JPWO2004042401A1

JPWO2004042401A1 - 癌細胞の検査方法及びそのための試薬

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Publication number: JPWO2004042401A1
Application number: JP2004549638A
Authority: JP
Inventors: 高橋　弘; 弘高橋; 花田　修一; 修一花田; 眞人光永
Original assignee: 高橋　弘; 弘高橋; 花田　修一; 修一花田
Priority date: 2002-11-08
Filing date: 2003-11-07
Publication date: 2006-03-09
Also published as: US20060154309A1; EP1566639A4; WO2004042401A1; EP1566639A1; AU2003277610A1; CA2517580A1

Abstract

高価な装置を用いることなく、簡便に効率良く癌細胞の検査を行うことができる方法及びそのための試薬が開示されている。本発明の癌細胞の検査方法では、ＳＦ−２５抗原を細胞表面上に発現している、生体から分離された癌細胞を、該癌細胞と抗ＳＦ−２５抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を利用して磁性ビーズに結合させる。次いで、磁性ビーズを磁力により集め、磁性ビーズ上に結合された前記癌細胞を検査する。

Description

本発明は、癌細胞の検査方法及びそのための試薬に関する。

従来より、細胞上に発現される特徴的な抗原をマーカーとして利用し、該特徴的抗原を発現している細胞を収集することが行われている。現在、最も一般的に行われている方法は、蛍光標識した抗体を細胞上の抗原と反応させ、細胞上に結合された抗体の蛍光標識を利用したフローサイトメトリーに基づいて細胞を分離する方法であり（例えば、日経バイオ最新用語辞典第５版「セルソーター」の項）、この装置はセルソーターと呼ばれている。しかしながら、セルソーターは１台が数千万円もする高価な装置であり、便利ではあるが、収集される細胞集団の純度は必ずしも満足できるほど高くはない。
また、細胞表面上に発現されるマーカー抗原に対する抗体を固定化した磁性ビーズを用いて該マーカー抗原を細胞表面上に発現している細胞を分離、収集する方法も知られている（例えば、特表平８−５１０３９０号公報及び特表２００１−５２２８０６号公報）。しかしながら、磁性ビーズを用いて収集した細胞集団の核酸を検索し、癌の検査に用いることは知られていない。

本発明の目的は、高価な装置を用いることなく、簡便に効率良く癌細胞の検査を行うことができる方法及びそのための試薬を提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、抗ＳＦ−２５抗体を利用して、ＳＦ−２５抗原を発現している癌細胞を磁性ビーズに結合させて収集し、磁性ビーズ上に結合された細胞を検査することにより、癌の診断を行うことができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、ＳＦ−２５抗原を細胞表面上に発現している、生体から分離された癌細胞を、該癌細胞と抗ＳＦ−２５抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を利用して磁性ビーズに結合させ、次いで、磁性ビーズを磁力により集め、磁性ビーズ上に結合された前記癌細胞を検査することを含む癌細胞の検査方法を提供する。また、本発明は、抗ＳＦ−２５抗体又はその抗原結合性断片を固定化した磁性ビーズを含む、上記本発明の方法を行うための癌細胞検査用試薬を提供する。
本発明の方法によれば、セルソーターのような高価な装置を用いることなく、簡便に効率良く癌細胞の検査を行うことができる。磁性ビーズの収集は、磁石を用いた装置又は磁石を用いて手動で行うことができ、セルソーターを用いる場合に比べて遥かに安価に行うことができる。また、磁性ビーズを用いた本発明の方法では、セルソーターを用いる場合に比べ、収集される細胞の純度が高く、すなわち、ＳＦ−２５抗原発現細胞のみを的確に収集することができ、このため、その後の検査も効率良く正確に行うことができる。

図１は、本発明の実施例において、急性ＡＴＬ患者、慢性ＡＴＬ患者、くすぶり型ＡＴＬ患者、健常ＡＴＬキャリア及び健常人（ＨＴＬＶ−１非感染者）の末梢血中の単核球を被検試料とし、抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーにより測定した、全単核球中のＳＦ−２５抗原陽性単核球の割合を示す図である。
図２は、本発明の実施例において、種々濃度のｐＸ遺伝子を増幅した際の、蛍光強度−サイクル数の関係を示す図である。

上記の通り、本発明の癌細胞の検査方法では、ＳＦ−２５抗原を細胞表面上に発現している、生体から分離された癌細胞を、該癌細胞と抗ＳＦ−２５抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を利用して磁性ビーズに結合させる。
ＳＦ−２５抗原は、１９８７年に発見された分子量約１２５ｋＤａの公知の糖タンパク抗原である（ＷＯ８９／０５３０７，欧州特許第０３９７７００号、米国特許第５，２１２，０８５号、ＴａｋａｈａｓｈｉＨ，ＷｉｌｓｏｎＢ，ＯｚｔｕｒｋＭ，ＭｏｔｔｅＰ，ＳｔｒａｕｓｓＷ，ＩｓｓｅｌｂａｃｈｅｒＫＪａｎｄＷａｎｄｓＪＲ．ｉｎｖｉｖｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｏｌｏｎａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｂｙｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｂｉｎｄｉｎｇｔｏａｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ１９８８；４８：６５７３−６５７９．、ＷｉｌｓｏｎＢ，ＯｚｔｕｒｋＭ，ＴａｋａｈａｓｈｉＨ，ＭｏｔｔｅＰ，ＫｅｗＭ，ＩｓｓｅｌｂａｃｈｅｒＫＪａｎｄＷａｎｄｓＪＲ．Ｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｃｈａｎｇｅｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｔｏｔｈｅｍａｌｉｇｎａｎｔｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９８８；８５：３１４０−３１４４．、ＴａｋａｈａｓｈｉＨ，ＣａｒｌｓｏｎＲ，ＯｚｔｕｒｋＭ，ＳｕｎＳ，ＭｏｔｔｅＰ，ＳｔｒａｕｓｓＷ，ＩｓｓｅｌｂａｃｈｅｒＫＪ，ＷａｎｄｓＪＲａｎｄＳｈｏｕｖａｌＤ．Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｃａｎｄｐｕｌｍｏｎａｒｙｍｅｔａｓｔａｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｃｏｌｏｎａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１９８９；９６：１３１７−１３２９．、ＨｕｒｗｉｔｚＥ，ＳｔａｎｃｏｖｓｋｉＩ，ＷｉｌｃｈｅｃｋＭ，ＳｈｏｕｖａｌＤ，ＴａｋａｈａｓｈｉＨ，ＷａｎｄｓＪＲ，ＳｅｌａＭ．Ａｃｏｎｊｕｇａｔｅｏｆ５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒｏｄｉｎｅ−ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）ａｎｄａｎａｎｔｉｂｏｄｙｒｅａｃｔｉｖｅｗｉｔｈｈｕｍａｎｃｏｌｏｎｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１９９０；１：２８５−２９０．、ＷａｎｄｓＪＲ，ＴａｋａｈａｓｈｉＨ．Ｓｔｕｄｉｅｓｏｎｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｃｈａｎｇｅｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｔｏｔｈｅｍａｌｉｇｎａｎｔｐｈｅｎｏｔｙｐｅａｎｄｔｈｅｉｒｒｏｌｅａｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇｓｉｔｅｓ．ＩｎＦｒｏｎｔｉｅｒｓｏｆＭｕｃｏｓａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌｕｍｅ２．ＥｄｓｂｙＴｓｕｃｈｉｙａＭ．１９９１ｐｐ．２９５−２９８．ＨｕｒｗｉｔｚＥ，ＡｄｌｅｒＲ，ＳｈｏｕｖａｌＤ，ＴａｋａｈａｓｈｉＨ，ＷａｎｄｓＪＲ，ＳｅｌａＭ．Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇｏｆｄａｕｎｏｍｙｃｉｎｔｏｌｏｃａｌｉｚｅｄａｎｄｍｅｔａｓｔａｔｉｃｈｕｍａｎｃｏｌｏｎａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｉｎａｔｈｙｍｉｃｍｉｃｅ．ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ１９９２；３５：１８６−１９２．、ＴａｋａｈａｓｈｉＨ，ＮａｋａｄａＴ，ＰｕｉｓｉｅｕｘＩ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｇｒｏｗｔｈｂｙａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｈｕｍａｎＬＡＫｃｅｌｌｓｉｎＳＣＩＤｍｉｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９３；２５９：１４６０−１４６３．、ＴａｋａｈａｓｈｉＨ，ＮａｋａｄａＴ，ＮａｋａｋｉＭ，ＷａｎｄｓＪＲ．ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｃｍｅｔａｓｔａｓｅｓｏｆｈｕｍａｎｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｉｎｎｕｄｅｍｉｃｅｂｙａｃｈｉｍｅｒｉｃＳＦ−２５ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１９９５；１０８：１７２−１８２．）。ＳＦ−２５抗原は、ヒト大腸癌細胞株（例えば、ＬＳ１８０（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＬ０１８７），ＣＯＬＯ３２０（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ−２２０．１），ＷｉＤｒ（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ−２１８），Ｃａｃｏ−２（ＨＴＢ−３７）や、ヒト肝癌細胞株（例えばＦＯＣＵＳ（ＬｕｎＨ．ｅｔａｌ．，ｉｎＶｉｔｒｏ２０；４９３−５０４（１９８４））の表面上に発現していることが知られている。また、抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体も公知であり（ＷＯ８９／０５３０７，欧州特許第０３９７７００号、米国特許第５，２１２，０８５号）、抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマがＡＴＣＣに寄託されている（ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９５９９）。
抗ＳＦ−２５抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。上記の通り、抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体は公知であり、寄託もされている。寄託されている、ハイブリドーマＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９５９９により産生されるモノクローナル抗体は、上記したヒト肝癌細胞株ＦＯＣＵＳを免疫原としてマウスに免疫し、常法によリモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製し、得られたモノクローナル抗体のうち、上記した各種ヒト大腸癌細胞株と抗原抗体反応するモノクローナル抗体を選択することにより得られた。本発明の方法には、この寄託された抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体を用いることもできるし、同様な方法で作製される他のモノクローナル抗体を用いることもできる。なお、ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９５９９を記載しているＷＯ８９／０５３０７，欧州特許第０３９７７００号及び米国特許第５，２１２，０８５号の実施例に具体的に記載されているように、上記の方法により、抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９５９９以外にも１回の作製操作で多数得られているから、抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体は、公知の方法により容易に作製可能なものであり、したがって、本発明の方法に用いられるモノクローナル抗体は、寄託されたハイブリドーマが産生するものに限定されるものでは全くない。また、抗体自体のみならず、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）_２フラグメントのような、抗原との結合性を有する断片も用いることができる。
磁性ビーズは、ラテックス粒子やポリスチレン粒子に、フェライトを配合する等の方法により磁性を持たせた粒子であり、これに抗原又は抗体を担持させたものは免疫測定の分野において周知であり、市販もされている。本発明の方法においては、免疫測定用の市販の磁性ビーズを好適に使用することができる。また、本発明に用いる磁性粒子としては、ＳＦ−２５抗体を介して結合する標的細胞以外の細胞を非特異的な相互作用によって吸着しない粒子が望まれ、好適にはダイナビーズ（商品名、ＤｙｎａｌＢｉｏｔｅｃｈ社製）等を用いることが出来る。
ＳＦ−２５抗原を細胞表面上に発現している、生体から分離された癌細胞を、該癌細胞と抗ＳＦ−２５抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を利用して磁性ビーズに結合させる方法には、直接法と間接法があり、いずれをも採用することができる。直接法は、磁性ビーズに抗ＳＦ−２５抗体又はその抗原結合性断片を固定化し、これと癌細胞との間の抗原抗体反応により、癌細胞を磁性ビーズに直接結合させる方法である。直接法は、抗原抗体反応が１回でよいので迅速、簡便に実施できる利点がある。
磁性ビーズに抗体又はその抗原結合性断片を固定化する方法自体は周知である。例えば、抗体又はその抗原結合性断片の溶液に磁性ビーズを加え、磁性ビーズ上に抗体又はその抗原結合性断片を物理吸着させることにより行うことができる。この場合、混合物中の抗体又はその抗原結合性断片の濃度は、特に限定されないが、通常、０．００１〜１重量％程度であり、磁性ビーズの濃度は、特に限定されないが、通常、０．１〜５０重量％程度である。また、物理吸着の条件は特に限定されないが、通常、４℃〜４５℃で０．５時間〜４８時間程度インキュベートすることにより行うことができる。なお、磁性ビーズ上への抗体又はその抗原結合性断片の固定化は、物理吸着に限定されるものではなく、他の公知の方法、例えば磁性ビーズ上に結合されたアミノ基やカルボキシル基等の官能基を利用して共有結合させる方法等を採用することも可能である。
一方、間接法は、癌細胞と、標識した又は標識していない抗ＳＦ−２５抗体又はその抗原結合性断片とを抗原抗体反応させて、該抗体又はその抗原結合性断片を細胞に結合させ、次いで若しくはこれと同時に、該抗体若しくはその抗原結合性断片又はこれに結合されている標識と、磁性ビーズとの特異的反応により、該抗体又はその抗原結合性断片を介して細胞を磁性ビーズに結合させる方法である。標識していない抗体又はその抗原結合性断片を用いる場合には、磁性ビーズには、該抗体又はその抗原結合性断片と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を固定化する。例えば、癌細胞と反応させる抗ＳＦ−２５抗体がマウスＩｇＧである場合には、磁性ビーズに抗マウスＩｇＧ抗体を固定化することができる。また、標識抗体又はその抗原結合性断片を癌細胞に結合させる場合には、その標識に対する抗体若しくはその抗原結合性断片又は該標識と特異的に結合する物質を磁性ビーズに固定化する。したがって、標識としては、抗原性を有し、癌細胞と抗ＳＦ−２５抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を妨害しないものであれば、いずれのものをも採用することができる。例えば、下記実施例では、蛍光標識として周知のフルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を標識として抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体に結合し、このＦＩＴＣを、抗ＦＩＴＣ抗体固定化磁性ビーズに結合させている。あるいは、標識としてビオチンを用い、アビジン又はストレプトアビジンのようなアビジン誘導体を固定化した磁性ビーズにビオチンを結合させてもよい。したがって、標識としては、また、ビオチンのような、他の物質と特異的に結合可能であり、癌細胞と抗ＳＦ−２５抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を妨害しないものであれば、いずれのものをも採用することができる。なお、間接法で用いられる、抗マウスＩｇＧ抗体固定化磁性ビーズ、抗ＦＩＴＣ抗体固定化磁性ビーズ及びストレプトアビジン固定化磁性ビーズ等は、免疫測定の分野で広く用いられており、汎用性が高いので市販もされている。本発明の方法では、これらの市販の磁性ビーズを好ましく用いることができる。
本発明の方法により、検査を行うことができる癌細胞としては、その表面上にＳＦ−２５抗原を発現している癌細胞であれば、いずれの癌細胞であってもよく白血病細胞、大腸癌細胞、小腸癌細胞、胃癌細胞、食道癌細胞、胆管癌細胞、胆のう癌細胞、甲状腺癌細胞、副甲状腺癌細胞、前立腺癌細胞、子宮癌細胞、卵巣癌細胞、絨毛上皮癌細胞、睾丸腫瘍細胞、膀胱癌細胞、腎癌細胞、副腎癌細胞、脳腫瘍細胞、悪性黒色種細胞、皮膚癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞、又は肝癌細胞を挙げることができる。白血病細胞としては、癌化したリンパ球や単核球を挙げることができる。なお、下記実施例１では、癌化したリンパ球である成人型Ｔ細胞白血病（ａｄｕｌｔＴｃｅｌｌｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＴＬ）を検査しているが、癌化したリンパ球上にＳＦ−２５抗原が発現していることはこれまでに知られていなかった。
本発明の好ましい態様では、被検試料として血液又は血液から分離された細胞が用いられる。上記した各種癌細胞のうち、白血病細胞は、血液中に含まれているから、血液又は血液から分離された細胞が本発明の方法の対象になるのは当然であるが、大腸癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞及び肝臓癌細胞等の固形癌細胞も、組織から剥離した細胞が血液、脳脊髄液、骨髄、胸水、腹水、膵液、十二指腸液、胆汁、糞便又は尿中に含まれているので、血液等を利用してこれらの固形癌細胞の検査も本発明の方法により可能になる。固形癌細胞を、臓器組織から採取する場合には、生検が必要となるが、本発明の方法によれば、臓器組織の生検に比べてはるかに採取が容易で安全な血液を被検試料として用いることができるので有利である。
直接法の場合、抗体又はその抗原結合性断片が固定化された磁性ビーズと癌細胞との抗原抗体反応の条件は、特に限定されないが、対象となる細胞（正常細胞と癌細胞の混合物）が既に分離されている場合には、細胞浮遊液と磁性ビーズとを、例えば、４℃〜４５℃程度の温度下で０．５時間〜２４時間程度接触させることにより行うことができる。この場合の、混合物中の細胞密度は、特に限定されないが、通常、１個／ｍｌ〜１０^６個／ｍｌ程度であり、また、磁性ビーズの濃度は、特に限定されないが、通常、０．１重量％〜１０重量％程度である。また、血液を磁性ビーズと接触させる場合には、例えば、４℃〜４５℃程度の温度下で０．５時間〜２４時間程度接触させることにより行うことができる。この場合の、混合物中の磁性ビーズの濃度は、上記と同様でよい。間接法の場合、癌細胞と抗原抗体反応させる抗ＳＦ−２５抗体又はその抗原結合性断片の濃度は、特に限定されないが、通常、０．００１重量％〜１重量％程度であり、また、抗原抗体反応の条件は、癌細胞と抗ＳＦ−２５抗体若しくはその抗原結合性断片との反応、及び、生成された抗原抗体複合物と、磁性ビーズ上の抗体又はその抗原結合性断片との反応のいずれも、上記した直接法と同様な条件下で行うことができる。また、間接法の場合、癌細胞と抗ＳＦ−２５抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を先ず行い、ついで、生成された抗原抗体複合物を磁性ビーズと反応させてもよいし、癌細胞、抗ＳＦ−２５抗体又はその抗原結合性断片及び磁性ビーズを共存させて上記２つの反応を並行して行わせてもよい。また、標識として、ビオチン等の特異結合性物質を用いる場合には、各標識にとって周知の条件で反応を行えばよい。
次いで、磁性ビーズを磁力により集める。上記の通り、磁性ビーズを用いた免疫測定法は周知であり、磁力により磁性ビーズを収集するための装置も市販されているので、市販の装置を用いて容易に行うことができる。あるいは、単に磁石を用いて手動で行うこともできる。
以上の工程により、表面上にＳＦ−２５抗原を発現している細胞が磁性ビーズに結合される。次に磁性ビーズに結合された癌細胞の検査を行う。なお、検査に先立ち、磁性ビーズを緩衝液で洗浄し、磁力により再度収集する、洗浄工程を行うことが好ましい。細胞の検査自体は、各癌細胞について公知の方法により行うことができる。例えば、核酸検査、病理検査、生化学的検査等、各癌細胞であることを同定することができる検査を行う。下記実施例１及び３では、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者由来の単核球からＤＮＡを採取し、プロウイルス化した、ＡＴＬの原因ウイルスであるＨＴＬＶ−Ｉの遺伝子をインバースＰＣＲ及びその後のサザンブロット法により検出することにより、ＡＴＬの診断を行っている。このような病原ウイルスや、各種癌のマーカー遺伝子を検出する核酸検査を好ましい例として挙げることができる。例えば、ＨＴＬＶ−１（ＡＴＬ）、Ｒｂ（網膜芽細胞腫、肺癌、乳癌）、ｐ５３（大腸癌、乳癌、肺癌など）、ＷＴＩ（Ｗｉｌｍｓ腫瘍）、ＡＰＣ（大腸癌、胃癌）、ｐ１ｂ（悪性黒色腫、食道癌）、ＮＦＩ（悪性黒色腫、神経芽腫）、ＮＦ２（髄膜腫、食道癌）、ＶＨＬ（腎臓癌）、ＤＰＣ−４（膵臓癌）、ＳＭＡＤ２（大腸癌）、ＰＴＥＮ（神経膠芽腫）、ＰＴＣ（皮膚基底細胞癌）、ｉｎｔ−２／ｈｓｔ−１／ｃｙｃＤ１（頭頸部癌、食道癌、膀胱癌）、ＭＤＭ−２（肉腫、脳腫瘍）、ｅｒｂＢ１（多型グリオーマ、乳癌）、ｅｒｂＢ２（ｎｅｕ）（乳癌、胃癌、卵巣癌）、ｃ−ｍｙｃ（子宮癌、肺小細胞癌、乳癌）、Ｎ−ｍｙｃ（神経芽細胞腫、肺小細胞癌、肉腫）、Ｈ−ｒａｓ（子宮癌）、Ｋ−ｒａｓ（胃癌）、ｃ−ｍｅｔ（胃癌）、Ｋ−ｓａｍ（胃癌）、ＡＫＴ−１，ＡＫＴ−２（Ｓ／Ｔ−ＰＫ）（ともに胃癌、卵巣癌）、Ａｕｒｏｒａ−２（Ｓ／Ｔ−ＰＫ）（大腸癌）を挙げることができる。さらに、核酸検査以外でも、例えば、ＥＧＦ受容体（乳癌等）、ｐ５３タンパク（大腸癌、肝臓癌）、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（肝臓癌、大腸癌等）、ＴＧＦ−β、ａｎｎｅｘｉｎ’−Ｉ等のような検査を例示することができる。また、各種の癌細胞においてユビクタスに発現の増加が認められる４Ｆ２遺伝子あるいはＰＣＤ１遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲで検索することが好ましい（実施例４参照）。これらの病原ウイルス遺伝子や癌マーカー遺伝子又はそのｃＤＮＡの塩基配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで無料で利用可能）に収録されているので、上記病原ウイルス名又は癌マーカー名をキーワードにして検索することにより、その塩基配列を容易に知ることができる。病原ウイルス遺伝子や癌マーカー遺伝子の検出は、遺伝子又はｃＤＮＡの塩基配列がわかっていれば、例えば、該配列中の任意の領域をＰＣＲ等の周知の核酸増幅法により増幅し、増幅が起きるか否かを調べることにより、細胞がその病原ウイルス遺伝子若しくは癌マーカー遺伝子を有しているか又は細胞内で発現しているか否かを調べることができる。
ＰＣＲ等の核酸増幅法やその後の増幅産物の検出方法は、この分野において周知であり、そのための試薬キット及び装置も市販されているので、当業者が容易に実施することができる。なお、ＰＣＲに用いるプライマーの長さは１５塩基以上、好ましくは１８塩基〜５０塩基程度である。標的病原ウイルス遺伝子若しくは癌マーカー遺伝子又はそれらのｃＤＮＡの塩基配列の一部及びその相補鎖の一対をプライマーとして用い、被検核酸を鋳型として用いて核酸増幅法を行うと、被検核酸が増幅されるのに対し、検体中に被検核酸が含まれない場合には増幅が起きないので、増幅産物を検出することにより検体中に被検核酸が存在するか否かを知ることができる。増幅産物の検出は、増幅後の反応溶液を電気泳動し、バンドをエチジウムブロミド等で染色する方法や、電気泳動後の増幅産物をナイロン膜等の固相に不動化し、被検核酸と特異的にハイブリダイズする標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、該標識を検出することにより行うことができる。また、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いたいわゆるリアルタイム検出ＰＣＲ（下記実施例参照）を行うことにより、検体中の被検核酸の量を定量することも可能である。なお、リアルタイム検出ＰＣＲ用のキットも市販されているので、容易に行うことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基づいて被検核酸を半定量することも可能である。なお、被検核酸は、ｍＲＮＡでも、ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡであってもよい。被検核酸としてｍＲＮＡを増幅する場合には、上記一対のプライマーを用いたＮＡＳＢＡ法（３ＳＲ法、ＴＭＡ法）を採用することもできる。ＮＡＳＢＡ法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、上記一対のプライマーを用いて容易に実施することができる。
病原ウイルス若しくは癌マーカー遺伝子若しくはそのｃＤＮＡは、核酸プローブを用いることによっても検出することができる。核酸プローブを用いる方法も周知であり、検出対象となる核酸の塩基配列がわかっていれば、その一部の領域に相補的な標識核酸プローブを対象核酸とハイブリダイズさせ、該標識を検出することにより行うことができる。プローブとしては、標的病原ウイルス遺伝子若しくは癌マーカー遺伝子又はそれらのｃＤＮＡの塩基配列の一部に相補的な核酸に蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブを用いることができる。被検核酸又はその増幅物を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、検体中に被検核酸が存在するか否かを調べることができる。あるいは、測定用核酸を固相化し、被検核酸をハイブリダイズさせ、固相に結合した被検核酸を標識プローブ等で検出することも可能である。このような場合、固相に結合した測定用核酸もプローブと呼ばれる。
また、上記方法により磁気ビーズ上に捕捉した癌細胞の病理検査及び生化学的検査としては、次のようなものを例示することができる。病理検査としては、慢性骨髄性白血病におけるフィラデルフィア染色体の検出、胃癌細胞などで認められる印環細胞癌（ｓｉｇｎｅｔ−ｒｉｎｇｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）の検出、癌細胞の核に認められるコーヒービーン様所見の検出、あるいは癌細胞が発現する腫瘍マーカー、例えば、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ）、ＡＦＰ（ａｌｆａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＡ１９−９、ＤＵＰＡＮ−２、ＴＰＡ（ｔｉｓｓｕｅｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅａｎｔｉｇｅｎ）等の検出が挙げられる。また、生化学的検査としては癌細胞が発現する前記腫瘍マーカーのＥＬＩＳＡによる測定や癌が発現する酵素のアイソザイム（例えば、ＬＤＨアイソザイムや５’−ＮＰＤ−Ｖアイソザイム）の測定が挙げられる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
参考例１ＡＴＬの検出
１．試料の調製
急性ＡＴＬ患者７名、慢性ＡＴＬ患者５名、くすぶり型ＡＴＬ患者９名、健常ＡＴＬキャリア４２名及び健常人（ＨＴＬＶ−１非感染者）８名の末梢血から単核球を分離した。単核球の分離は、具体的に次のようにして行った。Ｌｙｍｐｈａｐｒｅｐ（商品名）（Ａｘｉｓ−ＳｈｅｌｄＰｏＣＡＳ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）５ｍｌを遠心管にとり、前記対象から得られたヘパリン加静脈血５ｍｌを静かに重層する。その後４００ｇ、３０分遠心し血漿と分離液の中間に帯上に浮遊する単核球を毛細管ピペットで回収した。回収した単核球をリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて３回遠心洗浄し、以下の実験に用いた。
２．フローサイトメトリー
マウス抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体（ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９５９９により産生）を常法により、ＦＩＴＣで標識し、得られた蛍光標識抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体を用い、上記１で分離した単核球についてフローサイトメトリーを行った。フローサイトメトリーは、具体的に次のようにして行った。ＰＢＳ中に５×１０^６／ｍｌとなるよう調整した単核球浮遊液から、０．１ｍｌずつ２本の小試験管に分注し、１本には希釈した蛍光標識抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体を１０μｌ加え、他の１本には同様にＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１を１０μｌ加えた。１０分ごとに静かに混和させながら、４℃３０分間反応させた。反応終了後ＰＢＳを加え、２回遠心洗浄後フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳＸＬ（商品名）、Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，Ｆｌｏｒｉｄａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）にアプライし、ＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１をコントロールとして約１万個の細胞をカウントし陽性細胞の比率を求めた。
上記フローサイトメトリーにより、全単核球中の、ＳＦ−２５抗原を発現している単核球の割合を計測した。結果を下記表１及び図１に示す。

表１及び図１から明らかなように、単核球上のＳＦ−２５抗原をマーカーとして利用することにより、ＡＴＬについて、健常人＋健常キャリアの群と、急性＋慢性＋くすぶり型の群とは明瞭に区別することが可能である。

磁性ビーズを用いたＳＦ−２５抗原発現単核球の収集及びその核酸検査
ＳＦ−２５抗原を発現している単核球の染色体ＤＮＡに、ＨＴＬＶ−Ｉ遺伝子がプロウイルス化して挿入されているか否かをインバースＰＣＲ及びサザンブロットにより調べた。これらは、具体的に次のようにして行った。
（１）ＳＦ−２５抗原発現単核球の収集
くすぶり型ＡＴＬ患者の末梢血から上記のようにして分離した単核球１０^７をリン酸緩衝生食水（ｐＨ７．２、０．５％牛血清アルブミンおよび２ｍＭＥＤＴＡを含む一以下バッファー）６０μｌに浮遊させた。次に、ＦＩＴＣ標識したマウス抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体（ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９５９９により産生）溶液（濃度０．１％）１０μｌを加え４℃５分間反応させ、２回洗浄し未吸着の抗体を除去した。この細胞に９０μｌのバッファーを加え再浮遊させ、１０μｌのＡｎｔｉ−ＦＩＴＣマイクロ磁性ビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ，ＢｅｒｇｉｓｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ粒子直径５０ｎｍ）を加え、６℃１５分間標識し、ＳＦ−２５抗原を表面に有する単核球を磁性ビーズと結合させた。未吸着の磁性ビーズを除去するため細胞を２回洗浄後、５００μｌのバッファーに再浮遊させた。マックスミディセット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ，ＢｅｒｇｉｓｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、この細胞をＭＡＣＳ分離ポジティブセレクションＭＳカラム（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＧｍｂＨ，ＢｅｒｇｉｓｈＧｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（一度バッファー５００μｌで洗浄したもの）にアプライし、磁力により磁性ビーズで標識された細胞（ＳＦ−２５抗原陽性細胞）と磁性ビーズで標識されなかった細胞（ＳＦ−２５抗原陰性細胞）を分画し、以下の実験で検体として用いた。
（２）インバースＰＣＲ
ＴａｋｅｍｏｔｏＳらによる報告（ＢｌｏｏｄＶｏｌ８４Ｎｏ９３０８０−３０８５，１９９４）に基づき以下のように行った。ＤＮＡｚｏｌ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，ＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙＲｄ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ．）を用いて各検体より染色体ＤＮＡを抽出し、このＤＮＡをＳａｕ３ＡＩを用いて切断し、Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅをもちいてセルフライゲーションを行った。この方法により、ＨＴＬＶ−１５’ＬＴＲ及びｇａｇｓｅｑｕｎｃｅからなるものと、ＨＴＬＶ−１３’−ＬＴＲと染色体ＤＮＡからなるものとができる。ＨＴＬＶ−１の５’ｐｒｏｖｉｒａｌＤＮＡからなるものを除く目的で、ＳａｃＩＩで加熱処理した。このＤＮＡをテンプレートとしてｐｒｉｍｅｒ１：５’−ａａｇｃｃｇｇｃａｇｔｃａｇｔｃｇｔｇａ−３’（ＨＴＬＶ−Ｉ塩基配列の８９４６−８９２７）、ｐｒｉｍｅｒ２：５’−ａａｇｔａｃｃｇｇｃａａｃｔｃｔｇｃｔｇ−３’（ＨＴＬＶ−Ｉ塩基配列の８９５８−８９７７）で第一段階のＰＣＲを行い、次いでｎｅｓｔｅｄｐｒｉｍｅｒとしてｐｒｉｍｅｒ３：５’−ｇａａａｇｇｇａａａｇｇｇｇｔｇｇａａｃ−３’（ＨＴＬＶ−Ｉ塩基配列の８９２４−８９０５）ｐｒｉｍｅｒ４：５’−ｃｃａｇｃｇａｃａｇｃｃｃａｔｔｃｔａｔ−３’．（ＨＴＬＶ−Ｉ塩基配列の８９８６−９００５）で第二段階のｎｅｓｔｅｄＰＣＲを行った。各ＰＣＲはＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒを用いて９４℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒のサイクルを第一段階は５０回、第二段階は３５回行った。このＰＣＲ産物５μｌをとり２％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色後、バンドを確認しＨＴＬＶ−Ｉのクローナルな組み込みの有無をみた。
（３）サザンブロット
上記の泳動産物を、ナイロンメンブランフィルターにトランスファーし、オリゴヌクレチド（５’−ｃｔｃｃａｇｇａｇａｇａａａｔｔｔａｇｔａｃａｃ−３’ＨＴＬＶ−Ｉ塩基配列の９０１２−９０３５）をプローブとしてＨＴＬＶ−Ｉの組み込みを確認した。Ｔａｋｅｍｏｔｏらによる報告によると、この方法により染色体遺伝子を含むＨＴＬＶ−１の３’ＬＴＲのＵ５領域が増幅されると考えられる。ＡＴＬ患者におけるＨＴＬＶ−１遺伝子の組み込みは各症例間でランダムであるが、１人の患者ＡＴＬ細胞におけるＨＴＬＶ−１遺伝子の組み込みはモノクローナルであり、染色体ＤＮＡを含むＨＴＬＶ−１の３’ＬＴＲのＵ５領域を増幅することで、モノクローナルな増殖であるか否かを決定できる。事実彼らは染色体ＤＮＡを含むＨＴＬＶ−１の３’ＬＴＲのＵ５領域のＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ行うことによりそのことを確認している。
その結果、ＳＦ−２５抗原を発現する単核球では、ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス化ＤＮＡが、モノクローナルに組み込まれており、ＳＦ−２５陰性細胞では、ＨＴＬＶ−Ｉのプロウイルス化は検出されなかった。このことから、本発明の方法により、本発明の方法で、急性、慢性及びくすぶり型ＡＴＬが検出できることが確認された。

ＳＦ−２５抗体感作磁性粒子の合成
細胞分離用磁性粒子（ＤＹＮＡＬ社製、Ｍ−４５０Ｇｏａｔａｎｔｉ−ＭｏｕｓｅＩｇＧ）１０ｍＬ（固形分３００ｍｇ）をＰＢＳで４回リンスした後、６ｍＬのＰＢＳに分散した。ここに、ＳＦ−２５抗体（１．０ｍｇ／ｍＬ）を０．６０ｍＬ添加し、２０℃で４時間反応させた後、生理食塩水で洗浄してＳＦ−２５抗体で感作した磁性粒子を得た。得られた粒子は０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に固形分が２％となるように分散させた。

ＳＦ−２５抗体感作磁性粒子の合成（化学的抗体感作法）
細胞分離用磁性粒子（ＤＹＮＡＬ社製、Ｍ−２７０ＣａｒｂｏｘｙｌｉｃＡｃｉｄ）１００ｍｇを、固形分濃度が５％になるようにＭＥＳ緩衝溶液（５ｍＭ，ｐＨ６．０）に懸濁した。この磁性粒子のカルボキシル基に抗体を化学的に結合するために、水溶性カルボジイミド試薬であるＥＤＣ塩酸塩（１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロライド）を２０ｍｇ添加し、２０℃で１時間反応させて活性化した後、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（０．１Ｍ，ｐＨ７．４）で一回洗浄し、同緩衝溶液２ｍＬに分散させた。そこへ、ＳＦ−２５抗体（１．０ｍＬ／ｍＬ）を０．４ｍＬ添加し、２０℃で４時間反応させた後、生理食塩水で洗浄してＳＦ−２５抗体が化学的に結合された磁性粒子を得た。得られた粒子は０．１％ＢＳＡを添加したＰＢＳに固形分が２％となるように分散させた。

ＫＵＴ−２細胞の分離
健康人からクエン酸採血した血液５ｍＬを遠心分離し、バフィーコートを採取した。これに０．１７Ｍ塩化アンモニウム水溶液１０ｍＬを加え室温で１０分放置したのち遠心分離し、得られた沈殿を２ｍＭＥＤＴＡ含有ＰＢＳで２回洗浄し、４．５ｍＬの０．５％ＢＳＡ及び０．６％クエン酸を含有するＰＢＳに浮遊させ、１．２×１０^６細胞／ｍＬのヒト正常有核細胞浮遊液を得た。
１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータで培養したＫＵＴ−２細胞（ＨａｎａｄａＳ，ＴｓｕｂａｉＦａｎｄＮａｍｂａＹ．ＴｈｅＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＴ−ｃｅｌｌｌｉｎｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｄｄｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｄｕｌｔＴ−ｃｅｌｌｌｅｕｋｅｍｉａ−ｌｙｍｐｈｏｍａ．ＲｅｃｅｎｔＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＲＥＳＲｅｓｅａｒｃｈ１９８５；２５：１２４−１３３）を遠心分離し、得られた沈殿を２ｍＭＥＤＴＡ含有ＰＢＳで２回洗浄し、４．０ｍＬの０．５％ＢＳＡ及び０．６％クエン酸含有ＰＢＳに浮遊させ、６．０×１０^５細胞／ｍＬのＫＵＴ−２細胞浮遊液を得た。上記で得た正常ヒト細胞浮遊液およびＫＵＴ−２細胞浮遊液から、表５に示した細胞仕込み数となるように両者を混合し、合計液量が１．０ｍＬとなるように０．５％ＢＳＡ及び０．６％クエン酸含有ＰＢＳで希釈した。この細胞混合液から、実施例２および実施例３で合成したＳＦ−２５抗体感作磁性粒子を用いてＫＵＴ−２細胞を標的として選択分離を試みた。細胞混合液１．０ｍＬに実施例２および実施例３で合成したＳＦ−２５抗体感作磁性粒子を５０μＬ（粒子分１ｍｇ）添加し、３０分間４℃で転倒混和を行った。磁気分離により磁性粒子を分離し、０．５％ＢＳＡ及び０．６％クエン酸含有ＰＢＳで３回洗浄して粒子に弱い相互作用で吸着した細胞を除去した後、２ｍＭＥＤＴＡ含有ＰＢＳで１回洗浄し、磁気分離して洗浄液を除去して核酸増幅反応に悪影響を及ぼすクエン酸を除いた。磁性粒子に捕捉された細胞から核酸を溶出するために、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）で希釈したＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ溶液（０．８ｍｇ／ｍＬ）を５０μＬ添加し、５５℃で１５分反応して細胞を溶解した。続いて、９５℃で２０分反応し、細胞溶解に用いたＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを失活させると共に、細胞由来の核酸増幅反応を阻害する物質を失活させた。
この核酸溶液から２０μＬずつを用いて、定量ＰＣＲ法により磁性粒子に捕捉されたＫＵＴ−２細胞数と正常ヒト細胞数を定量した。ＫＵＴ−２細胞の定量は、ＨＴＬＶ−１ウイルス由来のｐＸ遺伝子領域内の１０２ｍｅｒを増幅・定量することによって行った。プライマーとプローブの配列は表２に示した。
正常ヒト細胞の定量方法は、β−グロビン遺伝子内の１１０ｍｅｒを増幅・定量することによって、捕捉したＫＵＴ−２細胞と正常ヒト細胞の合計数を求め、そこからＫＵＴ−２細胞の定量値を差し引くことで求めた。プライマーとプローブの配列は表３に示した。
定量ＰＣＲは、ＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。ＤＮＡからの細胞数の定量には、５０回の増幅過程において、蛍光強度が一定の基準値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：Ｔｈ）を越えたサイクル数（Ｔｈサイクル）から、同時に作成した検量線に外挿して求めた。
このｐＸ遺伝子およびβ−グロビン遺伝子の検量線作成には、一定量のＫＵＴ−２細胞、あるいは正常ヒト細胞に、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ溶液（０．８ｍｇ／ｍＬ）を添加し、５５℃で１５分反応して細胞を溶解したあと、９５℃で２０分反応して得られた核酸溶液の希釈系列を用いた。図２に、ｐＸ遺伝子を増幅した際の、蛍光強度−サイクル数の図を示した。０．５細胞から５×１０^５細胞の範囲で定量的な増幅を確認した。このとき、（細胞数）＝１０＾（３０．７７／３．４６−Ｔｈサイクル／３．４６）、相関係数ｒ＝１．００であった。

ＰＣＲ反応液はホットスタート用試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用い、表４に示す組成で使用した。その３０μｌに上記で得た核酸抽出液２０μｌを加えて増幅を行った。

ＰＣＲ条件は以下の通りに行った。
ポリメラーゼの活性化９５℃、１０分間
ＰＣＲサイクル６０℃、６０秒間
９５℃、１０秒間
このＰＣＲサイクルは５０回繰り返した。
得られたＫＵＴ−２細胞の定量値および正常ヒト細胞の定量値から、ＫＵＴ−２細胞の捕捉率、純度を以下の計算式から求め、１０回の測定値を平均して表５にまとめた。捕捉率（％）＝捕捉したＫＵＴ−２細胞数÷仕込みＫＵＴ−２細胞数×１００、純度（％）＝捕捉したＫＵＴ−２細胞数÷（捕捉したＫＵＴ−２細胞数＋捕捉した正常ヒト細胞数）×１００。

表５に示したように、ＳＦ−２５抗体感作磁性粒子を用いることによって、簡便な操作で標的のＫＵＴ−２細胞を高効率・高純度で回収することができた。回収した細胞から溶出させたＤＮＡは定量ＰＣＲに供するに十分な純度を有していた。本発明の方法により、細胞の遺伝子診断の精度アップが可能となり、癌などの疾患をより早期に発見する事が可能となる。

ヒト癌細胞からの核酸抽出および増幅
健常人からヘパリン採血した血液を遠心分離しバフィーコートを採取した。これをＦｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰｌｕｓ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ社製）に重層し、遠心分離した後にＰＢＳに浮遊させ、ヒト正常有核細胞分画を採取した。
ヒト胃癌細胞ＯＣＵＭ−２ＭＬＮ（ＦｕｊｉｈａｒａＴ，ＳａｗａｄａＴ，ＣｈｕｎｇＫＨ−ＹＳ，ＹａｓｈｉｒｏＭ，ＩｎｏｕｅＴａｎｄＳｏｗａＭ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｌｙｍｐｈｎｏｄｅｍｅｔａｓｔａｔｉｃｍｏｄｅｌｆｏｒｈｕｍａｎｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｉｎｎｕｄｅｍｉｃｅａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｆａｃｔｏｒｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、肺癌細胞Ｃａｌｕ−６（ＡＴＣＣＮｕｍｂｅｒ：ＨＴＢ−５６、ＪＦｏｇｈ（ｅｄｉｔｏｒ）．Ｈｕｍａｎｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ；１９７５．ｐｐ．１１５−１５９．）、膵癌細胞Ｃａｐａｎ−２（ＡＴＣＣＮｕｍｂｅｒ：ＨＴＢ−８０、ＤａｈｉｙａＲ，ＫｗａｋＫＳ，ＢｙｒｄＪＣ，ＨｏＳ，ＹｏｏｎＷ，ａｎｄＫｉｍＹＳ．ＭｕｃｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎｉｎｖａｒｉｏｕｓｈｕｍａｎｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｓｔｈａｔｅｘｐｒｅｓｓｔｈｅＭＵＣ−１ｍｕｃｉｎｇｅｎｅ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ１９９３；５３：１４３７−１４４３．）、大腸癌細胞ＨＴ−２９（ＡＴＣＣＮｕｍｂｅｒ：ＨＴＢ−３８、ＪＦｏｇｈ（ｅｄｉｔｏｒ）．Ｈｕｍａｎｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏ．ｐｐ．１１５−１５９．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ；１９７５．）、子宮癌細胞ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＮｕｍｂｅｒ：ＣＣＬ−２ＧｅｙＧＯ，ＣｏｆｆｍａｎＷＤａｎｄＫｕｂｉｃｅｋＭＴ．Ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｓｔｕｄｉｅｓｏｆｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｃａｐａｃｉｔｙｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｃａｒｃｉｎｏｍａａｎｄｎｏｒｍａｌｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ１９５２；１２：２６４−２６５．）をＰＢＳに浮遊させ、一定濃度の細胞浮遊液に調製した。
ヒト正常細胞および各種ヒト癌細胞から核酸を抽出するためにスマイテストＥＸ−Ｒ＆Ｄ（ゲノムサイエンス研究所社製）を用いた。具体的には、細胞浮遊液を遠心後に上清を除去し、酵素溶液１５μｌ、検体希釈液４８０μｌ、共沈剤溶液５μｌを添加し、混和後５５℃で３０分間反応させた。蛋白溶解液４００μｌを添加し、混和後５５℃で１５分間反応させた。更にイソプロパノール８００μｌを添加し混和の後、遠心し上清を除去した。７０％エタノール５００μｌを加え洗浄後、遠心し上清を同様に除去した。ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅＦｒｅｅの水にて溶解し核酸抽出液とした。
この核酸抽出液より定量ＲＴ−ＰＣＲ反応により遺伝子を増幅・定量した。
逆転写反応にはＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、表６に示す組成で使用した。その１５μｌに上記で得た核酸抽出液５μｌを加えて反応させた。

逆転写反応は以下の条件にて行った。
逆転写酵素の活性化３７℃、６０分間
逆転写酵素の不活化９３℃、５分間
次に、得られた一本鎖ＤＮＡをＰＣＲ反応にて増幅・定量した。増幅・定量するターゲット遺伝子として、各種癌細胞で発現が増加する遺伝子であるＰＣＤ１遺伝子領域内の１０１ｍｅｒおよび４Ｆ２遺伝子領域内の１０１ｍｅｒを用いた。これらのプライマーとプローブの配列を表７および表８に示した。一方、ヒト内在性ハウスキーピング遺伝子であるヒトベータアクチン、ヒトＧＡＰＤＨ、１８ＳリボソームＲＮＡを同じく増幅・定量した。

定量ＰＣＲ反応はＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。ＰＣＲ反応液はＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＰｒｏｂｅＰＣＲ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、表９に示す組成で使用した。その４７μｌに逆転写反応で得た反応液６μｌを加えて増幅を行った。

ＰＣＲ反応は以下の条件にて行った。
ポリメラーゼの活性化９５℃、１５分間
ＰＣＲサイクル９４℃、１５秒間
６０℃、６０秒間
このＰＣＲサイクルは５０回繰り返した。ＲＴ−ＰＣＲからの遺伝子発現の定量には５０回の増幅過程において、蛍光強度が一定の基準値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ：Ｔｈ）から、同時に作成した検量線に外挿して求めた。検量線の作成には一定細胞量の希釈系列を用いた。
ヒト正常細胞およびヒト癌細胞においてヒト内在性ハウスキーピング遺伝子とＰＣＤ１遺伝子、４Ｆ２遺伝子の発現の比を求めた。ヒト癌細胞はヒト正常細胞よりもヒト内在性ハウスキーピング遺伝子に対する４Ｆ２遺伝子、ＰＣＤ１遺伝子の発現が数細胞レベルから上昇していることが明らかとなった。
少量の細胞からも癌細胞で強く発現する遺伝子の増幅がみられた。癌特異的ＳＦ−２５抗体感作磁性粒子を用いることによって、血中の癌細胞を高効率・高純度で回収でき、また、特定した遺伝子の定量ＲＴ−ＰＣＲ反応にて検出することが可能となる。本発明の方法によって、血液など生体から分離された試料を用いた癌の早期発見及び診断が可能となる。

本発明の方法によれば、セルソーターのような高価な装置を用いることなく、簡便に効率良く癌細胞の検査を行うことができる。

【配列表】

Claims

ＳＦ−２５抗原を細胞表面上に発現している、生体から分離された癌細胞を、該癌細胞と抗ＳＦ−２５抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を利用して磁性ビーズに結合させ、次いで、磁性ビーズを磁力により集め、磁性ビーズ上に結合された前記癌細胞を検査することを含む癌細胞の検査方法。
前記癌細胞を、前記磁性ビーズに結合させる工程は、抗ＳＦ−２５抗体若しくはその抗原結合性断片を固定化した磁性ビーズと、前記癌細胞とを抗原抗体反応させることにより行われるか、又は、標識した若しくは標識していない抗ＳＦ−２５抗体若しくはその抗原結合性断片と前記癌細胞とを抗原抗体反応させ、次いで若しくはこれと同時に、生成された抗原抗体複合物と特異的に結合する物質を固定化した磁性ビーズと該生成された抗原抗体複合物とを反応させることにより行われる請求項１記載の方法。
前記癌細胞が、血液、脳脊髄液、骨髄、胸水、腹水、膵液、十二指腸液、胆汁、糞便又は尿中に含まれる癌細胞である請求項１又は２記載の方法。
前記癌細胞が、白血病細胞、大腸癌細胞、小腸癌細胞、胃癌細胞、食道癌細胞、胆管癌細胞、胆のう癌細胞、甲状腺癌細胞、副甲状腺癌細胞、前立腺癌細胞、子宮癌細胞、卵巣癌細胞、絨毛上皮癌細胞、睾丸腫瘍細胞、膀胱癌細胞、腎癌細胞、副腎癌細胞、脳腫瘍細胞、悪性黒色種細胞、皮膚癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞、又は肝癌細胞である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
前記癌細胞が白血病細胞、ヒト胃癌細胞、肺癌細胞、膵癌細胞、大腸癌細胞又は子宮癌細胞である請求項４記載の方法。
前記癌細胞が白血病単核球細胞である請求項５記載の方法。
前記検査が核酸検査である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
抗ＳＦ−２５抗体又はその抗原結合性断片を固定化した磁性ビーズを含む、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法を行うための癌細胞検査用試薬。
抗ＳＦ−２５抗体又はその抗原結合性断片を固定化した磁性ビーズの、癌細胞検査用試薬の製造のための使用。