WO2017183600A1 - 試料中の微粒子の数を推定する方法 - Google Patents

試料中の微粒子の数を推定する方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2017183600A1
WO2017183600A1 PCT/JP2017/015448 JP2017015448W WO2017183600A1 WO 2017183600 A1 WO2017183600 A1 WO 2017183600A1 JP 2017015448 W JP2017015448 W JP 2017015448W WO 2017183600 A1 WO2017183600 A1 WO 2017183600A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
fine particles
predetermined
detected
sections
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/015448
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
卓郎 遠藤
京柱 金
太秀 山口
Original Assignee
メタウォーター株式会社
卓郎 遠藤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by メタウォーター株式会社, 卓郎 遠藤 filed Critical メタウォーター株式会社
Priority to US16/093,566 priority Critical patent/US11320356B2/en
Priority to EP17785938.6A priority patent/EP3447472B1/en
Publication of WO2017183600A1 publication Critical patent/WO2017183600A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1429—Signal processing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/18—Water
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
    • G01N15/075—Investigating concentration of particle suspensions by optical means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
    • G01N2015/0687—Investigating concentration of particle suspensions in solutions, e.g. non volatile residue
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the number of fine particles in a sample which can be estimated quickly and easily without performing complicated processing (eg, culturing in the case of microorganisms), is representative of microorganisms. It relates to the estimation method.
  • a wide variety of pathogenic microorganisms that cause harm to the human body are known, and among these pathogenic microorganisms, microorganisms that are transmitted through tap water are also known. Strict water quality standards are established for tap water that can be used for drinking so that infectious diseases do not occur through tap water widely supplied to each household. Therefore, in the field of water treatment, it is necessary to confirm the number (hereinafter referred to as “concentration”) per unit volume of pathogenic microorganisms in tap water before supplying tap water as tap water. Only when the concentration of pathogenic microorganisms falls below the standard value, supply of tap water as tap water becomes possible.
  • the sample water is diluted at a predetermined magnification, and the microorganisms are cultured from the diluted sample, so that the number of microorganisms in the sample before culturing can be determined.
  • the concentration of the microorganism in the sample before dilution is estimated.
  • this method requires time for culturing and requires a step of culturing microorganisms in a sample as an essential step, so it is extremely difficult to estimate the concentration of microorganisms that are difficult to artificially culture.
  • Patent Document 1 discloses a method for rapidly measuring Legionella in a composition, which includes (a) a nutrient for culturing Legionella and a non-Legionella. Providing an absorption medium comprising at least one substance that selectively inhibits the growth of a genus microorganism; (b) contacting the sample with the absorption medium for a predetermined time; and (c) applying the absorption medium for about 6 hours to about Incubating for 48 hours at a temperature in the range of about 30 ° C. to about 45 ° C., (d) detecting the growth of Legionella on the absorption medium with the detection substance, and (e) viable Legionella in the sample.
  • a method for quantifying is disclosed.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and is a method for estimating the number of microparticles in a sample, typified by a microorganism, without the need for complicated operations in estimating the number of microparticles.
  • An object of the present invention is to provide a method that can be carried out quickly and easily.
  • the inventors of the present invention have conducted extensive research in view of the above problems.
  • the number of fine particles contained in the sample is measured at a predetermined flow rate, for example, by a counting means such as flow cytometry, and measurement data indicating the relationship between the elapsed time and the number of detected fine particles is measured for a predetermined unit time.
  • a predetermined number of sections are partitioned, and the number of sections of the section in which the fine particles are detected and the section in which the fine particles are not detected is counted, and the flow rate, the predetermined number of sections, the predetermined unit time, and
  • the present invention has been completed by finding that the above problem can be solved by estimating the number of fine particles in a sample by a statistical method from the number of compartments in which the fine particles are detected. Specifically, the present invention provides the following.
  • a first aspect of the present invention is a method for estimating the number of fine particles in a sample, and the number of target fine particles contained in the sample is counted at a constant flow rate at a predetermined flow rate.
  • the measurement data obtained as a result of the constant flow counting step and the constant flow counting and indicating the relationship between the elapsed time and the number of detected fine particles is partitioned into a predetermined number of sections with a predetermined unit time as one section.
  • a partitioning step, a partition number counting step of counting the number of each of a partition in which the fine particles are detected and a partition in which the fine particles are not detected among the predetermined number of partitions, and the constant flow counting step From the flow rate of the sample, the predetermined number of divisions and the predetermined unit time in the compartmenting step, and the number of compartments in the compartment where the fine particles are detected in the compartment number counting step, the fine particles in the sample are obtained by a statistical method.
  • Estimate the number of A density calculating step that is a method of estimating the number of particles in the sample with.
  • the second aspect of the present invention is the method according to (1), wherein the number of sections in the section in which the fine particles are not detected is 1 or more in the section number counting step. A predetermined unit time is determined in the partitioning step.
  • a third aspect of the present invention is the method according to (1) or (2), wherein the statistical method is a most probable number method.
  • a fourth aspect of the present invention is the method according to (3), wherein in the partitioning step, two or more rows of partitions having a predetermined number of partitions are divided by a predetermined two or more unit times.
  • concentration calculation step the flow rate of the sample in the constant flow counting step, the predetermined number of divisions in the partitioning step and the predetermined two or more unit times, and each unit time in the division number counting step.
  • the number of fine particles in the sample is estimated by the most probable number method from the number of compartments in which the fine particles are detected.
  • a fifth aspect of the present invention is the method according to any one of (1) to (4), wherein the microparticle is a microorganism, and binds to the antigen on the cell surface of the microorganism on the sample. And the number of the fine particles in the sample is measured by measuring the fluorescence of a fluorescent substance that labels the antibody in the constant flow counting step.
  • a sixth aspect of the present invention is the method according to any one of (1) to (4), wherein the number of the fine particles in the sample is measured by light scattering measurement in the constant flow counting step. Is measured.
  • the method of the present invention measures the number of fine particles typified by microorganisms from a sample flowing at a constant speed by flow cytometry or the like. Since such constant flow counting can detect the presence of fine particles in units of one particle (in the case of microorganisms, in units of one cell), it does not require complicated operations such as culture in the case of microorganisms. It is possible to count the number of contained fine particles, and it is possible to measure the number of one cell or one unit even in microorganisms or fine particles that cannot be cultured.
  • the particle size is determined by using a statistical method from the flow velocity in the constant flow counting step, the predetermined number of sections in the partitioning step and the predetermined unit time, and the number of sections of the partition in which the fine particles are detected in the section number counting step. Therefore, it is possible to estimate a statistically reliable number of fine particles without measuring the number of fine particles for a large number of samples.
  • FIG. 1 is a drawing for explaining the outline of the method of the present invention.
  • embodiments for carrying out the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
  • the method of the present invention is a method for estimating the number of fine particles in a sample, and includes a constant flow counting step, a compartmenting step, a compartment number counting step, and a concentration calculating step.
  • a constant flow counting step for estimating the number of fine particles in a sample
  • a compartmenting step for estimating the number of fine particles in a sample
  • a compartment number counting step for estimating the concentration of fine particles in a sample.
  • the constant flow counting step which is the first step in the method of the present invention, the number of target fine particles contained in the target sample is measured at a predetermined flow rate by a counting means such as flow cytometry or a fine particle counter.
  • a counting means such as flow cytometry or a fine particle counter.
  • the sample to which the method of the present invention is applied is not particularly limited to raw water, tap water, sewage, industrial water, industrial wastewater, etc. It is preferably used to estimate the number of microorganisms in a sample in tap water.
  • the fine particles to which the method of the present invention is applied include various pathogenic or non-pathogenic microorganisms, polystyrene latex (PSL), metal beads, (artificial) glass beads, blood cells in a blood sample, and the like. Can be mentioned. Among these, it is particularly preferable to apply the present invention for estimating the number of pathogenic microorganisms.
  • PSL polystyrene latex
  • metal beads metal beads
  • (artificial) glass beads blood cells in a blood sample, and the like.
  • the final volume of the sample to be measured is generally at least 1 mL or more, and is 1 mL or more and 20 mL or less.
  • the sample to be used for measurement may be concentrated by a conventionally known method.
  • the volume of the sample to be used for measurement is the volume after concentration.
  • the flow cytometry preferably used in the present invention is a state in which fine particles are dispersed in a fluid, a small amount of fluid is allowed to flow at a constant flow rate, and individual particles contained in the fluid are optically separated.
  • the detection method is a flow path for circulating a fluid, a light emitting section (LD) provided on one side across the flow path, and a light receiving section (PD) and detector (PD) provided on the other side.
  • PMT and a flow cytometer.
  • the light emitting section and the light receiving section provided in the flow cytometer are provided on a straight line passing through one point on the flow path.
  • a microparticle or the like passes through one point on the flow path, light is received at the light receiving section. Is blocked, and light having the same wavelength or longer than the light emitted from the light emitting unit reaches the detector and is detected by light scattering measurement or fluorescence measurement.
  • the flow cytometer detects the presence of particles in the fluid.
  • the flow cytometer that can be used in the method of the present invention is not particularly limited, and a general flow cytometer can be used without limitation. Specifically, CyAn ADP manufactured by Backman Coulter is cited. You can also.
  • the sample to be subjected to the constant flow counting step may be pretreated in advance or may not be pretreated at all.
  • pretreatment include a sample stock solution concentration step, a separation step, a purification step, and the like.
  • staining with a fluorescent labeled antibody or a fluorescent reagent which is performed when a microorganism is detected by an immunofluorescent antibody method or a fluorescent staining method, can be mentioned.
  • the fluorescently labeled antibody include an antibody that specifically binds to an antigen that specifically exists on the cell surface of the microorganism to be measured.
  • the fluorescent reagent examples include chemical substances that specifically bind to a specific chemical substance on the cell surface or in the cell.
  • a nucleic acid hybridization method represented by FISH Fluorescence In Situ Hybridization
  • FISH Fluorescence In situ Hybridization
  • Microorganisms can also be labeled.
  • an immunofluorescent antibody method, a fluorescent staining method, or a nucleic acid hybridization method is performed on a microorganism, the microorganism may be fixed and treated with a surfactant or the like as necessary.
  • the fluorescently labeled antibody or fluorescent reagent that can be used for the above-mentioned pretreatment is not particularly limited.
  • fluorescent dyes that can stain nucleic acids include PI, SYTO9, SYBR (registered trademark) Green, and the like.
  • the flow rate of the sample flowing through the flow cytometer channel is not particularly limited, but is 1 ⁇ L / sec. It is preferably 30 ⁇ L / sec or less, more preferably 10 ⁇ L / sec or more and 20 ⁇ L / sec or less.
  • Partitioning process In the partitioning step, which is the second step in the method of the present invention, the measurement data obtained as a result of constant flow counting and indicating the relationship between the elapsed time and the number of detected fine particles is divided into a predetermined unit time, Partition into a predetermined number of sections. At this time, the predetermined number of sections may be a predetermined number of consecutive sections.
  • the predetermined unit time which is one section at the time of compartmentalization, is not particularly limited.
  • the volume of the sample that has flowed through the flow cytometer in a predetermined unit time is predetermined. It is preferable to set so that it may become unit volume.
  • the flow rate of the sample flowing through the flow cytometer channel is 100 ⁇ L / sec
  • whether the target microparticles are contained in the 100 ⁇ L sample by setting the unit time to 1.0 second
  • the unit time By setting the unit time to 1.0 ⁇ 10 ⁇ 1 second, it is possible to determine whether or not the target fine particles are contained in a 10 ⁇ L sample.
  • By setting the time to 1.0 ⁇ 10 ⁇ 2 seconds it is possible to determine whether or not the target fine particles are contained in a 1 ⁇ L sample.
  • the number of sections divided by a predetermined unit time is not particularly limited, but is preferably 5 sections or more, and more preferably 10 sections or more. By increasing the number of sections, it is possible to estimate a statistically more accurate number of fine particles in the concentration calculation step.
  • the number of the particulates detected with respect to the number of particulates in the sample is Since the number of compartments will be saturated, the number of fine particles in the sample may not be accurately calculated. Even when the unit time is set so that the number of sections in which the fine particles are not detected is 1 or more, and only one unit time is set to partition the measurement data, the more accurate number of fine particles Can be calculated.
  • the section number counting step which is the third step in the method of the present invention, among the predetermined number of sections, the number of sections of the section in which the fine particles are detected and the section in which the fine particles are not detected is counted.
  • the concentration calculation described later is performed by determining whether any number of signals are present in each section.
  • the number of fine particles can be statistically estimated in the process.
  • the concentration calculation step which is the fourth step in the method of the present invention
  • the sample flow rate in the constant flow counting step, the predetermined number of divisions and the predetermined unit time in the compartmentalization step, and the fine particles in the compartment number counting step were detected.
  • the number of compartments for example, the total amount of sample water to be detected and the total amount of sample water in which particles are detected are obtained, and the number of fine particles in the sample is estimated by a statistical method.
  • the required number of fine particles can be obtained as a numerical range with a numerical value indicating a certainty or more certainty, and the number of statistically meaningful fine particles can be estimated. it can.
  • a statistical method used for estimating the number of fine particles is not particularly limited, but the most probable number method (for example, J. Milk Food Technol. Vol. 38, No. 9, Pages). 540-545, September, 1975).
  • a predetermined dilution series is prepared for a predetermined sample, and microorganisms in the diluted sample are cultured. From the number of culture positive samples per predetermined number of diluted samples at each dilution rate, This is a method for statistically estimating the microbial concentration of a sample.
  • an operation of dividing measurement data of a sample counted at a constant flow rate at a predetermined flow rate by a predetermined unit time and determining whether or not fine particles are detected is a microbe (microparticles) per predetermined unit volume in the sample. Therefore, the conventional most probable number method can be applied without performing complicated operations such as culturing in the case of detecting microorganisms.
  • the most probable number method a most probable number table obtained by a predetermined mathematical calculation is prepared, and the number of microorganisms is determined by referring to this most probable number table from the dilution factor and the number of culture positive samples.
  • the present invention is not limited to such a method, and the calculation is performed by a mathematical / statistical method based on the above-described flow velocity, the predetermined number of sections, the predetermined unit time, and the number of sections in which the fine particles are detected. It is possible to estimate the number of fine particles, or statistically estimate the number of fine particles by computer simulation or the like.
  • the aforementioned partitioning step two or more rows of a predetermined number of partitions are partitioned by a predetermined unit time of two or more, and in the concentration calculation step, the flow rate of the sample, the predetermined flow rate in the partitioning step is determined.
  • Estimate the number of fine particles in the sample by the most probable number method from the number of divisions and the above-mentioned two or more predetermined unit times and the number of divisions in the division that detected the fine particles corresponding to each unit time in the division number counting step. It is preferable to do.
  • a more reliable estimation can be performed by dividing a predetermined number of sections into two or more columns.
  • the most probable number method it is possible to estimate with a certain accuracy even if the number of sections is small, and therefore it is possible to perform an appropriate estimation according to time and cost.
  • measurement data is first set to 2 seconds.
  • Each partition is partitioned into unit times of 1 second, 1.0 ⁇ 10 ⁇ 1 second, and 1.0 ⁇ 10 ⁇ 2 seconds.
  • the number of the divided sections is recorded, and the number of the sections in which the fine particles are detected is recorded among the three sections each having a unit time of 1.0 ⁇ 10 ⁇ 2 seconds.
  • the number of fine particles in the sample is estimated by the most probable number method from the flow rate, the predetermined unit time and the predetermined number of sections, and the number of sections in which the fine particles are detected.
  • the present invention since the present invention does not require a step of culturing microorganisms in a sample, it can measure the concentration of protozoa such as Cryptosporidium and Giardia that are difficult to cultivate as well as fine particles that cannot be cultured in the first place. It can be suitably applied. Moreover, it is suitable also for the rapid measurement of the density

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

微生物を代表とする、試料中の微粒子の数を推定する方法であって、微粒子数の推定にあたり、煩雑な操作を行う必要なく、迅速かつ簡便に実施することができる方法を提供すること。試料中の微生物の数を推定するための方法であって、試料中に含まれる対象となる微生物の数を、所定の流速で定流計数する工程と、定流計数の結果として得られた測定データを、所定の単位時間を一区分として、所定区分数の区画に区画化する工程と、所定区分数の区画のうち、微生物を検出した区画、及び微生物を検出しなかった区画の、各区画数を計数する工程と、定流計数工程における試料の流速、区画化工程における所定の区分数及び所定の単位時間、並びに区画数計数工程における微生物を検出した区画の区画数から、統計的手法により、試料中の微生物の数を推定する工程と、を有する試料中の微生物の数を推定する方法。

Description

試料中の微粒子の数を推定する方法
　本発明は、微生物を代表とする、水中の微粒子の数を、煩雑な処理（微生物の場合の培養等）を行うことなく、迅速かつ簡便に推定することができる、試料中の微粒子の数を推定する方法に関する。
　人体に対して害悪を及ぼす病原性微生物としては、多種多様なものが知られており、これらの病原性微生物の中には、水道水を介して伝播する微生物も知られている。各家庭に広く供給される水道水を介して感染症等が発生することのないよう、飲用に供されうる水道水については、厳しい水質基準が定められている。したがって、上水処理の分野においては、水道水として上水を供給する前の段階で、上水中の病原性微生物の単位体積当たりの数（以下、「濃度」と称する）を確認する必要があり、病原性微生物の濃度が基準値を下回って、初めて、上水の水道水としての供給が可能となる。
　ところで、水中の微生物の濃度を特定しようとする場合、試料となる水を所定の倍率で希釈し、希釈後の試料から当該微生物を培養することにより、培養前の試料中における微生物の細胞数を推定して希釈前の試料における当該微生物の濃度を推定している。しかしながら、この方法では、培養のための時間もかかる上、試料中の微生物を培養する工程を必須の工程として要求するため、人工培養が難しい微生物の濃度を推定することは極めて困難であった。
　そのような問題を解決するため、例えば、特許文献１には、組成物中のレジオネラ属菌を迅速に測定する方法であって、（ａ）レジオネラ属菌を培養するための栄養素と、非レジオネラ属微生物の増殖を選択的に阻害する少なくとも１種の物質を含む吸収培地を準備し、（ｂ）上記試料と吸収培地とを所定時間接触させ、（ｃ）上記吸収培地を約６時間から約４８時間、約３０℃から約４５℃の範囲の温度でインキュベートし、（ｄ）吸収培地上のレジオネラ属菌の増殖を検出物質で検出し、（ｅ）上記試料中の生存可能なレジオネラ属菌を定量する方法が開示されている。
特表２００８－５３２５５１号公報
　しかしながら、特許文献１に記載の方法においても、微生物の培養の工程を必須の工程として有しているため、培養のために相応の時間を要することは変わりない。特に、特許文献１に記載の方法においては、非レジオネラ属微生物の増殖を選択的に阻害する物質を吸収培地に添加するため、場合によっては、当該吸収培地を用事調製しなければならず、レジオネラ属菌の定量に多くの手間と労力を要しうるものであった。したがって、本発明は以上の課題に鑑みてなされたものであり、微生物を代表とする、試料中の微粒子の数を推定する方法であって、微粒子数の推定にあたり、煩雑な操作を行う必要なく、迅速かつ簡便に実施することができる方法を提供することを目的とする。
　本発明の発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意研究を行った。その結果、試料中に含まれる微粒子の数を、例えば、フローサイトメトリー等の計数手段により所定の流速で測定し、経過時間と検出微粒子数との関係を示す測定データを、所定の単位時間を一区分として、所定の区分数だけ区画化し、微粒子を検出した区画、及び微粒子を検出しなかった区画の、各区画数を計数して、上記流速、所定の区分数、所定の単位時間、及び微粒子を検出した区画の区画数から、統計的手法により試料中の微粒子の数を推定することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下のものを提供する。
　（１）　本発明の第１の態様は、試料中の微粒子の数を推定するための方法であって、前記試料中に含まれる、対象となる微粒子の数を、所定の流速で定流計数する定流計数工程と、前記定流計数の結果として得られ、経過時間と検出微粒子数との関係を示す測定データを、所定の単位時間を一区分として、所定区分数の区画に区画化する区画化工程と、前記所定区分数の区画のうち、前記微粒子を検出した区画、及び前記微粒子を検出しなかった区画の、各区画数を計数する区画数計数工程と、前記定流計数工程における前記試料の流速、前記区画化工程における所定の区分数及び所定の単位時間、並びに前記区画数計数工程における前記微粒子を検出した前記区画の区画数から、統計的手法により、前記試料中の前記微粒子の数を推定する濃度算出工程と、を有する試料中の微粒子の数を推定する方法である。
　（２）　本発明の第２の態様は、（１）に記載の方法であって、前記区画数計数工程において、前記微粒子を検出しなかった前記区画の区画数が１以上となるように、前記区画化工程において所定の単位時間を決定することを特徴とするものである。
　（３）　本発明の第３の態様は、（１）又は（２）に記載の方法であって、前記統計的手法が最確数法であることを特徴とするものである。
　（４）　本発明の第４の態様は、（３）に記載の方法であって、前記区画化工程において、所定の２以上の単位時間により、所定区分数の区画の列を２列以上区画化し、前記濃度算出工程において、前記定流計数工程における前記試料の流速、前記区画化工程における所定の区分数及び所定の２以上の前記単位時間、並びに前記区画数計数工程における、各単位時間に応じた前記微粒子を検出した前記区画の区画数から、最確数法により、前記試料中の微粒子の数を推定することを特徴とするものである。
　（５）　本発明の第５の態様は、（１）から（４）のいずれかに記載の方法であって、前記微粒子は微生物であり、前記試料に、前記微生物の細胞表面の抗原と結合する蛍光標識抗体を添加し、前記定流計数工程において、抗体を標識する蛍光物質の蛍光を測定することにより、前記試料中の前記微粒子の数を測定することを特徴とするものである。
　（６）　本発明の第６の態様は、（１）から（４）のいずれかに記載の方法であって、前記定流計数工程において、光散乱測定により、前記試料中の前記微粒子の数を測定することを特徴とするものである。
　本発明の方法は、フローサイトメトリー等により、一定の速度で流れる試料から、微生物等に代表される微粒子の数を測定する。こうした定流計数は、１粒子単位（微生物の場合は１細胞単位）で微粒子の存在を検出することが可能であるので、微生物の場合の培養等、煩雑な操作を行うことなく、試料中に含まれる微粒子の数を計数することが可能であり、培養ができない微生物又は微粒子等においても1細胞または１個の単位で数を測定することが可能である。さらに、本発明においては、定流計数工程における流速、区画化工程における所定の区分数及び所定の単位時間、区画数計数工程における微粒子を検出した区画の区画数から、統計的手法を用いて微粒子の数を推定するので、多量に及ぶ試料について微粒子の数を測定しなくても、統計的に信頼性の高い微粒子数を推定することができる。
本発明の方法の概要を説明するための図面である。
　図１は、本発明の方法の概要を説明するための図面である。以下、本発明を実施するための形態について、図面を参照して詳細に説明する。
　＜試料中の微粒子の数を推定する方法＞
　本発明の方法は、試料中の微粒子の数を推定するための方法であって、定流計数工程と、区画化工程と、区画数計数工程と、濃度算出工程と、を有する。以下、各工程について詳細に説明する。
　［定流計数工程］
　本発明の方法における第１の工程である、定流計数工程は、対象となる試料中に含まれる、対象となる微粒子の数を、フローサイトメトリーや微粒子カウンタ等の計数手段により所定の流速で定流計数する工程である。ここで、本発明の方法を適用する対象となる試料については、原水や、上水、下水、工業用水、工業用排水等、特に限定されるものではないが、本発明の方法は、原水や上水における試料中の微生物の数を推定するために用いられることが好ましい。
　また、本発明の方法の適用の対象となる微粒子としては、病原性又は非病原性の各種微生物のほか、ポリスチレンラテックス（ＰＳＬ）、金属ビーズ、（人工の）ガラスビーズ、血液試料中の血球等を挙げることができる。これらの中でも、特に、病原性の微生物の数の推定のために本発明を適用することが好ましい。
　本発明においては、好ましくは、フローサイトメトリーによる定流計数を行うため、測定に供する試料の最終的な体積は、少なくとも１ｍＬ以上であることが一般的であり、１ｍＬ以上２０ｍＬ以下であることが好ましい。なお、この場合において、測定に供する試料は、従来公知の方法により濃縮されていてもよく、その場合における、測定に供する試料の体積は、濃縮後の体積を示すものとする。
　（フローサイトメトリー）
　なお、本発明において好適に使用されるフローサイトメトリーとは、微細な粒子を流体中に分散させた状態で、流体を一定の流速で微小量ずつ流し、流体中に含まれる個々の粒子を光学的に検出する手法であり、一般には、流体を流通させる流路と、流路を挟んで一方側に設けられる発光部（ＬＤ）と、他方側に設けられる受光部（ＰＤ）及び検出器（ＰＭＴ）とを有するフローサイトメーターを用いて実施される。
　そして、フローサイトメーターの備える発光部と受光部は、流路上の１点を通過する直線上に設けられており、当該流路上の１点を微生物等の微粒子が通過した場合、受光部において光が遮断されるとともに、光散乱測定や蛍光測定により、発光部から発せられる光と同一波長又はより長波長の光が検出器に到達して検出される。これにより、フローサイトメーターは流体中の粒子の存在を検出する。
　本発明の方法に使用可能なフローサイトメーターは、特に限定されるものではなく、一般的なフローサイトメーターを制限なく使用することができるが、具体的に、Ｂａｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社製のＣｙＡｎ　ＡＤＰを挙げることもできる。
　（試料の前処理）
　本発明において、定流計数工程に供される試料は、事前に前処理がなされていてもよいし、前処理が一切なされていなくてもよい。そのような前処理としては、試料原液の濃縮工程や分離工程、精製工程等が挙げられる。さらに、例えば、微粒子として微生物を検出する場合、免疫蛍光抗体法や蛍光染色法により微生物を検出する際に行われる、蛍光標識抗体や蛍光試薬による染色を挙げることができる。蛍光標識抗体としては、例えば、測定の対象とする微生物の細胞表面に特異的に存在する抗原に特異的に結合する抗体等を挙げることができる。また、蛍光試薬としては、細胞表面又は細胞内の特定の化学物質に特異的に結合する化学物質等を挙げることができる。さらに、微生物の蛍光標識には、ＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｉｎ　Ｓｉｔｕ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に代表される核酸ハイブリダイゼーション法をも採用することができ、この場合、蛍光物質や放射性物質で標識した核酸の切片を使用して微生物を標識することもできる。ここで、微生物に対して免疫蛍光抗体法、蛍光染色法、又は核酸ハイブリダイゼーション法を行う場合には、必要に応じて微生物を固定し、界面活性剤処理等を行ってもよい。上述の前処理に使用できる蛍光標識抗体や蛍光試薬としては、特に限定されるものではないが、例えば、クリプトスポリジウムやジアルジアを検出することを目的とする場合には、ＡＲＫ試薬、Ｒ－ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）標識抗体、ＦＩＴＣ標識抗体、Ｃｙ３標識抗体のほか、核酸を染色可能な蛍光色素として、ＰＩ、ＳＹＴＯ９、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ等を挙げることができる。
　（流速）
　本発明において、例えば、フローサイトメトリーにより試料中に含まれる微粒子の数を定流計数する場合、フローサイトメーターの流路を流れる試料の流速は、特に限定されるものではないが、１μＬ／ｓｅｃ以上３０μＬ／ｓｅｃ以下であることが好ましく、１０μＬ／ｓｅｃ以上２０μＬ／ｓｅｃ以下であることがより好ましい。流路を流れる試料の流速を上記のとおりに設定することにより、微粒子数の測定の精度及び確度を一定水準以上に維持しつつ、定流計数工程の効率を向上させることができる。
　［区画化工程］
　本発明の方法における第２の工程である区画化工程においては、定流計数の結果として得られ、経過時間と検出微粒子数との関係を示す測定データを、所定の単位時間を一区分として、所定区分数の区画に区画化する。この際、所定区分数の区画は、所定区分数の連続する区画としてもよい。
　ここで、区画化の際の一区分となる所定の単位時間としては、特に限定されるものではないが、例えば、所定の単位時間にフローサイトメーターの流路を流れた試料の体積が、所定の単位体積となるように設定することが好ましい。具体的には、フローサイトメーターの流路を流れる試料の流速が、１００μＬ／ｓｅｃである場合、単位時間を１．０秒とすることにより、１００μＬの試料中に対象となる微粒子が含まれるか否かを判定することができ、単位時間を１．０×１０－１秒とすることにより、１０μＬの試料中に対象となる微粒子が含まれるか否かを判定することができ、単位時間を１．０×１０－２秒とすることにより、１μＬの試料中に対象となる微粒子が含まれるか否かを判定することができる。
　所定の単位時間により区画化する区画の区分数としては、特に限定されないが、例えば、５区画以上であることが好ましく、１０区画以上であることがより好ましい。区分数を増加させることにより、濃度算出工程において、統計的により正確な微粒子の数を推定することが可能となる。
　本発明の区画化工程において、所定の単位時間を設定するにあたっては、当該単位時間により区画化した、所定の区分数の区画（例えば、５区画）のうち、微粒子を検出しなかった区画の区画数が１以上となるように所定の単位時間を決定することが好ましい。特に、１のみの単位時間を設定して測定データを区画化する場合、微粒子を検出しなかった区画の区画数が０である場合には、試料中の微粒子の数に対する微粒子を検出した区画の区画数が飽和してしまうこととなるため、試料中の微粒子の数を正確に算出できない可能性がある。微粒子を検出しなかった区画の区画数が１以上であるように単位時間を設定することにより、１のみの単位時間を設定して測定データを区画化する場合においても、より正確な微粒子の数を算出することができる。
　［区画数計数工程］
　本発明の方法における第３の工程である区画数計数工程においては、所定区分数の区画のうち、微粒子を検出した区画、及び微粒子を検出しなかった区画の、各区画数を計数する。なお、本発明においては、各区画における微粒子の検出数に該当するシグナル数を計数する必要はなく、各区画に任意の数のシグナルが存在するか否かを判定することにより、後述する濃度算出工程において微粒子数を統計的に推定することができる。このような手法を採用することにより、特に、１区画に複数のシグナルが存在する場合であって、各シグナルのピークが重複している場合においても、シグナルが存在するか否かを判定することにより計数データを取得するので、計数データの正確性を損なうことなく、計数データを取得することができる。
　［濃度算出工程］
　本発明の方法における第４の工程である濃度算出工程においては、定流計数工程における試料の流速、区画化工程における所定の区分数及び所定の単位時間、並びに区画数計数工程における微粒子を検出した区画の区画数から、例えば、被検試料水の総量並びに粒子を検出した試料水の総量を求め、統計的手法により、試料中の微粒子の数を推定する。このような手法を採用して微粒子数を推定することにより、求められる微粒子数を所定以上の確からしさを示す数値による数値範囲として取得でき、統計的に意味のある微粒子の数を推定することができる。
　ここで、微粒子の数を推定する際に使用する統計的手法としては、特に限定されるものではないが、最確数法（例えば、Ｊ．Ｍｉｌｋ　Ｆｏｏｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．９，Ｐａｇｅｓ　５４０－５４５，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９７５）を用いることが好ましい。
　最確数法は、一般には、所定の試料について、所定の希釈系列を準備して希釈試料中の微生物を培養し、各希釈倍率の希釈試料所定数あたりの培養陽性試料数から、希釈前の試料の微生物濃度を統計的に推定する方法である。本発明においては、所定の流速で定流計数した試料の測定データを所定の単位時間で区分し、微粒子が検出されるかを判定する操作が、試料中、所定の単位体積あたりに微生物（微粒子）が含まれるか否かを検討する操作に該当するので、微生物を検出する場合における培養等の、煩雑な操作を行うことなく従来の最確数法を適用することができる。
　なお、最確数法においては、所定の数学的計算により求められた最確数表が用意され、前述の希釈倍率や培養陽性試料数から、この最確数表を参照することにより微生物数を推定するが、本発明はこのような方法に限定されず、上述の流速、所定の区分数、所定の単位時間、及び微粒子を検出した区画の区画数から、数学的・統計的手法により計算を行って微粒子数を推定してもよく、コンピュータシミュレーション等により統計的に微粒子数を推定してもよい。
　本発明においては、前述の区画化工程において、所定の２以上の単位時間により、所定区分数の区画の列を２列以上区画化し、濃度算出工程において、試料の流速、区画化工程における所定の区分数及び上記の所定の２以上の単位時間、並びに区画数計数工程における、各単位時間に応じた微粒子を検出した区画の区画数から、最確数法により、試料中の微粒子の数を推定することが好ましい。所定区分数の区画の列を２列以上区画化することにより、より信頼度の高い推定を行うことができる。また、最確数法を利用すれば、区画が少なくても一定精度の推測が可能であるため、時間や費用に応じた適切な推定を行うことができる。
　ここで、図１を参照して、上述の工程を詳細に説明すれば、例えば、１００μＬ／ｓｅｃの流速でフローサイトメトリーを行った場合、まず、第１に単位時間を２秒として測定データを区画化し、各区画を単位時間を１秒、１．０×１０－１秒、１．０×１０－２秒としてそれぞれ区画化する。単位時間を１秒とした３区分の各区画のうち、微粒子を検出した区画の数を記録し、単位時間を１．０×１０－１秒とした３区分の各区画のうち、微粒子を検出した区画の数を記録し、単位時間を１．０×１０－２秒とした３区分の各区画のうち、微粒子を検出した区画の数を記録する。そして、流速、所定の単位時間及び所定の区分数、並びに微粒子を検出した区画の数から、最確数法により、試料中の微粒子の数を推定する。
　以上の方法によれば、微生物を検出する場合における試料中の微生物の培養等の煩雑な操作を行うことなく、統計的に精度及び確度の高い微粒子数を推定することができる。なお、本発明は、試料中の微生物を培養する工程を必要としないので、そもそも培養が不可能な微粒子はもちろん、クリプトスポリジウムやジアルジアのように、人工培養が難しい原虫類の濃度の測定にも好適に適用することができる。また、レジオネラのように培養に長時間を要する原虫類の濃度の迅速な測定にも好適である。

Claims (6)

  1. 　試料中の微粒子の数を推定するための方法であって、
    　前記試料中に含まれる、対象となる微粒子の数を、所定の流速で定流計数する定流計数工程と、
    　前記定流計数の結果として得られ、経過時間と検出微粒子数との関係を示す測定データを、所定の単位時間を一区分として、所定区分数の区画に区画化する区画化工程と、
    　前記所定区分数の区画のうち、前記微粒子を検出した区画、及び前記微粒子を検出しなかった区画の、各区画数を計数する区画数計数工程と、
    　前記定流計数工程における前記試料の流速、前記区画化工程における所定の区分数及び所定の単位時間、並びに前記区画数計数工程における前記微粒子を検出した前記区画の区画数から、統計的手法により、前記試料中の前記微粒子の数を推定する濃度算出工程と、を有する試料中の微粒子の数を推定する方法。
  2. 　前記区画数計数工程において、前記微粒子を検出しなかった前記区画の区画数が１以上となるように、前記区画化工程において所定の単位時間を決定する、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記統計的手法が最確数法である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記区画化工程において、所定の２以上の単位時間により、所定区分数の区画の列を２列以上区画化し、
    　前記濃度算出工程において、前記定流計数工程における前記試料の流速、前記区画化工程における所定の区分数及び所定の２以上の前記単位時間、並びに前記区画数計数工程における、各単位時間に応じた前記微生物を検出した前記区画の区画数から、最確数法により、前記試料中の微粒子の数を推定する、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記微粒子は微生物であり、前記試料に、前記微生物の細胞表面の抗原と結合する蛍光標識抗体を添加し、前記定流計数工程において、抗体を標識する蛍光物質の蛍光を測定することにより、前記試料中の前記微粒子の数を測定する、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
  6. 　前記定流計数工程において、光散乱測定により、前記試料中の前記微粒子の数を測定する、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
PCT/JP2017/015448 2016-04-19 2017-04-17 試料中の微粒子の数を推定する方法 WO2017183600A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/093,566 US11320356B2 (en) 2016-04-19 2017-04-17 Method for estimating number of microparticles in sample
EP17785938.6A EP3447472B1 (en) 2016-04-19 2017-04-17 Method for estimating number of microparticles in sample

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-083778 2016-04-19
JP2016083778A JP6683362B2 (ja) 2016-04-19 2016-04-19 試料中の微粒子の数を推定する方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017183600A1 true WO2017183600A1 (ja) 2017-10-26

Family

ID=60116027

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/015448 WO2017183600A1 (ja) 2016-04-19 2017-04-17 試料中の微粒子の数を推定する方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US11320356B2 (ja)
EP (1) EP3447472B1 (ja)
JP (1) JP6683362B2 (ja)
WO (1) WO2017183600A1 (ja)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03238340A (ja) * 1990-02-16 1991-10-24 Kowa Co 粒子測定方法
JPH0972842A (ja) * 1995-09-05 1997-03-18 Hitachi Ltd フロー式粒子画像解析方法および装置
JPH1194727A (ja) * 1997-09-16 1999-04-09 Hitachi Ltd フロー式粒子画像解析方法及び装置
JP2008532551A (ja) * 2005-03-17 2008-08-21 ファイジェニックス， エルエルシー 生存可能なレジオネラ属の迅速な検出および定量
JP2013178134A (ja) * 2012-02-28 2013-09-09 Metawater Co Ltd 水質測定システム

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060154309A1 (en) * 2002-11-08 2006-07-13 Hiroshi Takahashi Method of examining cancer cells and reagent therefor
EP3152294B1 (en) 2014-06-05 2021-03-10 Essen Instruments, Inc. Flow cytometer signal peak identification employing dynamic thresholding

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03238340A (ja) * 1990-02-16 1991-10-24 Kowa Co 粒子測定方法
JPH0972842A (ja) * 1995-09-05 1997-03-18 Hitachi Ltd フロー式粒子画像解析方法および装置
JPH1194727A (ja) * 1997-09-16 1999-04-09 Hitachi Ltd フロー式粒子画像解析方法及び装置
JP2008532551A (ja) * 2005-03-17 2008-08-21 ファイジェニックス， エルエルシー 生存可能なレジオネラ属の迅速な検出および定量
JP2013178134A (ja) * 2012-02-28 2013-09-09 Metawater Co Ltd 水質測定システム

Also Published As

Publication number Publication date
EP3447472B1 (en) 2023-11-08
JP2017192326A (ja) 2017-10-26
US20190204200A1 (en) 2019-07-04
EP3447472A4 (en) 2019-12-25
US11320356B2 (en) 2022-05-03
JP6683362B2 (ja) 2020-04-22
EP3447472A1 (en) 2019-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bamford et al. Investigating the physiology of viable but non-culturable bacteria by microfluidics and time-lapse microscopy
Martins et al. Biosensors for on-farm diagnosis of mastitis
Zulkifli et al. Detection of contaminants in water supply: A review on state-of-the-art monitoring technologies and their applications
Wang et al. Past, present and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology
Hammes et al. Cytometric methods for measuring bacteria in water: advantages, pitfalls and applications
Noble et al. A review of technologies for rapid detection of bacteria in recreational waters
Li et al. Rapid detection methods for bacterial pathogens in ambient waters at the point of sample collection: a brief review
Zhang Foodborne pathogenic bacteria detection: an evaluation of current and developing methods
López-Campos et al. Detection, identification, and analysis of foodborne pathogens
Cichocki et al. Bacterial mock communities as standards for reproducible cytometric microbiome analysis
RU2015135359A (ru) Быстрый способ детекции патогенов
US20150337351A1 (en) Methods of microorganism immobilization
Strathmann et al. Simultaneous monitoring of biofilm growth, microbial activity, and inorganic deposits on surfaces with an in situ, online, real-time, non-destructive, optical sensor
Quilliam et al. Unearthing human pathogens at the agricultural–environment interface: A review of current methods for the detection of Escherichia coli O157 in freshwater ecosystems
JP2018529968A (ja) アッセイプレートおよびその使用 本願は、２０１５年１０月１日に出願された、通し番号６２／２３５，７９５の米国仮特許出願に対して優先権を主張し、その開示内容の全体を本願に引用して援用する。
Bonadonna et al. Innovative analytical methods for monitoring microbiological and virological water quality
US20160223534A1 (en) Device and method for detecting, while using a microfluidic chip, the resistance of bacteria to an active substance to be analyzed
Altamore et al. Dual channel detection of ultra low concentration of bacteria in real time by scanning fluorescence correlation spectroscopy
Song et al. Algae detection and ship's ballast water analysis by a microfluidic lab-on-chip device
Henning et al. Measurement of low‐abundance intracellular mRNA using amplified FISH staining and image‐based flow cytometry
Papciak Domo n, A
WO2017183600A1 (ja) 試料中の微粒子の数を推定する方法
Lee Quantitation of microorganisms
Needs et al. Miniaturised broth microdilution for simplified antibiotic susceptibility testing of Gram negative clinical isolates using microcapillary devices
Zimmermann et al. High‐throughput cell quantification assays for use in cell purification development–enabling technologies for cell production

Legal Events

Date Code Title Description
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2017785938

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017785938

Country of ref document: EP

Effective date: 20181119

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17785938

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1