HU221278B1 - Method and device for detection of specific target cells in specialized or mixed cell populations and solutions containing mixed cell populations - Google Patents
Method and device for detection of specific target cells in specialized or mixed cell populations and solutions containing mixed cell populations Download PDFInfo
- Publication number
- HU221278B1 HU221278B1 HU9602432A HU9602432A HU221278B1 HU 221278 B1 HU221278 B1 HU 221278B1 HU 9602432 A HU9602432 A HU 9602432A HU 9602432 A HU9602432 A HU 9602432A HU 221278 B1 HU221278 B1 HU 221278B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cells
- cell
- antibodies
- target
- antibody
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
- G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/5748—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncogenic proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
- Y10S436/809—Multifield plates or multicontainer arrays
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás és berendezés specifikus célsejtek egyszerűés gyors kimutatására, melynek során paramág- neses részecskéket, acélsejtekkel kapcsolódni képes antitestek Fc-részeit felismerőantitesteket, és a célsejtek membránján lévő specifikusantigéndeterminánsok ellen irányuló, célsejtekkel kapcsolódni képesantitesteket alkalmaznak. Az eljárás specifitását jelentős mértékbenfokozza, hogy a sejtszuszpenziót detergenssel és/vagy másodikantitestekkel vagy antitestrészletekkel inkubálják, amelyek, aláthatóvá tétel elősegítése érdekében, előzetesen fluoreszcensanyagokkal, fém-kolloidokkal, radioaktív izotópokkal,biotinkomplexekkel vagy bizonyos enzimekkel jelölhetők. A találmányszerinti eljárás és berendezés szilárd hordozót és folyamatosregisztrációt biztosít, ami egyszerű mikroszkópos megfigyelést, azegész minta (és nem kis részletei) értékelését és mennyiségimeghatározását, és az analízishez nagy mintatérfogat alkalmazásátteszi lehetővé. Az átvizsgálás (letapogatás) hagyományosdenzitometriás technikával automatikusan is végezhető. A találmányszerinti eljárás, berendezés és készlet célsejtek mágneses téralkalmazásával történő izolálásához alkalmazható. ŕ
Description
A találmány tárgya immunmágneses eljárás specifikus célsejtek sejtpopulációkban és sejtpopulációkat tartalmazó oldatokban történő kimutatására, továbbá készlet és berendezés a kimutatási eljárás különböző sejtpopulációkban történő megvalósítására.
A biológiában, biokémiában és más, szomszédos területeken igen nagy szükség van olyan eljárásokra, amelyekben kémiai egységeket kapcsolunk egymáshoz. Az ilyen eljárásoknak egyre növekvő jelentőségük van, mind a normális, mind az abnormális sejtpopulációkkal foglalkozó kutatások terén. Különösen szilárd hordozók alkalmazása esetén a sejtek rögzíthetők (immobilizálhatók), detektálhatok, izolálhatok és tisztíthatok. Ezenfelül, a sejttartalom számos korszerű, kifinomult eljárás alkalmazásával vizsgálható. Szintén lényeges, hogy a sejteket élő alakban izolálhassuk.
Az affinitáskapcsolás a kémiai/biokémiai egységek egymáshoz kapcsolásának kifinomult módszere. Az ilyen eljárás során a kötőpartnerek (melyek például az összekapcsolni kívánt anyagokhoz kötődnek) egymással érintkezésbe hozva összekapcsolódnak. Az ilyen kapcsolatban az egyik kötőpartner lehet a sejt felületén lévő molekula. Számos ilyen kötőpartnerrendszer ismert, mint például az antigén-antitest, enzimreceptor, ligandumreceptor interakciók és a biotin-avidin kötődés, melyek közül leggyakrabban az antigén-antitest kötődést alkalmazzák.
Amennyiben későbbi vizsgálatok tárgyát képező specifikus sejtek izolálásához ilyen eljárásokat alkalmazunk, lényeges, hogy a sejtek - az eredeti állapotok visszaállítása után - visszanyerjék eredeti funkciójukat. Ez nem mindig történik így, bár előterjesztettek egy eljárást a fiziológiai feltételek biztosítására, melynek segítségével az izolált, specifikus sejtek a további karakterizáláshoz megfelelő mennyiségben fejlődhetnek ki.
Ismertek olyan eljárások, amelyekben az egyik kötőpartnert oldhatatlan hordozóhoz kapcsolják, például paramágneses részecskékhez, és amelyekkel a célsejtek izolálása vegyes sejtpopulációban negatív vagy pozitív izolálással végezhető. Negatív izolálás során a nem kívánt sejteket távolítjuk el a sejtek közül, oly módon, hogy a sejteket a nem kívánt sejtekre specifikus antitesttel bevont részecskékkel inkubáljuk, s az inkubálás után a sejt/antitest/részecske komplexek eltávolíthatók, miáltal a kívánt célsejtek maradnak vissza. Ez az eredmény gyakran nem kielégítő, mivel a kívánt sejtek a többé-kevésbé tiszta sejtopulációban maradnak, továbbá az izolálási eljárás célja a specifikus célsejtek további vizsgálata. A részecskék pozitív izolálásban való alkalmazására is tettek kísérleteket (melyek során a vegyes sejtpopulációból a kívánt sejteket távolítják el). Ezek az eljárások azonban csak bizonyos célsejtekre irányultak, s nem alkalmasak valamennyi célsejtrendszerhez. A haptén/antihaptén kötési rendszert alkalmazó pozitív izolálási eljárást a közelmúltban bocsátották közre (WO 91/01368 közzétételi számú szabadalom). Az eljárás abból áll, hogy a célsejteket - a haptén, az antihaptén antitestek, valamint a sejt elleni antitestek egymáshoz való kötődési képességének kihasználásával - oldhatatlan hordozóhoz kapcsoljuk, miáltal az oldhatatlan hordozó (azaz a részecske) és a célsejt között olyan kötést alakítanak ki, amely legalább hapténból és antihaptén antitestből vagy haptén és antihaptén antitestek és anti-antihaptén antitestek vagy másodlagos, sejt elleni antitestek kombinációiból áll. A komplex későbbi hasítását úgy végzik, hogy a komplexet ismételten hapténnal vagy hapténanalóggal hozzák érintkezésbe. Ilyenformán, a kialakított kötés mindig hapténból és egy vagy több elemből áll. Az eljárás nem specifikus célsejtekhez alkalmazható, és a célsejtek izolálására, valamint az oldhatatlan hordozó felszabadítására irányul.
A WO 91/09938 közzétételi számú szabadalomban pozitív és negatív szelekció kombinációjának alkalmazását írják le specifikus sejtek (vérképző őssejtek) csontvelőben történő izolálására és esetleges szaporítására. A WO 92/04961 közzétételi számú szabadalomban eljárást és egy bonyolult berendezést írnak le sejtek vagy különböző molekulák nem mágneses tesztelőközegtől történő elkülönítéséhez, amihez kolloidális mágneses részecskéket alkalmaznak. Ebben az eljárásban kisméretű (mikrométer alatti) részecskéket alkalmaznak, mivel meg kell akadályozni az oldatban lévő részecskék kicsapódását. Ez az eljárás bonyolult berendezés alkalmazását teszi szükségessé, melyben a tesztelőközegbe mágneses erősítőeszközt merítenek, ami zavaró hatást gyakorolhat a sejtekre.
Haukanes és Kvam több olyan eljárást írnak le, melyekben tumorsejtek csontvelőből történő eltávolításához, nyiroksejtek perifériás vérből történő izolálásához, valamint DNS, RNS és DNS-kötő proteinek izolálásához mágneses részecskéket alkalmaznak [Haukanes, B. és Kvam, C.: Bio/Technology 11,60-63 (1993)]. Valamennyi leírt eljárásra olyan specifitás jellemző, amely találmányunk céljainak (azaz csak a célsejtek kimutatásának) nem felel meg. Az említett eljárásokban - az antitestrészecske komplex keresztreaktivitása és nem specifikus tapadása miatt - a célsejteken kívül a nem célsejtek is megkötődnek.
Az EP-A-0 098 534 számú európai szabadalmi bejelentésben mikroliteres nagyságrendű minták vizsgálatához alkalmas, többüregű szűrőberendezést, az EP-A-0 339 769 számú európai szabadalmi bejelentésben mikroliteres nagyságrendű folyadékminták szűréséhez alkalmas szűrőszalagot és kazettát, az EP-A-0 131 934 számú európai szabadalmi bejelentésben pedig lényegében négyszögletes alaplemezzel, illetve fedőlappal, és négy oldalfallal rendelkező szűrőkazettát írnak le. A fenti berendezések egyike sem alkalmas a találmányunk szerinti megoldás céljaira, mivel az e készülékekben alkalmazott filterek pórusmérete céljainkhoz (azaz csak a részecske-sejt rozetták visszatartásához) túl kicsi. Ezenfelül, a filtereket nem úgy alakították ki, hogy a visszatartott sejteket, különböző vizsgálati módszerekkel, a szűrőközegből való eltávolítás nélkül lehetne vizsgálni.
A célsejtek oldhatatlan hordozóhoz való kapcsolásához olyan egyszerű kapcsolási módszerre van szükség, amely nem a kevéssé specifikus hapténcsoporttal ren2
HU 221 278 Β1 delkező vegyületek alkalmazásán alapul; amely specifikus célsejtek kimutatására irányul (a nem specifikus sejtek minimális mértékű asszociációja mellett); és amely szükségtelenné teszi az oldhatatlan hordozó és a specifikus célsejt közötti kötés későbbi hasítását.
Az elbírálás alatt álló, 1993. szeptember 10-én bejelentett, WO 94/07139 nemzetközi közzétételi számú szabadalmi bejelentésben a jelen találmány szerzőinek egyike eljárást írt le diagnosztikai célokra specifikus célsejtek kimutatására, amely eljárás kiküszöböli a normális sejtekhez való nem specifikus kötődés okozta problémákat. Az említett eljárás különböző sejttípusokhoz alkalmazható, érzékeny detektálási módszer, amely nagyszámú sejt mikroszkóp alatti könnyű átvizsgálását teszi lehetővé, továbbá gyors és egyszerű. Az eljárás sejtek biokémiai, biológiai és immunológiai vizsgálata, illetve specifikus gének (nukleotid- vagy proteinszintű) vizsgálata céljából történő izolálásához alkalmazható, továbbá lehetővé teszi a sejtek tenyésztését, anélkül, hogy a sejt-részecske komplexek hasítására lenne szükség. Mindezek ellenére azonban tökéletesítésekre van szükség, például a célsejtszuszpenzióban a részecskéhez kötődött célsejtek kötetlen részecskéktől, nem specifikusan kötődött nem célsejtektől, illetve a nem kötődött nem célsejtektől való elkülönítési módszerére, ami egyszerűen végrehajtható, nem időigényes, és a sejteket további vizsgálatok, például mikroszkópos megfigyelések végzésére és tenyésztő tápközegben történő szaporításra teszi alkalmassá.
A fenti célokat a találmány szerinti eljárás, berendezés és készlet segítségével valósítjuk meg.
A célsejtek vegyes sejtpopulációban és sejtpopulációkat tartalmazó fiziológiai oldatokban történő immunmágneses kimutatási eljárása alkalmazható detektálásra, de felhasználható a normális és patogén sejtek specifikus típusainak pozitív izolálására is. Az eljárás során egy specifikus célsejt és egy oldhatatlan hordozó (például paramágneses részecske) között kötést alakítunk ki, amely két vagy három elemből áll. A részecskéket bevonhatjuk a kívánt célsejtek membránjának specifikus antigéndeterminánsai ellen irányuló (egér- vagy humáneredetű) sejt elleni antitestekkel, vagy bevonhatjuk olyan poliklonális antiegér vagy antihumán antitestekkel, amelyek képesek a célsejtek membránjában lévő antigéndeterminánsok ellen irányuló sejt elleni antitestek Fc-részeihez kötődni. A részecskék bevonásához poliklonális antiegér/antihumán antitest helyett monoklonális patkány antiegér/antihumán antitest alkalmazható. Az utóbbi antitest, részben monoklonális eredete miatt, a sejt elleni antitesthez specifikusabb kötődést biztosíthat, és csökkentheti az oldatban (például vérben) lévő egyéb sejtekkel esetlegesen kialakuló keresztreakciók előfordulásának kockázatát. Ha a sejtszuszpenziót enyhe detergenssel és/vagy - a láthatóvá tétel elősegítése érdekében előzetesen fluoreszcens anyagokkal, fém-kolloidokkal, radioaktív izotópokkal, biotin komplexekkel vagy bizonyos enzimekkel jelölt vagy nem jelölt - más antitestekkel vagy antitestrészletekkel inkubáljuk, az eljárás specifitása jelentős mértékben növelhető.
Ezenkívül, az eljárás a találmány szerint jelentős mértékben javítható és egyszerűsíthető, oly módon, hogy a célsejt/részecske komplexek szuszpenzióját a találmány szerinti sejtszűrő berendezésbe vagy sejtosztályozóba helyezzük, és a mikroszkóp alatt megfigyelt vagy élettani szempontból alapvető anyagokat tartalmazó tenyésztő tápközegben növesztett valamennyi célsejtet specifikus biokémiai és biológiai jellemvonások alapján karakterizáljuk.
Az ábrák rövid leírása
Az 1.1 ábrán a sejtszűrő készülék vagy sejtosztályozó egyik (részben összeszerelt) változatának perspektivikus ábrázolását mutatjuk be.
Az 1.2 ábrán a sejtszűrő készülék vagy sejtosztályozó egy másik (részben összeszerelt) változatának perspektivikus ábrázolását mutatjuk be.
A 2. ábrán a sejtosztályozó többüregű lemeze egyik változatának perspektivikus ábrázolását mutatjuk be.
A 3. ábrán a sejtosztályozó többüregű egysége egyik változatának és a róla leválasztott membránfilter perspektivikus ábrázolását mutatjuk be.
A 4. ábrán a tenyésztőedény egyik változatának perspektivikus ábrázolását mutatjuk be (fedéllel együtt). A tenyésztőedényben alkalmas a többüregű egység és/vagy a membránfilter elhelyezésére.
A 4a. ábrán oldalnézetben mutatjuk be a többüregű egység tenyésztőedényben való elhelyezkedését.
Az 5. ábrán a sejtosztáíyozó szűrletgyűjtő dobozának perspektivikus ábrázolását mutatjuk be.
A 6. ábrán a sejtszűrőn a találmány szerinti eljárás alkalmazásával felfogott melanomasejt-/részecskerozettákat mutatjuk be.
A továbbiakban a találmány szerinti eljárás részletesebb bemutatását írjuk le. Az eljárás során a detektálás és az izolálás célsejtjeiként ráksejteket alkalmaztunk, azonban az eljárás nem korlátozódik csupán a ráksejtekre, és a leírással nem korlátozzuk az eljárást erre a speciális alkalmazási területre, mivel számos különböző citológiai kutatási területen alkalmazható.
Rákos betegek kezelésében az adott páciens kezelésének kiválasztása szempontjából a betegség stádiumának, vagyis lokalizált vagy más szövetekre átterjedő metasztázisos sajátságának megállapítása a legfontosabb. A rosszindulatú sejtek közvetlen benyomulással a szomszédos szövetekbe, a nyirokrendszeren keresztül vagy a vérkeringésen keresztül pedig távoli szervekbe (csontvelőbe, központi idegrendszerbe, agygerincvelői folyadékba) terjedhetnek át.
A metasztázisos tumorsejtek kimutatása, egészen mostanáig, morfológiai eljárásokon alapult, melynek során biopszia tumorminták, csontvelőből és perifériás vérből készített kenetek és különböző testfolyadékok
HU 221 278 Bl centrifúgálása után készített minták fény- és elektronmikroszkópos vizsgálatát alkalmazták. A különböző típusú rosszindulatú sejtek felületén expresszált antigéneket felismerő monoklonális antitestek megjelenése óta a metasztázisos sejtek azonosításához, egyre növekvő mértékben, az immuncitokémiát és az immunfluoreszcenciát is alkalmazzák. Ennek során a tumorbiopsziákból vagy a centrifugálással készített mintáit monoklonális antitestekkel kezelik, és ezek tumorsejtekhez való kötődését kolorimetriás vagy fluoreszcens módszerekkel teszik láthatóvá. Az utóbbi módszerhez fluoreszcencia-mikroszkóp alkalmazására van szükség. Egy másik lehetőség a sejtszuszpenzió elkészítése és áramlásos citometria alkalmazása.
A fenti módszerek hátránya a korlátozott érzékenység és/vagy specifitás, továbbá - általában - a jelentős munka- és időigény, valamint az a tény, hogy nagy szaktudást igényelnek. Az áramlásos citometriai vizsgálatokhoz drága felszerelésre van szükség.
A vérben és csontvelőben lévő tumorsejtek kimutatásának morfológiai módszerei sokkal kevésbé érzékenyek, mint az immuncitokémiát és immunfluoreszcenciát alkalmazó eljárások. Ezen utóbbi módszerek azonban alkalmatlanok az olyan esetekben, amikor a tumorsejtek az összes magvas sejt 1%-ánál kisebb mennyiségben vannak jelen. Az áramlásos citometria jobb érzékenységet biztosíthat, mint a mikroszkópos módszerek, de alkalmazásához nagyszámú sejtre van szükség, és több technikai nehézség is felvetődik. így például, nehézséget okozhat a sejtek aggregációja, és nem lehetséges a jelölt tumorsejtek, illetve a nem specifikusan fluoreszcens normális sejtek megkülönböztetése.
Találmányunk, például, metasztázisos tumorsejtek nagyon érzékeny kimutatását teszi lehetővé, mivel a mikroszkóp alatt nagy térfogatú és nagyszámú sejt vizsgálható át, és a kapcsolódó mágneses szemcsék könnyen felismerhetők. A találmány szerinti eljárás és berendezés szilárd hordozót és mikroszkóppal könnyen megfigyelhető, folyamatos regisztrációt biztosít, az egész minta (és nem kis részletei) értékelését és mennyiségi meghatározását, és az analízishez nagy mintatérfogat alkalmazását teszi lehetővé, továbbá az átvizsgálás hagyományos denzitometriás technikával automatikusan is végezhető. Az alkalmazott monoklonális antitestek megfelelő specifitással kötődnek, például, a tumorsejtekhez, míg a vegyes sejtszuszpenziókban, például vérben, csontvelőben és a daganatok más megnyilvánulási formáiban lévő egyéb sejtekhez nem kötődnek, így a mágneses szemcsékhez kapcsolódó valamennyi sejt célsejtet képvisel. Az eljárás ráadásul gyors és egyszerű, és bármelyik kutató által elvégezhető.
A találmány szerinti új eljárás során például egérvagy humáneredetű monoklonális antitesteket - melyek felismerik a tumorsejteken (és nem a normális sejteken) lévő antigéneket, vagy más célból, a normális sejtek meghatározott szubpopulációin lévő antigéneket - paramágneses részecskékhez kapcsolunk. Az antitesteket kapcsolhatjuk közvetlenül a paramágneses részecskékhez, de a kapcsoláshoz alkalmazhatunk olyan szemcséket is, amelyeket előzetesen a kapcsolni kívánt antitestet (vagy a tumorsejteket megkötő IgG antitestek Fc-részét) specifikusan felismerő másik antitestekkel vontunk be. A sejtekhez kötődő antitestek IgG vagy IgM típusúak, vagy IgG vagy IgM típusú antitestek részletei. Célsejt elleni antitestekként az antigéndeterminánsok csoportjai ellen irányuló antitestek alkalmazhatók; ilyen antigének például a CD56/NCAM antigén (MOC-1), Cluster 2 epithel antigén (M0C31), Cluster 2 (40 kD-os) antigén (NrLulO) (Myklebus és mtsi., Br. J. Cancer Suppl., 63, 49-53, 1991), HMWmelanómával kapcsolatos antigén (9.2, 27) Morgan és mtsi., Hybridoma, 1, 27-36, 1981), 80 kD-os, szarkómával kapcsolatos antigén (TP1 és TP3) (Cancer Rés., 48, 5302-5309, 1988), mucin antigének (Diel és mtsi., Breast Cancer Rés. Treatm., 1991) vagy az EGF-receptor antigén (425.3) (Merck), továbbá az anti-pánhumán antitest (Bruland és mtsi., nem publikált forrás), amely humán sejtek állati sejtek közötti detektálásához alkalmas. A 425.3 antitest normális és rosszindulatú sejtekben lévő antigének ellen irányul. A fentieken kívül, alkalmazhatók olyan antitestek is, amelyek növekedésifaktor-receptorok ellen, például EGF-receptor, PDGF (A és B)-receptor, inzulinreceptor, inzulinszerű receptor, transzferrinreceptor, NGF- és FGF-receptor, integrinek csoportja ellen, egyéb adhéziós membránmolekulák és MDR proteinek ellen (normális és abnormális sejtekben egyaránt), normális sejtek szubpopulációin jelen lévő antigének ellen, továbbá normális és rosszindulatú sejtek membránjain vagy kizárólag rosszindulatú sejteken expresszálódó onkogén termékek (mint például a Neu/erb B2/HER2) ellen irányulnak. A rosszindulatú sejtek lehetnek emlőrák-, petefészekrák- és tüdőráksejtek, melanoma-, szarkóma-, glioblasztomasejtek, a gyomor-bél rendszer és a retikuloendoteliális rendszer rákos sejtjei. Célsejtekként alkalmazhatunk nem daganatos betegséggel, például szív- és érrendszeri, idegrendszeri, tüdő-, autoimmun, gyomor-bél rendszeri, húgy- és ivarszervi, retikuloendoteliális és más rendellenességekkel kapcsolatos sejteket is. A rosszindulatú sejtpopuláció elhelyezkedhet a csontvelőben, perifériás vérben, származhat mellűri vagy hasűri folyadékgyülemből és más testfolyadékokból, például vizeletből, agy-gerincvelői folyadékból, ondóból, nyirokból, továbbá normális szövetekben és szervekben (például májban, nyirokcsomókban, lépben, tüdőben, hasnyálmirigyben, csontszövetben, központi idegrendszerben, prosztatában, bőrben és nyálkahártyamembránokban) lévő szilárd tumorokból. Az antigéndeterminánsok és a megfelelő antitestek teljesebb listáját az I. táblázatban mutatjuk be.
I. táblázat
A releváns antigének és a velük kapcsolatos antigénkötő antitestek
| Antigének | Monoklonális antitestek |
| Adhéziós molekulák | |
| F ibronectinreceptor (alfaSfil integrin) | Pierce 36114, BTC21/11, Calbiochem 341649 |
HU 221 278 Β1
| Antigének | Monoklonális antitestek |
| Integrin alfa3(il | M-Kiol 2 |
| Vitronectinreceptor (alfavp3 integrin) | TP36.1,BTC 41/42 |
| Integrin alfa2 | Calbiochem 407277 | |
| Integrin alfa3 | Calbiochem 407278 | |
| Integrin alfa4 | Calbiochem 407279 j |
| Integrin alfa5 | Calbiochem 407280 |
| Integrin alfaV | Calbiochem 407281 |
| Integrin β2 | Calbiochem 407283 |
| Integrin β4 | Calbiochem 407284 |
| GpIIfilIIalfa | 8221 |
| ICAM-1 | C57-60, CL203.4, RR 1/1' |
| VCAM-1 | Genzyme 2137-01 |
| ELAM-1 | Genzyme 2138-01 |
| E-szelektin | BBA8 |
| P-szelektin/GMP-140 | BTC 71/72 |
| LFA-3 (CD58) | TS 2/9 |
| CD44 | BM 1441 272,25:32 |
| CD44 változatok | 11.24,11.32, 11.10 |
| N-CAM (CD56) | MOC-1 |
| H-CAM | BCA9 |
| L-CAM | BM 1441 892 |
| N-CAM | TURA-27 |
| MACAM-1 | NKI-M9 |
| E-cadherin | BTC 111, HECD-1, 6F9 |
| P-cadherin | NCC-CAD-299 |
| Tenascin | BM 1452 193, Calbiochem 580664 |
| Thrombospondinreceptor (CD36) | BM 1441 264 |
| VLA-2 | A 1.43 |
| Lamininreceptor | |
| HNK-1 epitóp | HNK-1 |
| Szénhidrátantigének | |
| T antigén | HH8, HT-8 |
| Tn antigén | TKH6, BaGs2 |
| Szialil Tn | TKH-2 |
| Gyomor-bél rendszeri rákkal kapcsolatos antigén (M-200 kD) | CA 19-9 |
| Karcinómával kapcsolatos antigén | C-50 |
| Le> | MLuCl, BR96, BR64 |
| di-Lex, ttri-Lex | B3 |
| Dimer Lea epitóp | NCC-ST-421 |
| H-típus 2 | B1 |
| Antigének | Monoklonális antitestek |
| CA15-3 epitóp | CA15-3 |
| CEA | 1-9,1-14,1-27,11-10, 1-46, Calbiochem 250729 |
| Galbl-4GlcNac (nL4,6,8) | 1B2 |
| H-II | BE2 |
| A-típus 3 | HH8 |
| Lakto-N-fukopentanóz III (CD 15) | PM-81 |
| Glikolipidek | |
| gd3 | ME36.1, R24 |
| gd2 | ME36.1, 3F8,14.18 |
| Gb3 | 38-13 |
| gm3 | M2590 |
| gm2 | MKI-8, MKI-16 |
| FucGM, | 1D7.F12 |
| Növekedésifaktor-receptorok | |
| EGF-receptor | 425.3.2.E9, 225 |
| c-erbB-2 (HER2) | BM 1378 988, 800 E6 |
| PDGFalfa-receptor | Genzyme 1264-00 |
| PDGFp-rcccptor | Sigma P 7679 |
| Transzferinreceptor | OKT 9, D65.30 |
| NGF-receptor | BM 1198 637 |
| IL-2 receptor (CD25) | BM 1295 802, BM 1361 937 |
| c-kit | BM 428 616,14 A3, ID9.3D6 |
| TNF-receptor | Genzyme 1995-01, PAL-M1 |
| NGF-receptor | |
| Melanomaantigének | |
| Nagy molekulatömegű antigén | 9.2.27, NrML5,225.28 |
| (HMW 250.000) | 763.74, P41,2, IND1 |
| 105 kD-os, melanomával kapcsolatos glikoprotein | ME20 |
| 100 kD-os antigén (melanoma/karcinóma) | 376.96 |
| gP U3 | MUC 18 |
| p95-100 | PAL-M2 |
| Sp75 | 15.75 |
| gr 100-107 | NKI-bereb |
| MAA | K9.2 |
| Mr 125 kD (gpl25) | Mab 436 |
| Szarkómaantigének | |
| TP-1 és TP-3 epitóp | TP-1, TP-3 |
| Mw200 kD | 29-13,29.2 |
| MwlóOkD | 35-16,30-40 |
HU 221 278 Β1
| Antigének | Monoklonális antitestek |
| Karcinómaantigének | |
| MOC-31 epitóp (cluster 2 hámsejt antigén) | |
| MUC-1 antigének (például DF3-epitóp [gp290kD]) | MUC-1, DF3.BCP-7-től 10-ig |
| MUC-2ésMUC-3 | PMH1 |
| LUBCRU-G7 epitóp (gp 230kD) | LUBCRU-G7 |
| Prosztataspecifikus antigén | BM1276 972 |
| Prosztatarák-antigén | E4-SF |
| Nagy molekulatömegű prosztataantigén (M>400 kD) | PD41 |
| Polimorf epithel mucinok | BM-2, BM-7,12-H-12 |
| Prosztataspecifikus membránantigén (Cyt-356) | 7E11-C5 |
| Humántejzsír-globulin | Immunotech HMFG -1, 27.1 |
| 42 kD-os emlőrákepitóp | B/9189 |
| M>106 mucin | TAG-72, CC-49, CC-83 |
| Petefészekrák 0025 epitóp (M=750 kD) | 0025 |
| Nagy molekulatömegű hasnyálmirigy-glikopro- tein | DU-PAN-2 |
| Col7-1A vastagbélantigén (M=37 kD) | 17-1A |
| G9 epitóp (vastagbélrák) | G9 |
| Humánvastagbél- szulfomicin | 91.9H |
| 300 kD-os hasnyálmirigyantigén | MUSE11 |
| GA 733.2 | GA733, KS1.4 |
| TAG 72 | B72.3, CC49, CC83 |
| Meghatározatlan antigén | Oall.SMl |
| Hasnyálmirigyrákkal kapcsolatos antigén | MUSE 11 |
| Pán-karcinóma | CC49 |
| Prosztataadenokarcinóma- antigén | PD41 |
| 150-130 kD-os tüdőadenokarcinóma-antigén | AF-10 |
| gp 160 tüdőrákantigén (Cancer Rés., 48, 2768, 1988) | anti-gpl60 |
| 92 kD-os húgyhólyagrákantigén | 3G2-C6 |
| Antigének | Monoklonális antitestek |
| 600 kD-os húgyhólyagrákantigén | C3 |
| Húgyhólyagrák-antigén (Cancer Rés., 49, 6720, 1989) | AN43, BB369 |
| CÁR-3 epitóp (M>400kD) | AR-3 |
| MAM-6 epitóp (05.3) | 115D8 |
| Nagy molekulatömegű petefészekrák-antigén | 0VX1, 0VX2 |
| Ia3 mucin epitóp | Ia3 |
| májsejtrákantigén (M=900 kD) | KM-2 |
| Hepemal epitóp (gp43) máj sej trákantigén | Hepema-1 |
| O-kötésű mucint tartalmazó N-glikolilneuraminsav | 3E1.2 |
| 71 kD-os vastag- és végbélrákantigén | D612 |
| 71 kD-os emlőrákantigén | BCA 227 |
| 16.88 epitóp (vastag- és végbélrákantigén) | 16.88 |
| CAK.1 (petefészekrák-antigének) | KI |
| Vastagbélspecifikus p antigén | Mu-l,Mu-2 |
| Tüdőrákantigén (M=350-420 kD) | DF-L1,DF-L2 |
| gp54 húgyhólyagrák-antigén | T16 |
| gp85 húgyhólyagrák-antigén | T43 |
| gp25 húgyhólyagrák-antigén | T138 |
| Neuroblasztómaantigének | |
| Neuroblasztómával kapcsolatos antigének, például UJ13A epitóp | UJ13A |
| Gliomaantigének | |
| Mel-14 epitóp | Mel-14 |
| Fejen és nyakon kialakuló rákok antigénjei | |
| 18-22 kD-os antigén | E48 |
| HLA-antigének | |
| HLA 1 osztály | TP25.99 |
| HLA-A | VF19LL67 |
| HLA-B | H2-149.1 |
| HLA-A2 | KS1 |
| HLA-ABC | W6.32 |
| HLA-DR, DQ, DP | Q 5/13, B 8.11.2 |
HU 221 278 Β1
| Antigének | Monoklonális antitestek |
| P2-mikroglobulin | NAMB-1 |
| Apoptosisreceptor | |
| Apo-1 epitóp | Apó 1 |
| Egyéb | |
| Plazminogén aktivátor antigének és receptorok | Nyúl-poliklonálisantitest |
| p-glikoprotein | C219, MRK16.JSB-1, 265/F4 |
| Katepszin D | CIS-Diagnostici, Olaszország |
| Epevezeték epithel antigén | HEA 125 |
| Neuroglanduláris antigén (CD63) | ME491, NK.I-C3, LS62 |
| CD9 | TAPA-1.R2, SM23 |
| pán-humánsejt antigén | pan-H |
A találmány szerinti eljárás során az antitesteket közvetlenül vagy közvetve a paramágneses részecskékhez kapcsoljuk. A közvetett kapcsolás esetén felülethez kötött antitesteket, például poliklonális antiegér antitesteket, monoklonális patkány antiegér antitesteket vagy monoklonális antihumán antitesteket alkalmazunk, amelyek specifikusan az említett antitestek Fc-részeit ismerik fel. Az antitesttel bevont paramágneses szemcséket ezután összekeverjük a vizsgálandó sejtek szuszpenziójával, majd óvatos keverés közben 0-25 °C-on, előnyösen 4 °C-on, 5-10 perctől 2 óráig terjedő időtartamban, előnyösen 30 percig inkubáljuk. A találmány szerinti eljárás úgy is megvalósítható, hogy a lépéseket más sorrendben végezzük; ezek szerint, a szabad célsejtantitesteket adjuk a sejtszuszpenzióhoz, és az így kapott szuszpenziót óvatos keverés közben 0-25 °C-on, előnyösen 4 °C-on, 5-10 perctől 2 óráig terjedő időtartamban, előnyösen 30 percig inkubáljuk, majd az antiegér vagy antihumán antitestekkel bevont paramágneses részecskéket ezután adjuk az inkubált sejtszuszpenzióhoz, s az így kapott szuszpenziót óvatos keverés közben 0-25 °C-on, előnyösen 4 °Con, 5-10 perctől 2 óráig terjedő időtartamban, előnyösen 30 percig tovább inkubáljuk. Az eljárás kevesebb lépés beiktatásával is elvégezhető, melynek során a szabad célsejtantitesteket az előzetesen bevont paramágneses részecskékkel együtt adjuk a sejtszuszpenzióhoz, melyet óvatos keverés közben 0-25 °C-on, előnyösen 4 °C-on, 5-10 perctől 2 óráig terjedő időtartamban, előnyösen 30 percig inkubálunk. A sejtszuszpenzióhoz az antitesttel bevont szemcséket a célsejtek számához viszonyítva 0,5-10-szeres mennyiségben adjuk. Amennyiben a célsejtek száma nem ismert, a bevont szemcséket az összes sejtszámhoz viszonyítva 1-10% mennyiségben kell adagolni. Speciális célokra, és olyan esetekben, amikor a célsejtek denzitása kicsi (például rosszindulatú sejtek esetében) vagy amikor a célsejtek az összes sejtszám nagyon kis hányadát (körülbelül 1%-át) teszik ki, a célsejtek mágneses térben pozitív módon választhatók el a nem célsejtektől. Az izolált célsejteket ezután sejtszuszpenzióban sejtszámláló készülékbe tesszük, és a szemcsékhez kapcsolódó sejtek számát mikroszkópos megfigyeléssel határozhatjuk meg.
A találmány szerinti eljárás előnyösen más módon is megvalósítható, melynek során az izolált célsejtek szuszpenzióját a találmány szerinti sejtszűrő készülékbe öntjük, és mikroszkóp alatt megfigyeljük az összes izolált célsejtet. A szűrőkészülékben lévő izolált célsejteket a fénymikroszkópos megfigyelés elősegítése érdekében rögzíthetjük és megfesthetjük. Speciális célokra, és olyan esetekben, amikor az izolált célsejteknek funkcionálisan aktívnak kell lenni, a sejtszűrő készülékbe fiziológiai alapú tenyésztő tápközeget helyezünk, és 37 °C-on meghatározatlan ideig inkubáljuk. Az izolált célsejteket a növesztést követően specifikus biokémiai és biológiai sajátságok jelenléte alapján karakterizálhatjuk. Az ilyen sejtek alkalmazásának különösen nagy jelentősége van a molekuláris biológiai vizsgálatokban.
A fentebb felsorolt, korábbi eljárásokkal szemben, a találmányunk szerinti eljárás anélkül teszi lehetővé a célsejtek vizsgálatát és növesztését, hogy a paramágneses részecskéket el kellene választani a célsejtektől. Több célból is lényeges lehet egy tiszta célsejtpopulációban a specifikus gének vizsgálata DNS-, mRNSvagy proteinszinten, tumorbiopsziákban és tumorsejtekben egyaránt, mely tumorsejtek származhatnak a vérből, csontvelőből és más testfolyadékokból, például vizeletből, agy-gerincvelői folyadékból, ondóból, nyirokból, vagy másképpen normális szövetekből és szervekből, például májból, nyirokcsomókból, lépből, tüdőből, hasnyálmirigyből, csontszövetekből, központi idegrendszerből, prosztatából, bőrből vagy nyálkahártyamembránokból.
A korábbi eljárásokban a Southern-, Northern- és Westem-blot-analízisek eredményeként kapott jelek egyaránt reprezentálják a biopsziában lévő normális, illetve tumoros sejteket. Ha a tumoros anyagból először sejtszuszpenziót készítünk, majd a tumorsejteket immunmágneses eljárással pozitívan detektáljuk és elkülönítjük, a kapott anyaggal végzett mindenféle génvizsgálat csak a célsejteket fogja reprezentálni. Ez az emlősszövetekben, például csontvelőben, perifériás vérben, mell- és hasűri folyadékgyülemben és más testfolyadékokban, például vizeletben, agy-gerincvelői folyadékban, ondóban és nyirokban lévő rosszindulatú sejtekre egyformán vonatkozik. A találmány szerinti új eljárással kapott tiszta tumorsejtpopulációkkal végzett, polimeráz láncreakciót (PCR) alkalmazó vizsgálatok szintén fokozzák a specifitást és megbízhatóságot.
A találmány szerinti új eljárás lépéseit a vizsgálandó szövet típusától függően alkalmazzuk.
a) A szilárd tumorból vagy tűbiopsziából származó szövetet mechanikusan vagy enyhe enzimatikus kezeléssel különálló sejtek szuszpenziójává alakítjuk, amelyhez a primer, specifikus antitesteket vagy antitestrészeket közvetlenül, vagy a sejtszuszpenzió foszfátpufferelt sóoldattal vagy tenyésztő tápközeggel (szérummal, például magzati borjúszérummal, szarvas7
HU 221 278 Bl marha-, ló-, sertés-, kecske- vagy emberszérummal együtt vagy anélkül) végzett - mosása után adjuk.
b) Amennyiben a minta mellűri vagy hasvízkóros folyadék, agy-gerincvelői folyadék, vizelet, nyirok vagy más testfolyadék, például a különböző ízületi gyulladásokkal rendelkező páciensek ízületeiben lévő folyadékgyülem, a specifikus antitesteket vagy antitestrészeket vagy közvetlenül adjuk a mintához, vagy más módon, a sejtek centrifugálása után (a mintában lévő sejtek centrifugálása és újraszuszpendálása előtt vagy után végzett mosással vagy anélkül) is hozzáadhatjuk a mintához.
c) Amennyiben a vizsgálandó anyag vér vagy leszívott csontvelő, a specifikus antitesteket vagy antitestrészleteket vagy közvetlenül adjuk a mintához, vagy más módon, a sejtek centrifugálása után (a mintában lévő sejtek centrifugálása és újraszuszpendálása előtt vagy után végzett mosással vagy anélkül) is hozzáadhatjuk a mintához, vagy ismét más módon, a sejtek mosása, újraszuszpendálása és a megfelelő antitestek vagy antitestrészek hozzáadása előtt, például Lymphoprep alkalmazásával végzett gradiens centrifugálással egymagvú sejtekből álló frakciót készíthetünk.
Az (a) és (b) esetben az eljárás körülményei igazoltan alkalmasak, amit a későbbiekben leírt sikeres kísérletek eredményei alapján mutatunk be.
A (c) esetben azt találtuk, hogy az eredményeket számos, részletesen vizsgált tényező befolyásolja. E tényezők között említhetjük az antitest koncentrációját, a paramágneses részecskék számának a sejtek számához viszonyított arányát, az inkubálás idejét, az inkubáló tápközeg térfogatát, típusát és pH-ját. A paramágneses részecskék egymagvú sejtek számához viszonyított arányának valamennyi kísérletnél (a primer specifikus antitestek vagy antitestrészek kötési affinitásától függően) 0,5:1 -2:1 tartományba kell esni.
Jelentős problémát jelentett a normális vérsejtek vagy csontvelősejtek - juh vagy patkány antiegér antitestekkel önmagában vagy a specifikus antitestekkel együttesen bevont - mágneses részecskékhez való nem specifikus kötődése. Kísérletek igazolták, hogy a nem specifikus kötődés a specifikus antitestek jelenléte nélkül is azonos szintű, ami azt jelzi, hogy a problémát nem a célsejtek elleni antitestek normális sejtekkel mutatott keresztreaktivitása okozza. Kizártuk annak lehetőségét is, hogy az optimálisnál kisebb specifitást az ionos kötés okozná. Egy további lehetőség volt, hogy a B-sejt-vonalba tartozó normális sejtek szubpopulációi hozzátapadhatnak a részecske-antitest komplexekhez, azonban - a specifikus antitestek/antitestrészecske komplexek hozzáadása előtt - a B-sejtek sejtszuszpenzióból történő eltávolítása nem fokozta a specifitást.
A csontvelő és a perifériás vér izolált egymagvú frakciói esetében alkalmazott eljárásnál felmerülő problémát (vagyis, hogy néhány nem célsejt is kötődhet a paramágneses részecskékhez) kiküszöböltük. Ennek megfelelően, a juh antiegér antitesttel bevont részecskék - önmagukban történő vagy specifikus antitestekkel együttes - alkalmazása esetén az egymagvú vér- vagy csontvelősejtekhez nem specifikusan kötődő részecskék száma átlagosan 10-ről körülbelül egyre, és ezzel párhuzamosan, a részecskékhez kötődő normális sejtek aránya 1 —2%-ról 0,5-1%-ra vagy még kisebb hányadra csökkent.
Bebizonyítottuk, hogy a problémát a paramágneses részecskékhez kötődő antitestekkel kapcsolatos hidrofób erők okozzák. Ennek megfelelően, az említett hidrofobitás csökkentésére irányuló eljárások is a találmány tárgyát képezik. Az egyik ilyen eljárásban az antitesttel bevont részecskéket és a sejtszuszpenziót megfelelő koncentrációjú, enyhe detergensekkel (például Tween 20™) együtt előinkubáljuk, például 0,1% koncentrációban, 4 °C-on, 30 percig. Ha a célsejtek lehetséges szelekciója garantált, a sejtszuszpenzió alacsony koncentrációban tartalmazhatja a detergenst, például 0,01% Tween 20™-at. Ez az eljárás számos kísérletben majdnem megszüntette vagy jelentősen mérsékelte a vérből vagy csontvelőből származó egymagvú sejtffakciók esetében felmerülő nem specifikus kötődés problémáját.
A detergens alkalmazásával együtt egy másik tökéletesítés is alkalmazható. Eszerint, a sejtszuszpenzió primer antitestekkel vagy antitestrészletekkel, illetve - antitesttel bevont - paramágneses részecskékkel együttes inkubálása után a sejtszuszpenziót egy második csoport antitesttel vagy antitestrészlettel együtt inkubáljuk (melyek a célsejtek más extra- vagy intracelluláris determinánsai ellen irányulnak). A sejteket előzetesen fixálószerekkel, például formaldehiddel vagy alkoholokkal kezelhetjük. Ezek az újabb antitestek vagy részleteik előzetesen fluoreszcens anyagokkal, fémkolloidokkal, radioaktív izotópokkal, biotin komplexekkel vagy enzimekkel (például peroxidázzal és alkalikus foszfatázzal) jelölhetők, ami elősegíti a célsejtek láthatóvá tételét, amit önmagában ismert eljárásokkal, mikroszkóp és/vagy megfelelő számlálóberendezés alkalmazásával végezhetünk.
A célsejtek láthatóvá tétele történhet az utóbbi módon, illetve a felületükhöz kötött részecskék alapján egyaránt, miáltal a sejtek megszámlálhatok.
A nem célsejtek és célsejtek megkülönböztetésének egyszerűsége érdekében a sejtszuszpenziót vagy részét a második láthatóvá tételi lépés előtt centrifugálhatjuk, vagy a szuszpenzió részleteit lefedett tárgylemezeken rögzítjük, melyeken a részecskékhez kötődött sejtek vékony rétegben szétterülnek, elősegítve a kettős „festésű” sejtek felismerését.
A nem célsejtek és célsejtek megkülönböztetését tovább egyszerűsítő másik, találmány szerinti eljárás értelmében sejtszűrő berendezést alkalmazunk, melynek során a célsejtszelekciós lépéseket követően a teljes sejtszuszpenziót közvetlenül a sejtszűrőre öntjük. A szabad, kötetlen szemcsék, a nem specifikusan kötött nem célsejtek és a kötetlen nem célsejtek átjutnak a szűrőn, míg a kötött célsejtek a szűrőn maradva láthatóvá tehetők. Az izolált célsejteket tartalmazó szűrőt eltávolítjuk a készülékből, a sejteket rögzítjük és ismert immunhisztokémiai módszerekkel megfestjük, majd mikroszkóp alatt vizsgáljuk. A filtert, miután eltávolítottuk a készülékből, úgy kezeljük, mint az immunhisztoké8
HU 221 278 Bl miában ismert és általánosan alkalmazott, hagyományos mikroszkóp tárgylemezeket.
Speciális célokra a szűrőt eltávolíthatjuk a készülékből, de eljárhatunk úgy is, hogy a készülékben hagyjuk, és a szűrőn elhelyezkedő, izolált célsejtek szaporítása érdekében a készülékbe valamilyen ismert tenyésztő tápközeget (agarózzal vagy anélkül) töltünk.
A találmány szerinti új eljáráshoz alkalmazható készletek, például, az egyes monoklonális antitestekhez kialakított, előre bevont paramágneses részecskéket tartalmaznak. Egy másik megvalósítási módban a készletek, egyik komponensként, IgG izotípus-specifikus antiegér vagy antihumán antitesttel előzetesen bevont paramágneses részecskéket, másik komponensként pedig célsejttel, például tumorsejttel kapcsolódó másfajta antitesteket tartalmaznak. Egy harmadik megvalósítási módban a készlet specifikus anti-Fc-antitestekkel, például poliklonális antiegér vagy monoklonális patkány antiegér vagy antiegér vagy antihumán antitesttel (melyek képesek a célsejt elleni antitestek Fc-részeihez kötődni) előzetesen bevont paramágneses részecskéket tartalmaz. Egy negyedik megvalósítási módban a készletek paramágneses vagy nem mágneses tulajdonságú, megkülönböztető részecskéket tartalmaznak, melyek felületükön célsejtantigént vagy célsejtantigének alkotta csoportot tartalmazhatnak, s az eljárás végzése során ezek a részecskék a sejtszűrő készülékben maradnak, miáltal kontrollként szolgálnak, bizonyítva például, hogy az eljárás során az antitest-antigén interakciók minden szempontból megfelelően működnek. Ezek a részecskék az eljárás végzése során vagy előtte adhatók a sejtszuszpenzióhoz, vagy más módon, ezek a részecskék külön „sejtszuszpenzióként” alkalmazhatók, amelyet ugyanúgy kell feldolgozni, mint az elkülöníteni kívánt célsejteket tartalmazó sejtszuszpenziót. Egy további megvalósítási módban a készlet a kívánt célsejteken belül vagy azok felületén elhelyezkedő antigének/receptorok elleni, másfajta, specifikus (peroxidázhoz, alkalikus foszfatázhoz vagy más enzimekhez konjugált) antitesteket vagy antitestrészleteket tartalmaz (az ilyen enzimekhez megfelelő szubsztrátokkal együtt), vagy más módon az említett antitestek vagy antitestrészletek kötődhetnek specifikus színű vagy kötött enzimekkel rendelkező nem paramágneses részecskékhez is.
A találmány szerinti eljárás újdonsága egy sejtszűrő berendezés alkalmazása, amely többüregű sejtosztályozónak is nevezhető, és amely a fentebb leírt készlet részét képezheti. A többüregű sejtosztályozó berendezés különböző méretű sejtek (például vérsejtek vagy csontvelősejtek) vegyes populációinak szétválasztásához alkalmazható. A kapott sejtek közvetlenül a membránon, mikroszkóppal vagy automata letapogató készülékekkel vizsgálhatók. A találmány szerinti berendezés hagyományos, mágneses részecskék alkalmazásán alapuló sejtizolációs technikákkal együtt alkalmazható, ami nagyszámú (nagy vagy kis térfogatú) minta tumorsejtek jelenlétére végzett átvizsgálásának gyors, érzékeny és egyszerű módját biztosítja (1-4 órán belül).
A találmány tárgyát képező mikroüregű sejtosztályozó berendezés egy nyitott tetejű szűrletgyűjtő dobozból áll, amely tartalmazhat vákuumcső-csatlakozást, és amely kivehető és egyszer használatos soküregű egységet tartalmaz, melynek alját egy sejtosztályozó membránfilter képezi. A berendezés részét képezheti a szűrletgyűjtő doboz teteje vagy fedele is.
A szűrletgyűjtő doboz és teteje készülhet nagy hőmérsékleten végzett sterilizáláshoz alkalmas anyagból, illetve, az ismert szövettenyésztő műanyag eszközökhöz hasonlóan, átlátszó vagy átlátszatlan műanyagból.
A sejtosztályozó membránfilter szabályos és egységes alakú és méretű pórusokat tartalmaz (mint például az egyszálú nejlonmembránok). A membránfilter képezi az egyes üregek alját. A sejtosztályozó membránfiltert úgy rögzítjük a mikroüregekhez, hogy a sejtek elkülönítése után, a sejtek vizsgálata érdekében, eltávolítható legyen. A sejtosztályozó membrán - a mikroüregek eltávolítása utáni vizsgálat elősegítése érdekében - tartalmazhat karton vagy műanyag támasztó keretet is.
A szűrletgyűjtő doboz tartalmazhat egy olyan keretet, amelyen a többüregű egységek elhelyezhetők.
A szűrletgyűjtő doboz kiképzése egy olyan hagyományos 96 üregű lemezhez hasonló, amelyet úgy alakítottak ki, hogy magában foglalja a sejtosztályozó membránt, a gyűjtődobozt és az alacsony nyomású vákuum csatlakozást.
A berendezés részét képezheti a fedél vagy tető is.
A berendezésben lehet egy egyszer használatos tenyésztőedény is, amelyben elhelyezhetők a mikroüregű egységek, és amely steril tenyésztést tesz lehetővé. A tenyésztőedényeken belül bemélyedések vagy hornyok találhatók, amelyek elősegítik, hogy a mikroüregű egységeket hasonlóan helyezhessük el, mint a szűrletgyűjtő dobozban, és a tenyésztés ideje alatt megakadályozzák a mikroüregű egységek elmozdulását. A bemélyedések vagy hornyok biztosíthatják a sejtosztályozó membrán (mikroüregű egység eltávolítása utáni) elhelyezését is.
A találmányt az alábbiakban mutatjuk be részletesebben, melynek során hivatkozunk a mellékelt ábrákra, melyeken (csak példaként) a találmány szerinti sejtosztályozó berendezés néhány változata látható.
Az 1-5. ábrákon látható, hogy a mikroüregű sejtosztályozó berendezés (20) fedélből vagy tetőből (21) és szűrletgyűjtő dobozból (22) áll, amelyen lehet kisnyomású vákuumcsatlakozás (23), és amelyben kivehető, többüregű egységek (24) vannak, melyek alját eltávolítható membrán (25), illetve annak támasztókerete (25a) képezi.
Az 1.1 és 1.2 ábrán a találmány szerinti berendezés két részlegesen összeszerelt változata látható.
A szűrletgyűjtő doboz (22) bizonyos szempontból hasonlít a hagyományos 96 üregű lemez formátumához, és úgy alakítható ki, hogy egy vagy több eltávolítható mikroüregű egység féljen bele.
A többüregű egységek (24) az ábrákon látható módon, kettős sorokban, illetve egyszeres vagy többszörös sorokban helyezkedhetnek el.
A szűrletgyűjtő dobozban (22) a többüregű egységek úgy vannak kialakítva, hogy csak egyféle orientáció lehetséges, amit a csapok (28) és a hornyok (29) illesztésével biztosíthatunk.
HU 221 278 Bl
A sejtosztályozó membránfiltert (25) úgy rögzítjük a többüregű egységek (24) aljához, hogy a filterek képezzék az üregek alját. A rögzítést olyan megoldással végezzük, hogy a többüregű egységet (24) a membránfilter (25) vagy a membránfilter támasztókere- 5 tének (25a) deformációja nélkül lehessen eltávolítani.
A membránfiltert (25) mikroszkóp alatt, illetve denzitometriás vagy hasonló eljárással vizsgálhatjuk.
A membránfilter (25) szabályos és egységes alakú és méretű pórusokat tartalmaz (mint például az egyszá- 10 lú nejlonmembránok); a pórusok mérete 5-75 pm, előnyösen 20 pm.
A szűrletgyűjtő dobozon (22) belüli vagy azon kívüli többüregű egységek (24) szövettenyésztési célokra alkalmas anyagból készíthetők, amely alkalmas a hagyományos 96 üregű lemezek leolvasó készülékeiben történő vizsgálathoz.
A tenyésztőedény (26) és fedele (27) szintén szövettenyészeti célokra alkalmas anyagból állítható elő. Ilyen módon, a tenyésztő tápközeget az üregek tetején kérész- 20 tül, illetve a tenyésztőedény (26) alján is adagolhatjuk.
Az ábrákon feltüntetett valamennyi méret csak példaként szolgál, s nem jelentik a sejtszűrő berendezés (20) korlátozását. Tudni kell azt is, hogy a találmány szerinti berendezést nem szándékozzuk kizárólag a fen- 25 ti példára korlátozni, mivel számos változat lehetséges anélkül, hogy eltérnénk a találmány tárgykörétől. A találmányt az alábbiakban a modellkísérletekkel, az új eljárás alkalmazhatóságát bizonyító példákkal, illetve a gyakorlati alkalmazás példáival mutatjuk be. Ezekkel a példákkal semmiképpen nem szándékozzuk a találmányt korlátozni.
Modellkísérletek
1. Az antitestszemcse-komplexek kötődése tumorsejtekhez
Az antitest/paramágneses részecske komplexek tumorsejtekhez való kötődéséhez szükséges antitestkoncentrációk és optimális körülmények meghatározása érdekében számos rákos sejtvonalat alkalmaztunk. A paramágneses szemcséket oly módon kapcsoltuk a 15 sejtekhez, hogy a specifikus antitesteket juh antiegér (SAM; sheep anti-mouse) antitestekkel bevont paramágneses részecskékhez kapcsoltuk, vagy más módon, a sejteket először a specifikus antitestekkel inkubáltuk, majd mosást követően a SAM antitestekkel bevont részecskékkel inkubáltuk újra. E kísérletek eredményeit a II/A és II/B táblázatban mutatjuk be. A táblázatokban alkalmazottjelek az alábbi tartalommal bírnak:
+: valamennyi sejthez több szemcse kötődött;
(+): valamennyi sejthez kevesebb szemcse kötődött, vagy nem mindegyik tumorsejt rendelkezett felületéhez kötődő szemcsével;
-: nagyon gyenge kötődés.
Il/A táblázat
Az antitestek különböző sejtvonalakhoz való kötődésének eredményei
| Antitestek | Sejtvonal | ||||||||
| MCF-7 | SKBR3 | T47D | MDA231 | MDA435 | DU145 | FEMX-1 | LOX | ||
| NrLulO | IgG2b | + | + | (+) | (+) | + | |||
| Moc31 | IgGl | + | + | + | (+) | ( + ) | + | ||
| Mocl | IgGl | (+) | (+) | + | |||||
| 12H12 | IgGl | + | + | 4- | 4- | ||||
| 2E11 | IgG3 | + | + | + | 4- | + | |||
| 5A6 | IgGl | (+) | + | ||||||
| 5F2 | IgM | (+) | |||||||
| CC3 | IgG2a | - | - | - | - | ||||
| CC1 | IgM | - | (+) | ||||||
| CU18 | IgGl | - | - | - | |||||
| CU46 | IgGl | (+) | - | - | |||||
| 7F11 | IgGl | - | - | + | - | - | - | ||
| ID7 | IgG3 | (+) | |||||||
| E4SF | IgGl | + | + | (-) | - | 50%+ | |||
| 425-3 | + | - | 4- | ||||||
| 9.2.27 | + | + | |||||||
| MUCI 8 | - | - | - | - | |||||
| 2gl2 | IgGl | 4- | |||||||
| 4b7 | + | ||||||||
| IgGl | + | 4- | + | ||||||
| BCRU-G7 | IgM |
HU 221 278 Β1
Π/B táblázat
Az antitestek különböző sejtvonalakhoz való kötődésének eredménye
| Antitestek | Sejtvonal | ||||||||
| PM1 | MA-11 | CRL-1435 | CRL-1740 | 11-146 | Colo-205 | 786-0 | WIDr | ||
| NrLu 10 | IgG2b | + | + | + | + | + | + | - | |
| Moc31 | IgGl | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Mocl | IgGl | + | - | ||||||
| 12H12 | IgGl | + | + | (+) | - | - | - | ||
| 2E11 | IgG3 | (+) | + | - | - | - | - | ||
| 5A6 | IgGl | + | + | ||||||
| CC3 | IgG2a | - | - | ||||||
| CC1 | IgM | (+) | - | ||||||
| CU18 | IgGl | - | - | ||||||
| CU46 | IgGl | - | - | ||||||
| 7F11 | IgGl | (+) | + | - | - | - | - | ||
| 1D7 | IgG3 | - | - | ||||||
| E4SF | IgGl | + | + | + | + | - | - | - | |
| MUCI 8 | - | ||||||||
| 2gl2 | IgGl | - | - | ||||||
| 4b7 | IgGl | - | - | ||||||
| BM2(=2F11) | + | + | |||||||
| BM7(=7F11) | + | ||||||||
| GINTES | IgG | + | |||||||
| 3C9 | IgM | - | - | ||||||
| HH8 | IgM | - | - | ||||||
| 5F4 | IgM | - | - | ||||||
| 3F1 | IgGl | - | - |
2. Tumorsejtek kimutatása a csontvelő vagy a perifériás vér egymagvú frakciójában
A kísérlet során az említett egymagvú sejtekhez vagy olyan sejtszuszpenzióhoz, amelyben az egymagvú sejtekhez in vitro tenyésztett sejtvonalakból származó, különböző mennyiségű ráksejteket adtunk, specifikus antitestekkel és SAM antitestekkel bevont paramágneses részecskéket adtunk. Néhány kísérletben vagy az egymagvú sejteket, vagy a rosszindulatú sejteket fluoreszcens festékkel előzetesen megfestettük, hogy lehetővé tegyük a két sejttípus megkülönböztetését. Valamennyi kísérletnél kontrollként nem kötő primer antitesteket és/vagy juh antiegér antitesttel bevont szemcséket alkalmaztunk. Oly módon is végeztünk kísérleteket, hogy a perifériás vérből egymagvú sejtfrakciót készítettünk volna. Azt tapasztaltuk, hogy a sejtek ilyen módon végzett osztályozása a Lymhoprep alkalmazásával elkülönített vérsejtfrakciók esetében tapasztalhatóhoz képest csökkentette a nem specifikus kötődést.
3. A tumor sejtekhez kötődő antitestszemcsekomplexek elkülönítése és láthatóvá tétele a sejtszürő berendezés alkalmazásával
A tumorsejt-szuszpenziókat és a vér- és csontvelősejt-szuszpenziókkal kevert, fluoreszcensen jelölt tumorsejtek szuszpenzióját az 1. és 2. kísérletben leírtak szerint készítettük, illetve kezeltük, és a sejtszűrő berendezésbe töltöttük. Miután a filteren lévő sejteket mostuk, rögzítettük és festettük, mikroszkópos megfigyelést végeztünk. A csak tumorsejt-szuszpenzióval végzett vizsgálat eredményeként az antitestszemcse-tumorsejt komplexek egyértelműen elkülönültek a filteren. A vér- és csontvelősejtekkel kevert, fluoreszcensen jelölt tumorsejt-szuszpenzióval kapott eredmények alapján megállapítottuk, hogy az antitestszemcse-tumorsejt komplexek ebben az esetben is egyértelműen elkülönültek a filteren (6. ábra). Az eljárás érzékenységének tesztelésére végzett további kísérletek azt mutatták, hogy a fenti eljárás alkalmazásával 102 * * * * 7 darab vér- vagy
HU 221 278 Β1 csontvelősejtet tartalmazó szuszpenzióban mindössze 100 tumorsejt is kimutatható.
4. A sejtszűrő berendezés alkalmazásával izolált sejtek növesztése
Az 1. és 2. kísérletben leírtak szerint kezelt és izolált tumorsejt-szuszpenziókat a szűrőberendezésbe töltöttük, majd a filtert (20% borjúszérumot tartalmazó tenyésztő tápközegben 0,3% agarózt tartalmazó) félszilárd tápközegben inkubáltuk. A sejteket 5% CO2-ot tartalmazó levegőben, 37 °C-on inkubáltuk. A tumorsejtek képesek voltak osztódni és növekedni.
Több kísérletben megfigyeltük az egymagvú sejtek nem specifikus kötődését, ami nem volt összefüggésben a specifikus antitest típusával, és amely ugyanolyan szintű volt akkor is, ha csak a SAM antitesttel bevont részecskéket alkalmaztuk. A nem specifikus kötődés előfordulásának nagyságrendje közel 0%-tól 0,5-2%-ig terjed. Ez a nem specifikus kötődés - a sejtek közötti hidrofób kölcsönhatások csökkentése érdekében - detergens (Tween 20™) alkalmazásával majdnem teljes mértékben kiküszöbölhető volt.
Példák a találmány szerinti eljárás alkalmazhatóságára
1. Mikrometasztázisos daganatos betegség kimutatása vérben és csontvelőben
A rákos sejtek vérben és/vagy csontvelőben való elterjedésének korai és megbízható diagnosztizálása egyre nagyobb jelentőségű az olyan optimális kezelés kiválasztása szempontjából, amely minden valószínűség szerint sok ráktípus (beleértve a karcinómákat) esetében gyógyító hatású (lásd 1. példa). A rosszindulatú melanoma, szarkóma, neuroblasztoma, és több más ráktípus esetében már kialakultak ilyen eljárások (vagy folyamatban van kifejlesztésük).
2. Rosszindulatú sejtek kimutatása mellűri vagy hasvizkóros folyadékgyülemben és vizeletben
Az ilyen folyadékgyülemek természete jelentős diagnosztikai problémát vethet fel, különösen olyan esetben, ha normális reaktív sejtekkel vagy hámsejtekkel együtt kevés ráksejt van jelen. Az új eljárás alkalmazásával számos olyan esetben, ahol a hagyományos citológiai vizsgálatok negatív vagy nem meggyőző eredményt adtak, határozott és gyors diagnózist sikerült készíteni. A vese, a vizeletvezető rendszer és a húgyhólyag rákos megbetegedéseinél hasonló előnyök tapasztalhatók.
3. Daganatos sejtek kimutatása az agy-gerincvelői folyadékban
Ahogy sok ráktípus szisztémás kezelése egyre jobban fejlődött, a tünetekkel járó agyi metasztázisos esetek gyakorisága jelentősen növekedett, és ezzel párhuzamosan fokozódott az ilyen terjedés korai kimutatásának szükségessége. A találmány szerinti új eljárás alkalmazásával egészen kis mennyiségű rosszindulatú sejt is könnyen azonosítható, ami a koponyán belüli tumormanifesztációk korai stádiumában teszi lehetővé a beavatkozást.
4. Rák diagnosztizálása szövetbiopsziában
Ha rákos megbetegedésre gyanakszunk, és sebészeti úton vagy például tűbiopsziával szövetmintát veszünk, a találmány szerinti új eljárással és előkészített sejtszuszpenziók alkalmazásával sokkal egyszerűbb és gyorsabb diagnosztizálásra van lehetőség, mint a hagyományos morfológiai, immunhisztokémiai vagy citokémiai eljárások alkalmazása esetén. Megfelelő antitestek alkalmazásával több alternatív ráktípus különböztethető meg.
5. Prognózisos mutatók azonosítása
Mivel kimutatták, hogy bizonyos rákok esetében több membránmolekula expressziója összefügg a rosszindulatú betegség előrehaladásával, a találmány szerinti eljárás felhasználható prognózisos mutatók azonosítására, például a 2. példában leírt módon.
6. Specifikus betegségekre, a betegség előrehaladására vagy stádiumára utaló sejtek azonosítása
A különböző típusú reumás betegségek (például reumatoid artritis), továbbá allergiás, autoimmun- és szívés érrendszerei betegségek esetében - a betegség diagnosztizálása és stádiumának megállapítása szempontjából - nagy jelentősége van bizonyos sejtek specifikus szubpopulációinak szisztémás vagy helyi jelenlétének azonosításának. Következésképpen, az ilyen sejtpopulációk találmányunk szerinti eljárással végzett gyors kimutatása diagnosztikai és gyógyászati szempontból nagyjelentőségű.
7. Normális sejtek szubpopulációinak kimutatása
Számos esetekben szükség lehet arra, hogy egy sejtpopulációban kimutassuk a normális sejtek adott szubpopulációjának arányát. Ez érvényes például a májbiopsziákra, ahol fontos lehet az epe epithel antigént expresszáló sejtek azonosítása. Hasonlóan, különböző normális szövetekből készített sejtszuszpenziókban szükség lehet a specifikus belhámsejtek azonosítására, és esetleges izolálására.
8. A szelektált sejtek izolálása és növesztése
A fentebb említett célok érdekében, a vizsgálathoz számos esetben nagyobb méretű sejtpopulációra lehet szükség. A találmány szerinti sejtszűrő berendezés alkalmazásával megteremthetjük a pozitívan szelektált célsejtek szaporításának lehetőségét, anélkül, hogy szabad, kötetlen részecskék vagy más, nem specifikusan kötődött sejtek lennének jelen.
Az 1-6. pontokban említett sejtmembrán-molekulák közül többet alkalmazhatunk - különböző típusú, aktivált killersejttel vagy például immuntoxinokkal végzett - immunterápia célmolekulájaként is. Az ilyen molekulák expresszálásának találmány szerinti eljárással végzett azonosítása szintén értékes információkat szolgáltathat annak meghatározása céljából, hogy mely esetekben kell az ilyen típusú kezeléseket alkalmazni.
A találmány gyakorlati megvalósítására vonatkozó példák
1. példa
A ráksejtek vérben és/vagy csontvelőben való elterjedésének korai diagnosztizálása érdekében a találmány szerinti eljárásban MOC-31, NrLulO, BM2, BM7, 12H12 és MluCl antikarcinóma-antitesteket alkalmaztunk, hogy meghatározzuk, az ilyen testfolyadé12
HU 221 278 Β1 kokban érzékenyen azonosíthatók-e az emlőrákból, tüdőrákból, vastag- és végbélrákból, illetve prosztatarákból eredő mikrometasztázisos esetek. Az ezen antitestekkel kapott sikeres eredményeknek nagy klinikai jelentőségük van.
2. példa
Sok sejtmembrán-molekula expressziójáról kimutatták, hogy több ráktípus esetében összefüggésben áll a rosszindulatú folyamatok előrehaladásával. Az ilyen molekulák megfelelő antitestekhez való kötődésének kimutatásával prognózisértékű információkhoz juthatunk. Az I. táblázatban az ilyen antigének közül számos adhéziós molekulát, szénhidrát-antigént, glikolipidet, növekedésifaktor-receptort és karcinómaantigént felsoroltunk. A találmány szerinti eljárással sikerült azonosítani a részecske-antitest komplexek CD44 változatokhoz, E-cadherin-hez, Lev antigénhez, CEA antigénhez, EGF-r antigénhez, transzferrinreceptorhoz, MUC-1 epitóphoz, LUBCRU-G7 epitóphoz, prosztatarák-antigénhez, UJ13A epitóphoz, 2mikroglobulinhoz, HLA antigénekhez és apoptózisreceptorhoz való kötődését.
3. példa
Feltételezhetően rosszindulatú melanomában szenvedő pácienstől két liter mellűri folyadékot vettünk. Centrifugálás után a sejteket 10% magzati borjúszérumot tartalmazó 2 ml RPMI tápközegben szuszpendáltuk, 4 °C-on 9.2.27 antimelanoma antitesttel (10 g/ml) 30 percig inkubáltuk, mostuk, majd 4 °C-on 30 percig Dynabeads™ SAM M450/IgG2A paramágneses részecskékkel inkubáltuk. A sejtszuszpenziót mikroszkóp alatt vizsgáltuk, hogy meghatározzuk a felületükön paramágneses részecskéket hordozó sejtek hányadát. A rosszindulatú melanoma diagnózisa beigazolódott, mivel a sejtek körülbelül 10%-a jelentős számú kötött részecskerozettával rendelkezett.
4. példa
Kissejtes tüdőrák vagy rosszindulatú melanoma klinikai tüneteit mutató esetben bőr alatti tumorból biopsziával szövetmintát vettünk. A mintából különálló sejtekből álló szuszpenziót készítettünk, ezt két részre osztottuk, és az egyik részt a 9.2.27 antimelanoma-antitesttel, a másikat pedig MOC-31 antikarcinóma-antitesttel (mindkét esetben 10 g/ml antitestkoncentrációval) inkubáltuk. Az inkubálást az előző példában leírtak szerint végeztük. Az antimelanoma-antitesttel inkubált sejtek közül egy sem kötődött a szemcsékhez, míg a MOC-31 antitesttel inkubált tumorsejtek mindegyike pozitív volt.
5. példa
Feltételezhetően rosszindulatú melanomában szenvedő páciensből vett biopsziamintából különálló sejtekből álló szuszpenziót készítettünk, melyet a 9.2.27 antimelanoma antitesttel inkubáltunk, és a fentebb leírtak szerint inkubáltunk. A legtöbb sejt pozitív volt, membránjukhoz sok részecskerozetta tapadt.
6. példa
Emlőrákos pácienstől vett mellűri folyadékot annak megállapítása érdekében vizsgáltunk, hogy kimutathatók-e benne tumorsejtek. A folyadék egy literét centrifugáltuk, a sejteket újraszuszpendáltuk, és a szuszpenziót három részre osztottuk, és az egyes részleteket külön-külön három különböző rák elleni antitesttel (MOC-31, 2E11, 12H12) inkubáltuk. Az eljárást az előző példában leírtak szerint végeztük, s azt tapasztaltuk, hogy a sejtek többsége mind a három esetben kötődött az antitesttel bevont részecskékhez.
7. példa
Emlőrákos pácienstől vett csontvelő-szuszpenziót mikrometasztázisos tumorsejtek jelenlétére vizsgáltunk. Az egymagvú sejtek elkészítése után ezeket a fenti példában alkalmazott három rák elleni antitesttel inkubáltuk, de ebben az esetben az antitesteket először Dynabeads™ SAM IgG paramágneses részecskékhez kapcsoltuk. Ezekkel a közvetlenül bevont részecskékkel végzett inkubálás után a sejtszuszpenziót mikroszkóp alatt vizsgáltuk, és sok sejtet pozitívnak találtunk, felületükön számos részecskerozettával. Több emlőrákos pácienstől vett mell- és hasűri folyadékkal és csontvelővel hasonló kísérleteket végeztünk.
8. példa
T47D humán emlőráksejteket különböző időtartamban Hoechst fluoreszcens festékkel inkubáltunk, és ellenőriztük ajelölt sejtek életképességét. Ezután egészséges önkéntesektől vett 1 χ 106 darab csontvelősejthez különböző számú jelölt emlőráksejtet adunk. Az elegyített sejtekhez, külön kísérletekben, különböző koncentrációban, paramágneses monodiszperz részecskéket (Dynabeads™ P450) adtunk, melyeket előzetesen különböző rák elleni antitestekkel (NrLulO, M0C31, 12H12) vontunk be. Jégen végzett 30 perces inkubálás után a különböző tesztcsövekből származó mintákat fénymikroszkóp és fluoreszcenciamikroszkóp alatt számlálókamrában vizsgáltuk. Ha a tumorsejtek összes magvas sejthez viszonyított aránya alacsony volt, a sejtszuszpenziót mágneses tér hatásának vetettük alá, és a kapcsolt mágneses részecskékkel rendelkező sejteket izoláltuk, majd mikroszkóp alatt vizsgáltuk. Azt tapasztaltuk, hogy a sejtelegyben optimális paramágneses szemcse: tumorsejt aránynál (1-10:1) valamennyi tumorsejt 2-15 darab, felületéhez tapadt szemcsével rendelkezett. A kimutatási módszer érzékenysége közel volt az 1 célsejt/104 magvas sejt arányhoz. Jelölt tumorsejtekkel végzett kontrollkísérletekben, melyek során olyan antitesteket alkalmaztunk, melyekről tudtuk, hogy a normális sejtekkel mutatnak bizonyos mértékű keresztreaktivitást, az antitesttel bevont paramágneses részecskékkel igazoltuk ezt a keresztreaktivitást. A tumorral kapcsolatos antitestbevonat nélküli paramágneses szemcsék alkalmazásával végzett kísérletekben a célsejtek egyike sem kötődött a szemcsékhez.
Hasonló kísérleteket végeztünk egyéb emlőrák, illetve kissejtes tüdőráksejtvonalakkal. E kísérletek során hasonló érzékenységet és specifitást tapasztaltunk.
HU 221 278 Β1
9. példa
Emlőrákos és petefészekrákos páciensek mellűri és hasűri folyadékgyülemét lecentrifugáltuk, ezután a sejtszuszpenzióhoz az 1. példában alkalmazott, bevont paramágneses részecskéket adtuk, mágneses térben inkubáltuk és koncentráltuk, majd a szuszpenziót fénymikroszkóp alatt vizsgáltuk. Jellemzően azokhoz a sejtekhez kapcsolódtak a mágneses részecskék, amelyek a tumorsejtek egyértelmű morfológiai jellegzetességeit mutatták, és a kevés normális sejtek egyike sem kötötte meg az antitesttel bevont részecskéket. A mellűri folyadékokkal végzett kísérletek során két esetben is előfordult, hogy a független morfológiai vizsgálat nem mutatta ki daganatos sejtek jelenlétét, azonban az antitesttel bevont szemcsék alkalmazásával jelentős mennyiségű rosszindulatú sejtet detektáltunk. Néhány esetben a tumorsejteket mágneses térben elkülönítettük, és speciálisan emlőráksejtek növesztéséhez készített növesztő tápközeget tartalmazó, szövettenyésztő lombikokba helyeztük, amivel az volt a célunk, hogy folyamatos sejtvonalakat hozzunk létre. Ezzel párhuzamosan, a rosszindulatú folyadékgyülemekből származó sejteket a mágneses szemcsékkel való pozitív szelekció nélkül is tenyésztettük. Ebben az esetben sejtvonalat nem tudtunk kialakítani, míg a pozitívan szelektált sejtek alkalmazása esetén az esetek több, mint 50%-ában sikerült sejtvonalakat kialakítani.
10. példa
Néhány esetben az emlőrákban szenvedő páciensektől vett csontvelőt és perifériás vért a találmány szerinti eljárással úgy vizsgáltuk, hogy a mintához antitesttel bevont paramágneses szemcséket adtunk, a szuszpenziót 4 °C-on 30 percig inkubáltuk, a sejteket mágneses térben bekoncentráltuk, és a szuszpenziót fénymikroszkóp alatt vizsgáltuk. Mindkét típusú minta esetében kimutattuk a paramágneses szemcsék tumorsejtekhez való kötődését (a tumorsejtek száma, mind a csontvelő, mind a vér esetében, a magvas sejtek számának 0,1-1%-át tette ki). Az ilyen kis arányban jelen lévő tumorsejtek semmilyen más módszerrel nem azonosíthatók.
11. példa
Specifikus sejtpopulációk sejtjeinek felületén expresszált bizonyos növekedési faktorok és más géntermékek elleni antitestek felhasználhatók az ilyen sejtek azonosításához és pozitív szelektálásához. Az antitranszferrinreceptor antitestek alkalmazásával végzett, találmány szerinti új eljárásról bebizonyítottuk, hogy gyors, egyszerű és érzékeny módját képezi a transzferrinreceptort expresszáló sejtek azonosításának.
12. példa
Különböző célok érdekében a normális sejtek specifikus populációinak izolálására lehet szükség. A normális vagy tumoros szövetekben lévő kapillárisokat vagy kis ereket bélelő belhámsejteket pozitívan szelektálhatjuk a megfelelő szövetből készített sejtszuszpenziókból. A szelektálás! eljárás során csak a belhámsejteken (és nem a sejtszuszpenzióban lévő egyéb normális sejteken) expresszált struktúrák elleni antitestekkel bevont részecskéket alkalmazunk.
13. példa
Az immunhiányos rágcsálókba injektált humán sejtekről - anti-pán-humán antitesttel bevont mágneses részecskék alkalmazásával - kimutattuk, hogy megtalálhatók a tumoros xenograftokból és különböző gazdaszervekből/szövetekből készített sejtszuszpenziókban.
14. példa
Emlőrákban és melanomában szenvedő páciensek vér- és csontvelősejtjei által alkotott vegyes sejtpopulációkból, a találmány szerinti sejtszűrő berendezés alkalmazásával, tumoros sejtvonalakat különítettünk el és szűrtünk le. A tenyésztő tápközeg hozzáadásával és inkubálással a filteren lévő szelektált tumorsejteket szabad, kötetlen részecskék és más, nem specifikusan kötődött sejtek nélkül tudtuk növeszteni.
Claims (26)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás specifikus célsejtek kimutatására vegyes sejtpopulációkból álló sejtszuszpenziókban, vegyes sejtpopulációkat tartalmazó folyadékrendszerekben, vagy szilárd szövetekből készített egyedi sejtszuszpenziókban (a vérben és csontvelőben lévő normál- és rosszindulatú vérképző sejtek kivételével), ahol az eljárásban paramágneses részecskéket vagy gyöngyöket vonunk be olyan antitestekkel vagy antitestfragmentumokkal, amelyek célsejteken specifikusan expresszált és nem célsejteken nem expresszált membránszerkezetek ellen irányulnak a sejtkeverékben, az említett részecskékhez vagy gyöngyökhöz rögzített antitesteket összekeverjük a célsejteket tartalmazó sejtszuszpenzióval, a sejtszuszpenzió és az említett részecskékhez vagy gyöngyökhöz rögzített antitestek keverékét 10-15 perc és 2 óra közti időtartamon át, előnyösen 30 percen át, 0-25 °C közti hőmérsékleten, előnyösen 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk gyengéd rázatás közben, megfestjük vagy más módon láthatóvá tesszük a sejtrészecske-komplexumot a sejtszuszpenziókban, megvizsgáljuk és megszámoljuk a festett és festetten részecske-célsejt komplexumokat a sejtszuszpenzióban mikroszkópot vagy megfelelő sejt/részecske számláló berendezést alkalmazva, azzal jellemezve, hogy az így kapott célsejtszuszpenziót átvisszük egy sejtszűrő berendezésbe vagy sejtszeparátorba (20), amelyben a sejtszuszpenziót egy mikroüregbe helyezzük egy, a részecske/célsejt komplexumok visszatartására alkalmas membránszűrőt használva, kívánt esetben szívatást alkalmazva, a szűrőket az izolált célsejtekkel az említett sejtszűrő berendezésről eltávolítva, ezeket rögzítjük, festjük és mikroszkóppal megtekintjük, ahol a membránszűrő nejlon monofilmembránokat tartalmaz, amelyek szabályos és állandó alakú és méretűHU 221 278 Bl pórusokkal bírnak, hogy a részecske/célsejt komplexumok elkülönítése lehetővé váljék.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitestek vagy antitestfragmentumok poliklonális antiegér vagy monoklonális patkány antiegér antitestek vagy antihumán antitestek, amelyek képesek a membránszerkezet ellen irányuló említett antitestek Főrészeihez kötődni.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtszuszpenziót, amely a célsejteket a szabad célsejttel asszociált antitestekkel együtt tartalmazza, 5 perc és 2 óra közti időtartamon át inkubáljuk 0 °C és 20 °C közti hőmérsékleten gyengéd rázatás mellett, mossuk, majd hozzáadjuk az anti-Fc-antitestekkel előre bevont paramágneses részecskéket vagy gyöngyöket.
- 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a keveréket 30 percig inkubáljuk.
- 5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a keveréket 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk.
- 6. Az 15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtrészecske-komplexum festése vagy más módon láthatóvá tétele érdekében a sejtszuszpenziókat nem kezeljük vagy egy másik megoldás szerint előkezeljük formáimnál, alkohollal vagy más rögzítőszerrel, és inkubáljuk más olyan antitestekkel vagy antitestfragmentumokkal, amelyek a célsejteken jelen lévő extracelluláris vagy intracelluláris molekulákhoz kötődnek, és amelyek jelölve vannak előzetesen peroxidázzal, alkalikus foszfatázzal vagy más enzimekkel, amelyek lehetővé teszik a kötés láthatóvá tételét az ide vonatkozó szubsztrátumok hozzáadásával és inkubálásával.
- 7. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitest vagy antitestfragmentumok biotinilezve vannak, és a kötés peroxidázzal, alkalikus foszfatázzal vagy más enzimekkel komplexbe vitt avidinnel történő inkubálással van láthatóvá téve, a megfelelő enzimhez szolgáló, idevonatkozó szubsztrátumok hozzáadásával és inkubálásával.
- 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inkubált paramágneses részecske-antitestsejt keveréket mágneses mezőnek tesszük ki.
- 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitestekkel bevont részecskékkel asszociált bármely hidrofób erőt csökkentjük az antitestekkel bevont részecskék és a sejtszuszpenzió előinkubálásával enyhe detergensekkel megfelelő koncentrációkban 30 percen át 4 °C hőmérsékleten.
- 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitestek vagy fragmentumaik normális, élő sejtekben lévő antigének ellen irányulnak, amilyen sejtek például a májhepatociták, kupffersejtek, 1. és 2. típusú endoteliális sejtek, a tüdő clarasejtjei, speciális szervek endoteliális sejtjei, hasnyálmirigy exokrin és endokrin sejtek, húgyhólyag epitheliális sejtek, agy glia- és ependimális sejtek, húgyhólyag és prosztata epitheliális sejtek, a légutak csillós sejtjei, a gyomor- és béltraktus nyálkasejtjeinek különböző szubpopulációi, hipofízissejtek, és további endokrinsejtek különböző hormontermelő szervekből.
- 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a célsejtantitest reaktív a normális sejtek szubpopulációin és normális szövetsejtek membránján expresszált onkogéntermékeken jelen lévő antigénekkel.
- 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitest olyan antitest, amely az EGF-receptor, POGF (A és B)-receptor, inzulinreceptorok, inzulinszerű receptorok, transzferrinreceptor és NGF- vagy FGF-receptorok ellen irányul.
- 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitest integrinek és más adhéziós membránmolekulák ellen, vagy normális sejtekből való MDR fehérjék ellen irányul.
- 14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitest vagy fragmentumai antigén vagy receptorok ellen irányulnak abnormális fejlődési útú sejtekben, elsősorban primer és áttételes ráksejtekben.
- 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett, célsejttel asszociált antitestek lyG izotípusú antitestek, vagy F(ab’)2 vagy (ab) fragmentumok, vagy IgM izotípusú antitestek, vagy az IgM fragmentumai.
- 16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtszuszpenzió csontvelőből, perifériás vérből, mellhártyaizzadmányból, peritoneális izzadmányból, vizeletből, agy-gerincvelői folyadékból, ondóból, nyirokból, májból, nyirokcsomókból, lépből, tüdőből, hasnyálmirigyből, csontszövetből, központi idegrendszerből, prosztatából, bőrből vagy nyálkahártyákból származik.
- 17. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitestek és antitest fragmentumok és ezek kombinációi bármely olyan antigén vagy antigén altípus ellen irányulnak, amelyek az 1. táblázatban fel vannak sorolva, valamint rosszindulatú sejtek membránján expresszált növekedésifaktor-receptorok és onkogén termékek, továbbá inzulinreceptorok, inzulinszerű receptorok, FGF-receptorok és mindezek kombinációi ellen irányulnak.
- 18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett antitest olyan antitest, amely reaktív az abnormális sejteken jelen lévő antigénekkel, az ilyen sejtek közé értve például a mell-, petefészek- és tüdőkarcinóma-sejteket, melanóma-, szarkóma- és glioblasztomasejteket, a gyomor- és bélrendszer, a húgy- és ivarszervi traktus, valamint a retikulo-endoteliális rendszer ráksejtjeit, és/vagy nem neopláziás betegségekkel asszociált célsejteket, amilyen betegségek például a szív- és érrendszeri-, tüdő, autoimmun gyomor- és bélrendszeri, húgy- és ivarszervi-, retikulo-endoteliális és egyéb rendellenességek.
- 19. Sejtszűrő berendezés vagy sejtszeparátor (20) részecske-célsejt komplexumok elkülönítésére nem kötött gyöngyöktől és nem kötött nem célsejtektől kevertHU 221 278 BI sejtpopulációk sejtszuszpenziójában, azzal jellemezve, hogy a berendezés tartalmaz egy szűrő gyűjtődobozt (22) vezető csappal vagy csapokkal (28), fedéllel (21) és egy kisnyomású vákuum-csatlakozórésszel (23), és tartalmaz mikroüregekből álló többüreges egységet (24), amely vezetőhoronnyal (29) bír az alapoknál nyitva, és a többüreges egység el van látva egy sejtelkülönítő membránszűrővel (25) és egy membrán tartókerettel (25a) eltávolíthatóan rögzítve a többüreges egység (24) aljához, ahol a membránszűrő nejlon monofilmembránokat tartalmaz, amelyek szabályos és állandó alakú és méretű pórusokkal bírnak, hogy a részecske/célsejt komplexumok elkülönítése lehetővé váljék.
- 20. A 19. igénypont szerinti sejtszűrő berendezés (20), azzal jellemezve, hogy a nejlon monofilmembránok pórusmérete 5 pm és 75 pm között van.
- 21. A 19. igénypont szerinti sejtszűrő berendezés (20), azzal jellemezve, hogy a nejlon monofilmembránok pórusmérete 20 pm.
- 22. Az 1-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a létrejövő mágnesesen aggregált sejtek, és/vagy a sejtszűrő berendezés (20) alkalmazásával izolált sejtek alá vannak vetve további biológiai, biokémiai és immunológiai vizsgálatoknak, ezek közé értve a specifikus gének jellemzését DNS-, mRNS- és fehérjeszintnél, közöttük a polimeráz láncreakciót (PCR) és a reverz transzkriptáz PCR-t.
- 23. Az 1-18. igénypontok szerinti eljárás specifikus célsejtek kimutatására, azzal jellemezve, hogy az elkülönített paramágneses részecske/célsejt komplexumokat in vitro sejttenyészetek létesítésére alkalmazzuk.
- 24. Az 1-18. és 23. igénypontok szerinti eljárás specifikus célsejtek kimutatására, azzal jellemezve, hogy az elkülönített paramágneses részecske/célsejt komplexumokat vagy in vitro létesített sejttenyészeteket immunhiányos állatokba inokuláljuk, előnyösen humán testnedvxenográfokat létesítve az állatokban.
- 25. Készlet az 1-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás végrehajtására, azzal jellemezve, hogy tartalmaz célsejteken lévő antigénreceptorok ellen irányuló specifikus antitesteket vagy antitestfragmentumokat, ahol az említett antitest vagy antitestfragmentum a készletben benne foglalt paramágneses részecskékhez van kötve közvetlenül vagy anti-Fc-antitesteken át; és más specifikus antitesteket vagy antitestfragmentumokat, amelyek a célsejteken vagy célsejtekben található antigének/receptorok ellen irányulnak, ahol az említett antitestek vagy antitestfragmentumok biotinhoz, peroxidázhoz, alkalikus foszfatázhoz vagy más enzimekhez vannak konjugálva, vagy ahol az említett antitestek vagy antitestffagmentumok specifikus színnel, vagy kötött enzimekkel, például peroxidázzal vagy alkalikus foszfatázzal bíró nem paramágneses részecskékhez vannak kötve, és egy 19-21. igénypontok bármelyike szerinti sejtszűrő berendezést, és paramágneses vagy nem paramágneses részecskéket, amelyek előre be vannak vonva specifikus célantigénnel vagy antigének csoportjával standardként való felhasználáshoz.
- 26. Készlet az 1-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás végrehajtására, azzal jellemezve, hogy ez tartalmaz paramágneses részecskéket specifikus anti-Fc-antitestekkel előre beborítva, mégpedig poliklonális antiegér vagy monoklonális patkány antiegér vagy antihumán antitestekkel, amelyek képesek megkötni a célsejttel asszociált antitestek Fc-részeit, és specifikus szabad célsejtantitesteket, és más specifikus antitesteket vagy antitestfragmentumokat, amelyek a célsejteken vagy célsejtekben található antigének/receptorok ellen irányulnak, ahol az említett antitestek vagy antitestfragmentumok biotinhoz, peroxidázhoz, alkalikus foszfatázhoz vagy más enzimekhez vannak konjugálva, vagy ahol az említett antitestek vagy antitestffagmentumok specifius színnel, vagy kötött enzimekkel, például peroxidázzal vagy alkalikus foszfatázzal bíró nem paramágneses részecskékhez vannak kötve, és egy 19-21. igénypontok bármelyike szerinti sejtszűrő berendezést, és paramágneses vagy nem paramágneses részecskéket, amelyek előre be vannak vonva specifikus célantigénnel vagy antigének csoportjával standardként való felhasználáshoz.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO940866A NO180658C (no) | 1994-03-10 | 1994-03-10 | Fremgangsmåte og anordning for deteksjon av spesifikke målceller i spesialiserte eller blandede cellepopulasjoner og opplösninger som inneholder blandede cellepopulasjoner |
| PCT/NO1995/000052 WO1995024648A1 (en) | 1994-03-10 | 1995-03-10 | Method and device for detection of specific target cells in specialized or mixed cell populations and solutions containing mixed cell populations |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9602432D0 HU9602432D0 (en) | 1996-11-28 |
| HUT75370A HUT75370A (en) | 1997-05-28 |
| HU221278B1 true HU221278B1 (en) | 2002-09-28 |
Family
ID=19896917
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9602432A HU221278B1 (en) | 1994-03-10 | 1995-03-10 | Method and device for detection of specific target cells in specialized or mixed cell populations and solutions containing mixed cell populations |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6265229B1 (hu) |
| EP (1) | EP0749580B2 (hu) |
| JP (1) | JP4071824B2 (hu) |
| AT (1) | ATE191973T1 (hu) |
| AU (1) | AU690244B2 (hu) |
| CA (1) | CA2185128C (hu) |
| CZ (1) | CZ265296A3 (hu) |
| DE (1) | DE69516401T3 (hu) |
| DK (1) | DK0749580T3 (hu) |
| ES (1) | ES2147607T3 (hu) |
| FI (1) | FI963533A (hu) |
| GR (1) | GR3033946T3 (hu) |
| HU (1) | HU221278B1 (hu) |
| NO (1) | NO180658C (hu) |
| PL (1) | PL177483B1 (hu) |
| PT (1) | PT749580E (hu) |
| SK (1) | SK115196A3 (hu) |
| WO (1) | WO1995024648A1 (hu) |
Families Citing this family (75)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994007138A1 (en) | 1992-09-14 | 1994-03-31 | Fodstad Oystein | Detection of specific target cells in specialized or mixed cell population and solutions containing mixed cell populations |
| NO180658C (no) | 1994-03-10 | 1997-05-21 | Oeystein Fodstad | Fremgangsmåte og anordning for deteksjon av spesifikke målceller i spesialiserte eller blandede cellepopulasjoner og opplösninger som inneholder blandede cellepopulasjoner |
| NO180167C (no) | 1994-09-08 | 1997-02-26 | Photocure As | Fotokjemisk fremgangsmåte til å innföre molekyler i cellers cytosol |
| US6190870B1 (en) * | 1995-08-28 | 2001-02-20 | Amcell Corporation | Efficient enrichment and detection of disseminated tumor cells |
| NO961031D0 (no) | 1996-03-13 | 1996-03-13 | Det Norske Radiumshospital Tum | Fremgangsmåte til å drepe uönskede målceller |
| NO961221D0 (no) * | 1996-03-26 | 1996-03-26 | Oeystein Fodstad | Fremgangsmåte til å identifisere nye gener assosiert med setepreferert cancer mestastasedannelse |
| DE19706617C1 (de) * | 1997-02-20 | 1998-04-30 | Mueller Ruchholtz Wolfgang Pro | Verfahren zur Zählung mikroskopischer Objekte |
| DE19725894A1 (de) * | 1997-06-19 | 1998-12-24 | Biotechnolog Forschung Gmbh | Differentielle Vakuumkammer |
| US5985658A (en) * | 1997-11-14 | 1999-11-16 | Health Research Incorporated | Calmodulin-based cell separation technique |
| WO1999041613A1 (en) | 1998-02-12 | 1999-08-19 | Immunivest | Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells |
| US6277588B1 (en) * | 1998-05-01 | 2001-08-21 | Tel Aviv University | Screening of cell populations |
| DE19833738A1 (de) * | 1998-07-27 | 2000-02-03 | Michael Giesing | Verfahren zur Isolierung von Krebszellen aus zellhaltigen Körperflüssigkeiten sowie Sets zur Durchführung dieses Verfahrens |
| FR2782730B1 (fr) * | 1998-08-25 | 2002-05-17 | Biocom Sa | Procede de separation cellulaire pour l'isolation de cellules pathogeniques, notamment cancereuses rares, equipement et reactif pour la mise en oeuvre du procede et application du procede |
| US6828157B1 (en) * | 1999-05-04 | 2004-12-07 | Dan A. Pankowsky | Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells |
| US6682940B2 (en) * | 1999-05-04 | 2004-01-27 | Dan A. Pankowsky | Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells |
| DK1181551T3 (da) * | 1999-05-04 | 2007-02-26 | Dan A Pankowsky | Produkter og fremgangsmåder til enkeltparameter- og multiparameter-fænotypebestemmelse af celler |
| US6692702B1 (en) * | 2000-07-07 | 2004-02-17 | Coulter International Corp. | Apparatus for biological sample preparation and analysis |
| US6913697B2 (en) | 2001-02-14 | 2005-07-05 | Science & Technology Corporation @ Unm | Nanostructured separation and analysis devices for biological membranes |
| US6656587B2 (en) * | 2001-05-02 | 2003-12-02 | Phillips Plastics Corporation | Composite particles |
| US7863012B2 (en) * | 2004-02-17 | 2011-01-04 | Veridex, Llc | Analysis of circulating tumor cells, fragments, and debris |
| US8980568B2 (en) * | 2001-10-11 | 2015-03-17 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for detecting non-hematopoietic cells from a blood sample |
| US8986944B2 (en) | 2001-10-11 | 2015-03-24 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for separating rare cells from fluid samples |
| AU2003216175A1 (en) * | 2002-02-04 | 2003-09-02 | Colorado School Of Mines | Laminar flow-based separations of colloidal and cellular particles |
| AU2003213107A1 (en) | 2002-02-15 | 2003-09-09 | Exact Sciences Corporation | Methods for analysis of molecular events |
| EP1504121A4 (en) * | 2002-04-24 | 2005-06-29 | Hitachi Chemical Res Ct Inc | DEVICE AND METHOD FOR HIGH QUANTIZATION OF MESSENGER RNA FROM TOTAL BLOOD |
| US7745180B2 (en) | 2002-04-24 | 2010-06-29 | Hitachi Chemical Co., Ltd. | Device and method for high-throughput quantification of mRNA from whole blood |
| AU2003277153A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-04-19 | The General Hospital Corporation | Microfluidic device for cell separation and uses thereof |
| AU2003277610A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-06-07 | Shuichi Hanada | Method of examining cancer cells and reagent therefor |
| WO2004075855A2 (en) | 2003-02-26 | 2004-09-10 | Biomed Solutions, Llc | Process for in vivo treatment of specific biological targets in bodily fluid |
| US7592143B2 (en) * | 2003-04-18 | 2009-09-22 | Cytovia, Inc. | Methods of treating diseases responsive to induction of apoptosis and screening assays |
| WO2005028680A2 (en) * | 2003-09-12 | 2005-03-31 | Biocontrol Systems, Inc. | Methods, compositions, and kits for the concentration and detection of microorganisms |
| US20050181353A1 (en) * | 2004-02-17 | 2005-08-18 | Rao Galla C. | Stabilization of cells and biological specimens for analysis |
| CA2557819A1 (en) * | 2004-03-03 | 2005-09-15 | The General Hospital Corporation | Magnetic device for isolation of cells and biomolecules in a microfluidic environment |
| WO2005111244A2 (en) * | 2004-05-10 | 2005-11-24 | Exact Sciences Corporation | Methods for detecting a mutant nucleic acid |
| WO2006026654A2 (en) | 2004-08-27 | 2006-03-09 | Exact Sciences Corporation | Method for detecting a recombinant event |
| WO2006047787A2 (en) | 2004-10-27 | 2006-05-04 | Exact Sciences Corporation | Method for monitoring disease progression or recurrence |
| US20060171846A1 (en) * | 2005-01-10 | 2006-08-03 | Marr David W M | Microfluidic systems incorporating integrated optical waveguides |
| US20060223178A1 (en) * | 2005-04-05 | 2006-10-05 | Tom Barber | Devices and methods for magnetic enrichment of cells and other particles |
| US20070196820A1 (en) | 2005-04-05 | 2007-08-23 | Ravi Kapur | Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles |
| US9777314B2 (en) * | 2005-04-21 | 2017-10-03 | Esoterix Genetic Laboratories, Llc | Analysis of heterogeneous nucleic acid samples |
| US8921102B2 (en) | 2005-07-29 | 2014-12-30 | Gpb Scientific, Llc | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
| US9487812B2 (en) | 2012-02-17 | 2016-11-08 | Colorado School Of Mines | Optical alignment deformation spectroscopy |
| US8119976B2 (en) * | 2007-07-03 | 2012-02-21 | Colorado School Of Mines | Optical-based cell deformability |
| US9885644B2 (en) | 2006-01-10 | 2018-02-06 | Colorado School Of Mines | Dynamic viscoelasticity as a rapid single-cell biomarker |
| US9878326B2 (en) * | 2007-09-26 | 2018-01-30 | Colorado School Of Mines | Fiber-focused diode-bar optical trapping for microfluidic manipulation |
| US8372584B2 (en) | 2006-06-14 | 2013-02-12 | The General Hospital Corporation | Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags |
| US20080070792A1 (en) | 2006-06-14 | 2008-03-20 | Roland Stoughton | Use of highly parallel snp genotyping for fetal diagnosis |
| US20080050739A1 (en) | 2006-06-14 | 2008-02-28 | Roland Stoughton | Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats |
| US8137912B2 (en) | 2006-06-14 | 2012-03-20 | The General Hospital Corporation | Methods for the diagnosis of fetal abnormalities |
| CN101583722A (zh) * | 2006-07-14 | 2009-11-18 | 阿维瓦生物科学股份有限公司 | 从生物学样品检测稀有细胞的方法和组合物 |
| US7955867B2 (en) * | 2007-01-31 | 2011-06-07 | Millipore Corporation | High throughput cell-based assays, methods of use and kits |
| MX2009011228A (es) * | 2007-04-19 | 2009-11-02 | Wellstat Biologics Corp | Deteccion de niveles elevados de la proteina her-2/neu de celulas cancerosas circulantes no aisladas y tratamiento. |
| KR100926485B1 (ko) | 2007-07-27 | 2009-11-12 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 정량 관찰이 용이한 면역조직화학 염색 방법 |
| US20090062828A1 (en) * | 2007-09-04 | 2009-03-05 | Colorado School Of Mines | Magnetic field-based colloidal atherectomy |
| US10722250B2 (en) | 2007-09-04 | 2020-07-28 | Colorado School Of Mines | Magnetic-field driven colloidal microbots, methods for forming and using the same |
| EP2240778B1 (en) * | 2008-01-07 | 2014-07-23 | Luminex Corporation | Isolation and identification of cells from a complex sample matrix |
| JP2011509405A (ja) * | 2008-01-07 | 2011-03-24 | ルミネックス コーポレーション | 生物学的標的の免疫磁気捕捉および撮像の方法 |
| US7927561B2 (en) * | 2008-01-10 | 2011-04-19 | Becton, Dickinson And Company | Rapid particle detection assay |
| EP2952589B1 (en) | 2008-09-20 | 2018-02-14 | The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University | Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by sequencing |
| EP2379227B1 (en) * | 2008-12-31 | 2014-01-22 | 3M Innovative Properties Company | Methods for isolating microorganisms |
| CA2756493C (en) * | 2009-03-24 | 2019-07-02 | Biocept, Inc. | Devices and methods of cell capture and analysis |
| DE102010001322A1 (de) * | 2010-01-28 | 2011-08-18 | Siemens Aktiengesellschaft, 80333 | Anordnung und Verfahren zur Filtration einer Flüssigkeit und Verwendung in der Mikroskopie |
| EP2363501A1 (en) * | 2010-03-02 | 2011-09-07 | Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf | Method for isolating target cells |
| US20150233921A1 (en) * | 2011-02-16 | 2015-08-20 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of | Detection of subject biomarker diagnostic assay for dengue fever and the differentiation of dengue hemorrhagic fever |
| MX345017B (es) | 2011-02-16 | 2017-01-13 | The Government Of The Us Secretary Dept Of Health And Human Services Centers For Disease Control And | Metodos y aparatos para la vigilancia y el control de los vectores de insecto. |
| WO2013016600A2 (en) * | 2011-07-28 | 2013-01-31 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and reagents for diagnosing conditions and characterization of tumor cells associated with serous fluids |
| KR101422941B1 (ko) | 2012-12-06 | 2014-07-23 | 삼성전기주식회사 | 바이오 칩 |
| EP2996789B1 (en) | 2013-05-17 | 2019-07-17 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Particle release and collection |
| CN104492595B (zh) * | 2014-12-18 | 2017-08-01 | 佛山市赛科科技股份有限公司 | 一种介质盒及具有该介质盒的除铁装置 |
| GB201703383D0 (en) | 2017-03-02 | 2017-04-19 | Gargle Tech Ltd | Testing for particulates |
| CN108165479A (zh) * | 2018-01-15 | 2018-06-15 | 王辉 | 一种用于检测外周血循环肿瘤细胞的试剂盒 |
| CN110850067B (zh) * | 2018-08-21 | 2023-08-15 | 上海恒润达生生物科技股份有限公司 | 嵌合抗原受体亲和力检测方法 |
| IL281102B2 (en) | 2018-09-05 | 2024-04-01 | Hero Scient Ltd | Test for particle detection |
| WO2022149135A2 (en) | 2021-01-06 | 2022-07-14 | Hero Scientific Ltd. | Filtration sampling devices |
| WO2023133566A1 (en) * | 2022-01-07 | 2023-07-13 | The Regents Of The University Of California | Systems and methods for particle mapping |
Family Cites Families (53)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4219411A (en) | 1978-09-18 | 1980-08-26 | California Institute Of Technology | Cell sorting apparatus |
| US4230685A (en) | 1979-02-28 | 1980-10-28 | Northwestern University | Method of magnetic separation of cells and the like, and microspheres for use therein |
| US4510244A (en) | 1980-04-17 | 1985-04-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Cell labeling with antigen-coupled microspheres |
| AU563827B2 (en) * | 1982-07-01 | 1987-07-23 | Millipore Corp. | Filtration apparatus |
| US4659678A (en) | 1982-09-29 | 1987-04-21 | Serono Diagnostics Limited | Immunoassay of antigens |
| US4925922A (en) | 1983-02-22 | 1990-05-15 | Xoma Corporation | Potentiation of cytotoxic conjugates |
| US4664911A (en) | 1983-06-21 | 1987-05-12 | Board Of Regents, University Of Texas System | Immunotoxin conjugates employing toxin B chain moieties |
| US4704255A (en) | 1983-07-15 | 1987-11-03 | Pandex Laboratories, Inc. | Assay cartridge |
| US4920061A (en) | 1984-03-02 | 1990-04-24 | The University Of Texas System | Biological magnetic colloids |
| US4752569A (en) | 1984-06-21 | 1988-06-21 | The Regents Of The University Of California | Sialylated Lewisx epitope, antibodies and diagnosis |
| US5019497A (en) | 1984-11-09 | 1991-05-28 | Lennart Olsson | Human squamous lung carcinoma cell specific antigens and antibodies |
| US4710472A (en) | 1985-09-25 | 1987-12-01 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Magnetic separation device |
| US5076950A (en) * | 1985-12-20 | 1991-12-31 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Magnetic composition for particle separation |
| EP0241042A3 (en) | 1986-04-11 | 1988-05-04 | Hitachi, Ltd. | A method for cell analysis |
| EP0256471A3 (en) | 1986-08-15 | 1989-10-25 | Xoma Corporation | Cytotoxic conjugates for cancer therapy |
| US4895706A (en) | 1986-10-28 | 1990-01-23 | Costar Corporation | Multi-well filter strip and composite assemblies |
| US4857452A (en) | 1986-12-04 | 1989-08-15 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Assay for carcinoma of breast, colon and ovary |
| WO1988005309A1 (en) | 1987-01-27 | 1988-07-28 | Xoma Corporation | Potentiation of cytotoxic conjugates |
| US4847199A (en) † | 1987-02-27 | 1989-07-11 | Eastman Kodak Company | Agglutination immunoassay and kit for determination of a multivalent immune species using a buffered salt wash solution |
| JPH07104349B2 (ja) | 1987-04-11 | 1995-11-13 | 株式会社日立製作所 | 細胞測定法 |
| US5194300A (en) | 1987-07-15 | 1993-03-16 | Cheung Sau W | Methods of making fluorescent microspheres |
| US5322678A (en) | 1988-02-17 | 1994-06-21 | Neorx Corporation | Alteration of pharmacokinetics of proteins by charge modification |
| US5256532A (en) * | 1988-05-02 | 1993-10-26 | Zynaxis Technologies, Inc. | Methods, reagents and test kits for determination of subpopulations of biological entities |
| FR2638848B1 (fr) | 1988-11-04 | 1993-01-22 | Chemunex Sa | Procede de detection et/ou de dosage dans un milieu liquide ou semi-liquide d'au moins une substance organique, biologique ou medicamenteuse soluble, par une methode d'agglutination |
| FR2638849B1 (fr) | 1988-11-04 | 1994-03-18 | Chemunex Sa | Procede d'amplification d'un signal fluorescent pour la recherche specifique de la presence eventuelle de particules et application a la detection et a la numeration desdites particules |
| EP0452342B1 (en) | 1988-12-28 | 1994-11-30 | MILTENYI, Stefan | Methods and materials for high gradient magnetic separation of biological materials |
| GB8905001D0 (en) * | 1989-03-04 | 1989-04-19 | Univ Leicester | Screening for natural products of microbial metabolism |
| WO1990010692A1 (en) | 1989-03-15 | 1990-09-20 | University Of Florida | Monoclonal antibody for use in detection and treatment of childhood leukemia |
| US5081030A (en) | 1989-04-25 | 1992-01-14 | The Johns Hopkins University | Release of cells from affinity matrices |
| DE3919873A1 (de) * | 1989-06-19 | 1990-12-20 | Behringwerke Ag | Magnetische protein-konjugate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| DE3919923A1 (de) | 1989-06-19 | 1990-12-20 | Behringwerke Ag | Magnetische protein-konjugate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| GB8916859D0 (en) * | 1989-07-24 | 1989-09-06 | Dynal As | Hapten linking |
| WO1991009058A1 (en) | 1989-12-14 | 1991-06-27 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Therapeutic uses of the hypervariable region of monoclonal antibody m195 and constructs thereof |
| GB8929297D0 (en) | 1989-12-29 | 1990-02-28 | Dynal As | Method of separation |
| GB9007966D0 (en) | 1990-04-09 | 1990-06-06 | Dynal As | Antigen/anti-antigen cleavage |
| US5200084A (en) * | 1990-09-26 | 1993-04-06 | Immunicon Corporation | Apparatus and methods for magnetic separation |
| US5340719A (en) | 1990-11-23 | 1994-08-23 | Corporation Coulter | Method and apparatus for optically screening microscopic cells |
| JPH05107249A (ja) | 1991-02-04 | 1993-04-27 | Toyobo Co Ltd | リガンド・レセプター反応の高感度検出法 |
| US5491068A (en) * | 1991-02-14 | 1996-02-13 | Vicam, L.P. | Assay method for detecting the presence of bacteria |
| AU2115092A (en) | 1991-10-08 | 1993-04-22 | Eastman Kodak Company | Method, test device and kit for assay of specific binding ligand using controlled flow through filtration membrane |
| US5290707A (en) | 1991-11-25 | 1994-03-01 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Method for detection of microorganisms |
| US5256542A (en) | 1992-03-09 | 1993-10-26 | Tanox Biosystems, Inc. | Selecting low frequency antigen-specific single B lymphocytes with correction for background noise |
| ATE135050T1 (de) * | 1992-03-20 | 1996-03-15 | Celsis Int Plc | Verfahren und gerät zur analyse von biologischem material |
| US5422277A (en) | 1992-03-27 | 1995-06-06 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Cell fixative composition and method of staining cells without destroying the cell surface |
| CA2141428A1 (en) | 1992-07-28 | 1994-02-03 | Steven Kessler | Methods for positive immunoselection of stem cells |
| ES2123063T3 (es) | 1992-09-14 | 1999-01-01 | Stanford Res Inst Int | Marcadores convertidores al alza para ensayos biologicos y otros mediante tecnicas de excitacion laser. |
| WO1994007138A1 (en) * | 1992-09-14 | 1994-03-31 | Fodstad Oystein | Detection of specific target cells in specialized or mixed cell population and solutions containing mixed cell populations |
| FR2700010B1 (fr) * | 1992-12-24 | 1995-03-17 | Rocher Yves Biolog Vegetale | Méthode et dispositif pour tester la réactivité de cellules à l'égard de produits. |
| US5374531A (en) * | 1993-03-22 | 1994-12-20 | Zynaxis, Inc. | Immunoassay for determination of cells |
| US5514340A (en) * | 1994-01-24 | 1996-05-07 | Magnetix Biotechnology, Inc. | Device for separating magnetically labelled cells |
| NO180658C (no) | 1994-03-10 | 1997-05-21 | Oeystein Fodstad | Fremgangsmåte og anordning for deteksjon av spesifikke målceller i spesialiserte eller blandede cellepopulasjoner og opplösninger som inneholder blandede cellepopulasjoner |
| US5968753A (en) | 1994-06-14 | 1999-10-19 | Nexell Therapeutics, Inc. | Positive and positive/negative cell selection mediated by peptide release |
| AUPN214095A0 (en) | 1995-04-03 | 1995-04-27 | Australian Water Technologies Pty Ltd | Method for detecting microorganisms using flow cytometry |
-
1994
- 1994-03-10 NO NO940866A patent/NO180658C/no not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-03-10 DE DE69516401T patent/DE69516401T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-10 PT PT95913431T patent/PT749580E/pt unknown
- 1995-03-10 WO PCT/NO1995/000052 patent/WO1995024648A1/en not_active Application Discontinuation
- 1995-03-10 HU HU9602432A patent/HU221278B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-03-10 CZ CZ962652A patent/CZ265296A3/cs unknown
- 1995-03-10 US US08/704,619 patent/US6265229B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-10 PL PL95316209A patent/PL177483B1/pl unknown
- 1995-03-10 DK DK95913431T patent/DK0749580T3/da active
- 1995-03-10 CA CA002185128A patent/CA2185128C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-10 JP JP52338595A patent/JP4071824B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-10 SK SK1151-96A patent/SK115196A3/sk unknown
- 1995-03-10 ES ES95913431T patent/ES2147607T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-10 AT AT95913431T patent/ATE191973T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-03-10 EP EP95913431A patent/EP0749580B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-10 AU AU20864/95A patent/AU690244B2/en not_active Ceased
-
1996
- 1996-09-09 FI FI963533A patent/FI963533A/fi unknown
-
2000
- 2000-07-12 GR GR20000401631T patent/GR3033946T3/el not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SK115196A3 (en) | 1997-06-04 |
| FI963533A0 (fi) | 1996-09-09 |
| DE69516401T3 (de) | 2006-06-01 |
| NO940866L (no) | 1995-09-11 |
| EP0749580B1 (en) | 2000-04-19 |
| JP4071824B2 (ja) | 2008-04-02 |
| NO940866D0 (no) | 1994-03-10 |
| US6265229B1 (en) | 2001-07-24 |
| ES2147607T3 (es) | 2000-09-16 |
| NO180658C (no) | 1997-05-21 |
| PL316209A1 (en) | 1996-12-23 |
| CA2185128C (en) | 2009-01-13 |
| CA2185128A1 (en) | 1995-09-14 |
| EP0749580A1 (en) | 1996-12-27 |
| AU2086495A (en) | 1995-09-25 |
| EP0749580B2 (en) | 2005-07-27 |
| AU690244B2 (en) | 1998-04-23 |
| FI963533A (fi) | 1996-11-07 |
| GR3033946T3 (en) | 2000-11-30 |
| PL177483B1 (pl) | 1999-11-30 |
| HU9602432D0 (en) | 1996-11-28 |
| CZ265296A3 (en) | 1997-10-15 |
| DE69516401T2 (de) | 2001-01-04 |
| NO180658B (no) | 1997-02-10 |
| HUT75370A (en) | 1997-05-28 |
| WO1995024648A1 (en) | 1995-09-14 |
| DK0749580T3 (da) | 2000-10-23 |
| DE69516401D1 (de) | 2000-05-25 |
| PT749580E (pt) | 2000-10-31 |
| JPH09510779A (ja) | 1997-10-28 |
| ATE191973T1 (de) | 2000-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0749580B1 (en) | Method and device for detection of specific target cells in specialized or mixed cell populations and solutions containing mixed cell populations | |
| EP0660930B1 (en) | Improved method for detection of specific target cells in specialized or mixed cell population and solutions containing mixed cell populations | |
| US6682940B2 (en) | Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells | |
| US20080131917A1 (en) | Products and methods for single parameter and multiparameter phenotyping of cells | |
| EP0951645B1 (en) | Method for characterisation of cells in suspension | |
| JP4590109B2 (ja) | 細胞の単一パラメータ及び複数パラメーター表現型解析のための生成物と方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |