PT749580E - Metodo e aparelho para a deteccao de celulas alvo especificas em colonias de celulas especializadas ou misturadas e solucoes contendo colonias de celulas misturadas - Google Patents

Description

1

"MÉTODO E APARELHO PARA A DETECÇÃO DE CÉLULAS ALVO ESPECIFICAS EM COLÓNIAS DE CÉLULAS ESPECIALIZADAS OU MISTURADAS E SOLUÇÕES CONTENDO COLÓNIAS DE CÉLULAS MISTURADAS" A presente invenção diz respeito a um método imunomagnético para detecção de células alvo especificas em colónias de células e soluções de colónias de células. A invenção também diz respeito a um “kit” e aparelho para a realização do método em colónias de células diferentes.

Em biologia, bioquímica e áreas adjacentes existe uma necessidade considerável de métodos nos quais entidades químicas estão ligadas em conjunto. Tais métodos têm uma importância crescente na pesquisa de ambas as colónias de células normais e anormais. Especialmente quando são utilizados suportes sólidos as células podem ser imobilizadas, detectadas, e isoladas e purificadas. Além disso, o conteúdo da célula pode ser examinado usando um conjunto de métodos sofisticados. É também de grande importância ser capaz de isolar as células em formas viáveis. A afinidade de ligação é uma forma sofisticada de ligar entidades químicas/bioquímicas em conjunto. Num tal método um par de conjunto de ligação que por exemplo estão ligados às substâncias a ser ligadas, ligam-se uns aos outros quando postos em contacto. Um dos conjuntos de ligação numa tal ligação pode ser representado por uma molécula na superfície da célula. Vários destes sistemas de pares de ligação são conhecidos, tais como antigene-anticorpo, enzima-receptor, interacções ligante-receptor em células e ligações biotina-avidina, dos quais a ligação antigene-anticorpo é a mais frequentemente utilizada.

Quando tais métodos são utilizados para isolamento de células especificas, que são o sujeito de várias examinações posteriores, é necessário que as células possam recuperar a sua função assim que voltam às condições originais. Nem sempre é este o caso, consequentemente é proposto um método para providenciar as condições fisiológicas tais que as células especificas isoladas se possam desenvolver em números suficientes para permitir a posterior caracterização. São conhecidos métodos nos quais um dos conjuntos de ligação é ligado a um suporte insolúvel, tal como partículas paramagnéticas, e pelos quais o isolamento das células alvo numa colónia de células misturada é realizada como um isolamento negativo ou isolamento positivo. Num procedimento de isolamento negativo as células não desejadas podem ser removidas da preparação de células por incubação das células com partículas revestidas de anticorpo, especifico para as células não desejadas. Seguidamente à incubação o célula/anticorpo/complexo de partículas pode ser removido usando as partículas, deixando para trás as células alvo desejadas. Este resultado não é com frequência satisfatório, uma vez que as células desejadas são deixadas na colónia de células, mais ou menos purificada, e também uma vez que a invenção do procedimento de isolamento é para examinar e/ou realizar estudos posteriores nas células alvo especificas. Têm sido feitas tentativas para usar partículas para o isolamento positivo, nas quais as células alvo desejadas são removidas da colónia de células misturadas. Estes procedimentos têm no entanto, sido direccionados para certas células alvo e não são aceitáveis para todos os sistemas de célula alvo. Um isolamento positivo foi recentemente proposto envolvendo um sistema de ligação hapteno/anti-hapteno (patente mundial n 0 91/01368) e também diz respeito a um método de ligação de células alvo a um suporte insolúvel usando as capacidades do hapteno, anticorpos anti-hapteno e anticorpos anti-células para se ligarem uns aos outros, construindo assim uma ligação entre o suporte insolúvel, isto é partícula, e a célula alvo, consistindo pelo menos num hapteno e anticorpo anti-hapteno ou combinações de hapteno e anticorpos anti-hapteno e anticorpos anti-anti-hapteno ou secundariamente anticorpos anti-célula. A última clivagem do complexo é realizada expondo-o novamente a um hapteno ou análogo do hapteno. Assim as ligações construídas consistem sempre em hapteno além de um ou mais elementos. O método é direccionado a células alvo inespecíficas e é direccionado para o isolamento de células alvo e libertação do suporte insolúvel.

Além disso a patente mundial n° 91/09938 descreve o uso de uma combinação de selecção positiva e negativa com o objectivo de isolamento e possibilidade de crescimento de células especificas, isto é células progenitoras hematopoiéticas, na medula óssea, e é dependente da remoção das partículas. A patente mundial n° 092/04961 compreende um método e um equipamento complicado para separar células ou moléculas diferentes de um meio teste não magnético pelo uso de partículas magnéticas coloidais. Neste método pequenas partículas (sub microns) são usadas porque é necessário evitar a precipitação de partículas na solução e este método necessita de um aparelho complicado, no qual meios de intensificação magnética são imersos no meio de teste. Isto pode ter efeitos adversos nas células.

No “Application of Magnetic Beads in Bioassays” B. Haukner e C. Kuam, Bio/Technology, 11:60-63, 1993, são descritos vários métodos para o uso de partículas magnéticas para remover células tumorais da medula óssea, isolamento de células linfóides do sangue periférico e isolamento do ADN, ARN, e proteínas de ligação ao ADN. Todos os métodos descritos têm especificidades que são indesejáveis para o objectivo presente de detecção apenas das células alvo. Os métodos acima irão também para além das células alvo ligar células não alvo devido à reactividade cruzada e adesão não especifica do complexo partícula-anticorpo.

Também é descrito um aparelho de filtração com dispositivos múltiplos para o ensaio de quantidades tais como microlitro (pedido de patente Europeia n° 0 098 534), uma faixa de filtragem e conjuntos compostos para filtrar quantidades de microlitro do fluido (pedido de patente Europeia n° 0 339 769) e uma cápsula de ensaio a qual tem um prato base substancialmente rectangular, e um prato de topo substancialmente rectangular e quadro paredes laterais (pedido de patente Europeia n° 0 131 934). Nenhum dos aparelhos acima é aplicável para o objectivo da presente invenção porque descrevem tamanhos de poros que são demasiado pequenos para o objectivo presente de retenção 4 apenas das células-partículas rosas. Além disso os filtros não são desenhâdos para serem expostos a várias examinações das células retidas sem remoção das mesmas do meio de filtragem. Há uma necessidade de uma ligação simples para ligar uma célula alvo a um suporte insolúvel, o qual não envolve compostos de um outro grupo hapteno inespecífico, e o qual é direccionado para a detecção de células alvo especificas, com um mínimo de associação de células inespecíficas e a qual toma desnecessária uma clivagem posterior entre o suporte insolúvel e a célula alvo especifica.

Num pedido em anexo feito por um dos peticionários (patente mundial n° 94/07139, depositada a 10 de Setembro de 1993) é descrito um método com os objectivos de detectar células alvo especificas para diagnóstico, sem o problema com ligações inespecíficas às células normais. Eles apresentam métodos de detecção sensíveis para uma variedade de tipos de células, tal que um número elevado de células pode ser prontamente detectada no microscópio e o procedimento é rápido e simples. Além disso, o presente método podem ser usados para isolamento de células para examinação bioquímica, biológica e imunológica, e para o estudo de genes específicos ao nível do nucleotido ou da proteína, para além da cultura de células, sem a necessidade de clivagem do complexo células-partículas. Há, no entanto, uma necessidade de melhoramentos tal como o isolamento das células alvo ligadas a partículas na suspensão de células alvo, das partículas não ligadas, das células não alvo inespecíficas ligadas e células não alvo não ligadas, o que é simples de realizar não sendo necessário tempo, e toma os complexos partícula/célula alvo aceitáveis para realizar posterior análise como por exemplo exames microscópicos e crescimento num meio de cultura.

Estes objectivos são obtidos pelo método e “kit” caracterizados nas reivindicações incluídas. O método para detecção imunomagnética das células alvo numa população de células misturada e soluções fisiológicas contendo populações de células é aceitável para ί

i detecção, mas pode também ser usado no isolamento positivo de tipos específicos quer de células normais quer de células patogénicas. O método cria uma ligação entre uma célula alvo especifica e um suporte insolúvel tal como partículas paramagnéticas, que consistem num ou dois elementos. A partícula está revestida quer com um anticorpo anti-célula de murina quer de origem humana, direccionada para determinantes antigénicas especificas nas membranas das células alvo desejadas ou as partículas são revestidas com um anticorpo policlonal anti-murganho ou anti-humano capaz de se ligar a porções Fc do anticorpo anti-célula especifico direccionado para os determinantes antigénicos nas membranas da célula alvo. Em vez de se usar o anticorpo policlonal anti-murganho/anti-humano para revestir as partículas, pode ser utilizado um anticorpo monoclonal de rato anti-murganho/anti-humano. Este último anticorpo devido em parte à sua origem monoclonal, pode providenciar uma ligação mais especifica ao anticorpo anti-célula e reduzir o risco de possíveis reacções cruzadas com outras células em soluções, tais como sangue. Além disso, a incubação de suspensão de células com um detergente suave e/ou uma segunda série de anticorpos ou fragmentos de anticorpos pré marcados ou não com agentes fluorescentes, metalo coloides, rádio isótopos, complexos de biotina ou certas enzimas permitindo a visualização, aumentará dramaticamente a especificidade do método.

Além disso, de acordo com a presente invenção, o método pode ser profundamente melhorado e simplificado pela transferência da suspensão dos complexos célula alvo/partícula para o aparelho de filtração de células ou separador de células de acordo com a presente invenção e o número total de células alvo vistos microscopicamente ou crescendo num meio de cultura fisiológicamente básico para ser caracterizado pela presença de características especificas bioquímicas e biológicas.

Dos desenhos: A Figura 1.1 mostra uma vista em perspectiva de uma forma de dispositivo do aparelho de filtração de célula Cell Separator, parcialmente instalado. A Figura 1.2 mostra uma vista em perspectiva de outra forma de realização do Cell Separator, parcialmente instalado.

A Figura 2 mostra uma vista em perspectiva de uma versão do Cell Separator Multiwells com um Menbrane Filter separado das Multiwells. A Figura 4 mostra uma vista em perspectiva de uma versão do prato de cultura com uma disposição de abertura para o Cell Separator Multiwells e/ou Menbrane Filter. A Figura 4 a mostra uma elevação lateral da disposição Multiwell no prato de cultura. A Figura 5 mostra uma vista em perspectiva de colecção de uma versão do Cell Separator Filtrate Collection Box. A Figura 6 mostra os complexos célula alvo-partícula do melanoma aprisionados no dispositivo de filtração de células usando o método descrito. A seguir é apresentado um relato mais detalhado do método, usando células cancerígenas como células alvo para detecção e possível isolamento. O método não é, no entanto limitado às células cancerígenas e a apresentação não deve limitar o método a esta área de utilização em particular, uma vez que o método é aceitável em várias áreas de pesquisa citológica.

No tratamento de doentes de cancro, o estádio da doença no que diz respeito quer à localização ou se ocorreu expansão das metásteses para outros tecidos, é de extrema importância para a escolha da terapêutica alternativa para cada paciente. A expansão das células malignas é feita por invasão directa nos tecidos circundantes, através dos linfáticos ou pela distribuição de células tumorais pelo sangue até órgãos distantes, incluindo a medula óssea e o sistema nervoso central e o fluido cérebro espinal. A detecção de células tumorais das metásteses tem-se baseado, até recentemente, em métodos morfológicos usando o microscópio luminoso e o electrónico em espécies de tumores biopsados, na imagem estendida horizontalmente da medula óssea e sangue periférico, e em diapositivos preparados após citocentrifugação em vários fluidos orgânicos. Desde o advento do reconhecimento dos anticorpos monoclonais predominantemente anti-genes expressos na superfície de diferentes tipos de células malignas, a identificação de células metastásicas tem, com cada vez maior extensão, envolvido também imunocitoquimica e imunofluorescência. Assim, os diapositivos preparados a partir de tumores biopsados ou de citocentrifugação têm sido tratados com anticorpos monoclonais, e a ligação destes às células tumorais é visualizada clorimétricamente ou por fluorescência. O último método requer a utilização de um microscópio de fluorescência preparando altemativamente uma suspensão de células e o uso de um fluxo citométrico.

Os métodos anteriores sofrem de uma sensibilidade e/ou especificidade limitada e são habitualmente trabalhosos e consomem muito tempo, requerendo também um elevado grau de experiência. Os exames de fluxo citométrico envolvem também um equipamento dispendioso.

Os métodos morfológicos para a detecção de células tumorais no sangue e na medula óssea são muito menos sensíveis que os métodos envolvendo imunocitoquimica e imunofluorescência. Os últimos métodos são também, no entanto, inadequados nos casos onde as células tumorais representam menos de 1% do número total de células nucleadas. O fluxo citométrico pode providenciar uma melhor sensibilidade do que os métodos envolvendo o uso de um microscópio, mas requer a disponibilidade de um elevado número de células e envolve também várias dificuldades técnicas. Assim, a agregação de células pode causar problemas, e o método não providencia a possibilidade de distinguir entre as células tumorais marcadas e as células normais com fluorescência inespecífica. A invenção permite uma detecção muito sensível de por exemplo, células tumorais metastásicas, uma vez que um elevado número de células podem facilmente ser vistas no microscópio e as bandas magnéticas a elas ligadas são facilmente reconhecidas. O método e aparelho descritos providenciam um suporte sólido e o registo permanente que é facilmente visto pelo microscópio, permite a avaliação e a quantificação da totalidade da espécie em vez de pequenas fracções da mesma e permite o uso de uma grande variedade de volumes a serem analisados, o dispositivo também pode ser monitorizado automaticamente por tecnologia densitométrica convencional. Os anticorpos monoclonais utilizados ligam-se com especificidade suficiente a, por exemplo, células tumorais e não a outras células que não as células alvo presentes nas suspensões de células misturadas, tal como sangue, medula óssea, e em outras manifestações tumorais tal que todas as células com bandas ligadas representam as células alvo. Além disso, o procedimento é rápido e simples, e pode ser realizado por qualquer investigador com acesso a um microscópio convencional. O novo método envolve, a ligação de anticorpos monoclonais, por exemplo de murina ou de origem humana, que reconhecem especificamente os antigenes presentes nas células tumorais, e não nas células normais em questão, ou para outros propósitos para sub-populações específicas de células normais, para partículas paramagnéticas, quer directamente ou para partículas primeiro convertidas com anticorpos que reconhecem especificamente os respectivos anticorpos ou a porção Fc dos anticorpos IgG, que se ligam às células tumorais. Os anticorpos que se ligam à célula podem ser do tipo IgG ou IgM ou ser um fragmento de ab IgG e IgM. Exemplos de anticorpos anti-células alvo utilizados podem ser aqueles direccionados contra grupos de antigenes determinantes, por exemplo antigene CD56/NCAM (MOC-1), antigene epitelial Cluster 2 (MOC-31), antigene Cluster 2 (MW-40kD) (NrLulO) (Myklebust e outros. Br. J. Câncer Suppl. 63, 49-53, 1991), antigene associado ao melanoma HMW (9.2, 27) (Morgan e outros, Hybridoma, 1, 27-36, 1981), 80kD, antigene associado ao sarcoma (TP1 & TP3) (Câncer Res. 48, 5 302-5 309, 1988), antigenes de mucina (Diel e outros, Breast Câncer Res. Treatm., 1991), antigene receptor EGF (425.3) (Merck), para além do anticorpo anti pan, humano (Bruland e outros, não publicado), que é aceitável para detecção de células humanas entre células animais. O anticorpo 425.3 é direccionado aos antigenes quer de células normais quer de células malignas. Os anticorpos podem além disso ser direccionados contra os receptores do factor do crescimento, por exemplo o receptor-EGF, o receptor PDGF (A e B), o receptor da insulina, o receptor semelhante à insulina, o receptor da transferrina, os receptores NGF e FGF, o grupo de integrinas, outras moléculas de adesão à membrana e proteínas MDR quer em células normais quer em células anormais e antigenes presentes nas sub-populações de células normais, além dos produtos oncogénicos, expressos nas membranas das células normais e malignas e apenas nas células malignas, por exemplo Neu/erb B2/HER2. Como para as células malignas, estas podem ser células de carcinomas no peito, ovário e pulmão, melanoma,

sarcoma, glioblastoma, células de cancro do tracto gastrointestinal e do sistema reticuloendotelial, ou as células alvo podem ser associadas a doenças não neoplásicas, tais como doenças cardiovasculares, neurológicas, pulmonares, auto imunes, gastrointestinais, genito- urinárias, reticuloendoteliais e outras. Além disso, a população de células malignas pode ser localizada na medula óssea, circulação periférica, vir de efusões pleurais e peritoniais ou outros compartimentos de fluidos orgânicos, tais como urina, fluido cérebro espinal, sémen, linfa, ou de tumores sólidos em tecidos normais e órgãos, por exemplo fígado, nódulos linfáticos, baço, pulmão, pâncreas, tecido ósseo, sistema nervoso central, glândula prostática, pele e membranas mucosas. Uma lista mais completa de determinantes antigénicos e os anticorpos correspondentes ou os fragmentos de anticorpos usados no presente método melhorado é apresentada na tabela 1 (ver anexo).

METODOLOGIA O método compreende a ligação de anticorpos directamente a partículas paramagnéticas, ou a ligação pode ter lugar por ligação de anticorpos presos à superfície, tal como anticorpos policlonais anti-murganho, anticorpos anti-murganho rato monoclonal ou anticorpos anti-humano monoclonais, reconhecendo especificamente a porção Fc dos ditos anticorpos individuais. As partículas paramagnéticas revestidas de anticorpos são então misturadas com a suspensão de células a ser examinada e incubada por 5-10 minutos a 2 h, preferencialmente por 30 minutos a 0-25 graus C, preferencialmente a 4 graus C, sob suave rotação. O presente método pode também ser realizado numa ordem de passos diferente, uma vez que os anticorpos livres das células alvo são adicionados à suspensão de células, incubados por 5-10 minutos durante 2 h, preferencialmente 30 min, a 0-20 graus C, preferencialmente 4 graus C, sob suave rotação. As partículas paramagnéticas, pré-revestidas com anticorpos anti-murganho ou anti-humano são então adicionadas à suspensão de células incubada, como descrito acima, e a suspensão resultante é sujeita a uma posterior incubação por 5-10 minutos durante 2 horas, preferencialmente 30 minutos, a 0-25 graus C, preferencialmente 4 graus C sob suave agitação. O presente método pode também ser realizado num número abreviado de passos, pelo facto de os anticorpos livres das células alvo serem adicionados à suspensão f;

de células, ao mesmo tempo e em conjunto com as partículas paramagnéticas pré-revestidas e sujeitos a incubação de 5-10 minutos por 2 horas, preferencialmente 30 minutos a 0-25 graus C, preferencialmente 4 graus C sob suave agitação. O número de partículas revestidas de anticorpo adicionadas à suspensão de células deve ser entre 0,5-10 vezes o número de células alvo. Quando este número não é conhecido, a quantidade de partículas revestidas adicionadas deve ser 1-10 % do número total de células. Para propósitos específicos, e nos casos onde a densidade das células alvo é baixa, por exemplo células malignas, ou as células alvo representam uma ffacção muito baixa do número total de células (cerca de 1%), as células alvo podem ser separadas positivamente das células não alvo num campo magnético. As células alvo isoladas, na suspensão de células podem então ser transferidas para um dispositivo de contagem de células, e o número de células com partículas ligadas pode ser determinado pelo microscópio. O presente método pode também ser realizado, e é o preferencialmente, por transferência da suspensão de células alvo isoladas para o dispositivo de filtração de células descrito neste pedido de, e o número total de células alvo isoladas é observado pelo microscópio. As células alvo isoladas no dispositivo de filtração podem ser fixadas e coradas para facilitar a observação pelo microscópio luminoso. Para propósitos específicos e em casos onde as células alvo isoladas necessitam de ser funcionalmente activas, pode ser adicionado um meio de cultura fisiológicamente básico ao dispositivo de filtração de células e sujeito a incubação por um tempo inespecífico a 37 graus C. As células alvo isoladas podem crescer e ser subsequentemente caracterizadas pela presença de características bioquímicas e biológicas especificas. Com mais frequência, as células alvo podem ser caracterizadas pela presença de características bioquímicas e biológicas. De particular importância será o uso de tais células para estudos em biologia molecular. Em contraste, com os métodos acima citados de técnicas anteriores, o presente método permite estudos e o crescimento de células alvo sem realizar a clivagem da ligação da célula alvo com a partícula paramagnética. Por várias razões existe interesse em examinar genes específicos numa população pura de células alvo ao nível do ADN, ARN-m e proteínas, quer em biópsias tumorais quer em células tumorais presentes no sangue, medula óssea e outros fluidos orgânicos, por exemplo urina, fluido cérebro espinal, sémen, linfa, ou por outro lado de tecidos normais e órgãos, por exemplo fígado, nódulos linfáticos, baço,

π t «3*.

/ pulmão, pâncreas, tecidos ósseos, sistema nervoso central, glândula prostática, pele e membranas mucosas, e em outras áreas da actividade de pesquisa citológica. Com os métodos de técnicas anteriores, sinais obtidos nas manchas meridionais. Manchas setentrionais e ocidentais representam as células normais bem como as células tumorais na biópsia. Se uma suspensão de uma só célula é preparada primeiro a partir de material tumoral, e as células tumorais são então detectadas imunomagnéticamente positivo e separadas, quaisquer estudos de genes realizados neste material representará apenas células alvo. Isto também diz respeito a por exemplo células malignas presentes nos tecidos dos mamíferos, por exemplo na medula óssea, circulação periférica, efusões pleural e peritonial, e outros fluidos orgânicos, por exemplo urina, fluido cérebro espinal, sémen e linfa. Estudos envolvendo a metodologia de reacção em cadeia de polimerase (RCP) vão também ganhar na especificidade e confiança quando realizados em populações de células tumorais puras obtidas pelo novo método. A aplicação dos passos do novo método pode diferir dependendo do tipo de tecidos a ser examinado. a) tecido de biópsias de tumores sólidos ou por agulha é preparado mecanicamente ou por tratamento enzimático suave numa suspensão de célula simples, à qual os anticorpos específicos ou fragmentos de anticorpo são adicionados directamente ou após lavagem da suspensão de célula com fosfato em tampão salino ou meio de cultura com ou sem soro, tal como soro fetal de bezerro, bovino, cavalo, porco, cabra ou soro humano. b) Se o material é uma amostra de efusão pleural ou ascítica, fluido cérebro espinal, urina, linfa ou fluidos orgânicos tais como efusões das articulações de pacientes com várias formas de artrites, os anticorpos específicos ou fragmentos de anticorpo são adicionados quer directamente às amostras, quer após centrifugação com ou sem lavagens antes ou depois das células nas amostras serem depositadas e postas de novo em suspensão.

c) Se o material consiste em sangue ou medula óssea aspirada, os anticorpos ou fragmentos de anticorpo são quer adicionados directamente às amostras, ou após centrifugação com ou sem lavagem antes ou depois as células nas amostras são sedimentadas e postas de novo em suspensão, ou a fracção de célula mononuclear pode ser preparada pelo gradiente de centrifugação em por exemplo Lymphoprep antes da lavagem re-suspensão e adição de anticorpos ou fragmentos de anticorpo apropriados.

As condições de procedimento para a) e b) está estabelecido, como exemplificado pelos resultados obtidos em experiências com sucesso como aquelas descritas abaixo.

Para c) descobriu-se que os resultados eram influenciados por um elevado número de factores que foram examinados em detalhe. Entre estes está a concentração de anticorpo, a razão do número de partículas paramagnéticas versus o número de células, os tempos e volumes de incubação, o tipo de meio de incubação e o grau de pH. A razão de partícula para célula mononuclear em todas as experiências deve ser na ordem de 0,5/1-2/1, dependendo da afinidade de ligação dos primeiros anticorpos específicos ou fragmentos..

Um problema maior tem sido a ligação inespecífica ao sangue normal ou células da medula óssea de partículas revestidas apenas com anticorpos de carneiro ou rato anti-murganho ou além disso com os anticorpos específicos. Experiências demonstraram que a ligação inespecífica e igualmente elevada sem a presença de anticorpos específicos, indicando que o problema não é causado pela reactividade cruzada dos anticorpos alvo para células normais. A possibilidade de menos do que a especificidade óptima poder ser causada pela ligação iónica tem sido posta de parte. Outra possibilidade foi que sub-populações de células normais da linhagem B poderem aderir a complexos partícula-anticorpo. No entanto, a remoção imunomagnética das células B da suspensão de células antes da adição dos complexos anticorpos/anticorpo-partícula não aumentou a especificidade do último. O problema com o procedimento usado em fracções mononucleares isoladas da medula óssea e circulação periférica, de algumas'células não alvo se poderem também ligar a

partículas paramagnéticas, tem sido circundado ou superado. Assim com partículas revestidas apenas de anticorpo carneiro anti-murganho ou também com anticorpos específicos o número de partículas ligadas inespecíficamente a uma pequena fracção de sangue mononuclear ou células de medula óssea foi reduzido de uma média de 10 para cerca de 1 e em paralelo a fracção de células normais com partículas diminuiu de 1-2 % a 0,5-1 % ou menos.

Tem-se tomado evidente que o problema pode ser causado por forças hidrofóbicas associadas com os anticorpos ligados às partículas paramagnéticas. Métodos para redução desta hidrofobicidade são assim reclamados. Um tal método é a pré-incubação das partículas revestidas de anticorpo e da suspensão da célula com detergentes suaves em concentrações aceitáveis, por exemplo Tween 20™ em concentrações de menos de 0,1% por 30 minutos a 4 graus C. Quando é garantida a possível selecção das células alvo, a suspensão de célula deve conter uma baixa concentração de detergente, por exemplo 0,01% de Tween 20™. Em várias experiências este procedimento quase eliminou ou reduziu dramaticamente o problema da ligação inespecífica observada com as fracções de células mononucleares do sangue ou medula óssea. O outro melhoramento que se encontra garantido, pode ser usado em conjunto com o passo detergente como se segue:

Após incubação da suspensão célula com os anticorpos primários ou fragmentos de anticorpo e as partículas paramagnéticas revestidas de anticorpo como descrito previamente a célula em suspensão é incubada com um segundo conjunto de anticorpos ou fragmentos de anticorpo dirigidos contra outras determinantes extra celulares ou intracelulares das células alvo, com ou sem pré tratamento com células fixantes tais como formaldeído ou álcoois. Estes anticorpos ou seus fragmentos devem ser pré marcados por agentes fluorescentes, metalocolóides, radioisótopos, complexos de biotina ou enzimas como a peróxidase e a fosfatase alcalina, permitindo a visualização por métodos conhecidos per si no microscópio e/ou um aparelho de contagem aceitável.

As células alvo serão ambas visualizadas com o último método e têm partículas ligadas à sua superfície e podem assim ser enumeradas.

Para simplificar a distinção entre células alvo e não alvo, a suspensão de célula ou parte da mesma pode antes do passo de segunda visualização ser sujeita quer a centrifugação de citospin ou porções da suspensão são ligadas a diapositivos revestidos de vidro nos quais as células ligadas a partículas serão pulverizadas numa fina camada, facilitando o reconhecimento das células duplamente coradas.

Um método alternativo de acordo com a presente invenção para simplificar posteriormente a distinção entre as células alvo e as células não alvo compreende um dispositivo de filtração de células, em que a totalidade de suspensão de células após os passos de selecção das células alvo, pode ser adicionada directamente ao dispositivo de filtração de células. As partículas livres não ligadas, ligam-se às células não alvo de modo inespecífico e qualquer célula não alvo, passará através do filtro deixando as células alvo ligadas para serem visualizadas no filtro. O filtro com as células alvo isoladas pode ser removido do aparelho e as células podem ser fixadas e suspensas usando métodos imunohistoquímicos conhecidos e observadas ao microscópio. Após o filtro ter sido removido do aparelho este pode ser tratado como um dispositivo convencional de microscópio do tipo conhecido e normalmente usado em imunohistoquímica.

Para os propósitos específicos o filtro pode ser quer removido do aparelho ou permanecer integral no aparelho, e um meio de cultura adicionado, tal como qualquer meio de cultura conhecido com ou sem agarose, para o propósito de propagação das células alvo isoladas situadas no filtro.

Para uso no novo procedimento, os “kits” conterão por exemplo partículas paramagnéticas pré-revestidas preparadas para cada anticorpo monoclonal. Numa outra forma de realização os “kits” contêm partículas paramagnéticas pré-revestidas com isótopo especifico IgM anti-murganho ou anticorpo anti-humano como uma parte deles, e diferentes células alvo associadas, por exemplo célula tumoral, anticorpos como outra parte. Numa terceira forma de realização o “kit” contém partículas paramagnéticas pré-revestidas com anticorpos específicos anti-Fc, tal como anti-murganho policlonal ou anti-murganho rato monoclonal, ou anti-murganho ou anticorpos anti-humano, capazes de se ligarem com a porção Fc dos anticorpos associados às células alvo ligados a anticorpos específicos anti-célula alvo. Numa quarta forma de realização os “kits” contém partículas distintas de natureza paramagnética ou não magnética, as quais podem ser revestidas ou não com um antigene ou grupos de antigenes de célula alvo, de tal modo que quando processado por este método estas partículas ficam aprisionadas no aparelho de filtração de células, actuando em consequência disso como um controlo na demonstração de que por exemplo todos os aspectos das interacções anticorpo antigene no método estão a funcionar correctamente. Estas partículas podem ser incorporadas na suspensão de células numa altura anterior ou posterior ao método, ou as partículas podem ser usadas como uma “suspensão de células” separada para ser processada usando o mesmo método como a suspensão de células compreendendo as células alvo a serem separadas. Num enquadramento posterior o “kit” contém outros anticorpos específicos ou anticorpos fragmentos de dirigidos contra anti-genes/receptores dentro ou sobre as células alvo desejadas onde os ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo são conjugados com peróxidase, fosfatase alcalina, ou outros enzimas, em conjunto com substratos relevantes para tais enzimas, ou onde o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo é ligado a partículas não paramagnéticas com colorações especificas ou com enzimas ligados tais como peróxidase e fosfatase alcalina.

APARELHO A nova característica do método diz respeito a um dispositivo de filtração de células, o qual pode também ser chamado um separador de célula com compartimentos múltiplos, e pode ser ou não uma parte do kit como descrito. O aparelho diz respeito a um separador de célula de micro-hélice, o qual é usado para separar populações de células misturadas de diferentes tamanhos, tais como aqueles encontrados no sangue ou medula óssea. As células resultantes podem ser vistas directamente na membrana pelo microscópio ou

3

aparelhos de varrimento automáticos. Esta invenção pode ser usada em conjunto com técnicas convencionais de isolamento de células das partículas magnéticas para providenciar um método rápido, sensível e simples para demonstrar números largos de amostras com volumes elevados ou baixos para a presença de células tumorais dentro de 1 a 4 horas.

De acordo com a presente invenção é providenciado um separador de células com um micro-compartimento com uma disposição compreendendo uma caixa de colecta de filtrado de topo aberto, a qual pode ter ou não uma ligação para um tubo de vácuo, e tem um arranjo de hélices com um filtro de membrana de separação de células que forma a base destes compartimentos múltiplos. Também pode ser providenciada uma tampa ou cobertura para este dispositivo. O dispositivo da caixa de recolha de filtrado e da tampa pode ser feito de um material aceitável para esterilização a alta temperatura, ou pode ser feito de um material plástico ç opaco ou transparente tal como aquele conhecido por para artigos de plástico de cultura de tecidos. O filtro de membrana de separação de célula pode compreender uma forma e tamanho de poro consistente e regular, tal como encontrado nas membranas de nilon monofilamentos as, que formam a base dos compartimentos individuais. O filtro de membrana de separação de células pode ser seguro aos micro-compartimentos de tal modo que pode ser removido após o método de separação de células com o objectivo de facilitar a examinação. A membrana de separação de células pode também compreender uma armação circundante de cartão ou plástico para facilitar a examinação após a remoção dos micro-compartimentos. A caixa de recolha de filtrado pode compreender uma armação na qual podem ser inseridas tiras removíveis de mais do que um compartimento. 17 A caixa de recolha de filtrado pode ter o formato similar a um prato convencional de 96 compartimentos adaptado para acomodar a membrana de separação de célula, a caixa de recolha e a ligação ao vácuo de baixa pressão. A invenção pode também compreender uma tampa ou cobertura. É providenciado um prato de cultura descartável com tampa para o aparelho que permite as tiras dos micro-compartimentos serem inseridas e cultivadas assépticamente. A integrarem o disco de cultura estão entalhes ou incisões que facilitam o posicionamento das tiras dos micro-compartimentos durante a cultura. Os entalhes ou incisões como descritos podem ou não providenciar também a colocação da membrana separadora de célula após remoção da tira dos micro-compartimentos. A invenção será evidente após a descrição que se segue com referencia às figuras dos esquemas em anexo, que mostram, apenas a título de exemplo, uma forma do dispositivo de separação de células em microcompartimentos e a forma de realização do mesmo.

No que se refere às figuras 1 a 5 dos esquemas pode ser visto que o Microwell Cell Separador com a disposição 20 consiste numa tampa ou cobertura 21 e uma caixa de recolha de filtrado 22, a qual pode ou não ter uma ligação ao vácuo de baixa pressão através da porta 23, com tiras Multiwell removíveis 24 que têm uma base de membrana destacável 25 com um suporte 25 a.

As figuras 1.1 e 1.2 mostram duas formas de realização alternativas da invenção parcialmente semelhantes. A caixa de recolha de filtrado 22 pode ser similar em alguns aspectos ao formato do prato do compartimento 96 convencional com tiras de compartimentos removíveis, e podem ser dispostas para acomodar uma ou múltiplas tiras. O Multiwells 24 pode ser disposto em tiras duplas como demonstrado ou em tiras simples ou múltiplas. O ajuste do Multiwell 24 na caixa de recolha de filtrado 22 é tal que apenas é possível uma orientação, que pode ser providenciada pela localização da cavilha 28 ou entalhes 29. O CelI Separator Membrane Filter 25 é fixado ao fundo do Multiwell 24 e forma a base dos compartimentos. A fixação do filtro de membranas 25 ao Multiwells 24 é tal que podem ser separados sem deformação do filtro de membrana 25 ou do suporte do filtro de membrana 25 a. O filtro de membrana 25 pode ser observado ao microscópio ou pode ser “varrido” por densitometria ou metodologia similar. O filtro de membrana 25 pode compreender um formato e tamanho de poro consistente e regular, tal como o encontrado em membranas de monofílamentos de nylon, as quais formam a base dos compartimentos individuais, e podem ter um tamanho de poro de 5-75 pm mais preferencialmente 20 pm. A Multiwells 24 dentro ou fora da caixa de recolha de filtrado 22 pode também ser feita de um material aceitável para a finalidade de cultura de tecidos, que pode também ser aceitável para ser vista por varrimento do prato 96 ou em máquinas de leitura de pratos. O prato de cultura 26 e a tampa do prato de cultura 27 podem também ser feitos de um material aceitável para a finalidade da cultura de tecidos. Deste modo, é possível fornecer um meio de cultura quer pelo cimo dos compartimentos múltiplos quer pelo fundo do prato de cultura 26.

Todas as dimensões representadas nas figuras são exemplos e o dispositivo de filtração de células 20 não deve ser limitado por estas dimensões. Além disso, será observado que não é intenção limitar a invenção apenas ao exemplo acima, sendo possíveis muitas variações sem nos afastarmos do âmbito da mesma. O método presente será seguidamente ilustrado por modelos experimentais, exemplos da utilidade do novo método e exemplos de aplicações práticas. Estes exemplos não devem ser encarados como limitando a invenção de qualquer modo.

Experiências modelo: 1. Ligação das bandas de complexos de anticorpo a linhas de células tumorais: Para determinar as concentrações de anticorpo e as condições óptimas para a ligação dos complexos partícula paramagnética - anticorpo a células tumorais foi utilizada uma grande variedade de linhas de células cancerígenas. As bandas paramagnéticas foram ligadas a células, quer revestindo os anticorpos específicos para anticorpo carneiro anti-murganho (SAM)-partículas paramagnéticas revestidas ou, pela incubação em primeiro lugar de células com os anticorpos específicos lavando, seguindo-se uma segunda incubação com partículas revestidas SAM. Os resultados destas experiências são dados nas tabelas 2a e 2b, (ver anexo) nas quais + indica a ligação de várias bandas a todas as células, (+) indica que quer um número baixo de bandas se ligou a cada célula ou que nem todas as células tumorais têm bandas ligadas à sua superfície não se reflectindo ligações e (-) indica uma ligação muito fraca. 2. Detecção de células, tumorais na fracção mononuclear da medula óssea ou sangue periférico. Foram realizados modelos experimentais onde anticorpos específicos e partículas paramagnéticas SAM revestidas foram adicionados quer às tais células mononucleares quer a uma suspensão de células onde um diferente número de células cancerígenas de linhas de células cultivadas in-vitro foram adicionadas às ditas células mononucleares. Nalgumas experiências, quer as células mononucleares quer as células malignas foram pré-marcadas com corante fluorescente, para ser possível distingur entre os dois tipos de células. Em todas as experiências anticorpos primários não ligados e/ou bandas revestidas de anticorpos carneiro anti-murganho foram usados separadamente como controlo. Foram realizadas experiências adicionais sem a preparação de uma fracção de célula mononuclear de sangue

periférico. Foi descoberto que a separação das células deste modo reduz a quantidade de ligação inespecífíca comparada com as fracções de sangue separadas de Lymphoprep. 3. Separação e visualização dos complexos anticorpos-camada para linhas de células tumorais usando o aparelho de filtração de célula. As suspensões de células tumorais e células tumorais marcadas por fluorescência misturadas com suspensões de sangue ou medula óssea foram preparadas e tratadas como descrito nas experiências modelo 1 e 2, e foram sujeitas ao aparelho de filtração de célula. Após lavagem , fixação e coloração das células no filtro no aparelho o filtro foi visto ao microscópio. Os resultados da suspensão de células tumorais só mostrou apenas complexos de célula tumoral-camada-anticorpo claramente isolados no filtro. Os resultados da suspensão de células tumorais marcadas por fluorescência em conjunto com sangue ou medula óssea também mostraram complexos células tumorais-camada-anticorpo claramente isolados no filtro (Figura 6). Experiências adicionais para testar a sensibilidade do método mostraram que 100 células tumorais, quando misturadas com uma suspensão de 107 células de sangue ou medula óssea, podem ser detectadas usando este método. 4. Crescimento de células separadas isoladas usando um aparelho de filtração de células. As suspensões de células tumorais tratadas e isoladas como descrito nas experiências modelo 1 e 2, foram sujeitas ao aparelho de filtração de células e o filtro foi subsequentemente incubado num meio semi-sólido contendo 0,3 % de agarose num meio de cultura contendo 20 % de soro de bovino. As células foram incubadas numa atmosfera de 5 % de C02 a 37 graus C. As células tumorais mostraram uma capacidade de se dividirem e crescerem.

Em várias experiências foram observadas algumas ligações inespecíficas às células mononucleares, as quais se descobriu não estarem relacionadas com a natureza do anticorpo específico, e as quais se pronunciavam igualmente com partículas revestidas -SAM sozinhas. A magnitude desta ligação inespecífíca variou de quase

Ο % a um nível entre 0,5 - 2 %. Esta ligação inespecífica foi quase eliminada por um tratamento suave com detergente, (Tween 20)™ realizado para reduzir o problema das interacções de células hidrofóbicas.

EXEMPLOS DA UTILIDADE DO PROCEDIMENTO 1. Detecção de doença neoplásica micrometastásica no sangue e medula. Um diagnóstico rápido e seguro da invasão de células cancerosas no sangue e/ou medula óssea tornou-se de extrema importância para a escolha da terapia ideal, possivelmente curativa em muitos tipos de cancro, incluindo carcinomas, como descrito na aplicação do Exemplo 1. Procedimentos semelhantes para o melanoma maligno, sarcoma, neuroblastoma, e vários outros cancros têm sido estabelecidos e estão em desenvolvimento. 2. Detecção de células malignas nas efusões pleural ou ascitica, e na urina. A natureza de tais efusões pode representar um importante problema de diagnóstico, particularmente quando um número baixo de células cancerosas estão presentes em conjunto com células reactivas normais ou células epiteliais. Em vários casos tem sido feito rapidamente um diagnóstico definitivo com o novo método, em casos onde o exame citológico convencional foi negativo ou inconclusivo. Uma vantagem similar pode ser encontrada em casos de cancro nos rins ou no tracto urinário e bexiga. 3. Detecção de células neoplásicas no fluido cérebro espinal. Como o tratamento sistémico de muitos tipos de cancro melhorou, a frequência de casos com sintomas dando metásteses no cérebro aumentou significativamente, e em paralelo com isto, a necessidade de uma detecção precoce de tal invasão. Com o uso do novo procedimento mesmo um número baixo de células malignas pode ser facilmente identificado, permitindo a intervenção com terapêuticas alternativas num estado precoce de manifestações de tumor intracraniano.

4. Diagnóstico de cancro em tecidos biopsados. Quando se suspeita de cancro, e são obtidos biópsias de tecidos por procedimentos cirúrgicos, ou por exemplo por biópsias através de agulhas, pode ser feito um diagnóstico muito mais simples e rápido com o novo método, usado em suspensões de células preparadas, comparado com os procedimentos morfológicos convencionais, ou imunohistoquímicos ou citoquímico. A distinção entre vários cancros alternativos pode ser feita pelo uso de anticorpos apropriados. 5. Identificação de indicadores de prognóstico. Uma vez que tem sido demonstrado que a expressão de várias moléculas da membrana estão correlacionadas com a progressão de doença maligna em vários cancros, o presente método pode ser usado para identificar os indicadores de prognóstico, por exemplo como descrito na aplicação do Exemplo 2. 6. Identificação de células indicadoras de doenças específicas ou de progressão ou estado da doença. Em vários tipos de doenças reumatoides (tal como artrite reumatoide), bem como nas doenças alérgicas, auto-imunes e cardiovasculares, a identificação da presença local ou sistémica de sub-populações específicas de células é importante para o diagnóstico e para a determinação do estádio da doença. A rápida detecção de tais populações de células com o novo método é portanto de considerável importância para o diagnóstico e terapêutica. 7. Detecção de sub-populações de células normais. Por várias razões, será importante detectar a ffacção de uma sub-população particular de células normais numa população. Isto aplica-se por exemplo às biópsias do fígado onde a identificação de células exprimindo o antigene biliar epitelial, pode ser importante. Igualmente pode ser garantida, a identificação, e possível isolamento de células endoteliais específicas de uma suspensão de células preparada a partir de vários tecidos normais. 8. Isolamento e crescimento de células seleccionadas. Por muitas das razões acima mencionadas pode ser necessário ter uma população de células maior para estudar. O método presente usando o aparelho da filtração de célula pode providenciar as __ TSSiw***'

condições para permitir a propagação de células alvo seleccionadas positivàmente, sem a presença de partículas não ligadas livres ou outras células ligadas inespecíficamente. Várias moléculas da membrana celular acima mencionada nas secções 1-6 podem também ser usadas como alvos para imunoterapia com vários tipos de actividade de morte de células ou por exemplo com imuno-toxinas. A identificação com o novo método de expressão de tais moléculas é, portanto, também de valor para determinar em que casos tais tipos de terapia deveriam ser usados. EXEMPLOS DE APLICAÇÃO PRÁTICA DO MÉTODO:

Exemplo 1. Para diagnosticar a invasão das células cancerosas no sangue e/ou medula óssea num estádio precoce, usámos no novo procedimento os anticorpos MOC-31, NrLulO, BM2, BM7, 12H12 e MLuCl anti-carcinoma para determinar se a doença micro-metastásica do peito, pulmão, colorectal, e cancro de próstata pode ser sensivelmente identificado em tais fluidos orgânicos. Os resultados com êxito com estes anticorpos têm implicações clínicas significativas.

Exemplo 2. A expressão de muitas moléculas da membrana da célula tem sido demonstrada estar correlacionada com a progressão da doença maligna em vários tipos de cancro. A detecção da ligação de tais moléculas aos respectivos anticorpos pode portanto ser utilizada para obter informação de elevado valor de prognóstico. Entre tais anti-genes está um elevado número de moléculas de adesão, anti-genes carbohidratos, glicolipídos, receptores do factor de crescimento e marcadores de carcinoma listados abaixo. Temos, com o novo procedimento identificado a ligação dos complexos partícula-anticorpo para variantes CD44, E-caderin, Ley, CEA, EGF-r, receptor da transferrina, MUC - 1 epitope, LUBCRU - G7 epitope, antigene do cancro da próstata; UJ13A epitope, 2-microglobulina, antigenes - HLA, e receptores da apoptosis.

Exemplo 3. Foram obtidos dois litros de efusão pleural de um paciente que se supunha sofrer de melanoma maligno. Após centrifugação, as células foram suspensas num volume de 2 ml de RPMI com um soro fetal de bovino a 10 %, incubadas com anticorpo anti-melanoma 9.2.27 (10 g/ml) a 4 graus C por 30 min., lavadas e de novo incubadas com Dynabeads™ SAM M450/IgG2A a 4 graus C por 30 min. A suspensão de células foi então examinada sob um microscópio para determinação da fracção de células com células paramagnéticas ligadas à sua superfície. O diagnóstico de melanoma maligno foi confirmado, uma vez que cerca de 10 % das células teve um número significativo de partículas rosa ligadas.

Exemplo 4. Foram obtidos tecidos biopsados de um tumor subcutâneo num caso com indicações clinicas quer de pequenas células de cancro pulmonar quer de um melanoma maligno. Foi preparada uma só suspensão de células a partir da biópsia, dividida em duas fracções, uma incubada com anticorpo anti-melanoma 9.2.27, e a outra com anticorpo anti-carcinoma MOC - 31 (ambas a 10 g/ml). A incubação foi semelhante aquela usada no exemplo acima. Nenhuma das células incubadas com o anticorpo do melanoma se ligou a quaisquer partículas, enquanto que todas as células tumorais incubadas com MOC-31 foram positivas.

Exemplo5. Foram examinados tecidos biopsados a partir de um paciente suspeito de ter melanoma maligno por preparação de uma só suspensão de células, incubando com anticorpo anti-melanoma 9.2.27, e seguindo depois o procedimento como acima. A maioria das células foram positivas com um elevado número de partículas rosas ligadas às suas membranas.

Exemplo 6. Foi estudada uma efusão pleural de um paciente com cancro no peito para examinar se as células tumorais podiam ser detectadas no fluido. Um litro de fluido foi centrifugado, as células foram re-suspensas, e em vasos separados incubados com um de 3 anticorpos anti-carcinoma diferentes (MOC-31, 2E11, 12H12). Após completar o procedimento como no exemplo anterior, descobriu-se que a maioria das células se ligava a partículas revestidas de anticorpo em qualquer dos 3 casos.

Exemplo 7. Foi estudada uma suspensão de uma medula óssea obtida de um paciente com cancro no peito para examinar se podiam estar presentes células tumorais micrometastásicas. Após a preparação de células mononucleares, estas foram incubadas com os mesmos 3 anticorpos anti-carcinoma usados no exemplo acima, mas neste caso os anticorpos foram -primeiro ligados a partículas paramagnéticas IgG SAM Dynabeads™. Após a primeira incubação com estas partículas revestidas directamente, a suspensão de célula foi examinada no microscópio, e um número elevado de células foram positivas com um número de partículas rosa ligadas à sua membrana. Experiências similares foram realizadas num número de efusões pleural ou ascítica e medula óssea de pacientes com cancro no peito.

Exemplo 8. Células de carcinoma no peito T47D foram incubadas por diferentes períodos de tempo com corante fluorescente Hoechst, e foi verificada a viabilidade das células marcadas. Diferentes números de células marcadas de carcinoma no peito foram então adicionadas a lxlO6 células de medula óssea obtidas de voluntários saudáveis. Em diferentes experiências, foram adicionadas diferentes concentrações de partículas paramagnéticas, monodispersas (Dynabeads™ P450) revestidas com anticorpos anti-carcinoma individuais (NrLulO, MOC-31, ou 12H12). Após incubação por 30 minutos em gelo, foram examinadas amostras de diferentes tubos de ensaio numa câmara de contagem sob microscospia luminosa e de fluorescência. Quando a razão de células tumorais/número total de células nucleadas era baixa, a suspensão de células era sujeita a um campo magnético e as células com partículas ligadas foram isoladas antes do exame no microscópio. Descobriu-se que a uma razão óptima de 1-10 partículas paramagnéticas por célula tumoral na mistura de células, todas as células tumorais tinham de 2-15 partículas ligadas à sua superfície. A sensibilidade do método de detecção foi próxima de uma célula alvo por 104 células nucleadas. Em experiências de controlo com células tumorais marcadas usando anticorpos conhecidos para ter alguma reactividade cruzada para células normais, esta reactividade cruzada foi confirmada com as partículas paramagnéticas revestidas de anticorpo. Em experiências com partículas sem revestimento de anticorpo associado ao tumor, nenhuma das células alvo se ligou a quaisquer partículas.

Experiências semelhantes foram realizadas quer com outros tipo de linhas de cancro do peito e uma linha de células de pequenas células do cancro do pulmão. Sensibilidade e especificidade semelhante foram obtidas nestas experiências.

Exemplo 9. Foram centrifugados fluido pleural e ascítico de pacientes com cancro no peito e carcinoma nos ovários, foram adicionadas as mesmas partículas paramagnéticas revestidas usadas no Exemplo 1, incubadas e concentradas num campo magnético antes da suspensão ser examinada sob microscópio luminoso. Normalmente, células que tinham claras características morfológicas de células tumorais tinham partículas ligadas, ao passo que nenhuma das poucas células normais se ligou a partículas revestidas de anticorpo. Em dois casos com efusão pleural, uma examinação morfológica independente não revelou a presença de quaisquer células tumorais, ao passo que um número significativo de células malignas foram detectadas pelo uso de partículas revestidas de anticorpo. Em alguns casos, células tumorais foram separadas num campo magnético e transferidas para frascos de cultura de tecidos contendo um meio de crescimento especialmente preparado para o crescimento de células de cancro no peito, na tentativa de estabelecer linhas de células permanentes a partir de destas culturas. Em paralelo, células de efusões malignas foram cultivadas directamente sem selecção positiva com partículas magnéticas. Nos últimos casos, nenhuma linha de células pôde ser estabelecida, ao passo que em mais de 50 % dos casos onde foram seleccionados positivamente, células tumorais têm sido usadas, linhas celulares foram estabelecidas com êxito.

Exemplo 10. Nalguns casos, foram examinados medula óssea e sangue periférico obtido de pacientes com cancro no peito com o presente procedimento adicionando partículas paramagnéticas revestidas de anticorpo, incubando por 30 minutos a 4 graus C e concentrando num campo magnético e examinando a suspensão sob microscópio luminoso. Em ambos os casos a ligação de partículas paramagnéticas a células tumorais, representando de 0,1-1 % de células nucleadas na medula óssea e sangue foi detectada, células essas que não podiam ser identificadas por qualquer outro método.

Exemplo 11. Podem ser usados anticorpos contra certos receptores de factor de crescimento ou outros produtos genéticos expressos na superfície de populações específicas de células para identificar e seleccionar positivamente estas células. Partículas revestidas com os anticorpos do receptor anti-transferrina, usados no novo método de acordo com a presente invenção são demonstrados para representar um método rápido, simples e sensível para identificação de células expressando o receptor da transferrina.

Exemplo 12. Para vários propósitos o isolamento de populações específicas de células normais é garantido. As células endoteliais que revestem os capilares ou vasos pequenos no tecido tumoral ou tecido normal podem ser seleccionadas positivamente a partir de suspensões de células preparadas a partir de tecidos relevantes. O procedimento envolveu a utilização de partículas revestidas com anticorpo dirigido contra estruturas expressas nas células endoteliais, mas não nas outras células normais na mistura de células.

Exemplo 13. Células humanas injectadas em roedores imunodeficientes demonstraram estar presentes nas suspensões de células preparadas a partir dos xenográficos tumorais e a partir de órgãos hospedeiros/tecidos empregando partículas magnéticas revestidas com um anticorpo anti-pan humano.

Exemplo 14. Foram separadas de uma população mista de células de sangue ou medula óssea, linhas de células tumorais de pacientes com carcinoma no peito e melanoma e filtradas usando o dispositivo de filtração de células descrito. Após a adição do meio de cultura e subsequente incubação as células tumorais seleccionadas no filtro foram capazes de crescer na ausência de partículas não ligadas livres ou outras células ligadas inespecíficamente.

Tabela 1

Lista de antigenes relevantes e exemplos de anticorpos associados pbr ligação

a antigenes [ANTIGENES

[ Moléculas de adesão | Receptor Fibronectina (a5 βΐ integrin)

Integrina3 βΐ

Receptor Vitronectin (αν β3 integrin)

Integrin a2

Integrin a3

Integrin a4

Integrin a5

Integrin aV

Integrin β2

Integrin β4 ΟρΙΙβΙΙΙα ICAM-I (CD54) VCAM-1 ELAM-1 E-selectin P-selectin/GMP -140 LFA-3 (CD58) CD44

Variantes CD44 N-CAM (CD56)

H-CAM

L-CAM

N-CAM MAC AM-1 E-cadherin P-cadherin

Tenascin

Receptor Trombospondin (CD36) VLA-2

Receptor Laminín

ANTICORPOS MONOCLONAIS

Pierce 36114,BTC 21/22 CalbioChem 341 649 M-Kiol 2 TP36,l,BTC41/42 Calbiochem 407 277 Calbiochem 407 278 Calbiochem 407 279 Calbiochem 407 280 Calbiochem 407 281 Calbiochem 407 283 Calbiochem 407 284 8221 C57-60, CL203.4, RR 1/11 Enzima G 2137-01 Enzima G 2138-01 BBA 8 BTC 71/72 TS 2/9 BM 1441 272,25:32 11.24, 11.31, 11.10 MOC-1 BCA9 BM 1441 892 TURA-27 NKI-M9 BTC 111, HECD-1, 6F9 NCC-CAD-299 BM 1452 193 Calbiochem 580664 BM 1441 264 A 1.43

29

\ ΗΝΚ-1 epitope HNK-1 f Antigenes carbohidratos Antigene-T HH8, HT-8 Antigene-Tn TKH6, BaGs2 Sialyl Tn Antigene associado a cancro gastrointestinal TKH-2 (Mw 200kD) CA 19-9 Antigene associado a carcinoma C-50 Ley MLuCl, BR96, BR64 di-Le\ tri-Lex B3 Dimetric Lea epitope NCC-ST-421 H-tipo 2 BI Epitope CAI 5-3 CA15-3 CEA 1-9,1-14,1-27, II-10,1-46, Calbiochem 250729 Galb-4GlcNac (nL4, 6, 8) 1B2 H-II BE2 A tipo 3 HH8 Lacto-N-fucopentanose III (CD15) PM-81 Glicolipidos GD, ME 36.1, R24 GD, ME36.1,3F8,14.18 Gb, 38-13 gm3 M2590 gm2 MKI-8, MKI-16, FucGM, 1D7, F12 Receptores do factor do crescimento Receptor EGF 425.3, 2.E9, 225 c-erbB-2 (HER2) BM 1378 988, 800 E6 Receptor PDGFa EnzimáG 1264-00 Receptor PDGFp Sigma P 7679 Receptor de transferrina OKT 9, D65.30 Receptor NGF BM 1198 637 Receptor IL-2 (CD25) BM 1295 802, BM 1361 937 Kit-c BM 428 616,14 A3, ID9.3D6 Receptor TNF Receptor NGF Enzima G 1995-01, PAL-M1 Antigenes de melanoma Antigene de alto peso molecular (HMW 250.000) 9.2.27, NrML5, 225.28, 763.74, TP41.2, IND1 Glicoproteína associada a melanoma PM105 ME20 _

Antigene 100 kDa (melanoma/carcinoma) 376.96 gP 113 MUC18 p95-100 PAL-M2 Sp75 15.75 gr 100-107 NKI-bereb MAA K9.2 M125kD (gpl25) Mab 436 Antigenes de sarcoma TP-1 e TP-3 epitope TP-1, TP-3 Pm 200kD 29-13,29.2 Pm 160kD 35-16, 30-40 Marcadores de carcinoma MOC-31 Epitope (antigene cluster 2 epitelial) MOC-3 l,NrLul0 Antigenes MUC-1 (tais como epitope DF3 (gp290kD)) MUC-1, DF3.BCP-7 a-10 MUC-2 e MUC-3 PMH1 Epitope LUBCRU-G7 (gp 230kD) LUBCRU-G7 Antigene específico da próstata BM 1276 972 Antigene de cancro na próstata E4-SF Antigene da próstata de alto peso Molecular Pm > 400kD PD-41 Mucinas epiteliais polimórficas BM-2, BM-7, 12-H-12 Antigene específico da membrana prostática (Cit-356) 7E11-C5 Globulina da gordura do leite humano Imunotech HMFG-1, 27.1 Epitope do carcinoma do peito 42kD B/9189 Mucina Pm> 106 TAG-72, CC-49, CC-83 Epitote OC 125 do carcinoma do ovário (Pm 750 kD) OC125 Glicoproteína pancreática HMW DU-PAN-2 Antigene do cólon Col7-lA (Pm 37000) 17-1A Epitope G9 (carcinoma do cólon) G9 Sulfomucina colónica humana 91.9H Antigene do pâncreas Mr 300kD MUSE 11 GA 733.2 GA733, KS1.4 TAG 72 B72,3, CC49, CC83 Não definido Oal 1, SM1 Cancro pancreático associado MUSE 11 Pancarcinoma CC49 Antigene de adenocarcinoma da próstata PD 41 Adenocarcinoma do pulmão Pm 150-130kD AF-10 Antigene de cancro do pulmão gp 160(Cancro Res. 48, 2768, 1988) anti gpl60 Antigene de carcinoma na bexiga Pm 92kD 3G2-C6 Antigene de carcinoma na bexiga Pm 600kD C3 Antigene de carcinoma na bexiga (Cancro Res. 49, 6720, 1989) AN43, BB369 Epitope CAR-3 Pm > 400kD AR-3 Epitote MAM-6 (Cl 5.3) 115D8

"WWNMMWt

1 Antigene de cancro nos ovários de elevado peso OVX1, OVX2 molecular Ia3 Epitope de mucina Ia3 KM-2 Antigene de carcinoma hepatocelular Pm 900kD Hepema-1 Epitote hepemal (gp43) Carc. hepatocelular ag. 3E1.2 Ácido N-glicopilneurâmico contendo mucina ligada a 0~ D612 Antigene de carcinoma colorectal Pm 48kD BCA 227 Antigene de carcinoma do peito Pm 71kD 16.88 Epitope 16.88 (antigene de carcinoma colorectal) Kl CAK1 (cancros nos ovários) Mu-1, Mu-2 Antigene p específico do cólon DF-L1, DF-L2 Antigene de carcinoma no pulmão Pm3 50-420 kD T16 Antigene de carcinoma na bexiga gp54 T43 Antigene de carcinoma na bexiga gp85 TI 3 8 Antigene de carcinoma na bexiga gp25 Antigenes de neuroblastoma UJ13A Neuroblastoma associado, tal como epitope UJ13A Antigenes de glioma Mel-14 Epitope Mel-14 Antigenes dos cancros da cabeça e pescoço E48 Antigene Pm 18-22kD Antigene HLA TP25.99 HLA classe 1 VF19LL67 HLA-A H2-149.1 HLA-B KS1 HLA-A2 W6.32 HL A-ABC Q 5/18, B 8.11.2 HLA-DR. DQ. DP NAMB-1 Microglobulina - β2 Receptor da Apoptosis Apo-1 Epitope Apo-1 Vários Receptores e antigenes activadores do plasminogénio coelho policlonal glicoproteína - p C219, MRK16. JSB-1,265/F4 Cadepsina D CIS- Diagnostici, Itália Antigene biliar epitelial' HEA 125 Antigene neuroglandular (CD63) ME491, NKI-C3, LS62 CD9 TAPA-1, R2, SM23 Antigene da célula pan-humana pan-H

Tabela 2 a - Resultados da ligação do anticorpo com linhas de células diferentes

Anti corpos Linha de célula MCF-7 Linha de célula SKBR3 Linha de célula T47D Linha de célula MDA231 Linha de célula MDA435 Linha de célula DU145 Linha de célula FMEX-I Linha de célula LOX NrLulO IgG2b + 4- (+) (+) + Moc31 IgGl + + + (+) (+) + Mocl IgGl (+) (+) + 12H12 IgGl + + + + 2E11 IgG3 + + 4- + + 5A6 IgGl (+) + 5F2 IgM (+) CC3 IgG2a - - - - CC1 IgM - (+) CU 18 IgGl - - - CU46 IgGl (+) - - -7F11 IgGl - - -1- - - - ID7 IgG3 (+) E4SF IgGl + + (-) - 50 %+ 425-3 4- - + 9.2.27 + 4- MUC18 - ' - - - 2g 12 IgGl + 4b7 + IgGl + 4- + BCRU- G7IgM í

Tabela 2b - Resultados de ligação do anticorpo a diferentes linhas de células

Anticorpos Linha dc célula PM1 Linha de célula MA-11 Linha de célula CRL-1435 Linha de célula CRL-I740 Linha de célula 11-146 Linha de célula Colo-205 Linha de célula 786-0 Linha de célula WIDR NrLulO IgG2b + + + + + + - Moc31 IgGl + + + + + + + + Mocl IgGl + - 12H12 IgGl + + (+) - - - 2E11 IgG3 (+) + - + - - - 5A6 IgGl + + CC3 IgG2a - - CCI IgM (+) - CU 18 IgGl - - CU46 IgGl - - 7F11 IgGl (+) + - - - - ID7 IgG3 - - EASF IgGl + + + + - - - MUC 18 - 2gl2 IgGl - - 4b7 IgGl - - BM2 (=2F11) + + BM7 (=7F11) + GINTES IgG + - 3C9 IgM - - HH8 IgM - - 5F4 IgM - - 3F1 IgGl - -

Dra. Maria Silvina Fbrreira Agente 0;;.-.:! ce Propiisrôdo Industrial R. Castilho, 201-3.3 E -10/0-051 LISBOA Telefs. 213 851 339 - 213 854 613

Lisboa, H JUL. 2000

ANA SILVA CARVALHO

Adjunto

Claims (26)

1. REIVINDICA ÇÕES 1. Um método para detecção e separação de células alvo especificas em suspensões de células e populações de células misturadas, em sistemas de fluido contendo populações de células misturadas, ou em suspensões de uma só célula preparadas a partir de tecidos sólidos (excepto células hematopoiéticas normais e malignas no sangue e medula óssea) o método compreende: Revestimento das contas ou partículas paramagnéticas com anticorpos, ou fragmentos de anticorpo, dirigidas contra as estruturas da membrana expressas especificamente em células alvo e não em células não-alvo na mistura de células, misturas os anticorpos ligados às ditas partículas ou contas, com a suspensão de células contendo células alvo. incubar a mistura da suspensão de células e os anticorpos ligados às ditas partículas ou contas por 5 a 10 minutos a 2 horas, preferencialmente por 30 minutos, a 0-25 graus C, preferencialmente 4 graus C, sob ligeira rotação. Corar ou por outro lado tornar visível o complexo partícula-célula nas suspensões de células, examinando ou contar os complexos célula-alvo-partícula corados e não corados na suspensão de células, usando um microscópio ou um dispositivo de contagem de células/partículas, caracterizado pelo facto de que a suspensão de células alvo assim obtidas é transferida para um dispositivo de filtração de células ou separador de células (20) no qual a suspensão de células é aplicada em micro-compartimentos, usando um filtro de membrana aceitável para reter os complexos particula/célula alvo, usando sucção opcionalmente, removendo os filtros com as células alvo isoladas do dito dispositivo de filtração de células para ser fixado e corado e visto pelo microscópio e pelo facto de que a membrana filtro compreende membranas de monofilamentos de nilon com poros de forma e tamanho consistente e regular para permitir a separação dos complexos célula alvo/partícula da mistura.
2. 2. Um método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de que os anticorpos ou fragmentos de anticorpos são anticorpos anti-murganho policlonal ou

   anticorpos rato anti-murganho monoclonal ou anticorpos ligarem às porções -Fc dos ditos anticorpos que são dirigidos contra a estrutura da membrana.
3. Um método de acordo com a reivindicação lou 2, caracterizado pela suspensão de células contendo as· células alvo com anticorpos associados ás células alvo-livres é incubada por 5 minutos a 2 horas, a uma temperatura entre 0 graus C e 20 graus C, sob suave rotação e lavada antes da adição das partículas paramagnéticas ou partículas pré-revestidas com anticorpos-anti-Fc.
4. 4. Um método de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo facto de que a mistura é incubada por 30 minutos.
5. 5. Um método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de que a mistura é incubada a uma temperatura de 4 graus C.
6. 6. Um método de acordo com qualquer das reivindicações precedentes caracterizado pelo facto de corar ou visualizar de outro modo o complexo partícula célula as suspensões de células não são tratadas ou alternativamente são pré-tratadas com formalina, álcool ou outros fixadores, e incubados com outros anticorpos ou fragmentos de anticorpo os quais se ligam a moléculas extra-celulares ou intracelulares presentes nas células alvo e as quais são marcadas previamente por peróxidase, fosfatase alcalina, ou outros enzimas permitindo a visualização da ligação por adição e incubação com substractos reveladores.
7. 7. Um método de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo facto do anticorpo ou fragmentos de anticorpo são biodiminuidos e a ligação é visualizada por incubação com avidina complexada para peróxidase, fosfatase alcalina, ou outras enzimas, além da incubação com substractos relevantes para a enzima respectiva.
8. 8. Um método de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto da mistura de células-anticorpos-partícula paramagnética incubada ser sujeita a um campo magnético.
9. 9. Um método de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto de que quaisquer forças hidrofóbicas associadas com partículas revestidas de anticorpo são reduzidas pela pré-incubação das partículas revestidas de anticorpo e da suspensão de células com detergentes suaves em concentrações aceitáveis, por 30 minutos a 4 graus C.
10. 10. Métodos de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado por direccionar o anticorpo ou fragmentos do mesmo contra os anti-genes nas células normais vivas, tal como hepatocitos do fígado, células Kupffer e células endoteliais tipo 1 e 2 e células Clara do pulmão, células endoteliais de órgãos específicos, células exocrinas e endocrinas do pâncreas, células tubulares do rim, células epiteliais da bexiga, células gliais e ependimais do cérebro, células epiteliais da próstata e bexiga, células ciliadas das vias aéreas, diferentes sub-populações de células mucosas no tracto gastrointestinal, células pituitárias, e outras células endocrinas em vários órgãos produtores de hormonas.
11. 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto do anticorpo de célula alvo ser reactivo com os anti-genes presentes nas sub-populações de células normais e produtos oncogénicos expressos na membrana das células de tecido normal.
12. 12. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto de que o anticorpo é um anticorpo que é direccionado contra os receptores -EFG, receptor PDFG (A e B), receptores da insulina, receptores semelhantes aos da insulina, receptor de transferrina, receptores NGF e FGF.
13. 13. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações precede caracterizado pelo facto de que o anticorpo é direccionado contra os integrins e outras moléculas de adesão à membrana, ou proteínas MDR das células normais.
14. 14. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto do anticorpo ou fragmentos do mesmo serem direccionados contra o antigene ou receptores nas células com padrões de desenvolvimento anormais, preferencialmente tais como células cancerosas primárias e metastásicas.
15. 15. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto de que os ditos anticorpos associados a células alvo, serem anticorpos do isótopo IgG, ou fragmentos F(ab')2 ou F(ab), ou IgM, ou fragmentos de IgM.
16. 16. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto de que a suspensão de célula é derivada da medula óssea, sangue periférico, efusões pleurais, efusões peritoniais, urina, fluido cérebro espinal, sémen, linfa, fígado, nódulos linfáticos, baço, pulmão, pâncreas, tecido ósseo, sistema nervoso central, glândula prostática, pele e membranas mucosas.
17. 17. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo facto de que o anticorpo ou fragmentos de anticorpo ou combinações destes serem direccionados contra quaisquer antigenes ou sub-tipo de antigenes como listados na tabela 1, receptores do factor de crescimento e produtos oncogénicos expressos na membrana das células malignas, receptores de insulina, receptores semelhantes à insulina, receptores FGF ou contra combinações dos mesmos.
18. 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes caracterizado pelo facto de que o dito anticorpo o qual é reactivo com antigenes presentes nas células anormais, por exemplo células de carcinoma do peito, do ovário, e do

    pulmão, melanoma, sarcoma, glioblastoma e células cancerosas do 'tracto gastrointestinal e genito-urinário, e do sistema retículo endotelial, e/ou células alvo associadas com doenças não-neoplásicas, tais como distúrbios cardiovasculares, neurológicos, pulmonares, auto-imunes, gastrointestinais, genito-urinários, retículos endoteliais e outros:
19. 19. Um dispositivo de filtração de células ou separador de células (20) para separação dos complexos célula-alvo-partícula de partículas não ligadas e células não-alvo não ligadas numa suspensão de células das populações de células misturadas, caracterizada pelo facto de que o dispositivo compreende além disso uma caixa de recolha de filtrado (22) com uma cavilha de orientação (28), uma tampa (21), e uma parte de ligação ao vácuo de baixa pressão (23) contendo um número de unidades de multicompartimentos (24) tendo uma incisão guia (29), aberta nas bases e providenciando com um filtro de membrana separador de células (25) e um suporte membrana (25 a ) fixada de modo destacável ao fundo da unidade multicompartimentos (24), em que o filtro membrana compreende membranas de monofilamento de nilon tendo poros com formato regular e consistente e tamanho para permitir a separação dos complexos célula alvo/partícula a partir da mistura.
20. 20. Um dispositivo de filtração de célula (20) de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto do tamanho do poro de membranas de monofilamentos de nilon ser de 5 pm a 75 pm.
21. 21. Um dispositivo de filtração de células (20) de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de que o tamanho do poro de membranas de monofilamentos de nilon ser de 20 pm.
22. 22. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, em que as células resultantes agregadas magnéticamente e/ou células isoladas usando o dispositivo de filtração de células (20) são posteriormente sujeitas a exames biológicos, bioquímicos ou imunológicos, incluindo também a caracterização dos genes específicos ao nível do ADN, ARNm e proteína, incluindo reacção em cadeia da polimerase (PCR) e transcritas e reversa PCR.
23. 23. Um método para detecção de células alvo específicas de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, em que os complexos célula alvo/partícula paramagnética separados são usados para estabelecer culturas de células in vitro.
24. 24. Um método para detecção de células alvo específicas de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18 e 23, em que os complexos célula-alvo/partícula paramagnética separados, ou estabelecidos em culturas de células in vitro são inoculados em animais imunodeficientes, preferencialmente para estabelecer xenográficos de humor humano nos animais.
25. 25. Um “kit” para realização do método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, caracterizado pelo facto de compreender; anticorpos específicos ou fragmentos de anticorpo direccionados para os receptores antigénicos nas células-alvo, onde o dito anticorpo ou fragmento de anticorpo está ligado a partículas paramagnéticas incluídas, directamente no kit ou através dos anticorpos-anti-Fc, e outros anticorpos específicos ou fragmentos de anticorpo direccionado contra receptores/anti-genes no interior ou sobre as células alvo, onde os ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo são conjugados com biotina, peróxidase, fosfatase alcalina, ou outros enzimas, ou onde os ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo são ligados a partículas não paramagnéticas com cores específicas ou com enzimas ligados tais como a peróxidase e fosfatase alcalina, e um dispositivo de filtração e células de acordo com qualquer das reivindicações de 19 a 21, e partículas paramagnéticas ou não-paramagnéticas pré-revestidas com antigene ou grupo de antigenes específico de célula alvo para uso como padrão.
26. 26. Um “kit” para realização do método de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 18, caracterizado pelo facto de que ele compreende partículas paramagnéticas pré-revestidas com anticorpos específicos anti-Fc, preferencialmente anti-murganho 7 7

    policlonal, ou rato anti-murganho monoclonal, ou anticorpos anti-humano, capazes de se ligarem a porções Fc dos anticorpos associados à célula alvo, e anticorpos específicos das células alvo livres e outros anticorpos específicos ou fragmentos de anticorpos dirigidos contra antigene/receptores dentro ou sobre as células alvo, onde os ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpos são conjugados com biotina, peróxidase, fosfatase alcalina, ou outras enzimas, ou onde os ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo são ligados a partículas não-paramagnéticas com cores específicas ou com enzimas ligadas tais como peróxidase e fosfatase alcalina, e um dispositivo de filtração de célula de acordo com qualquer uma das reivindicações de 19 a21, e partículas paramagnéticas ou não-paramagnéticas pré-revestidas com antigene específico da célula alvo ou grupos de antigenes para utilização como um padrão. Lisboa, | ig JUL. 2000

    Dra. Maria Silvina Ferreira Agente GíumI de Prop:;;àds industriai R. Castilho, 201-3." E- 1070-051 LISBOA Telefs. 213 351339 - 213 S54 613