paramagnetických částic nebo kuliček předem potažených anti-Fc protilátkami, a 1,3. 1.3.1. inkubace obou směsí dle. 1.2.1, a 1..2.2. 5. až 1.0 .minut .až....2. .hodiny s výhodou- 30 min.,· při teplotě mezi o °C a 25 °C s' výhodou 4 °C, za mírného otáčení a 1.4. 1.4.1. je-li populace . _; J —Jť- : Hllťr. m -W ... j_. í I >** Mr*“ cílových'buněk obsažena v odsáté krvi nebo kostní dřeni, mohou být hydrofobní síly sdružené s částicemi potaženými protilátkami redukovány předinkubováním částic potažených protilátkami a buněčných suspensí s mírnými detergenty ve vhodných koncentracích, po dobu 30 min při 4 °C, 1.4.2. je-li žádáno potřísnění nebo zviditelnění buněčných Částic složitých buněčných suspenzí neupravených nebo předem upravených formaldehydem,. alkoholem nebo jinými fixativy, může být inkubováno dalšími protilátkami.nebo fragmenty protilátek, vázajících se na mimobuněčné nebo nitrobuněčné molekuly přítomné v cílových buňkách a použité protilátky se označí předem pomocí peroxidáze, alkalické fosfaťáze nebo jinými enzymy umožňujícími zviditelnění vazby přidáním a inkubováním s příslušnými substráty, nebo 1,4.3. fragmenty protilátek mohou být biotinylovány a vazba zviditelněna přidáním inkubace s avidinem vytvářejícím soubor s peroxidázou, alkalickou fosfatázou nebo jinými enzymy s přidáním a inkubací s odpovídajícími substráty, nebo 1.5. Inkubovaná směs buněčných protilátek s paramagnetickými částicemi (1.3.) bude vystavena magnetickému poli je-li hustota cílových buněk nízká, nebo je-li poměr cílových buněk ku celkovému počtu buněk v buněčné směsi nízký (<1%) a poté 1.5.1. Přezkoumání a sečtení obarvených a neobarvených komplexů' Cílových buněkáčástic v buněčné suspenzi za použití mikroskopu a /nebo vhodného čítacího zařízení buněk/částic nebo 1.5.2. Převedení izolované suspenze cílových buněk do zařízení pro filtraci buněk nebo buněčného separátoru (20), vekterém je buněčná suspenze podrobena mikrojímce za použití membránového filtru vhodného pro zadržení komplexů částic/cílových buněk·, za použití nebo bez použití sání, odstranění filtrů s izolovanými cílovými buňkami z řečeného zařízení pro filtraci buněk upevněného a drženého známými imunohistochemickými ...způsoby a-prohlíženého· - mikroskopem nebo přidání kultivačního prostředí pro účel šíření komplexů izolovaných cílových buněk situovaných na . - · ... . -mi .„ί- .· - v»»»*' — iítrřTvyznačené specifickými biochemickými a biologickými výhodami nebo 1.6. Je-li poměr cílových buněk k celkovému počtu buněk v buněčné suspenzi (< 1%) cílové buňky v inkubované směsi paramagnetických částic, protilátek a buněčné směsi (1.3.) je prozkoumáno a sečteno, nebo pokud jsou fragmenty protilátek nebo protilátky sraženy na nepař amagnetické částice, které mohou být zviditelněny přímo v důsledku aktivace barev nebo enzymatickou aktivací, 1.6.1. Za použití mikroskopu a /nebo vhodného čítacího zařízení

t.. JMMI- * buněk/částic, nebo 1.6.2. Převedení suspenze izolovaných cílových buněk do přístroje pro buněčnou filtraci nebo buněčného separátoru a provedení podle metody dle 1.5.2.· shora. Podle výhodného provedení mohou být směrovány

- # 7 protilátky nebo jejich fragmenty proti antigenům v normálních živých buňkách, jako jsou játrové hepatocyty, Kupfférový buňky a endotheliální buňky specifických orgánů, pankr eatické. agzocrynní a endocrynní buňky, ledvinové a prostatické epiteliální buňky, rasové buňky dýchacích cest, různé subpopulace slizničních buněk v trávícím traktu, pituitární buňky a jiné endokrynní buňky v různých orgánech produkujících hormony. Podle dalšího výhodného provedení může způsob spočívat v užití protilátky jako řečené protilátky cílových buněk', která reaguje s antigeny přítomnými v subpopulacích 'normálních buněk a v onkogenických produktech vyjádřených na membráně normálních tkáňových buněk. Podle dalšího výhodného provedení může být užita protilátka jako řečené pozitivně selektivní protilátky, která je zaměřena proti réceptorům růstového faktoru na membráně normálních buněk , E G F receptorů, PDGF (A a B) receptorů podobných inzulínu, receptorů transfer inu, receptorů NGF a FGF. Podle dalšího výhodného provedení, způsobu může být užití protilátky zaměřeno proti skupině integrinů a jiných adhézních membránových molekul a proteinů MDR v.normálních buňkách. Podle dalšího výhodného-provedení vynálezu může být' zaměřena protilátka nebo jejích fragmenty proti antigenům nebo^rečeptorům v buňkách s abnormálními vývojovými tvary, přednostně takovými jako jsou primární a metastatické rakovinové buňky. Podle dalšího výhodného provedení vynálezu může být užito protilátek izotypu IGG, nebo F(áb')2 nebo F(ab) fragmentů nebo IgM, nebo fragmentů IgM jako protilátek sdružujích cílové buňky. Podle dalšího výhodného provedení vynálezu může být připravena uvedená buněčná suspenze ze směsových buněčných populací zahrnujících savčí tkáně, např. lidskou kostní dřeň a periferijní krev, pleurální a pobřišnicové efůze, jiné tělní tekutiny -např. moč, mozkomíšní mok, semeno, mízu , z tuhých novotvarů v normálních tkáních a orgánech, např. v játrech, v mízních uzlinách, slezině, plicích, slinivce břišní, kostní tkáni, centrálním nervovém

- # 8 systému, prostatické žláze, kůži a slizničních membránách. Podle dalšího výhodného provedení vynálezu může být ' protilátka nábo fragmenty protilátek zaměřeny proti skupinám antigeních determinantů, jako jsou ty uvedené .v tabulce 1. Podle dalšího výhodného provedení vynálezu může být užito protilátky nebo fragmentu protilátky jako protilátky cílových buněk, zaměřené proti receptorům růstového faktoru a onkogením produktům vyjádřených na membráně zhoubných buněk, jako např. receptory inzulínu, receptory podobné inzulínu a receptory FGF dodatečně k těm uvedeným v tabulce 1. Podle dalšího výhodného' provedení vynálezu může být užito protilátky nebo fragmentu protilátky zaměřeného proti skupině integrinů, jiným adhezním membránovým molekulám a MDR proteinům v abnormálních buňkách, jak uvedeno v tabulce 1... Podle dalšího výhodného provedení vynálezu může být užitá·, protilátka, fragmenty protilátek nebo jejich kombinace, zaměřeny na rozhodující činitele antigenů jak uvedeno v tabulce l, Podle dalšího výhodného provedení vynálezu může být užita protilátka jako řečená protilátka, která reaguje s antigeny přítomnými v normálních buňkách, jako např... v prsních, vajěčníkových a v plicních rakovinových buňkách v melanomu,v sarkomu, v glioblastomu a v rakovinových buňkách n -ť- iť-iin- u IÝ - > ---‘f -V* Ť I· ·’-» >' -T: * - J·· . trávícího a močopohlavního traktu, a retikuloendoteliálního systému, a/nebo cílových buněk sdružených s ne-neoplastickými charobami jako jsou kardiovaskulární, neurologické, plicní.. autoimunní trávící, močopohlavní, retikoendoteliální a jiné poruchy. Zařízení pro buněčnou filtraci nebo buněčný separátor pro odstraňování komplexů částic cílových buněk z nevázaných kuliček a nevázaných necílových buněk v buněčné suspenzi směsových buněčných populací podle vynálezu zahrnuje na fi 1 tracní .sběrné^krabici s vodícími trny, s víkem, s připojovací částí pro hluboké vakuum obsahující počet vícejímkových jednotek, s vodícím zářezem, se separaČním membránovým filtrem buněk a membránovou podpěrou odpojitelně připevněnou ke dnu vícejímkové jednotky. Zařízení může mít s

- # 9 výhodou póry řečeného membránového filtru pravidelné a homogenní co do tvaru a velikosti, jako např. u jednovlákenných membrám z nilonu s velikostí póru mezi ΐομιη, s výhodou 20μσι. Způsob detekce podle nároku 1-13 pro izolaci cílových buněk může být použit tak, že komplex buněk a paramagnetických částic jsou vystaveny magnetickému poli a výsdledné magneticky připojené buňky A/nebo buňky izolované za použití filtračního zařízení buněk jsou dále podrobeny biologickým, biochemickým a imunologickým prověřením, včetně určení specifických genů na DNA , mRNA a proteinové úrovni, včetně'reakce pdlýmeřázního řetězce (PCR) a obrácené transkriptáze PCR. Způsob detekce specifických cílových buněk podle vynálezu může být použit tak, že je zřízena invitrobuněčná kultura ze separovaných komplexů paramagnetických nebo nemagnetických částic cílových buněk, a/nebo pro inokulaci do imunodeficitních zvířat, s výhodou zřízena lidské nádorové xenografty v řečených zvířatech. Sada pró provádění 2púsobuzahrnuje 18.1. specifické protilátky nebo fragmenty protilátek zaměřené na antigennové receptory na žádaných cílových buňkách., přičeměž řečená protilátka nebo fragment protilátky jsou vázányna'zapojené paramagnetické částice přímo nebo přes proti-Fc- protilátky, nebo 18.2. Paramagnetické částice předem potažené specifickými.antiFc protilátkami s výhodou polyklonální antimyšsí nebo monoklonální krysí antimyší, nebo protilidskými pr otilátkami, schopnými vazby na Fc části protilátek sdružujících cílové buňky a specifické protilátky volných cílových buněk, a/nebo 18.3. Paramagnetické částice předem potažené specifickými antiFc protilátkami s výhodou polyklonální antimyšší nebo monoklonální krysí antimyší, nebo protilidskými protilátkami, schopnými vazby na Fc části protilátek sdružujících cílové buňky, vázané na specifické protilátky proticílových buněk, a/nebo 18.4. Ostatní specifické protilátky nebo fragmenty protilátek zaměřené proti antigenům nebo re.ceptorům v nebo na žádaných cílových buňkách, přičemž řečené protilátky nebo * # 10 fragmenty protilátek jsou sraženy na biotin, peroxidázu, fosfatázu alkalynu nebo ostatní enzymy nebo kde řečené protilátky nebo fragmenty protilátek jsou vázány na nepařamagnetické částice se specifickými barvami nebo vázanými enzymy jako peroxidázou a fosfatázou alkalinu a/nebo 18.5. Filtrační zařízení buněk a 18.6. Paramagnetické nebo nepařamagnetické částice předem potažené antigenem specifických cílových buněk nebo skupinou antigenu pro použití jako kontrola nebo standart s nebo bez použití filtračního přístroje buněk. Způsob imunomagnetické detekce cílových'buněk ve smíšené populaci.buněk a ve fyziologických roztocích obsahujících populace buněk je vhodný pro detekci, ale lze jej též použít pro pozitivní izolaci specifických typů jak normálních tak i patogenních buněk. Tento způsob vytváří.vazbu mezi cílovou buňkou a nerozpustným podkladem., jako např. paramagnetickými částicemi, který pozůstává z jednoho nebo dvou .prvků. Částice je buď obalena protíbuněční protilátkou myššího. nebo lidského původu, zaměřeného na specifické antigenní.rozhodující činitele na membránách . požadovaných cílových buněk nebo j sou .částice, obaleny. .. ... polyklonní protimyšší nebo protilidskou protilátkou schopnou vazby na Fc části specifické protibuněČné protilátky zaměřené na antigenní rozhodující činitele na membránách cílových buněk. Namísto použití polyklonní protimyšsí/protilidské protilátky pro obalení částic' lze použít monoklonní krysí protimyšsí/protilidské protilátky. Tato posledně uvedená protilátka může, díky svému monoklonnímu původu, částečně poskytnout specifičtější .vazbu na protíbuněční protilátku a snížit riziko možné příčné reakce s jinými buňkami v roztocích, jako např. krve. Dále, inkubace buňky v suspenzi s mírným detergentem a/nebo druhou sadou protilátek nebo fragmentů protilátek, předem označená nebo neoznačená fluorescenčními látkami, kovovými koloidy., radioizotopy, biotinnými komplexy nebo určitými enzymy umožňujícími zviditelnění, dramaticky zvýší specifičnost tohoto způsobu.

- # 11

Dále může být podle předloženého vynálezu způsob zásadně zlepšen a zjednodušen převedením roztoku cílových buněk/ souborů částic do buněčného filtračního přístroje nebo buněčného separátoru podle vynálezu a celé množství cílových buněk prohlédnuto mikroskopem nebo pěstováno ve fyziologicky založeném kultivačním prostředí, aby byly určeny specifické biochemické a biologické přednosti.

E ňehl_e.d_ob ráz ků_ha_vý k ne.s.e.

.....Vynález je blíže osvětlen pomocí výkresu, na kterém obrázek 1.1. ukazuje perspektivní pohled na provedení buněčného filtračního přístroje nebo buněčného separátoru, částečně sestaveného, obrázek 1.2. ukazuje perspektivní pohled na jiné provedení buněčného separátoru, částečně sestaveného, obrázek 2. ukazuje perspektivní pohled na verzi buněčného separátoru vícenástavbového s membránovým filtrem odděleným od nástaveb, obrázek 4. ukazuje perspektivní pohled na verzi kultivační misky s uspořádáním víka pro ví c enás t avbový, buněčný separátor a/nebo. membránový· filtr,· - obrázek 4a. ukazuje boční řez uspořádáním vícenástavby v kultivační misce, obrázek 5 . ukazuj e'perspetivní pohled na verzi sběrnou filtrační krabici buněčného separátoru a obrázek 6 ukazuje rozety pro melanoma buněčné částice zachycené na buněčném filtračním zařízení za použití popsané metody.

Eňiklady-pnovedfiní

V nás leduj i cím podrobnějším popise je ukázán způsob, - - — používající rakovinové buňky jako cílové buňky pro detekci a možnou izolaci. Způsob však není omezen na rakovinové buňky a popis není omezen na způsob pro toto zvláštní pole využití, nebot je vhodný v celém rozsahu cytologických výzkumů. Při

- # 12 práci s rakovinnými pacienty je určení stadia nemoci, z hlediska zda je rakovina lokalizována nebo zda metastatické rozšíření postihlo i jiné tkáně, nanejvýš důležité pro volbu terapeutických alternativ pro individuální pacienty. Zhoubné buňky se rozšiřují přímým napadením okolní tkáně, mízou nebo rozšířením novotvarových buněk obsažených v krvi do vzdálených orgánů, včetně kostní dřeně a centrálního nervového systému a mozkomíšního moku. Až do nedávná detekce metastatických novotvarových buněk závisela na morfologických způsobech používajících světla a elektronové mikroskopie na biópšní vzorky novotvarů nebo nátěr kostní dřeně a periferijní krve, všechny připravené na podložním skle po cytocentrifugaci různých tělních tekutin. Od objevení monoklonních protilátek poznávajících antigeny převážně vyjádřené na povrchu různých druhů zhoubných buněk, identifikace metastatických buněk ve zvyšující se míře zahrnuje též imunocytochemii a imunoflurescencí. Podložní skla, připravená- z biopsovaných novotvarů nebo cytocentrifugátů, byla tedy upravena monoklonními protilátkami a vazba, .těchto. novotvarových buněk - by-l-a-pak- . ' zviditelněna kolometricky nebo fluorescenčně. Poslední způsob vyžaduje použití fluorescenčního mikroskopu, nebo alternativně přípravu suspenze buněk a použití cytometrického průtokoměru. Předchozí způsoby trpí omezenou citlivostí a/nebo specifičností a jsou obvykle pracné a. časově náročné a také vyžadují vysoký stupeň odbornosti. Vyšetření průtokovou cytometrií rovněž vyžaduje nákladné zařízení. Morfologické způsoby detekce novotvarových buněk v krvi a v kostní dřeni jsou daleko méně citlivé než způsoby používající imunocytochemie a imunofluorescence. I poslední způsoby jsou však nedostatečné v případech, kdy novotvarové buňky představují méně než i % z celkového počtu zárodkových buněk. Průtoková cytometrie může poskytnout lepší citlivost než způsoby používající mikroskop, ale vyžaduje dostupnost vysokého počtu buněk a také nese sebou některé technické

- # 13 potíže. Populace buněk tudíž může způsobit problémy a tento způsob neposkytuje možnost rozlišování mezi značkovanými novotvarými buňkami a nespecificky fluoreskujícími normálními buňkami. Vynález umožňuje velmi citlivou detekci např. metatatických novotvarých buněk, jelikož vysoký počet buněk lze snadno zviditelnit v mikroskopu a připojené magnetické kuličky jsou snadno rozeznatelné. Popsaný způsob a zařízení zajišťují pevnou podporu a stálé zaznamenávání, snadno prohlédnutelné mikroskopem, dovoluej vyhodnocení a kvantifikaci celého vzorku spíše než jeho malých částí a dovolujé'použití'vélkýčh'objemů vzorků pro analýzu, zařízení může být také skenováno automaticky konvenční hustoměrnou technologií. Použité monoklonní.protilátky se váží dostatečně specificky např. na novotvarové buňky a ne na jiné buňky než jsou cílové buňky ve smíšené buňkové suspenzi, jako jsou např. krev, kostní dřeň a jiné novotvarové úkazy, takže všechny buňky s připojenými kuličkami představují cílové buňky. Tento způsob je navíc rychlý a jednoduchý a může být prováděn každým pracovníkem s přístupem k normálnímu mikroskopu. Způsob podle vynálezu.zahrnuje. vazbu monoklonních protilátek, např, myšího nebo lidského původu, které specificky poznají antigeny přítomné na novotvarových buňkách a ne na. normálních buňkách při vyšetřování nebo pro jiné účely na specifické'sůbpopulace normálních buněk a na paramagnetické částice, a to buď přímo nebo na kuličky předem pokryté protilátkami specificky poznávajícími příslušné protilátky nebo Fc části IgG protilátek, které se váží na novotvarové buňky.. Buňky vázající protilátky mohou být typu IgG nebo IgM nebo ab fragment IgG nebo IgM. Příklady používaných proticílových buňkových protilátek mohou být ty, které jsou namířeny proti skupinám antigenních rozhodujících činitelů, jako jsou např. CD56/NCAM antigen (MOC-1), populace 2 epiteliálních (výstelkových) antigenů (MOC-31), populace 2 (MW 4OkD) _tantigenů (NrLulO) (Myklebust a další, Br.J. Cancer Suppl. 5_3_, 49-5Š, 1991), HMW-melamonu přidružený antigen

- # 14 (9.2, 27) (Morgan a další, Hybridoma, i, 27-36, 1981), 80kD, sarkomu přidružený antigen (TP1 a TP3) (Cancer Res. 48, 53025309, 1988), hlenové antigeny (Diel a další, Breast Cancer Res. Treatm., 1991), nebo EGF receptorový antigen (425.3) (Merck), navíc k antipanlidským protilátkám (Bruland a další, nepublikováno), které jsou vhodné pro detekci lidských buněk mezi zvířecími buňkami. Protilátka 425.3 je zaměřena na antigeny jak v normálních tak i v zhoubných buňkách. Protilátky mohou být dále zaměřeny proti receptorům růstového faktoru, jako je např. receptor EGF, receptor PDGF (A á'B),'receptor inzulínu, receptor inzulinu podobných látek, receptor transferinu, receptory NGF a FGF, skupiny integrinů, jiné molekuly s adhezními membránami a MDR proteiny, jak v normálních buňkách tak i v abnormálních buňkách, a antigeny přítomné na subpopulacích normálních buněk, navíc k onkogenním produktům, vyjádřeným na membránách normálních a zhoubných-buněk a jen na zhoubných buňkách, jako např. Neu/erh B2/HER2. Pokud se týká zhoubných buněk, tyto mohou být prsní, vaječníkové a prsní rakovinné buňky, melanom, sarkom, glioblastom,. rakovinné ,buňky trávicího traktu a retikuloendotelního systému, nebo cílové buňky mohou být spojeny s ne-neoplastickými chorobami jako jsou _Hj.· př · · ’^· ™ “ ’-s ί«Λ «(•MIK·**¹ “ *.· - IR i · »“ kardiovaskulární, neurologické, plicní, autoimunní, trávicí, močopohlavní, retikoluendoteiální a jiné poruchy. Dále se mohou zhoubné populace buněk nacházet v kostní dřeni, periferijní krvi, mohou mít původ v pleurálních a pobřišnicových efúzích a jiných tělesných tekutinových oddílech, jako např. moč, mozkomíšní mok, semeno, míza, nebo z pevných novotvarů v normálních tkáních a orgánech, jako např. játra, mízní uzliny, slezina, plíce, slinivka břišní, kostní dřeň,, centrální n_ervový systém, předstojná žláza, kůže a hlenové membrány. Ucelenější seznam antigenních rozhodujících činitelů a odpovídajících protilátek nebo. protilátkových fragmentů protilátek používaných ve spojitosti s tímto zlepšeným způsobem podle vynálezu je předložen v Tabulce čís. 1 (viz příloha). Způsob podle vynálezu pozůstává z připojení protilátek přímo na paramagnetické částice nebo se připojení může uskutečnit připojením na povrchově vázané protilátky jako např. polyklonní protimyšší protilátky, monoklonní krysí protimyšší protilátky nebo monoklonní protilidské protilátky, specificky rozeznávající Fc část jednotlivých řečených protilátek. Protilátkami obalené paramagnetické kuličky jsou pak smíšeny se suspenzí vyšetřovaných buněk a inkubovány po dobu od 5-10 minut do 2 hodin, přednostně 30 minut, při teplotě ’ 0-'25 °Č/ přednostně' při '4°Č,za mírného otáčení .

Způsob podle vynálezu může být též provozován s pozměněným pořadí kroků, při kterém se volné protilátkové cílové buňky přidají do suspenze buněk, inkubuji se po dobu od 5-10 minut do 2 hodin, přednostně 30 minut, při teplotě 0-20°C, přednostně 4° C, za mírného otáčení. Pak se do buněk, inkubovaných jak.uvedeno shora, přidají paramagnetické Částice, předem obalené protimýssími nebo protilidskými protilátkami a výsledná suspenze se podrobí další inkubaci, po dobu od,5-,10 jninut do 2 hodin, .přednostně. 30 minut, při . . teplotě 0-20° C, přednostně 4° C, za mírného míchání. Předložený způsob může být prováděn také ve zkráceném počtu kroků tak, že volná antitělís.ka cílových buněk jsou přidána do buněčného roztoku ve stejný čas a zároveň s předem obalenými paramagnetickými částicemi a podrobena inkubaci 5-10 min. až 2 hod., s výhodou 30 min., při 0-25 °C, s výhodou 4 °C za mírného míchání. Počet protilátkou obalených kuliček přidávaných do.buňkové .suspenze by se měl rovnat 0,5-10 násobku počtu cílových buněk. Není-li toto číslo známé, pak počet přidávaných a protilátkou obalených kuliček by se měl rovnat 1-10 % celkového počtu buněk. Pro specifické účely a v případech s.nízkou hustotou cílových buněk jako např. zhoubných buněk, nebo když cílové buňky představujb velmi nízkou část celkového počtu buněk (kolem 1 %), lze cílové buňky positivně oddělit v magnetickém poli od

- # 16 necílových. Izolované cílové buňky pak mohou být v buněčném roztoku převedeny do čítacího zařízení buněk a počet buněk s připojenými kuličkami může být určen mikroskopicky.

Předložený způsob může být s výhodou prováděn s převáděním roztoku izolovaných cílových buněk do buněčného filtračního přístroje popsaného v této přihlášce a celkový počet izolovaných cílových buněk prohlédnut mikroskopicky.

Isolované cílové buňky mohou být ve filtračním přístroji zachyceny a obarveny, aby se usnadnilo prohlížení'světlem mikroskopu. Pro specifické účely a v, případech, kdy se požaduje, aby izolované cílové buňky byly funkčně aktivní, může být přidáno fyziologicky založené kultivační medium do buněčného filtračního přístroje a podrobeno inkubaci po nespecifikovanou dobu při 37 °C. Izolované cílové buňky mohou ponechány růstu a následně zkoumány na přítomnost specifických biochemických a biologických znaků. Kromě toho lze cílové.buňky charakterizovat podle přítomnosti specifických biochemických a biologických vlastností. Zvlášť důležité bude použití takových buněk při studiích v oblasti molekulární biologie. Na rozdíl od shora uvedených-způsobů, citovaných v rámci známé techniky, způsob dle vynálezu umožňuje studium a růst cílových buněk bez provedení .štěpení vazby mezi paramagnetickou částicí a cílovou buňkou. Pro několik účelů je zajímavé zkoumat specifické geny v čisté populaci cílových buněk na ONA. mENA a proteinové hladině, jak při biopsii novotvarů tak i v novotvarových buňkách přítomných v krvi, kostní dřeni a jiných tělních tekutinách, jako jsou např. moč, mozkomišní mok, semeno, míza, nebo z jinak normálních tkání a orgánů, jako jsou např. játra, mízní uzliny, slezina, plíce, slinivka břišní, kostní dřeň, centrální nervový systém, předstojná žláza, kůže a hlenové membrány a v jiných oblastech Činností v rámci cytologického výzkumu. U způsobů známé techniky představují v biopsii signály z jižních, severních a západních skvrn normální buňky jakož i zhoubné buňky. Připraví-li se napřed jednobuněční

- # 17 suspenze ze zhoubného materiálu a zhoubné buňky jsou pak imunomagneticky pozitivně zjištěny a odděleny, jakékoliv studie genů provedené na tomto materiálu by proto představovaly jen cílové buňky. To se též vztahuje např. na zhoubné buňky přítomné v prsních tkáních, např. v kostní dřeni, periferijní krvi, pleurální a pobřišniční efúze a na jiné tělní- tekutiny, např. moč, mozkomišní mok, semeno a míza. Studie týkající se postupu polymerační řetězové reakce (PCR) též získají na specifičnosti a spolehlivosti jsou-li prováděny na populacích čistě zhoubných buněk, získaných 'způsobem podle vynálezu. .Použití kroků způsobu podle vynálezu se může lišit v závislosti na typu vyšetřované tkáně.

(a) Tkáň z pevné nebo jehlové biopsie novotvaru se připraví mechanicky nebo pomocí enzymového ošetření na jednobuněční suspenzi, do které se pak přidají primární specifické protilátky nebo fragmenty protilátek, buď přímo nebo po umytí suspenze buněk fosfátem .tlumeným solným nebo kulturním médiem s nebo bez séra, jako např. telecím plodovým sérem, hovězím,^ koňským, prasečím, kozím nebo lidským sérem. (b) Je-li materiál vzorek pleurální nebo ascitesní efúze,- mozkomišní mok, moč, míza nebo tělní tekutina, jako např. efúze z pacientových kloubů s různými formami zánětů kloubů, specifické protilátky nebo fragmenty protilátek se buď přidají do vzorků přímo nebo po odstředění s nebo bez mytí před nebo po odstředění ke dnu a navrácení do suspenze.

(c) Pozůstává-li materiál z odsáté krve nebo kostní dřeně, specifická antitělíska nebo zlomky antitělísek jsou buď přidány ke vzorkům přímo, nebo po odstředění s nebo bez předchozího promývání nebo poté, co jsou buňky ve vzorcích přivedeny dolů a zpátky do roztoku nebo je zlomek mononuklepvé buňky připraven spádovým odstředěním na např. míznípreparát před mytím, opětnou suspenzí a.přidáním příslušných protilátek nebo fragmentů protilátky. Podmínky postupu pro ai_a_bl jsou potvrzeny jak doloženo výsledky, docílenými úspěšnými pokusy popsanými níže. U cl se ukázalo,

- # 18 že výsledky byly ovlivněny vysokým počtem faktorů, které byly detailně prozkoumány. Mezi ně patří koncentrace protilátek, poměr počtu paramagnetických částic k počtu buňek, inkubaČní doba a objem, typ inkůbačního média a hladina pH. Poměr částic k jednozárodkové buňce u všech pokusů by měl být v rozsahu 0,5/1- 2/1, v závislosti na vazební přitažlivosti primárních specifických protilátek nebo fragmentů. Velkým problémem bylo nespecifické připojení částic, obalených ovčími nebo krysími protimyššími protilátkami samostatně nebo navíc specifickými protilátkami, na buňky normální krve nebo kostní dřérič. Pokusy' ukázaly/' že nespecifická vazba je stejně vysoká bez přítomnosti specifických protilátek, což naznačuje, že problém není způsoben příčnou reaktivitou cílových protilátek na. normální .buňky. Možnost, že méně než optimální specifičnost by mohla ' být způsobena ionickou vazbou bylá vyloučena. Jiná možnost byla, že subpopulace normálních buněk-B-rodu by mohly přilnout ke komplexům pozůstávajícím z částice a-.protilátky. Avšak imunómagnetické odstranění B-buněk ze- suspenze buněk před přidáním specifických protilátek nebo komplexů pozůstávajících z .. . protilátky,a částice nezlepšilo specifičnost posledně jmenovaného. Problém při postupu použitým pro izolaci jednozárodkových frakcí kostní dřeně a periferijní krve spočívající v tom, že některé necílové buňky by také mohly vázat paramagnetické částice byl obešen nebo překonán. Tak u částic obalených ovčí protimyšší protilátkou samostatně nebo se specifickými protilátkami byl počet částic nespecificky připojených na malou, frakci.jednozárodkových-krevních nebo kostnědřenriích. buněk snížen z průměru asi 10 na 1 a paralelně s tím se frakce normálních buněk s částicemi snížila z 1-2 % na 0,5-1 nebo méně. Důkaz byl, získán o tom, že problém mohl být způsoben hydrofobními silami spojenými s protilátkami vázanými na paramagnetické částice. Způsob snížení této hydrofobnosti je tudíž nárokován, Jeden takovýto způsob spočívá v předinkůbaci protilátkami obalených částic a

- # 19 suspenzi buněk pomocí slabých detergentů o vhodné koncentraci, např. Tween 20 (TM) v koncentracích nižších než 0,1 % po dobu 30 minut při teplotě 4° C. Je-li opostatněna možná selekce cílových buněk, suspenze buněk by měla obsahovat nízkou koncentraci detergentu, např. 0,01 % Tween-u 20 (TM). u několika pokusu tento postup skoro vyloučil nebo dramaticky snížil problém nespecifické vazby známé u jednozárodkových buněčných frakcí z krve nebo z kostní dřeně. Následující další zlepšení, pokud budou opodstaněna, použitelná ve spojení s detergentním krokem jsou tato: Po inkubací'buňkové suspenze primárními protilátkami nebo fragmenty protilátky a paramagnetickými částicemi obalenými protilátkami, jak popsáno shora, se' suspenze buněk inkubuje druhou sadou protilátek nebo fragmenty protilátky zaměřené proti jiným mimobuněčním nebo nitrobuněčním rozhodujícím činitelům cílových buněk s nebo bez předchozího ošetření buněčnými fixativy, jako- jsou např .. .formaldehyd nebo alkoholy. Tyto protilátky nebo j'ejich fragmenty by se měly předem označit fluoreskujícími látkami, kovovými koloidy, rádiozotopy, komplexy biotinů nebo enzymů·jako jsou peroxidáza a alkanická fosfatáza, umožňující zviditelnění jako takové známými způsoby v mikroskopu a/nebo vhodným . počítacím zařízením. Cílové buňky budou jak zviditeliněny pomocí posledně uvedeného způsobu, přičemž budou mít na svém povrchu připojené částice, tak i spočítány. Pro zjednodušení rozlišení mezi necílovými a cílovými buňkami lze suspenzi buněk před druhým zviditelňujícím krokem bud' podrobit cytospinovému odstředění nebo připojit části suspenze na obalená podložná skla na nichž se buňky připojené na částice rozptýlí v tenké vrstvě, což usnadní zjišťování dvojnásobně “obarvenej¹ buňky. K dalšímu zjednodušení rozlišení necílových buněk od cílových buněk zahrnuje alternativní způsob podle předloženého vynálezu filtrační přístroj- buněk, u kterého je celý buněčný roztok po krocích k výběru cílových buněk přidán přímo do filtračního přístroje buněk. Volné nevázané kuličky,

- tt 20 nespecificky vázané necílové buňky a všechny nevázané necílové buňky projdou filtrem a zanechají vázané cílové buňky ke shlédnutí na filtru. Filter s izolovanými cílovými buňkami může být odstraněn z přístroje a buňky mohou být zaxifovány a obarveny za použití známých umunohistochemických metod a prohlíženy mikroskopem. Po odstranění filtru z přístroje s ním může být zacházeno jako se známým a v imunohistochemii normálně užívaným typem konvenčního podložního sklíčka mikroskopu..Pro specifické účely může být filtr bud odstraněn z přístroje nebo zůstane jeho integrální částí a přidáno kultivační medium jako jakékoliv známé kultivační medium s nebo bez agarosy, pro účel pěstování cílových·.buněk nacházejících se na filtru. Pro použití dle nového způsobu bude sada nástrojů obsahovat např. předem obalené paramagnetické částice, připravené pro každou monoklonní protilátku. V jiném provedení bude ,sada nástrojů na jedné straně obsahovat paramagnetické částice předem obalené IgG izotypem specifické' protimyšší nebo protilidské protilátky a na druhé straně jiné cílové buňky, např'. novotvarové buňky, přidružující protilátky-·. Třetíprovedení sady nástrojů bude. obsahovat paramagnetické částice předem obalené specifickými proti-Fc protilátkami, jako např. polyklonní protimyšší, nebo monoklonní krysí protimyšší, nebo protimyšší, nebo· protilidské protilátky schopné vazby na Fc část cílových buněk přidružujících, protilátky, vázané na specifické protilátky proticílových buněk. Podle čtvrtého provedení sada nástrojů zahrnuje charakteristické částice i

paramagnetické nebo nemagnetické podstaty, které mohou být potaženy nebo nepotaženy antigenem cílových buněk nebo skupinou antigenů cílových buněk, takže při zpracování podle způsobuji sou tyto .částice zachycovány ve filtračním přístroji buněk, čímž působí jako kontrola, ukazující například, že všechny aspekty vzájemných reakcí antigenů protilátek podle způsobu pracují správně. Tyto částice mohou být obsaženy v buněčném roztoku v stadiu před nebo při provádění způsobu,

21nebo mohou být částice užity jako zvláštní buněčný roztok zpracovatelný za použití stejného způsobu jako buněčný roztok obsahující cílové buňky, které mají být odstraněny. V dalším provedení bude sada nástrojů obsahovat jiné specifické protilátky nebo fragmenty protilátek zaměřených proti antigenům/receptorům uvnitř nebo na žádaných cílových· buňkách, kde tyto protilátky nebo fragmenty protilátek jsou konjugovány s peroxidázou, alkalickou fosfatázou nebo s jinými enzymy společně s příslušnými substráty k takovým enzymům nebo kde řečené protilátky nebo fragmenty protilátek

.....jsou vázány há'neparámagnětické částice o specifických barvách nebo s vázanými enzymy jako je např. peroxidáza nebo alkalická fosfatáza.· Podle vynálezu je zařízení pro provádění způsobu podle.vynálezu tvořeno.filtračním přístrojem buněk,, který může být nazván také mnohajímkový buněčný separátor a může nebo nemusí být součástí popsané sady nástrojů. Přístroj ' se týká uspořádání: mikrojímkového'.·buněčného separátoru, který .je použit pro oddělení smíšených .populací buněk různé velikosti, jako jsou ty, které se nalézají v krvi nebo kostmi dřeni. .Výsledné buňky mohou být prohlíženy přímo· na......i membráně mikroskopem nebo automatickými skenovacími zařízeními. Tento vynález může být využit ve spojení s i, ,, , i._T -t(. t í -*bi ^,J _{x t} ¹¹ · ***: , ^T ·* ··· * konvenčními technikami isolace magnetických částic buněk pro zajištění rychlého, citlivého a jednoduchého způsobu zobrazování velkého počtu vysokých nebo malých obj emů· vzorků pro přítomnost nádorových buněk od 1 do 4 hodin. Podle tohoto vynálezu je zajištěno uspořádání mikrojímkového buněčného separátoru.zahrnujícíotevřenou dovrchu naplněnou'filtrační sběrnou krabici, která může ale nemusí mít. připojení na vakuovou trubici, a má odstranitelné nebo na jednou použitelné vícenásobné^jímkové uspořádání s membránovým filtrem pro separaci buněk, který voří základ těchto ' vícenásobných jímek. Toto uspořádání může být opatřeno také víčkem nebo krytem. Filtrační sběrná krabice a uspořádání víčk mohou být vyrobeny z materiálu vhodného pro vysoké

- # 22 sterilizační teploty nebo mohou být vyrobeny z umělohmotného průhledného nebo neprůhledného materiálu jak je znám pro kultivaci tkáně. Membránový filtr pro separaci buněk může obsahovat pravidelný nebo konsistentní pórový tvar a velikost, jako je na nylonových monofilních membránách, které tvoří základ jednotlivých jímek. Membránový filtr pro separaci buněk může být zajištěn pro mikrojímky tak, že může být odstraněn po způsobu buněčné separace, aby usnadnil zkoumání, membrána pro separaci buněk může také zahrnovat kartu nebo obklopující umělohmotný rám pro zjednodušení zkoumání po^rodstranění mikrojímek. Filtrační sběrná krabice muže zahrnovat rám, do kterého mohou být zavedeny odstranitelné řady více než jedné jímky. Filtrační sběrná krabice může být navržena podobně jako konvenční 96-jímková deska uzpůsobená pro přijetí buněčné separační membrány, sběrné krabice'a malého připojení pro vakuový tlak. Vynález může také zahrnovat horní víčko nebo kryt. Jednou použitelné kultivační víčko je zajištěno pro zařízení, aby umožnilo řadám mikrojímek, aby byly zavedeny a pěstovány ascepticky. Integrálně s.kutivačními víčky jsou protlačení nebo vruby, · ' umožňující polohování;pruhu, mikrojímek obdobně jako u filtrační sběrné krabice, aby zabránili pohybu řady

^.. . _w.. * ·,·Μ I φ~·.. r *- 1F- * ' **' mikrojímek během kultivace. Protlačení nebo vruby jak jsou popsány mohou nebo nemusí též zajištovat umístění membrány pro separaci buněk po odstranění z řady mikrojímek. Vynález bude dále vysvětlen následujícím popisem s odvolání na obrázky připojených výkresů, které ukazují pouze cestou příkladu, jednu formu uspořádání mikrojímkového buněčného separátoru. S odvoláním na obrázky 1 až 5 výkresů je vidět, že uspořádání mikrojímkovového buněčného separátoru 20 sestávájsj/íčka^nebo, krytky 21 a filtrační sběrné krabice 22, která může nebo nemusí mít připojovací vstup pro nízkotlakého vakua, s odstranitelnými mnohajímkovými řadami 24, které mají odpojitelný membránový základ 25 s podstavcem 25a. Obrázek 1.1. a 1.2. ukazuje dvě alternativy provedení vynálezu

- # 23 částečně smontované. Filtrační sběrná krabice 22 může být podobná v některých ohledech konvenčním 96-ti jímkovým deskovým formátům s odstranitelnými řadami jímek a může být uspořádána pro jednu nebo více řad jímek. Mnohonásobné jímky mohou být uspořádány ve dvou řadách jak je ukázáno nebo v jedné nebo násobné řadě. Zasunutí mnohonásobných jímek 24 do sběrné filtrační krabice 22 je takové, že dovoluje njen jednu orientaci, která může být zajištěna uložením trnů 28 nebo vrubů 29. Membránový filtr buněčného separátoru 25 je připevněn ke dnu vícenásobných jímek 24 a tvoží základ jímek.. Upevnění membránového ifltru 25 k vícenásobným jímkám 24 je takové, že mohou být separovány bez deformace membránového filtru 25 nebo podstavce membránového filtru 25a. Membránový filtr 25 může být prohlížen mikroskopem nebo může být skenován hostoměrem nebo podobnou metodou. Membránový filtr může mít pravidelný nebo konsistentní pórový tvar a velikost, jako je u monof i lriích nylonových membrán, které tvoří základ jednotlivých jímek a může mít velikost pórů 575m ale přednostně 20m. Vícenásobné jímky 24 v nebo bez sběrné-filtrační krabice 22 mohou být vyrobeny- také- z·· materiálu vhodného pro účely kultivace tkání, který může být a -X- *fc:n vhodný též pro prohlížení při konvenčním 96-jímkovém deskovém *“ ·· ***** Λ Λ J ~->R- - - JJ . ... Jv ip . * * .. -r w * . .u. Μ·- y.

skenování nebo v deskových čtecích strojích. Kultivační miska 26 a kultivační víčko misky 27 mohou být vyrobeny také z w w -I- V -í á I π τ rVi Aki ΓΛ V\V Ή 7 ΙζΐΐΊ Ί” 1 1 7 Λ <1 Q F Ι/ΛΙΊ 1

ULUtCj.±tL±U VaIOLUíCXíU Lrx<Ci.iI± ímto zp-ůsofoern je možné dodávat kultivační medium jak horem vícenásobných jímek tak dnem kultivační misky 26. Všechny rozměry ukázané na obrázcích jsou příkladné a filtrační; přístroj buněk 20 není těmito rozměry omezen. Dále je žádoucí, aby nebylo zamýšleno omezit vynález jen na shora uvedený- př-íklad,přičemž--jsou-možné četné obměny, aniž-by byl opuštěn jeho rámec. Předložený způsob bude v následujícím osvětlen modelovými pokusy, příklady užitečnosti nového způsobu a příklady praktických aplikací. Tyto příklady nemají být považovány v žádném případě za omezující vynález.

Modelové pokusy

1, Vázání komplexů pozůstávajících z protilátkových kuliček na- odrůdy novotvarových buněk. Pro zjištění koncentrace protilátek a optimálních podmínek pro vázání komplexů pozůstávajících z protilátky a paramagnetické částice na novotvarové buňky byla použita Široká skála novotvarových buňek. Tyto .paramagnetické kuličky byly navázány na-buňky buď obalením ovčí protimyšší (sheep-anti-mouše = SAM) protilátkou paramagnetické částice předem Obalené specifickou protilátkou nebo napřed inkubováním buněk specifickými protilátkami a mytím následovaným druhou inkubací SAM obalených částic. Výsledky těchto postupů jsou uvedeny v Tabulkách 2a a 2b (viz příloha), ve kterých + značí vazbu několika kuliček na všechny buňky, (.+ ) značí buď nižší počet kuliček vázaných.na .každou„buňku nebo, že ne všechny novotvarové buňky měly kuličky připojené-na svém povrchu, kdežto - značí·, že k žádné vazbě nedošlo a (--) -značí velmislabou vazbu.

2. Detekce novotvarových buněk v jednozárodkové frakci kostní dřeně nebo periferijní krve. Byly provedeny modelové, pokusy, při nichž specifické protilátky a ΞΑΜ-em Obalené paramagnetické částice byly přidány buď k takovýmto jednozárodkovým buňkám nebo k suspenzi buněk, kde různé počty ve zkumavce pěstovaných typů novotvarových buněk byly přidány k uvedeným jednozárodkovým buňkám. U některých z těchto pokusů byly jednozárodkové buňky nebo zhoubné buňky předem obarveny pomocí fluorescentního barviva-pro umožnění rozlišení mezi dvěma typy buněk. U všech pokusů byly. nevazbové primární látky a/nebo kuličky obalené ovčí protimnyšší protilátkou pro kontrolu použity odděleně. Byly provedeny dodatečné pokusy bez přípravy mononukleových

- # 25 buněčných zlomků periferní krve. Bylo shledáno, že separace buněk tímto způsobem snižuje výši nespecifických vazeb s porovnání s Lymfoprep separovanými zlomky krve.

•-i

3. Separace a zviditelnění souborů protilátkových kuliček k řadám'nádorových buněk za použití filtračního přístroje buněk. Roztoky nádorových buněk a fluoroseenčne označených nádorových buněk smíchaných s krví nebo roztoky kostní dřeně byly připraveny a upraveny jak je popsáno v modelových pokusech 1. a 2. a byly podrobeny filtračním.přístrojem buněk. Po promytí, fixování a obarvení buněk na filtru přístroje byl filter prohlédnut mikroskopem. Výsledky pouze z roztoku nádorových buněk ukázaly soubory protilátkových kuliček nádorových buněk, jasně isolované na filtru. Výsledky z roztoků fluorescenčně označených nádorových buněk spolu s krví nebo kostní dření též ukázaly soubory protilátkových kuliček nádorových buněk' jasně izolované na filtru (Obrázek 6) . Dodatečné pokusy.testování, citlivosti metody ukázaly, že

100 nádorových buněk, když byly smíseny s roztokem 10⁷ krevních buněk nebo buněk kostní- -dřeně, mohlo být určeno zapoužití této metody.

ip· · '* ··« -f'-wiPÍr . *>.' * .ίΛ·· i*· Jp · -w W·’ · » < ’ i ř** -r·

4. Růst separovaných buněk izolovaných za použití filtračního přístroje buněk. Roztoky nádorových buněk pěstované a i 7fil γίιγατίΛ ίαΊγ ΓϊΓιϊίcíατίγι 17 Wčičlol/ůvóin 1 λ 9 ΗνΊν τίζλγ-Ίrnl^onw ~ J £- •'Ι- V Α* » >**»1 £< VÍ’·. WM, Srt, í-ř ** J £» w vix filtračnímu přístroji a filtr byl následně inkubován v polotuhém mediu obsahujícím 0,3 % agarosy v kultuře media obsahujícího 20 % lýtkového'séra. Buňky byly inkubovány v atmosféře 5% CO2 při 37 °C. Nádorové buňky ukázaly schopnost dělení a růstu.

U několika pokusů byla zpozorována určitá nespecifická vazba na jednozárodkové buňky, u které bylo zjištěno, že nemá žádný vztah k charakteru specifické protilátky a která byla stejně výrazná u samotných ΞΑΜ-obalených protilátek. Velikost této

- # 26 nespecifické vazby kolísala téměř od nuly do hladiny mezi 0.5-2 %. Tato nespecifická vazba byla téměř odstraněna mírným ošetřením detergentem (Tween 20) , provedeným pro snížení problému hydrofobní buňkové interakce.

Příklady užitnosti způsobu podle vynálezu

1. Detekce' mikrometastatické neoplastické choroby krve a mízy.. Včasná á spolehlivá diagnóza rozšíření rakovinných buněk do krve a/nebo do mízy je stále důležitější pro volbu optimální léčby, možná uzdravující u mnoha typů. rakoviny, včetně karcinomů, jak popsáno v aplikaci Příkladu čís. 1. Podobné postupy byly ověřeny nebo jsou ve vývoji pro zhoubnou melanomu, sarkomu, neuroblastomu a několik dalších druhů rakoviny.

2. Detekce zhoubných buněk,v pleuráních nebo ascitesních efuzíčh a v moči charakter- těchto efuzí může představovat důležitý diagnostický, problém obzvláš.tě v případech, kdy je přítomen nízký počet rakovinných buněk spolu s normálními < ' Λ J. J* ΗΓ '.* -|. . - „.. Ií. ,v Kw -#». Wl TRI - Mm· ohM

-reaktivními nebo epiteliálními buňkami. V několika případech byla učiněna rychlá definitivní diagnóza pomocí způsobu nodle wnálezu ^w nřínaHpnh. krtvnnrmÁl ní r.vt.nl octi cká zkouška byla negativní nebo neurčitá. K podobné výhodě dochází v případech rakoviny ledvin nebo močového traktu a měchýře.

3. Detekce neoplastických buněk v mozkomišním moku

Spolu s tím jak se zlepšovala systematická léčba mnoha druhů rakoviny se zvýšil i podstatně počet případů ukazujících na symptom mozkové metastázy a paralelně s tím i potřeba včasné detekce takového rozšíření. Použitím způsobu podle vynálezu lze identifikovat i nízký počet zhoubných buněk, což

- # 27 umožňuje zákrok léčebnými alternativami v ranném stádiu projevu nitrolebečního novotvaru.

4. Diagnóza rakoviny drobnohledným vyšetřením tkáně V případe podezření na rakovinu a získání tkáně pro drobnohledné vyšetření chirurgickými postupy nebo např . punkční biopsijní jehlou, lze způsobem podle vynálezu učinit daleko jednodušší a rychlejší diagnózu aplikovanou na připravenou suspenzi buněk, oproti obvyklému morfologiekému nebo imunohistochemickému nebo cytochemickému postupu. Rozlišení mezi několika alternativními rakovinami lze učinit pomocí příslušných protilátek.

5. Identifikace prognostických ukazatelů

Jelikož výraz některých membránových molekul se ukázal být ve vztahu k postupu zhoubné, choroby několika druhů rakoviny, lze použít způsobu podle vynálezu pro identifikaci prognostických ukazatelů,. např. jak popsáno v aplikaci Příkladu čís. 2.

6. Identifikace buněk příznačných pro specifické choroby nebo pro postup nebo pro stav choroby; U různých druhů . revmatických chorob (jako např. u revmatické artritidy), jakož i u alergických, auto- imunitních a kardiovaskulárních . nVl Αϊ ΓιΉ Ίώ τί T rl 7 λ γγτί Αγζίι λ + c ί λ γί -r 7 rlťi Ί avi ha v v j ÍJ <Λ Μ M w- W M r-S t-4. ViÁV VJ/J ΚΛ. kAJ. V ťj a.

identifikace systematické nebo místní přítomnosti specifických subpopulací buněk. Rychlá detekce takových populací buněk pomocí způsobu podle vynálezu má proto značný diagnoistický a léčebný význam.

7. Detekce subpopulací normálních buněk Pro několik účelů je důležité detekovat frakci určité subpopulace normálních buněk v populaci. To se týká např. jaterní biopsie, kde může identifikace buněk, vyjadřujících žlučový epiteliální antigen, hrát důležitou roli. Podobně

- # 28 může být opodstatněna identifikace a možná izolace specifických endoteliálních buněk ze suspenze buněk připravené z různých normálních tkání.

8. Isolace a růst vybraných buněk. Pro mnoho shora uvedených účelů může být požadováno, aby byla k dispozici větší populace buněk pro studium. Předložený způsob může za použití filtračního přístroje buněk zajistit podmínky'pro umožnění zachycení pozitivně vybraných cílových buněk bez přítomnosti volných nevázaných částic nebo jiných nespecifikovaných vázaných buněk.

Některé z membránových buněk zmíněných v bodech čís.· 1-6 mohou být použity jako cíle v imunoterapii spolu s několikadruhy aktivovaných ničivých buněk nebo např. s imunotoxiny. Identifikace výrazu takových molekul způsobem podle vynálezu je proto též důležitá _;pro stanovení:·, ve kterých případech by se měly použít takové.-typy léčby·;.·

Příklady praktické aplikace způsobu

-,.11— ,. ν'ϋ™··'*· - > k** ’····· o-.rtlí·. —Příklad l. Pro diagnózu šíření rakovinných buněk v krvi nebo kostní dřeni v ranném stádiu jsme pomocí způsobu podle vynálezu použili protirakovinné protilátky MOC-31, NrLulO, BM2, BM7, 12H12 a MLuCl pro určení zda lze nebo nelze citlivě identifikovat mikrometastatickou chorobu rakoviny prsu, plic, konečníkového traktu a předstojné žlázy z tělesných tekutin. Úspěšné výsledky s. těmito protilátkami mají důležité klinické důsledky.

Příklad 2. Výraz několika .membránových molekul buněk se ukázal.být ve vzájemném vztahu s postupem zhoubné choroby několika typů rakoviny. Detekci vazby těchto protilátek na příslušné protilátky .lze proto použít pro získání informace o

- # 29 vysoké prognostické hodnotě. Mezi takovými antigeny je vysoký počet adhezních molekul, sacharidových antigenů, glykolipidů, r-eceptorů růstového faktoru a indikátorů rakoviny, uvedených níže'. Pomocí způsobu podle vynálezu jsme identifikovali vazbu komplexů pozůstávajících z částice a protilátky na varianty CD44, E kadherin, LeY, CEA, EGF-r, receptor transferinu, epitop MUC-1, epitop LUBCRU-G7, antigenů rakoviny předstojné žlázy, epitop UJ13A, mikroglobulin D₂, antigeny HLA a receptor apoptosy.

Příklad 3. Od pacienta s předpokládaným onemocněni'zhoubnou melanomou byly získány 2 litry pleurální difúze. Po odstředění byly buňky suspendovány v objemu 2 ml RPMI s ID % telecího, plodového séra inkubovaného s 9.2.27 antimelanomo.u protilátkou (10 jTg/ml) při teplotě 4° C podobu 30 minut, umyty a opět inkubovány pomocí Dynabeads™ (dynakuliček)·SAM M450/lgG2A při, teplotě·. 4^O,C poi.dobu, 30 minut. Suspenze buněk byla pak zkoumána·, pod·, mikroskopem'pro určení frakce buněk s paramagnetickými' částicemi připojenými k jejich povrchu. 'Diagnóza zhoubné· melanomy byla. potvrzena, -jelikož asi. 1.0 % buněk mělo podstatný počet rozetových částic.

Příklad 4'. Biopšijní tkáň byla získána z podkožního nádoru případu s klinickou indikací bud' malé buněční plicní rakoviny nebo zhoubného melanomu. Z biopsie byla připravena jednobuněčná suspenze a ta byla rozdělena na 2 frakce, z nichž jedna byla inkubována antimelanomou protilátkou 9.2.27 a druhá antikarcinomou protilátkou MOC-31 (obojí při 10 Jg/ml). Inkubace byla podobná té, která byla použita ve shora uvedeném příkladu. Žádná z buněk inkubovaných melanomou proti-látku-nevázala kuličky, zatímco všechny novotvarové buňky ínkubované s MOC-31 byly pozitivní.

Příklad 5. Biopšijní tkáň odebraná pacientu s podezřením na zhoubný melanom byla zkoumána přípravou jednobuněčné

- # 30 suspenze, inkubací antimelanomou protilátkou 9.2^27 a dále podle shora uvedeného postupu. Většina buněk byla pozitivní s vysokým počtem částicových rozet připojených k jejich membránám.

Příklad 6. Byla studována pleurální efúze pacienta s rakovinou prsu pro zjištění zda lze v tekutině zjistit novotvarové buňky. Litr kapaliny byl odstředěn, buňky znovu suspendovány a inkubovány v oddělených lahvičkách, každá obsahující jeden ze 3 odlišných protirakovinných protilátek (MOC-31, 2E11, 12H12) . Po ukončení postupu stejným způsobem jako shora bylo zjištěno, že většina buněk se ve všech 3 případech navázala na částice obalené protilátkou.

Příklad 7. Kostní dřeň. pacienta s rakovinou prsu byla' zkoumána pro zjištění přítomnost, mikrometastatických ' novotvarových buněk; Po přípravě jednozárodkových buněk byly tyto inkubovány stejnými· 3 antikarcinomými· protilátkami použitými ve shora uvedeném příkladu, ale v tomto případě protilátky ..byly nejprve připojeny na- paramagnetické^: částice Dynabeads™ (dynakuličky) SAM IgG. Po 1 inkubaci těmito přímo obalenými částicemi byja. suspepze_buněk zkoumána.. . , mikroskopicky, přičemž bylo zjištěno, že vysoký počet buněk je pozitivní a má ha své membráně připojenu řadu částicových rozet. Podobné pokusy byly povedeny s řadou pleurálních nebo asciteských efúzí a kostních dření pacientů s rakovinou prsu..

Příklad 8. Lidské prsní rakovinné buňky T47D byly inkubovány po různé doby fluorescenčním barvivém Hoechst a byla kontrolována životaschopnost označených buněk. Různé počty označených prsních rakovinných buněk byly pak přidány do 1 x 10⁶ buněk kostní dřeně získané ze zdravých dobrovolníků. Při různých pokusech byly přidány různé koncentrace paramagnetických monodispezních částic- (Dynabeads™ [dynakuličky] P450) obalené individuálními protirakovinnými protilátkami {NrLulO, MOC31, nebo 12H12). Po inkubaci na lede, trvající 30 minut, byly vzorky z jednotlivých zkumavek zkoumány v počítac.í komoře světelnou a fluorescenční mikroskopií. Když byl poměr novotvarových buněk k celkovému počtu buněk s λ/y tvořeným zárodkem nízký, suspenze buněk byla vystavena magnetickému poli a buňky s připojenými částicemi byly izolovány před jejich mikroskopickým zkoumáním. Bylo zjištěno, že optimální poměr byl 1-10 paramagnetických ' kuliček na novotvarou buňku, a že všechny novotvarové buňky měly 2-15 kuliček připevněných na svém povrchu. Citlivost detekční metody byla blízko jedné'cílové buňky' na'1'0⁴ buněk 's vytvořeným zárodkem. Při kontrolních pokusech s označenými novotvarými buňkami se,použitím protilátek, o kterých se ví, že mají křížovou reaktivitu s normálními buňkami, tato příčná reaktivita se potvrdila s paramagnetickými částicemi obalenými protilátkou. Při pokusech s kuličkami bez obalu protilátek přidružených k.novotvarům, se nenavázaly žádné cílové buňky na: žádné ..kuličky. Podobné pokusy, byly provedeny jak s jinými druhy prsní rakoviny a řadou rakovinných buněk malobuňko.vých..p lícních rakovin. Při těchto pokusech byla. docílena podobná citlivost a specifičnost .

Příklad 9. Pleurální a ascitesní tekutina, získaná od pacientů s- prsní rakovinou a rakovinou vaječníku, byla odstředěna, byly přidány stejné obalené paramagnetické částice jako v Příkladu Čís.l, materiál·'byl pak ínkubován a soustředěn v magnetickém poli před suspendováním á'zkoumáním světelnou mikroskopií. Typicky, měly buňky s. jasně morfologicŘými vlastnostmi novotvarových buněk na sobě navázány kuličky, kdežto žádné z mála normálních buněk na

-™sebe.„nenavázaly kuličky obalené protilátkou. Ve dvou případech pleurální efúze nevykázalo individuální morfologické vyšetření přítomnost žádné novotvarové buňky, . zatímco význačný počet zhoubných buněk byl detekován použitím protilátkou-obalených kuliček, v některých případech byly

- # 32 novotvarové buňky odděleny v magnetickém poli a přeneseny do kultivačních baněk obsahující růstové médium, speciálně připravené pro růst buněk prsní rakoviny, v pokusu založit permanentní odrůdy buněk z těchto kultur. Paralelně s tím byly buňky ze zhoubných efúzí kultivovány přímo bez pozitivní selekce pomocí magnetických.kuliček, V posledně uvedených případech nebylo možné založit žádné odrůdy buněk, zatímco ve více než 50 % případech, ve kterých byly použity pozitivně vybrané novotvarové buňky, byly odrůdy úspěšně založeny.

Příklad 10. V některých případech byly kostní dřeň a periferijní krev, získané.od pacientů s prsní rakovinou, zkoumány způsobem podle vynálezu a to přidáním paramagnetických kuliček obalených protilátkou, inkubováním po dobu 30 minut při teplotě 4° C, koncentrací v magnetickém poli a zkoumáním-’ suspenze, pomocí světelné mikroskopie. V obou případech vazba paramagnetických kuliček na novotvarové, buňky, představující 0,1-1 % buněk s vytvořeným zárodkem v kostní dřeni, a v krvi, byla- takto-detekována·;· tyto buňky' nebyly identifikovatelné žádným jiným způsobem, , .... _..1 . ·*Η^··|. f ™ · 'π* * ^w · ''‘d* ř

'.j, . -i uat- «Μ¹'#’' ^w,t ·« ·*·* ·*

Příklad 11. Protilátky proti určitým receptorům růstového faktoru nebo jiným genovým produktům vyjádřeným na povrchu populace specifických buněk mohou být použity pro identifikaci a případně i pro výběr těchto buněk. U kuliček obalených antitransferinými receptorovými protilátkami a použitých ve způsobu podle vynálezu, bylo prokázáno, že představují rychlý, jednoduchý a citlivý způsob identifikace buněk vyjadřujících transferinový receptor.

i-** ·

Příklad 12. Pro různé potřeby je opodstatněna izolace populace normálních buněk. Endoteliální buňky obalující kapiláry nebo malé cévy v normální nebo novotvarové tkáni by mohly být pozitivně vybrány ze suspenzí buněk připravených

- # O ·

-Ι-r jh u

X>t t£>.

-J

O

O

CO* r— a

<^; cn : ΓΟ xn «ϋ.

o<

- »

Antigeny	Monoclonální protilátky
Adhezní molekuly
Fibronectin rcceptor (α5β1 integrin)	Picrce 36114, BTC21/22
	Calbiochem 341649
Integrin α.3β1	M-Kiol 2
Vitroncctin rcceptor (ανβ3 integrin)	TP36.1, BTC 41/42
Integrin a.2	Calbiochem 407277
Integrin ct3	Calbiochem 407278
Integrin cc4	Calbiochem 407279
Integrin a5	Calbiochem 407280
Integrin ctV	Calbiochem 407281
Integrin β2	Calbiochem 407283
. Intcgrin-Pl ------ -- -.......	Calbiochem 407284
Gplipilla	8221
ICAM-I (CD54)	C57-60, CL203.4, RR 1/11 .
VCAM-1	Genzyme 2137-01
ELAM-1	Gcnzyme 2138-01
E-seiectin	BBA8
P-selcctin/GMP-140	BTC 71/72
LFA-3 (CD58)	TS 2/9 .
CD4.4’	BM 1441 272, 25:32
CD44-variants s	11.24, 11.31, 11.10
N-CAM (CD56)	MOC-1
H-CAM	BCA9 · · ··· ' '
L-CAM	BM 1441 892
N-CAM	TURA-27 „
i MACAM-1'**=“’***'· * * ’	NKI-M9
E-cadherin ..........	BTC 111, HECD-1, 6F9
P-cadherin	NCC-CAĎ-299
Tcnascin	BM 1452 193
	Calbiochem 580664 .............
Thrombospondin rcceptor (CD36)’	BM 1441 264
VLA-2	A1.43
Laminin rcceptor

>!*»-·

-Λ'*

Tab. .1 *^*·”* *

Přehled relevantních antigenů a příklady přidružených protilátek vázajících antigeny příslušných tkání. Tento postup vyžaduje použití kuliček obalených protilátkami zaměřenými proti strukturám vyjádřeným na endoteliálních buňkách, ale ne na ostatních normálních buňkách ve směsi buněk.

Příklad 13., Přítomnost lidských buněk inj ikovaných do imunodeficitních hlodavců byla prokázána v suspenzích buněk připravených z novotvarových xenoimplantátů a z různých hostitelských orgánů-nebo tkání použitím magnetických částic obalených protivšelidskou protilátkou.

Příklad 14. Řady nádorových buněk od pacientů s poprsní carcinomou a melanomou byly separovány ze smíšené populace krevních buněk nebo buněk kostní dřeně a filtrovány za použití shora popsaného filtračního přístroje. Po přidání kultivačního media a následné inkubaci byly vybrané nádorové buňky na.filtru schopné růstu za nepřítomnosti volných' nevázanýchčás'tic nebo jiných¹ nespecificky vázaných buněk.

T·

- # J V fa

HNK.-I cpitopc	HNK-1 A *
Uhlohydrátové antigeny
T-antigcn	HH8, HT-8
Tn-antigen	TKH6, BaGs2
Sialyl Tn	TKH-2
Gasirointcstinalní rakovinné sdruž.
antigcny(Mw2Q0kD)	CA 19-9
Jardnogainí sdružené antigay	C-50
Lď	MLuCl, BR96, BR64
di-Lex, trí-Lex	B3
Dimetric Lea epitope	NCC-ST-421
H-typc 2	BI
CA15-3 cpitopc τ____.... ...... -	CA15-3 ......- '......’
CEA	1-9,1-14,1-27,11-10,1-46 Calbiochem 250729
Gaibl-4GlcNac (nL4,6,8)	1B2 ' '
H-II	BE2
A type 3	HH8
Lacto-N-fucopentanosc III (CD 15)	PM-81
Glykolipidy
GD3	ME36.1, R24
GD;	ME36.1, 3F8, 14.18
Gbj	38-13 .....
GMj	M2590
gm2	MKJ-8, MK1-16
FucGM, ......	.1D7, F12 - > · -- : -
Receptory růstového faktoru
EOF receptor	425.3.2.E9, 225
c-erbB-2 (HEK2)	BM 1378 988, 800 E6
PDGFa receptor .. :____	Genzytne· 1264-00'' ........
PDGFp receptor	Sigma P 7679
Transferrin receptor	OKT 9, D65.30
NGF receptor	BM 1198 637
IL-2 receptor (CD25)	BM 1295 802, BM 1361 937
c-k.it	BM 428 616, 14 A3, ID9.3D6

Tab. 1 • r

	TNF-rcccptor NGF-receptar	Gcnzymc 1995-01, PAL-Ml h *
	Melanoma antigeny Antigeny s vysok.molekul.váho	§.2.27, NrML5, 225.28
5	(HMW 250.000) Mwl05 meianoma-associated	763.74, TP41.2, INDI
	glycoprotcin	ME20
	lOOkDa antigen (mclanoma/carcinoma)	376.96
	gp 113	MOC 18
10	p95-100	PAL-M2
	Sp75	15.75
	gr 100-107	NKI-bcreb. ......-
	MAA	K9.2
	M,125kD (gpl25)	Mab 436
’ 15	Sarcoma antigeny TP-I and TP-3 epitope	TP-1, TP-3
	Mw200kD	29-13, 29,2
	Mw160kD	35-16, 30-40
	Carcinoma. značkovače
20	MOCT 1 epitope (cluster 2 epithelial antigen)	MOC-31, NrLulO . . .
	MUC-I anťigeny jakoDF3epitope (gp290kD)	MUC-1, DF3.BCP-7 to -10
	MUC-2 and MUC-3 * ,	PMH1-
^25^-	'LUBCRU-G7 epitope (gp 230kD)	LUBCRU-G7
	prostatické specifi.antigeny	BM1276 972
	prostatické rakovin.antigeny orůstat.antigeny s vysok.mol.	E4-SF
	Mw>40ÓkD _	PD41------- · ......... - “
30	polymorfní epiteliální mucir	MBM-2, BM-7, 12-H-12
	prostatické specifické membi
	(Cyt-356) antiky	7E11-C5
	lidský mléčný tukiglobulin	Inununotcch HMFG-1, 27.1
	42kD prsní karcinom.epitop	B/9189
,35—	Mw> 104 mucin	TAG-72, CC-49, CC-83

Tab. 1

- 4 5

vaječ.karcin. OC125 cpitopc
(Mw7 50 kD)	OC125
pankreaJIMW glycoprotein	DU-PAN-2
Colon antigen Col7-1A(MW37000)	17-1A
G9-epitope (colon-carcinoma)	G9
lidský oolonic. sulfanucin	91.9H
M^OOkD panereas antigen	MUSEU
GA 733.2	GA733,KS1.4
TAG 72	B72.3, CC49, CC83
nedefinováno	Oall, SMI
pankreatický rakovin.sdruž.	MUSE 11
Pancarcinoma	CC49
Prostatě adenocarcinoma-antigcn	PD 41
Mw150;130kD.adenocarcinoma óf
the lung	AF-10
gp 160 lung canccr antigen (Cancer
Res. 48, 2768, 1988)	anti gplóO
Mw92kD moč .m. carcinoma antigen	3G2-C6
Mw600kD 11,00•N-carcinoma antigen	C3
Ttoč.m. carcinoma antigen (Cancer
Res. 49, 6720, 1989)	AM43, BB369
CAR-3 cpitope M^OOkD'	AR-3
MAM-ó cpitope (Cl 5:3) ‘	115D8
vysokctnolekul. vajec.rakovin
antigen	OVX1, OVX2
Mucin cpitope Ia3	Ia3
Hepatocellular carcinoma antigen		t 1!'
Mw900kD _ . _	KM-2 '
Hepernal epitope (gp43) Hepato-
ccllular care. ag	Hepcma-1
Ospojený mucin obsahující
N-glycotylneuraminic acid ·	3E1.2	-
Mw48kD colorectal carcinoma
antigen	D612
Mw71 kD prsn£carcinoma antigen	BCA 227
16.88 cpitopc (colorectal carcinopia-
antigen)	16.88
CAKl (ovarian cancers)	K1

Tab. 1

-	Colon specific antigen p Lung carcinoma antigen	Mu-1, jvlu-2
	Mw350-420kD	DF-L1, DF-L2
	SP54moč.m. carcinoma “tigcn	T16
5	gpSSnoč.m. carcinoma antigen	T43
	gp2Smoč.m. carcinoma antigen	T138
	Neuroblastoma antigeny Neuroblastoma-sdružené jako UJ13A cpitope	UJ13A
10	Glioma antigeny Mel-14 epitopc	. MeI-14 ..
	Hlavové a krční rakovin, ant:	geny
	Mwl8-22kD antigen	E48
	HLA- antigeny
15	HLA Class 1	TP25.99
	HLA-A	VF19LL67
	HLA-B·	H2-149.1
	HLA-A2	KS1
	HLA.-ABC'	W6.32
20	HLA-DR, DQ, DP	Q 5/13, B 8.11.2
.	P2-microg!obulin	NAMB-1
! w ·*Μ·- ·- ”	Apoptosis receptor Apo-l cpitope'** : *** *	Apo 1
	Různé
25	plasminogenní aktivšsntigefij
	a receptory p-glycoprotciň7_	myšší polyclonální---------- C219, MRK16.JSB-1, 265/F4-
	cathepsin D	CIS-Diagnostici, Italy
	biliáry cpithelial antigen	HEA 125
30	neuroglandular antigen (CD63)	ME491, NKI-C3, LS62
	CD9	TAPA-1, R2, SM23 '
	pan-human cell antigen	pan-H

Tah- 1

Claims (18)

1. Způsob detekce specifických cílových buněk v buněčných suspenzích smíšených buněčných populací a v tekutých soustavách obsahujících smíšené buněčné populace a v jednotlivých buněčných suspenzích připravených z pevných tkání, s výjimkou normálních a zhoubných hematopoietických buněk v krvi a kostní dřeni, vyznačený t í m,· že sestává z následujících kroků: obalení paramagnetickch částici nebo.kuliček samo o sobě ~z^_námým způsobem bud' aj protilátkami nebo fragmenty protilátek zaměřených proti membránovým strukturám specificky -vyjádřeným na cílových buňkách a ne na necílových buňkách ve směsi buněk, nebo b)' protilátkami, přednostně polyklonními protimyššími nebo monoklonními krysími protimyššími protilátkami nebo lidskými protilátkami schopnými vazby na Fc-části uvedených protilátek, zaměřených proti membránovým strukturám, a 1.2. 1.2.1. smísení protilátek sdružujících cílové buňky (myšší nebo lidské) nebo připojených k uvedeným částicím nebo kuličkám se suspenzí buněk obsahující, cílové buňky nebo 1.2.2. smísení buněčné suspenze obsahující cílové buňky s protilátkami sdružujícími volné cílové buňky a» inkubace této Směsi 5-10 minut až 2 hodiny, s výhodou 30 minut, při teplotě mezi 0°C a 20^ĎC s výhodou 4°C za mírného otáčení, promytí a přidání paramagnetických Částic nebo kuliček předem potažených anti-Fc protilátkami, a 1.3. 1.3.1_.___ inkubace obou směsí dle 1.2.1. a 1.2.2. 5 až 10 minut až 2 hodiny s výhodou 30 min., při teplotě mezi 0 °C a 25 °C s výhodou 4 °C, za mírného otáčení a 1.4. 1.4.1. je-li populace cílových buněk obsažena v odsáté krvi nebo kostní dřeni, mohou být.hydrofobní síly sdružené s částicemi potaženými ----protilátkami redukovány předinkubováním částic potažených protilátkami a buněčných suspensí s mírnými detergenty ve vhodných koncentracích, po dobu 30 min při 4°C 1..4.2. je-li žádáno potřísnění nebo zviditelnění buněčných částic

- # 35 složitých buněčných suspenzí neupravených nebo předem upravených formaldehydem, alkoholem nebo jinými fixativy, může být inkubováno dalšími protilátkami nebo fragmenty protilátek, vázajících se.na mimobuněčné nebo nitrobuněčné molekuly přítomné v cílových buňkách a použité protilátky se označí předem pomocí peroxidáze, alkalické fosfatáze nebo jinými enzymy umožňujícími zviditelnění vazby přidáním a inkubováním s příslušnými substráty, nebo 1.4.3. fragmenty protilátek mohou.být biotinylovány a vazba zviditelněna přidáním inkubace s avidinem vytvářejícím soubor s peroxidázou, alkalickou fosfatázou nebo jinými enzymy s přidáním a inkubací s odpovídajícími substráty, nebo 1.5, Inkubovaná směs buněčných protilátek s paramagnetickými částicemi (1.3.) bude vystavena magnetickému poli jer li hustota cílových buněk nízká, nebo je-li poměr cílových buněk ku celkovému počtu buněk v buněčné směsi nízký (<1 %) a poté 1.5.1. Přezkoumání, a- sečtení obarvených a neobarvených komplexů cílových buněk.·a .částic, v buněčné suspenzi za použití mikroskopu a /nebo vhodného čítacího zařízení buněk/.částic nebo l . 5.2 . Převedení izolované suspenze cílových buněk do zařízení pro filtraci buněk nebo buněčného separátoru (20), ve kterém je buněčná suspenze podrobena mikrojímce za použití membránového filtru vhodného pro. zadrženíkomplexů částic/cílových buněk, za použití nebo bez použití sání, odstranění filtrů s izolovanými cílovými buňkami z řečeného zařízení pro filtraci buněk upevněného a drženého známými imunohistochemickými způsoby a prohlíženého mikroskopem nebo přidání kultivačního prostředí pro účel síření komplexů izolovaných cílových buněk situovaných na filtru vyznačené specifickými biochemickými a biologickými výhodami_nebo 1.6. Je;li poměr.cílových buněk.k celkovému počtu buněk v buněčné suspenzi (< 1%) cílové buňky v inkubované směsi paramagnetických částic, protilátek a buněčné směsi (1.3.) je prozkoumáno a sečteno, nebo pokud jsou fragmenty protilátek nebo protilátky sraženy na ne- # 36 paramagnetické částice, které mohou být zviditelněny přímo v důsledku aktivace barev nebo enzymatickou aktivací, 1.6.1. Za použití mikroskopu a /nebo vhodného čítacího zařízení buněk/částic, nebo 1.6.2. Převedení suspenze izolovaných cílových buněk do přístroje pro buněčnou filtraci nebo buněčného separátoru a provedení podle metody dle 1.5.2. shora

2. Způsob detekce specifických cílových buněk podle nároku l, vyznačený .směrováním'protilátek nebo jejich fragmentů proti antigenům v normálních živých buňkách, jako jsou játrové hepatocyty,

Kupfferovy buňky a endotheliální buňky specifických- orgánů, pankreatické agzocrynní a endocrynní buňky, ledvinové a prostatické epiteliální buňky, rasové buňky dýchacích cest., různé subpopulace slizničních buněk v trávícím traktu, pituitární buňky a jiné· endokrynní buňky v různých orgánech produkuj ících hormony .. .

3. Způsob detekce specifických cílových buněk podle jednoho z ><. * nár oků 1 až 2, vyznačený užitím protilátky jako řečené protilátky cílových buněk, která reaguje s antigeny přítomnými v subpopulacích normálních buněk a v onkogenických produktech vyjádřených na membráně normálních tkáňových buněk.

4. Způsob detekce specifických cílových buněk podle jednoho z nároků 1-3, vyznačený užitím^protilátky jako., řečené pozitivně'selektivní protilátky, která je zaměřena proti receptorům růstového faktoru na membráně normálních buněk , E G F receptoru, PDGF (A a B) receptorů podobných inzulínu, receptorů trans.f erinu, receptorů NGF a FGF.

- # 37

5. Způsob detekce specifických cílových buněk podle jednoho z nár okú 1 - 4, vyznačený užitím protilátky zaměřené proti skupině integrinů a jiných adhezních membránových molekul a proteinů MDR v normálních buňkách

6. Způsob detekce specifických cílových buněk podle jednoho z nároků 1-5, v y z ή ač e n ý zaměřením protilátky nebo jejích fragmentů proti antigenům něho receptorům v buňkách s abnormálními vývojovými tvary, přednostně takovými jako jsou primární a metastatické rakovinové buňky.

7. Způsob detekce specifických cílových buněk podle jednoho z nároků 1-6, vyznačený užitím protilátek izotypu IGG, nebo F(ab')2 nebo F(ab) fragmentů nebo IgM, nebo fragmentů IgM·jako protilátek sdružujích cílové buňky. . *

8. Způsob detekce specifických cílových buněk podle jednoho z nároků 1-7, vyznačený přípravou uvedené buněčné suspenze z směsových buněčných populací zahrnujících savčí tkáně, např. lidskou kostní dřeň a periferijní krev, pleurální a pobřisnicové efůze, jiné tělní tekutiny např. moč, mozkomíšní mok, semeno, mízu , z tuhých novotvarů v normálních tkáních a orgánech, např. v játrech, v mízních uzlinách, slezině, plících, slinivce břišní, kostní tkáni, centrálním nervovém systému, prostatické žláze, kůži a slizničních membránách.

- # 38

9. Způsob detekce specifických cílových buněk podle jednoho z nár oků 1- 8, vyznačený tím, že protilátka nabo fragmenty protilátek jsou zaměřeny proti’ skupinám antigeních determinantů, jako jsou ty uvedené v tabulce 1.

10. Způsob detekce specifických cílových buněk podle jednoho z nár oků 1- 9, vyznačený užitím protilátky nebo fragmentu protilátky jako protilátky cílových buněk, zaměřené proti receptorům růstového faktoru a onkogením produktům vyjádřených na membráně zhoubných buněk, jako např. receptory inzulínu, receptory podobné inzulínu-a receptory FGF dodatečně k tem uvedeným v tabulce l,

11. Způsob detekce specifických cílových buněk podle jednoho z nároků 1-10, vyznačený užitím protilátky nebo fragmentu protilátky zaměřeného proti skupině integrinu, jiným adhezním membránovým molekulám a MDR proteinům v abnormálních buňkách, jak uvedeno v tabulce 1.

12. Způsob detekce specifických cílových buněk podle jednoho z nároků 1-11, vyznačený tím, že užité’protilátky, fragmenty protilátek nebo jejich kombinace jsou zaměřeny .na. rozhoduj ící. činitele antigeriu jak uvedeno v tabulce 1.

- # 39

13. Způsob detekce specifických cílových buněk podle jednoho z nároků 1-12, vyznačený užitím protilátky jako řečené protilátky, která reaguje s antigeny přítomnými v normálních buňkách, jako např. v prsních, vajěčníkových a v plicních rakovinových buňkách v melanornu,v sarkomu, v glioblastomu a v rakovinových buňkách trávícího a močopohlavního traktu, a retikuloendoteliálního systému, a/nebo cílových buněk sdružených s ne-neoplastickými v charobami jako jsou kardiovaskulární, neurologické, plicní,, autoimunní' trávící, 'močópohlávní, retikoendoteliální a jiné poruchy.

14. Zařízení pro buněčnou filtraci nebo buněčný separátor(20) pro odstraňování komplexů částic cílových buněk z nevázaných kuliček a nevázaných necílových buněk v buněčné suspenzi směsových buněčných populací, vyznačené tím, že zahrnuje na filtrační sběrné krabici- (22) s vodícími trny (28), s víkem (21), s připojovací částí (23) pro hluboké vakuum- obsahující' počet vícej ímkových'jednotek (24), s vodícím zářezem (29) , se. separačním membránovým filtrem (25) buněk a membránovou podpěrou (25 a) odpojitelně připevněnou ke dnu vícejímkové jednotky (24).

15. Zařízení pro buněčnou filtraci podle nároku 14,

............ v y z' n ac e n' e' , t í' mý žě......... ........ .........

póry řečeného membránového filtru jsou pravidelné a homogenní co do tvaru a velikosti, jako např. u jednovlákenných membrám z nilonu s velikostí póru mezi ΙΟμκι, s výhodou 20pm.

- # 40

16. Užití způsobů detekce podle nároku 1-13 pro izolaci cílových buněk, přičemž komplex buněk a paramagnetických částic jsou vystaveny magnetickému poli a výsdledné magneticky připojené buňky A/nebo buňky izolované za použití filtračního zařízení buněk jsou dále podrobeny biologickým, biochemickým a imunologickým prověřením, včetně určení specifických genů na DNA , mRNA a proteinové úrovni, včetně reakce polymerázního řetězce (PCR) a obrácené transkriptáze PCR.

17. Užití způsobu detekce specifických cílových buněk podle jednoho z předchozích nároků přičemž je zřízeno invitrohuněčné kultury ze separovaných komplexů paramagnetických nebo nemagnetických.částic cílových buněk',, a/nebo pro inokulaci do imunodeficitních zvířat, s výhodou zřídit lidské nádorové xenografty v řečených zvířatech.

< .. 'l· · * i*·

- # 41

18. Sada pro provádění způsobů podle jednoho z předchozích nároků, vyznačená tím, že zahrnuje 18.1,Specifické protilátky nebo fragmenty protilátek zaměřené na antigennové receptory na žádaných cílových buňkách, přičeměž řečená protilátka nebo fragment protilátky jsou vázány na zapojené paramagnetické částice přímo nebo přes proti-Fc- protilátky, nebo 18.2. Paramagnetické částice předem potažené specifickými antiFc protilátkami s -výhodou polyklonální antimyšší nebo monoklonální krysí antimyší, nebo protilidskýmiprotilátkami,'schopnými vazby na Fc části protilátek sdružujících cílové buňky a specifické protilátky volných cílových buněk, a/nebo 18.3. Ostatní specifické protilátky nebo fragmenty protilátek zaměřené proti antigenům nebo receptorům v nebo na žádaných cílových buňkách, přičemž řečené protilátky nebo fragmenty protilátek jsou sraženy na· biotin, per.oxidázu., fosfatázu alkalynu nebo ostatní enzymy nebo kde. řečené protilátky.'nebo fragmenty protilátek jsou · vázány na neparamagnetické částice' se specifickými barvami' nebo vázány, enzymy jako. peroxidázou a fosfatázou alkalinu · a/nebo 18.4. Filtrační zařízení buněk podle nároků 14-15 a18.5. Paramagnetické nebo neparamagnetické částice předem potažené antigenem specifických cílových buněk nebo skupinou antigenů pro použití .jako standart.