JP6683362B2 - 試料中の微粒子の数を推定する方法 - Google Patents
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Description
本発明の方法は、試料中の微粒子の数を推定するための方法であって、定流計数工程と、区画化工程と、区画数計数工程と、濃度算出工程と、を有する。以下、各工程について詳細に説明する。
本発明の方法における第1の工程である、定流計数工程は、対象となる試料中に含まれる、対象となる微粒子の数を、フローサイトメトリーや微粒子カウンタ等の計数手段により所定の流速で定流計数する工程である。ここで、本発明の方法を適用する対象となる試料については、原水や、上水、下水、工業用水、工業用排水等、特に限定されるものではないが、本発明の方法は、原水や上水における試料中の微生物の数を推定するために用いられることが好ましい。
なお、本発明において好適に使用されるフローサイトメトリーとは、微細な粒子を流体中に分散させた状態で、流体を一定の流速で微小量ずつ流し、流体中に含まれる個々の粒子を光学的に検出する手法であり、一般には、流体を流通させる流路と、流路を挟んで一方側に設けられる発光部(LD)と、他方側に設けられる受光部(PD)及び検出器(PMT)とを有するフローサイトメーターを用いて実施される。
本発明において、定流計数工程に供される試料は、事前に前処理がなされていてもよいし、前処理が一切なされていなくてもよい。そのような前処理としては、試料原液の濃縮工程や分離工程、精製工程等が挙げられる。さらに、例えば、微粒子として微生物を検出する場合、免疫蛍光抗体法や蛍光染色法により微生物を検出する際に行われる、蛍光標識抗体や蛍光試薬による染色を挙げることができる。蛍光標識抗体としては、例えば、測定の対象とする微生物の細胞表面に特異的に存在する抗原に特異的に結合する抗体等を挙げることができる。また、蛍光試薬としては、細胞表面又は細胞内の特定の化学物質に特異的に結合する化学物質等を挙げることができる。さらに、微生物の蛍光標識には、FISH(Fluorescence In Situ Hybridization)に代表される核酸ハイブリダイゼーション法をも採用することができ、この場合、蛍光物質や放射性物質で標識した核酸の切片を使用して微生物を標識することもできる。ここで、微生物に対して免疫蛍光抗体法、蛍光染色法、又は核酸ハイブリダイゼーション法を行う場合には、必要に応じて微生物を固定し、界面活性剤処理等を行ってもよい。上述の前処理に使用できる蛍光標識抗体や蛍光試薬としては、特に限定されるものではないが、例えば、クリプトスポリジウムやジアルジアを検出することを目的とする場合には、ARK試薬、R−phycoerythrin(PE)標識抗体、FITC標識抗体、Cy3標識抗体のほか、核酸を染色可能な蛍光色素として、PI、SYTO9、SYBR(登録商標)Green等を挙げることができる。
本発明において、例えば、フローサイトメトリーにより試料中に含まれる微粒子の数を定流計数する場合、フローサイトメーターの流路を流れる試料の流速は、特に限定されるものではないが、1μL/sec以上30μL/sec以下であることが好ましく、10μL/sec以上20μL/sec以下であることがより好ましい。流路を流れる試料の流速を上記のとおりに設定することにより、微粒子数の測定の精度及び確度を一定水準以上に維持しつつ、定流計数工程の効率を向上させることができる。
本発明の方法における第2の工程である区画化工程においては、定流計数の結果として得られ、経過時間と検出微粒子数との関係を示す測定データを、所定の単位時間を一区分として、所定区分数の区画に区画化する。この際、所定区分数の区画は、所定区分数の連続する区画としてもよい。
本発明の方法における第3の工程である区画数計数工程においては、所定区分数の区画のうち、微粒子を検出した区画、及び微粒子を検出しなかった区画の、各区画数を計数する。なお、本発明においては、各区画における微粒子の検出数に該当するシグナル数を計数する必要はなく、各区画に任意の数のシグナルが存在するか否かを判定することにより、後述する濃度算出工程において微粒子数を統計的に推定することができる。このような手法を採用することにより、特に、1区画に複数のシグナルが存在する場合であって、各シグナルのピークが重複している場合においても、シグナルが存在するか否かを判定することにより計数データを取得するので、計数データの正確性を損なうことなく、計数データを取得することができる。
本発明の方法における第4の工程である濃度算出工程においては、定流計数工程における試料の流速、区画化工程における所定の区分数及び所定の単位時間、並びに区画数計数工程における微粒子を検出した区画の区画数から、例えば、被検試料水の総量並びに粒子を検出した試料水の総量を求め、統計的手法により、試料中の微粒子の数を推定する。このような手法を採用して微粒子数を推定することにより、求められる微粒子数を所定以上の確からしさを示す数値による数値範囲として取得でき、統計的に意味のある微粒子の数を推定することができる。
Claims (6)
- 試料中の微粒子の数を推定するための方法であって、
前記試料中に含まれる、対象となる微粒子の数を、所定の流速で定流計数する定流計数工程と、
前記定流計数の結果として得られ、経過時間と検出微粒子数との関係を示す測定データを、所定の単位時間を一区分として、所定区分数の区画に区画化する区画化工程と、
前記所定区分数の区画のうち、前記微粒子を検出した区画、及び前記微粒子を検出しなかった区画の、各区画数を計数する区画数計数工程と、
前記定流計数工程における前記試料の流速、前記区画化工程における所定の区分数及び所定の単位時間、並びに前記区画数計数工程における前記微粒子を検出した前記区画の区画数から、統計的手法により、前記試料中の前記微粒子の数を推定する濃度算出工程と、
を有し、
前記区画化工程において、所定の2以上の単位時間により、所定区分数の区画の列を2列以上区画化し、
前記濃度算出工程において、前記定流計数工程における前記試料の流速、前記区画化工程における所定の区分数及び所定の2以上の前記単位時間、並びに前記区画数計数工程における、各単位時間に応じた前記微粒子を検出した前記区画の区画数から、最確数法により、前記試料中の微粒子の数を推定する、
試料中の微粒子の数を推定する方法。 - 前記区画数計数工程において、前記微粒子を検出しなかった前記区画の区画数が1以上となるように、前記区画化工程において所定の単位時間を決定する、請求項1に記載の方法。
- 前記微粒子は微生物である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記定流計数工程において、蛍光測定により、前記試料中の前記微粒子の数を測定する、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 前記微粒子は微生物であり、前記試料に、前記微生物の細胞表面の抗原と結合する蛍光標識抗体を添加し、前記定流計数工程において、抗体を標識する蛍光物質の蛍光を測定することにより、前記試料中の前記微粒子の数を測定する、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 前記定流計数工程において、光散乱測定により、前記試料中の前記微粒子の数を測定する、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
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