CN104178563B - 用于核酸样品的测量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于核酸样品的测量方法。所述测量方法提供在一个实验中对具有悬殊浓度范围的不同类型的模板的定性和定量分析。因此，同一测试小组的各个分析可以在单个测试载片中执行。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年5月20日提交的美国临时申请第61/855,573号的优先权益。上述专利申请的全文据此以引用的方式并入本文中并且构成本说明书的一部分。
技术领域
本发明涉及一种测量方法。具体地说，本发明涉及一种用于核酸样品的测量方法。
背景技术
在分子生物学领域，可能需要定量或定性研究多种不同核酸标靶(例如DNA或RNA或微RNA的片段)以研究具体样品。举例来说，测试样品的一组基因的表达水平是常见的。此外，若干DNA分析可以由测试小组组成用于诊断目的。生物标本中存在的具体核酸标靶可以具有典型浓度范围。常见的是，预期用于诊断小组的一组核酸物质具有广泛浓度范围。
聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，简称：PCR)是用于检测样品中核酸标靶的存在以及测量其浓度的常见方法之一。在与大多数化学分析方法相比时，PCR反应通常被视为宽动态范围测试方法。PCR动态范围可以跨越5个数量级。然而，又，在许多情况下，有关的核酸标靶可以具有更宽浓度范围并且不能“适合”于单个测试。目前，处理这种浓度范围差异的唯一方式是以不同稀释度或浓度比稀释或浓缩所提取的核酸溶液以适合PCR方法的动态范围。执行稀释或浓缩既不省时又不省力。
发明内容
本发明提供一种用于核酸样品的测量方法。本发明与PCR方法组合利用阵列型载片和实时荧光强度检测技术，以提供定性和定量测试结果。
本发明提供一种测量样品中的多于一种核酸标靶(模板)的浓度的方法。该方法包括：提供具有多个反应孔的测试载片，并且提供需要被检测或测量多种核酸标靶的样品。将所述多个反应孔分组，并且将每一组指定以检测一种具体标靶。将用于检测所述具体标靶的引物和探针在使用之前分配到各自组的孔中。当使用所述载片时，将所述样品装载到所述多个反应孔中的每一者中。在使所述测试载片经受预定热循环条件之后，对每个孔在每个循环中的荧光强度进行测量和记录。然后分析获得的强度数据以测定每种标靶的浓度。
代替(1)将相等数目的孔分配给小组中的每种标靶和(2)将相等样品体积放置到每组孔中，本发明提供一种基于具体类型的生物组织中每种标靶的估计浓度范围或基于载片的预期浓度测量范围来测定(1)被指定或分配给每种标靶的反应孔的最佳化数目和(2)待放置到每组孔中的最佳化样品体积的方法。目的是当遭遇具有悬殊浓度范围的多重标靶时使稀释/浓缩步骤减到最少或甚至消除。
本发明还提供一种基于被指定给标靶的反应孔之中PCR荧光强度的变化来测定所述标靶的浓度的方法。本方法中所用的反应孔数目通常多于技术所需的反应孔数目，有冗余，典型地冗余2个到10个。用于测量标靶的反应孔数目可以是50个、100个、500个或甚至数千个。所述方法包含至少3种类型的浓度测定算法，它们是Ct定量、数字PCR定量、两者的组合，以及一种用于针对具体测试选择适当浓度测定算法的预定义规则。所述预定义规则基于展示阳性结果的反应孔的数目与展示阴性结果的反应孔的数目的比率或其它统计计算。反应孔的阳性结果或阴性结果可以通过荧光强度是否超过选择阈值来确定。
根据本发明的实施例，每种标靶具有具备上边界和下边界的可能浓度范围。下边界用以计算待分配给所述标靶的最少孔数目。上边界用以测定应该使用的反应孔的最大体积。
将更多孔指定给样品中的典型地具有低浓度的那些标靶。举例来说，在基因表达谱测试中，将更多孔指定给稀有标靶；并且反之亦然，将更少孔指定给所述样品中的通常具有高浓度的那些标靶。因此，有效率地使用载片中的孔。更重要的是，使稀释或浓缩步骤减到最少或甚至消除。
根据本发明的实施例，在测试之前将引物与荧光报道体一起填充到孔中。这些试剂的填充步骤可以在工厂中进行。布局(即哪个孔指定给哪种标靶的示意图)与载片相关。在数据分析过程期间，将孔荧光强度数据按照孔指定布局信息分组用于分析。
为了使本发明的前述和其它特征和优势可理解，下文详细描述附有图的若干例示性实施例。
附图说明
随附图包含在内以提供对本发明的进一步理解，并且被并入和构成本说明书的一部分。附图说明本发明的实施例并且与描述一起用来解释本发明的原理。
图1展示具有三种标靶的样品，其中其各自的浓度范围是已知的。
具体实施方式
传统定量聚合酶链反应(Quantitative Polymerase chain reaction，简称：qPCR)方法通过在每个热循环中记录反应孔内部的荧光强度而提供对核酸模板的定量分析。在qPCR方法中，将所记录的荧光强度的所绘统计曲线的变化用以测定在每个热循环开始之前反应孔内模板的拷贝数。将反应孔中的模板的初始拷贝数用以测定所测试的样品内的模板的浓度。当使用qPCR方法用于定量分析时，在反应孔内部需要具有模板的至少一个拷贝用于进一步复制，这在更多热循环之后产生增加的荧光强度。在实时qPCR中，Ct值是荧光强度超过阈值强度所处的循环或荧光强度开始戏剧性地增加所处的循环的数目。样品达到这一水平所处的PCR循环被称为循环阈值(Cycle threshold，简称：Ct)。通过将具有未知浓度的样品的Ct值与一系列标准物或预定循环阈值比较，可以准确地测定反应中模板的量。所述定量测量被称为Ct值定量方法。
另一PCR定量方法被称为数字PCR(伯特沃格尔斯坦(Bert Vogelstein)和肯尼斯W.金茨勒(Kenneth W.Kinzler)；数字PCR(Digital PCR),美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),第96卷,第9236-9241页,1999)。在数字PCR方法中，将测试样品分布在众多反应孔之中，并且每个反应孔中的测试样品具有多于一个模板拷贝的可能性小于1。换句话说，根据可能性计算，每个反应孔可能不具有模板或仅具有几个模板拷贝。每个反应孔在PCR实验条件下经历热循环。然后，基于所检测的信号(例如荧光信号)评估每个反应孔以确定反应孔展示阳性信号(荧光信号高于选择阈值)还是阴性信号(荧光信号低于选择阈值)。具有阳性信号的反应孔指示所述反应孔具有至少一个模板拷贝并且在那个反应孔中复制成功。另一方面，具有阴性信号的反应孔指示所述反应孔不具有模板或存在的模板在那个反应孔中的复制失败了。在数字PCR方法中，使用那个实验中反应孔的总数目(N)、在反应之后具有阴性信号的反应孔(即阴性孔)的数目(n-)以及在反应之后具有阳性信号的反应孔(即阳性孔)的数目(n+)计算定量结果，以测定一批测试样品中的模板浓度(沈峰(FengShen),杜文彬(Wenbin Du),贾森E.克鲁兹(Jason E.Kreutz),艾丽斯弗克(Alice Fok)以及鲁斯泰姆F.伊斯马吉洛夫(Rustem F.Ismagilov)；在SlipChip上的数字PCR(Digital PCR ona SlipChip)；芯片实验室(Lab Chip),2010；DOI:10.1039/c004521g)。
上述Ct值定量方法适用于具有更高浓度的模板的测试样品，而数字PCR方法适用于具有宽浓度范围的模板的测试样品。通过传统qPCR方法测量的模板的浓度范围可以跨越5个数量级。对于数字PCR方法来说，待测量的模板的浓度范围取决于反应孔的数目。当待测量的模板的浓度范围跨越6个数量级时，则需要使用1,000,000个反应孔。然而，如果如在普通实验中仅涉及10个到1,000个反应孔，那么待测量的模板的浓度范围可以仅跨越1个到3个数量级。
出于说明目的提供以下描述以进一步定义本发明。
标本或样品一般是指被测试的物体。举例来说，样品可以是含有核酸片段(DNA或RNA)的农业标本、病理切片、土壤标本或类似物。模板是指具有具体序列的DNA或RNA或微RNA链，它也被称为生物标记并且可以经由PCR扩增来检测。
测试或测试项目可以指对具体模板执行的一或多个测试或测试项目，并且测试试剂可以指若干种在具体实验或测试中用于具体模板的成分(包含引物对和任选地探针)的配制品。一般来说，一个测试项目用以检查一种模板。
测试小组可以指通过对同一标本同时执行多于一个测试项目而对一种标本的综合检查，它检测多种模板(模板分子)。标本中的模板分子的综合测试结果例如可以用作具体疾病诊断的基础。为了检验医学标本、农业标本或环境标本，可能需要对若干种模板分子的浓度进行检查以便诊断或分析。举例来说，在病理标本的医学检查中，RNA和微RNA的表达量常用作诊断标记(生物标记)。此外，各种胃肠细菌的数量可以用作健康状况指示。
PCR阵列载片可以指含有多个反应孔的载片板，并且每个反应孔将执行PCR测试。一般来说，因为反应孔小(小于1微升/孔，甚至小于0.01微升/孔)，所以所述载片通常被称为微米孔PCR阵列或纳米孔PCR阵列。
在本发明中，将具有众多反应孔的PCR阵列板上的反应孔的数目和反应孔的类型或尺寸个别地分配以测量具有多样浓度范围的不同类型的模板。PCR板的这种排列使在一个实验中对具有发散浓度范围的不同类型的模板的定性和定量分析变得可能。因此，通过使用本发明的测量方法，可以在仅一个测试载片中执行同一测试小组的各个分析。根据用于核酸样品的测量方法，提供具有众多反应孔、多达数百个反应孔的测试载片(分析阵列板)。测试样品可以是包含多于一种核酸模板(标靶)的核酸样品。根据本发明的测量方法尤其适用于测量具有多于一种核酸模板的样品，其中各种类型的模板的浓度范围悬殊。在具有众多反应孔的PCR阵列板之中，将不同组的反应孔个别地分配以测量具有多样浓度范围的不同类型的模板。基本上，既定测试样品中的模板的预期浓度决定将多少反应孔分配以测量所述模板。可以将测试样品装载到这些反应孔中，并且可以将相同体积或不同体积的测试样品分配到这些反应孔中。对于每个反应孔来说，如果将一或多对引物和多组荧光标记装载到每个反应孔中，那么可以在一种PCR测试条件下独立地并且同时执行一或多组PCR反应。
在常规测试小组中，如果在标本中的标靶模板分子之中存在大浓度范围差，那么标本通常需要被浓缩或稀释以适应不同标靶模板。以基因表达谱为实例，对于高表达RNA来说，数千到数以万计的拷贝(1,000到100,000个拷贝/细胞)可以存在于细胞中；对于中等表达RNA来说，数以万计的拷贝(10到10,000个拷贝/细胞)可以存在于细胞中；并且对于低表达RNA来说，仅极少数的拷贝(0到100个拷贝/细胞)可以存在于细胞中。如果测试小组旨在包含高表达、中等表达以及低表达RNA或微RNA的标靶模板，那么必须针对不同标靶分子将标本用稀释或浓缩不同地处理，这显着增加测试小组的复杂性。
现将在下文中参考以下实例更充分描述本申请，所述实例代表某些例示性实施例但不应理解为限制本申请的范围。在本申请的一个例示性实施例中，三种标靶T1、T2、T3需要在测试标本中进行测量。基于关于标本的来源的知识，已知所提取的溶液(即含有从标本提取的核酸的溶液)中的T1、T2以及T3的最可能的浓度范围分别是10,000,000个到100,000个拷贝/微升、100,000个到100个拷贝/微升以及1,000个到0个拷贝/微升。如果是典型实时PCR反应，那么将在每个小瓶中使用10微升所提取的溶液并且具有500个到1,000,000个拷贝/小瓶的定量范围的96效价板用以执行测试。如果直接应用所提取的溶液，那么小瓶中的T1、T2以及T3的可能拷贝数将分别是100,000,000个到1,000,000个拷贝、1,000,000个到1,000个拷贝以及10,000个到0个拷贝。仅T2将由这种测试条件的定量范围充分覆盖。为了准确地测量T1，所提取的溶液需要被稀释100倍。为了准确地测量T3，所提取的溶液需要被浓缩至少100倍。因此，需要具有一个稀释操作和一个浓缩操作的三个单独测试。在所述情况下，现行方法是针对传统qPCR或数字PCR测试将模板T1、模板T2、模板T3个别地设定在不同稀释率下，因此，因额外步骤而对用户造成不便。
本发明利用针对标本中的各种标靶模板的浓度差被组态的PCR阵列载片中的反应孔的具体排列，以使得可以在一个阵列载片中针对一个测试分析或测试小组同时检测标靶模板，而不需要预处理(浓缩或稀释)标本。
本发明可以容易地调节PCR阵列载片中被指定给每种标靶模板用于PCR反应的反应孔的数目和体积，以使得可以在一个阵列载片中同时检测标靶模板，并且同时提供一个测试分析或测试小组的所要信息。对于本发明的测量方法来说，可以使用具有许多(数百个或多于数百个)反应孔的PCR阵列载片。可以将测试样品在每个孔中以相同或不同体积应用到反应孔中。然而，在每个反应孔之中，可以独立地执行一个或一组PCR反应。被指定给每个分析的反应孔的数目取决于样品中存在的模板分子的估计拷贝数。
按照上述情况并且使用由本发明提供的方法，具有2,500个孔的载片，并且每个孔可以装载10纳升所提取的溶液。载片适用于准确地测量100,000个到0个拷贝/孔的标靶。如果将10纳升所提取的溶液装载到载片上的孔之一中，那么一个孔中三种标靶T1、T2、T3的可能拷贝数将分别是100,000个到1,000个拷贝、1,000个到1个拷贝以及10个到0个拷贝/孔。三种标靶T1、T2以及T3的浓度范围在可定量范围内，但标靶T1/T2以及T3的浓度范围悬殊并且将难以在这种条件下准确地定量。因此，基于本发明的方法，将至少一个孔指定以测量T1，一个孔指定以测量T2，并且剩余孔(2498个)指定给T3。将用以检测T1、T2以及T3的引物和探针根据以上设计预分配到孔中。然后将载片用所提取的溶液装载，并且执行实时PCR反应。对每个孔在每个循环中的荧光强度进行测量和记录。然后基于Ct值定量方法分析数据。因此可以测量T1和T2的浓度。首先通过Ct值定量方法分析被指定给T3的孔。然后，检查是否所有孔都能够用Ct值测定。具有有效Ct值的孔暗指在孔内部检测到一定量标靶，并且将其定义为阳性孔。不能产生有效Ct值的孔暗指在孔内部未检测到标靶，并且将其定义为阴性孔。或者，可以将终点荧光信号高于所选阈值的孔定义为阳性孔。将终点荧光信号低于所选阈值的孔定义为阴性孔。阈值取决于仪器并且可以通过标准标靶样品来测定。被指定给T3的孔可能发生三种可能性：1)所有孔都是阳性孔，2)一些孔是阳性孔，并且其它孔是阴性孔；以及3)所有孔都是阴性孔。在第一种情况下，对被指定给T3的所有孔的Ct值取统计平均值，并且基于平均值结果报道T3的最可能浓度。在第二种情况下，将阳性孔的数目(n+)和阴性孔的数目(n-)用以计算在孔中找到至少一个T3标靶的平均可能性(p)，就是说，n+/(n++n-)。然后将可能性(p)用以估计所提取的溶液中存在的T3的最可能浓度。在第三种情况下，T3具有零个拷贝或接近于零个拷贝。因此，一个载片和一个PCR测试能够测量浓度范围广泛的标靶而无额外稀释或浓缩步骤。
由于实验室操作中存在偏差，因此可以将多于一个孔指定给T1和T2，例如10个孔用于T1并且50个孔用于T2，以执行冗余分析并且通过使用冗余Ct值的统计平均值改进测量精度。然而，理论上，将N个孔指定给T3实际上将测试的检测极限延伸到当使用单个孔时的检测极限的1/N。
提供具有N个(数目)具有相同体积的反应孔的分析阵列载片板。待测定或测试的模板分别是T1、T2以及T3。在正常条件下，将测试样品装载到每个反应孔中，并且每个反应孔接收相同体积v的测试样品。将一或多组PCR引物对和检测引物根据预定PCR分析装载到个别反应孔中，使得个别反应孔使得相应模板扩增。
举例来说，在体积v的测试样品流体中，模板T1的拷贝数可以在1000个到100,000个范围内，而模板T2的拷贝数可以在1个到10,000个范围内，并且模板T3的拷贝数可以在0.01个到100个范围内。在本发明中，调节被分配给不同模板的反应孔的数目，例如，将10个反应孔分配以接收模板T1并且以模板T1的引物探针填充，将100个反应孔分配以接收模板T2并且以模板T2的引物探针填充，并且将1,000个反应孔分配以接收模板T3并且以模板T3的引物探针填充。就是说，N个反应孔等于1,110个反应孔。
注意，本文中为了便于描述，可以省略在PCR实验中作为数量参考用于对照组的反应孔的数目。
在实验期间，将测试样品溶液分配并且分布在1,110个反应孔之中用于个别PCR反应。在PCR反应之后，记录每个反应孔的荧光信号。将所记录的荧光信号绘制为荧光曲线并且用以根据以下步骤计算测试样品中的模板的浓度。
步骤1：确定每个反应孔的结果(即荧光信号)是阳性还是阴性信号。
步骤2：如果既定反应孔的结果是阴性信号，那么将既定反应孔记录为具有阴性信号。如果既定反应孔的结果是阳性信号，那么根据定量qPCR方法估计在反应开始时既定反应孔内部的模板的拷贝数。
步骤3：在模板T1的反应孔的总数目(N_T1)之中，将展示阴性结果的反应孔的数目(n_T1)获得并且用以通过例如泊松分布(Poisson distribution)的统计方法估计每个反应孔中的模板T1的预期拷贝数。
步骤4：对于T1模板的展示阳性结果的反应孔来说，将qPCR定量方法(例如Ct值定量方法)用以估计每个反应孔中的模板T1的拷贝数。
步骤5：将步骤3和步骤4的结果用以通过确定的方法估计测试样品中的模板T1(T1模板)的浓度。
步骤6：重复步骤3到步骤5以估计模板T2和模板T3(T2模板和T3模板)的浓度。
如果在反应孔内部存在1.6个模板拷贝，那么阳性结果(阳性信号)的可能性是0.8。当在反应孔内部模板的拷贝数多于5个时，阳性结果的可能性是几乎1.0。
在使用N个以具体引物对填充的反应孔的实验中，如果所有N个反应孔都展示阳性结果，那么将Ct值定量方法或其它类似评估方法用以计算在实验开始时每个反应孔中的模板的估计拷贝数。然后，通过统计方法获得N个反应孔的模板的估计拷贝数的平均值。
实验实例I：
提供具有10,000个反应孔的PCR阵列载片，并且将每个反应孔用0.01微升体积v的测试样品(0.01微升/孔)装载。测试样品(病理标本)包含三种模板(核酸分子)T1、T2、T3(标靶模板)。在测试样品中，这些三种标靶模板的拷贝数的预期范围如下：
预期T1模板分子是10,000个到1,000,000个分子/微升(10,000个到1,000,000个拷贝/μL)
预期T2模板分子是10个到100,000个分子/微升(10个到100,000个拷贝/μL)
预期T3模板分子是0.1到1,000个分子/微升(0.1到1,000个拷贝/μL)
基于Ct值定量方法分析每个反应孔，并且其定量范围是10个到100,000个分子。
最初，将样品装载到反应孔中(v＝0.01μL)，并且在反应孔内，模板T1的拷贝数在100个到10,000个分子之间的范围内(100个到10,000个拷贝/孔)，模板T2的拷贝数在0.1个与1,000个分子之间的范围内(0.1个到1,000个拷贝/孔)，并且模板T3的拷贝数在0.001个到10个分子之间的范围内(0.001个到10个拷贝/孔)。
基于Ct值定量方法，模板T1可以直接定量测量，模板T2必须被浓缩至少100倍，模板T3必须被浓缩至少10,000倍。因此，将进行至少三个不同测试。对于数字定量方法来说，模板T1必须被稀释至少10,000倍，模板T2必须被稀释1000倍，并且模板T3必须被稀释10倍。
将不同数目的反应孔分配给各种模板。在10,000个反应孔之中，将8,000个孔分配给模板T3的测试，1,880个孔分配给模板T2的测试，并且120个反应孔分配给模板T1的测试。
如果在反应孔中的每一者中模板T1的拷贝数在100个到10,000个拷贝/孔之间的范围内，那么可以将Ct值定量方法用于定量，并且将120个反应孔的定量结果的统计平均值视为由样品获得的模板T1的拷贝数。如果每个反应孔中模板T2的拷贝数在0.1个到1,000个拷贝/孔之间的范围内，那么当模板T2的拷贝数多于5个拷贝/孔时，可以将Ct值定量方法用于定量，并且将所有1,880个反应孔的定量结果的统计平均值视为由样品获得的模板T2的拷贝数。或者，当模板T2的拷贝数少于5个拷贝/孔时，将数字PCR定量方法用以测量1,880个孔之中具有阳性信号的反应孔的数目(数量)，并且将统计方法用以计算每个反应孔中的可能拷贝数。类似于模板T2测量模板T3。当模板T3的拷贝数多于5个拷贝/孔时，可以将Ct值定量方法用于定量，并且将所有8,000个反应孔的定量结果的统计平均值视为由样品获得的模板T3的拷贝数，或当模板T3的拷贝数少于5个拷贝/孔时，将数字PCR定量方法用以测量8,000个孔之中具有阳性信号的反应孔的数目(数量)，并且将统计方法用以计算每个反应孔中的可能拷贝数。因此，不需要稀释或浓缩来预处理模板，并且可以通过将不同数目的反应孔指定给这些三种模板来同时定量测量具有三种悬殊浓度范围的三种模板。
在前述实例中，对于测量具有1个到100个范围内的拷贝数的模板来说，Ct值定量方法不是很准确。更好的是使用两个或多于两个反应孔的统计结果。根据统计分析，首先测定光信号的平均值，并且然后计算Ct值；或者，计算反应孔的Ct值，并且然后测定其平均值。统计平均值可以是算术平均值、中值或其它统计有效值。
在前述实例中，在进行任何定量计算之前，可以执行筛检步骤以移除异常反应孔，即经历异常反应的反应孔、不适当地填充有样品或探针的反应孔。
在前述实例中，阵列载片的反应孔可以是多余的，并且可能不用作空白或用作光学反应或生物化学反应的基线参考或用作阴性对照。
对于反应孔的分配来说，标靶模板的拷贝数越低，标靶模板需要越多反应孔。相比之下，模板的拷贝数越高，需要越少反应孔(甚至一个反应孔)。然而，出于考虑测量的误差，可以使用多个反应孔(例如10个孔)以促成平均值被取用。
如果标靶模板的拷贝数高于基于Ct值定量方法的定量的上限，那么可以减少待填充在具体反应孔中的样品的体积或量。举例来说，正常反应孔装载有0.01微升(μL)样品，并且具体反应孔装载有0.002微升(μL)样品。
如果标靶模板的拷贝数太低，那么数字PCR定量需要大量反应孔，并且可以增加待填充在具体反应孔中的样品的体积或量。举例来说，正常反应孔装载有0.01微升(μL)样品，并且具体反应孔装载有0.05微升(μL)样品。
可以根据测试或测试小组的需求专门地设计PCR阵列载片以及载片的反应孔的数目。
对于仅几个PCR反应测试来说，可以将对照并入作为定量的参考，并且可以将探针组添加到载片中。
一般来说，可以使用标靶模板的拷贝数的下限的倒数估计反应孔的最小数目。估计方法描述如下：
如果反应孔装载有0.02μL样品(0.02μL样品/孔)，那么标靶模板Ti的拷贝数在0.001个到100个拷贝之间的范围内(0.001个到100个拷贝/孔)。标靶模板Ti的下限是0.001个拷贝/孔，其倒数是1/0.001＝1,000。就是说，反应孔的最小数目是1,000个(即1,000个反应孔)。考虑到误差，具有1,200个或多于1,200个反应孔是优选的。
PCR分析之后的数据分析步骤可以如下执行：
在反应结束时，根据反应孔中的每一者的荧光曲线按照以下程序计算样品中的标靶模板的浓度：
将分配给标靶模板Ti的反应孔的总数目假定为N。在N个反应孔之中，对阳性反应孔(具有阳性信号)的数目n+和阴性反应孔的数目n-进行测量和测定。如果n+/N>预定义数目(基准U)，那么将Ct值定量方法用以测定反应孔的初始拷贝数。如果n+/N<预定义数目(基准L)，那么将数字PCR定量方法用以测定反应孔的初始拷贝数。相应地基准U可以是99％、95％或90％，并且基准L可以是95％、90％或85％。
此外，对于数据分析步骤来说，可以将检查步骤并入以检查反应孔是否是有效反应孔并且预先移除无效反应孔。所述步骤可以如下执行：
在N个反应孔之中，对无效反应孔的数目n0、阳性反应孔(具有阳性信号)的数目n+以及阴性反应孔的数目n-进行测量和测定。如果n+/(N-n0)>基准U，那么将Ct值定量方法用以测定反应孔的初始拷贝数。如果n+/(N-n0)<基准L，那么将数字PCR定量方法用以测定反应孔的初始拷贝数。
或者，所述步骤可以如下执行：
在N个反应孔之中，对无效反应孔的数目n0、阳性反应孔(具有阳性信号)的数目n+以及阴性反应孔的数目n-进行测量和测定。如果n+/(N-n0)>基准U，那么将Ct值定量方法用以测定反应孔的初始拷贝数。如果n+/(N-n0)<基准L，那么将数字PCR定量方法用以测定反应孔的初始拷贝数。如果分别地n+/(N-n0)<基准U并且n+/(N-n0)>基准L，那么个别地使用Ct值定量方法和数字PCR定量方法，并且将结果加权以获得最可能拷贝数。
通过调节各组反应孔中用于不同类型的模板的反应孔的数目，有可能在一个实验中使用一个载片以测定不同类型的模板的浓度，所述模板的浓度变化多达3个到7个数量级，而不需要对既定测试样品进行多重稀释过程和多重实验。
测试载片或分析阵列板内的反应孔可以经设计以具有相同体积、相同尺寸或不同体积或尺寸。举例来说，一组反应孔可以经设计以具有2.8nL的体积，而另一组的反应孔可以经设计以具有16nL的体积。
可以用一定体积的引物探针溶液填充每个反应孔，并且可以基于实验方案调节所述体积。使用如上所述具有2.8nL体积的反应孔，可以将装载到反应孔中的引物探针溶液的体积控制在0.02nL到2.5nL范围内。使用16nL的反应孔作为实例，引物探针溶液的体积可以在0.02nL到15nL范围内。对于预填充有1nL引物探针溶液的2.8nL的反应孔来说，在反应孔中接收1.8nL流体体积的测试样品。对于16nL并且预填充有1nL引物探针溶液的反应孔来说，这种反应孔可以具有15nL测试样品。
通过预先选择反应孔的体积、反应孔的数目、预填充的引物探针溶液的体积，有可能很好地控制反应孔内的一或多种模板的稀释比或拷贝数，以便确保一或多种模板的浓度范围至少部分重叠。
举例来说，一种方法是将不同体积的引物溶液填充到同一组反应孔中用于单个模板T4。此外，在用于单个模板T4的反应孔组中，包含10个体积是18nL的反应孔和1000个体积是2.8nL的反应孔。在10个18nL的反应孔中，将三个孔用1nL的引物探针溶液预填充，而将7个孔用15nL的引物探针溶液预填充。将所有1000个2.8nL的孔都用0.1nL的引物探针溶液预填充。
不仅可以调节待预填充到反应孔中用于具体模板的引物探针溶液，而且可以调节引物探针溶液的浓度以确保样品内的具体模板的可能浓度范围重叠。
对于基于Ct值定量方法的定量PCR(qPCR)来说，至少一个模板拷贝存在于被填充到反应孔中用于PCR的样品流体中。因此，这个实验的下限阈值是一个(标靶)模板拷贝，表示为1/Vs(Vs：样品体积)的浓度。对于具有2nL的样品流体的反应孔来说，浓度的下限阈值是1标靶模板/2nL。如果标靶模板的浓度低于下限阈值，那么使用传统PCR方法将不能获得结果，或需要样品流体的浓度以增加标靶模板的浓度。然而，在本发明中，可以将许多反应孔(10个、100个、1000个或多于1000个反应孔)分配给一或多种模板用于PCR。将展示阳性结果和阴性结果的反应孔的数目用以计算标靶模板的浓度。
本发明的更一般性描述是，提供一种具有m种类型的待测量核酸标靶(m种标靶)的样品和一种具有n个反应孔的载片。每个孔可以准确地定量PCR反应中的标靶的D-下限拷贝到D-上限拷贝，其中m是大于或等于二的整数，而n可以是2,500、10,000或40,000，D-下限是大于或等于一的整数，并且D-上限通常在106到109范围内。将反应孔分配给标靶的最佳化方案基于由这种载片涵盖的浓度范围。对于m种标靶之中的标靶i来说，其中i是1到m范围内的整数，Ci-上限和Ci-下限是预期由这种载片涵盖的标靶i的上限和下限检测极限。在孔中找到至少一个拷贝的理论概率是pi＝(Ci-下限×v)，其中v代表装载到孔中的样品体积。为了在测试中检测至少一个阳性孔，理论上需要载片上的至少1/pi个孔用于测量标靶i。
对于标靶i来说，为了防止所有孔中存在的标靶超过D-上限，至少一个孔应该装载有体积小于D-上限/Ci-上限的样品。
对于仅需要一个孔的标靶来说，可以将若干个孔指定给标靶作为技术冗余以消除由实验误差所引起的大偏差。用于技术冗余的典型数目是2个到10个孔。对于已经使用多于10个孔的那些标靶来说，技术冗余可能不是必需的。
根据以下步骤分析在PCR循环期间记录的荧光强度数据：
1)检查和确定孔是否是好孔；如果是，那么将孔标记为好孔；如果不是，那么将孔标记为坏孔并且从以下分析排除。好孔意指可以获得PCR数据的孔。坏孔意指主要由于仪器或操作误差而不能获得PCR数据的孔。稍后可以基于2种不同方法(Ct或阈值)将好孔的结果解释为“阴性”或“阳性”。
2)检查是否可以测定每个好孔的Ct值；如果可以，那么将孔标记为阳性孔并且估计那个孔的Ct值；如果不可以，那么将孔标记为阴性孔。阳性孔可以是(1)终点荧光强度高于阈值的孔，或(2)具有有效Ct值的孔。阴性孔可以是(1)终点荧光强度低于阈值的孔，或(2)不具有有效Ct值的孔。某一孔无法产生有效Ct值可能归因于PCR之后的不充分荧光扩增。
3)对每种标靶的阳性孔和阴性孔的数目(n+、n-)进行计数。
4)如下计算标靶浓度：
a)如果n-/(n++n-)小于预选择比R+，那么经由所有阳性孔的Ct值的统计平均值来估计测试样品中的标靶浓度，其中R+可以是1％、5％或10％；
b)如果n-/(n++n-)大于预选择比(R-)，那么通过使用统计概率分布方法计算n+/(n++n-)来估计测试样品中的标靶浓度，其中R-可以是5％、10％或15％；
c)如果n-/(n++n-)在以上两个预选择比之间，那么可以通过获得由步骤a)和步骤b)测定的浓度的加权平均值来估计标靶浓度。
d)如果n+＝0，那么将标靶浓度报道为低于这种载片的检测极限。
可以通过使用一组标准物执行校准过程来测定预选择比R+和R-。还可能设定荧光阈值以确定好孔应该被视为阳性孔还是阴性孔。阈值可以是绝对强度或强度变化百分比。可以通过使用一组标准物进行校准过程来测定阈值。统计分布可以是泊松分布或二项分布。
根据本发明的测量方法，使可以定量的既定样品中的标靶模板的浓度范围扩增。如图1中所示，三种不同模板T1、T2以及T3浓度范围与常规qPCR(标记为R1)和数字qPCR(标记为R2)的定量浓度范围重叠。本发明的测量方法的定量浓度范围(标记为R3)可以延伸超出常规qPCR和数字qPCR的定量浓度范围R1、R2。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (4)
1.一种测量样品中的多于一种模板的浓度的方法，其特征在于，包括：
提供具有多个反应孔的测试载片；
提供具有待用所述测试载片测量的m种标靶的所述样品，其中m是大于或等于二的整数，其中所述多个反应孔中的每一者装载有体积v的所述样品；
提供所述m种标靶中的标靶i的上限浓度范围Ci-上限和下限浓度范围Ci-下限；
计算在所述多个反应孔中的一个反应孔中找到所述标靶i的至少一个拷贝的概率pi＝(Ci-下限×v)；
测定所述多个反应孔中被分配给所述m种标靶中的所述标靶i的反应孔的数目，其中所述多个反应孔中被分配给所述标靶i的所述反应孔的所述数目是至少1/pi；
将对应于所述m种标靶的引物对分配到所述多个反应孔中；
执行聚合酶链反应PCR测试，并且在每个PCR循环中记录所述多个反应孔中每个反应孔的萤光强度；以及
分别计算所述多个反应孔中被分配给所述m种标靶中的所述标靶i的阳性孔的数目n+和阴性孔的数目n-，并且根据所述阳性孔的数目n+和所述阴性孔的数目n-来估计所述m种标靶中的所述标靶i的浓度，其中n+和n-分别是大于或等于零的整数；
其中如果所述多个反应孔中被分配给所述m种标靶中的所述标靶i的所述反应孔中无一者经测定为所述阴性孔，那么经由所述阳性孔的循环阈值估计所述m种标靶中的所述标靶i在所述样品中呈现的所述浓度；
如果所述多个反应孔中被分配给所述m种标靶中的所述标靶i的所述反应孔有5％到15％以上经测定为所述阴性孔，那么经由n+/(n++n-)的概率分布估计所述m种标靶中的所述标靶i在所述样品中呈现的所述浓度；以及
如果所述多个反应孔中被分配给所述m种标靶中的所述标靶i的所述反应孔中无一者经测定为所述阳性孔，那么将所述m种标靶中的所述标靶i在所述样品中呈现的所述浓度报道为低于所述下限浓度范围Ci-下限。
2.一种测量样品中的多于一种模板的浓度的方法，其特征在于，包括：
提供具有n个反应孔的测试载片；
提供具有待用所述测试载片测量的m种标靶的样品，其中m是大于或等于二的整数，其中所述n个反应孔中的每一者装载有相同体积v的所述样品；
提供所述m种标靶中的标靶i的上限浓度范围Ci-上限和下限浓度范围Ci-下限；
通过计算在所述n个反应孔中的一者中找到所述标靶i的至少一个拷贝的概率pi＝(Ci-下限×v)来测定所述n个反应孔中被分配给所述m种标靶中的所述标靶i的数目，其中所述n个反应孔中被分配给所述标靶i的所述数目与1/pi成正比；
将对应于所述m种标靶的引物对分配到所述n个反应孔中；
执行聚合酶链反应PCR测试，并且在每个PCR循环中记录所述多个反应孔中每个反应孔的萤光强度；以及
分别计算所述多个反应孔中被分配给所述m种标靶中的所述标靶i的阳性孔的数目n+和阴性孔的数目n-，并且根据所述阳性孔的数目n+和所述阴性孔的数目n-来估计所述m种标靶中的所述标靶i的浓度，其中n+和n-分别是大于或等于零的整数；
其中如果所述多个反应孔中被分配给所述m种标靶中的所述标靶i的所述反应孔中无一者经测定为所述阴性孔，那么经由所述阳性孔的循环阈值估计所述m种标靶中的所述标靶i在所述样品中呈现的所述浓度；
如果所述多个反应孔中被分配给所述m种标靶中的所述标靶i的所述反应孔有5％到15％以上经测定为所述阴性孔，那么经由n+/(n++n-)的概率分布估计所述m种标靶中的所述标靶i在所述样品中呈现的所述浓度；以及
如果所述多个反应孔中被分配给所述m种标靶中的所述标靶i的所述反应孔中无一者经测定为所述阳性孔，那么将所述m种标靶中的所述标靶i在所述样品中呈现的所述浓度报道为低于所述下限浓度范围Ci-下限。
3.一种测量样品中的多于一种模板的浓度的方法，其特征在于，包括：
提供具有多个反应孔的测试载片；
提供具有m种待测量标靶的样品；
提供预期使用所述测试载片测量的所述m种标靶中的标靶i的上限浓度范围Ci-上限和下限浓度范围Ci-下限；
提供经由所述多个反应孔中的一个反应孔定量的所述m种标靶中的所述标靶i的拷贝的上限N-上限，其中被装载到所述一个反应孔中用于测量所述m种标靶中的所述标靶i的最大体积是N-上限/Ci-上限；
根据所述m种标靶将引物分配到所述测试载片中；
执行聚合酶链反应PCR测试，并且在每个PCR循环中记录所述多个反应孔中每个反应孔的萤光强度；以及
分别计算所述多个反应孔中被分配给所述m种标靶中的所述标靶i的阳性孔的数目n+和阴性孔的数目n-，并且根据所述阳性孔的数目n+和所述阴性孔的数目n-来估计所述m种标靶中的所述标靶i的浓度，其中n+和n-分别是大于或等于零的整数；
其中如果所述多个反应孔中被分配给所述m种标靶中的所述标靶i的所述反应孔中无一者经测定为所述阴性孔，那么经由所述阳性孔的循环阈值估计所述m种标靶中的所述标靶i在所述样品中呈现的所述浓度；
如果所述多个反应孔中被分配给所述m种标靶中的所述标靶i的所述反应孔有5％到15％以上经测定为所述阴性孔，那么经由n+/(n++n-)的概率分布估计所述m种标靶中的所述标靶i在所述样品中呈现的所述浓度；以及
如果所述多个反应孔中被分配给所述m种标靶中的所述标靶i的所述反应孔中无一者经测定为所述阳性孔，那么将所述m种标靶中的所述标靶i在所述样品中呈现的所述浓度报道为低于所述下限浓度范围Ci-下限。
4.一种经由多个聚合酶链反应PCR测试来测定核酸标靶浓度的方法，其特征在于，包括：
在一组孔中执行相同实时PCR反应，其中决定所述组的孔的数目的方法包括：
提供所述标靶的上限浓度范围Ci-上限和下限浓度范围Ci-下限；
计算在所述孔中找到所述标靶的至少一个拷贝的概率pi；以及
测定分配给所述组的孔的数目，其中被分配给所述标靶的所述组的孔的数目是至少1/pi；
在每个循环中记录所述组的孔中的每个孔的荧光强度；
分析所述每个孔的所述荧光强度，其中分析所述荧光强度的步骤包括：
检查所述组的孔中的所述每个孔是好孔还是坏孔；
如果所述组的孔中的孔是好孔，那么将所述组的孔中的所述孔标记为所述好孔，并且如果所述组的孔中的所述孔是坏孔，那么将所述孔标记为所述坏孔并且排除所述坏孔；
检查所述组的孔中的所述好孔的循环阈值Ct；以及
如果所述好孔的所述Ct值可测定，那么将所述好孔标记为阳性孔并且估计所述好孔的所述Ct值，并且如果所述好孔的所述Ct值不能被测定，那么将所述孔标记为阴性孔；
对每种核酸标靶测定所述阳性孔的数目n+和所述阴性孔的数目n-；以及
计算所述核酸标靶浓度，其中计算所述核酸标靶浓度的步骤包括：
a)如果所述n-/(n++n-)小于第一预选择比R+，那么经由所有所述阳性孔的所述Ct值的统计平均值来估计所述核酸标靶浓度；
b)如果所述n-/(n++n-)大于第二预选择比R-，那么通过计算n+/(n++n-)的概率分布来估计所述核酸标靶浓度；
c)如果n-/(n++n-)在以上所述第一预选择比与所述第二预选择比之间，那么通过获得由所述步骤a)测定的所述核酸标靶浓度和由所述步骤b)测定的所述核酸标靶浓度的加权平均值来估计所述核酸标靶浓度；以及
d)如果n+＝0，那么将所述核酸标靶浓度报道为低于检测极限。
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