CN102713620B - 结合内外校准法的分析物定量多重微阵列 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于分析物量化的多重微阵列和方法。尤其是，本发明涉及改进的方法，该方法根据参考标准曲线对测试样本中目标分析物浓度进行标准化，该参考标准曲线是从已知浓度目标分析物的经验证、核准和公认的参考标准中导出的。本发明还涉及用于对确定正常化标准和控制的置信度进行同时测量的方法和检查。

Description

结合内外校准法的分析物定量多重微阵列
技术领域
本发明涉及用于分析物定量的多重微阵列和方法，尤其是，本发明涉及改进的方法，该方法针对内部参考标准化曲线和从已知参考标准获得的标准化曲线来对分析物浓度进行标准化。本发明还涉及对用于确定正常化标准和控制的置信度进行同时测量的方法和校验。
背景技术
生物标记是可被测量和评价的特性，作为有机体的生物状态的指示剂。在医学中，生物标记可以是外生的物质，其被引入到患者体内以检查生物过程，比如器官功能及生物化学机能和路径。生物标记也可以是从患者处获得的生物分子，比如蛋白质或核酸，其表示具体的疾病状态或者对药物治疗的反应。这样的生物化学生物标记在新药的发现和研发中也是特别有用的。在这些药物的早期临床研究期间，合适的生物标记的量化可以潜在地帮助研究人员更快速地识别最有希望的候选药物，因此精简了药物开发过程。与疾病有关的生物标记还可用于疾病的诊断和预后，并用作对疗效的测定。因此，这对于识别和验证新的生物标记（其可以用于评估患者的健康和/或对治疗介入的响应）以及提供用于已知生物标记的准确且可复制的确定的方法是非常重要的。
生物标记分析高度地依赖于诸如抗体的试剂的完整性，该试剂本身是从生物源得到的并因此可能受到质量控制和稳定性因素的影响。在许多生物标记分析过程中使用了未核准的标准，比如重组蛋白质和替代矩阵，从而导出校准曲线。因此，需要进行平行研究，其中对替代矩阵中组成的一定范围的校准标准浓度的分析的响应是与对一系列患者样本稀释液的分析的响应相当的。稀释线性度也可能存在问题，因为抗体和配体结合的亲和力可以在不同的介质中有很大变化。生物标记分析的开发和鉴定的目的是为了开发用于临床获益的分析。
基于目标抗原的抗体的结合特异性，诸如酶联免疫吸附测定（“ELISA”）的免疫分析在本领域中是众所周知的（参见例如，Engvall等人，免疫化学，1971年，8卷，第871页；Ljunggren等人，免疫方法杂志，1987年，88卷，第104页；Kemeny等人，当代免疫学，1986年，7卷，第67页）。免疫分析对于识别新的生物化学生物标记，比如蛋白质或核酸，以及量化已知的生物标记是非常有用的，因为可针对特定的生物标记而产生抗体。
通过免疫分析定量确定生物标记的方法的实例在本领域中是已知的。参见例如，Hawkes等人，生物化学分析，1982年，119卷，第142-147页，和Tobin和Gordon，免疫方法杂志，1984年，72卷，第313-340页，和Gordon等人的序号为5,486,452、名称为“用于免疫分析的装置和工具”的美国专利。
以前所采用的免疫分析方法易于受到限制，因为其在每个测试周期中只能在单个反应容器内检测一个目标分析物。已经通过将探针分子（例如抗体）附着至固体基底（例如盘上的珠子或孔）、然后将测试样本、缓冲液和试剂溶液布满固体基底进行了尝试，以减少完成每个测试周期的时间，并增加在每个周期中所完成的测试的量。
微阵列是一种装置，其中大量（例如数百至数千）的比如DNA和蛋白质的生物分子的样本被附着或固定于适合的未反应基底表面，比如塑料（例如聚丙烯、聚苯乙烯、环烯）、硅树脂和玻璃。如果基底表面相对平直，生物分子可以被“印刷”到表面上，由此通过应用含有已知浓度生物分子的已知体积的“测定点位”的缓冲液来实施印刷。使用固定于已知基底或基底表面上的已知位置的生物分子，基底表面可以被暴露于生物化学/化学试剂，以用于检测、定性和定量分析的目的。例如，微阵列可以用于实施ELISA型免疫分析，其中固定于基底的生物分子为抗体，然后基底表面被暴露于含有抗原（其上可结合抗体）的测试溶液。然后可用缓冲溶液布满基底表面并使其暴露于第二抗体，该第二抗体要么与可检测标签（例如放射性标签或荧光染料）配对，要么与酶（该酶对反应进行催化，对该反应的反应产物进行染色且因此可被检测到）配对。因此微阵列容许大量样本的高通量分析。同时，已经开发了计算机软件程序来分析从微阵列中产生的大量数据。
微阵列的大量实例和对由微阵列所提供的数据进行处理的方法在本领域中是已知的。参见例如Ghandour等人的序号为6,516,276、名称为“用于对来自生物分子阵列的数据进行分析的方法和设备”的美国专利，Shah的序号为6,916,621、名称为“用于基于阵列的比较结合测定的方法”的美国专利，和Minor的序号为7,072,806、名称为“用于横跨多个平台进行数据值比较的方法和系统”的美国专利。
典型地，若干抗原物质或生物标记是与包括疾病的生物过程的检测和诊断相关联的。为了确定多个生物标记的存在，将需要对测试样本中的每个标记实施单独的免疫分析。这大大增加了分析给定测试样本的时间量，并产生了其它的问题，比如随着必须实施每一项分析而增加的增大的成本和增大的实验误差。因此，希望识别和采用生物标记的定量确定方法，其容许对多个抗原或生物标记同时进行检测和定量测量，即“多重”检测和确定。
由于微阵列容许同时、多重的生物化学分析，微阵列可适用于执行多重分析物的检测。为了增加现有微阵列的容量，已开发了“多重”微阵列，其中多个不同的探针生物分子存在于同一个微阵列中。这容许用户检测和分析测试样本中多于一个的目标分析物。这对于多个生物标记的组织液/体液样本的高通量筛选尤其有用，其可以用于检测和诊断包括病原和生理功能紊乱的生物过程。
在使用微阵列时可产生大量的问题，包括难于获得准确定量化分析和重现性。在试图进行多重检测时，这类问题将更显著。在已被固定至微阵列表面的生物分子之间可产生交叉杂交。另外，在印刷过程中，并不是所有期望量的生物分子都可以附着至基底表面。例如，在较平直的基底表面的情况下，在基底表面上可以存在生物分子量的不均匀印刷，其会影响量化分析的准确性。而且，在分析过程中，在应用和移除分析试剂时，未知量的生物分子可以被冲掉。因此，在分析过程中基底表面上给定位置内的生物分子的实际量可能小于理论印刷量，即：基于测试点位缓冲液的已知浓度和应用于表面的测试点位缓冲液的体积所计算得到的量。然而，现有技术中对测试样本内的分析物量进行量化的方法不考虑固定在微阵列上的生物分子的理论量和实际量之间的差异。
因此，需要开发一种对微阵列中获得的数据进行标准化的方法，以使微阵列方法中固有的实验误差最小化，比如，这种误差可能是由于基于涂层/测试点位缓冲液浓度的微阵列基底表面上的生物分子的理论浓度和存在于基底表面上的生物分子的实际浓度之间的差异。另外，由于多重微阵列的单个测试周期可提供来自多个分析或多批标准的数据，需要比较多个分析或多批标准的方法，使得不同分析或标准之间的转换值成为可能，并提供覆盖所有这些分析的参考基础。
发明内容
根据本发明的广阔方面，提供了一种用于对测试样本中一个或多个分析物进行量化的方法，其包括：
（a）提供多个离散反应基底，每个反应容器具有印制在其上的微阵列，所述微阵列包括：
含有多个校准点的校准矩阵，每个校准点含有预定量的校准化合物，其中每个校准点对应于所述校准化合物的理论浓度；和
分析物捕捉矩阵，其包含多个捕捉点，每个捕捉点含有预定量的试剂，所述试剂可选择地结合至所述分析物；
（b）将预定体积的测试样本应用于所述离散反应基底中的一个；
（c）提供多个参考标准，每个参考标准具有已知浓度且每个参考标准含有预定量的每个所述分析物；
（d）将预定体积的每个参考标准应用于所述离散反应基底中的一个；
（e）在来自步骤（b）和步骤（d）的每个离散反应基底上：
（i）应用被标记的报告化合物，其中所述被标记的报告化合物提供可测量的信号强度，所述信号强度与结合至每个点的分析物或者校准化合物的量成正比；
（ii）测量所述微阵列内的每个点的信号强度值；
（iii）对步骤（b）中的反应基底生成第一校准曲线，并对步骤（d）中的反应基底生成第二校准曲线，在每种情况下，所述校准曲线是通过将曲线与图表进行拟合而制备的，所述图表将信号强度值与校准化合物理论浓度进行对比；
（iv）使用所述第一校准曲线，确定所述测试样本的第一分析物当量浓度，并且使用所述第二校准曲线，确定每个所述参考标准的第二分析物当量浓度；
（f）通过将曲线与图表进行拟合来生成参考标准化曲线，所述图表将所述第二分析物当量浓度与每个参考标准的已知浓度进行对比；和
（g）使用所述参考标准化曲线，对所述测试样本的第一分析物当量浓度进行标准化，以获得修正后的分析物浓度。
在如上面提供的方法的实施例中，在步骤（e（iii））中，所述第一和第二校准曲线通过以下生成：
（1）在校准矩阵中，如果所述校准矩阵含有两个或多个校准点，且该校准点为对应于所述校准化合物的常用理论浓度的复制点，则将每个复制校准点的测量信号强度值标准化为每个所述校准点的平均测量信号强度值；和
（2）将曲线与图表进行拟合，所述图表将每个所述校准点的平均测量信号强度值与每个校准标准的对应的理论浓度进行对比。
在如上面所提供方法的另一个实施例中，在步骤（e（iv））中，所述测试样本或者参考标准中的分析物的浓度是由以下确定的：
（3）在步骤（b）和步骤（d）中的每个反应基底的分析物捕捉矩阵中，如果分析物捕捉矩阵含有两个或多个作为复制的捕捉点，将每个复制的捕捉点的测量信号强度值标准化为平均测量信号强度值，并且将每个点的测量信号强度值标准化为每个所述捕捉点的平均测量信号强度值；和
（4）（i）使用步骤（b）中的反应基底的每个所述捕捉点的平均测量信号强度值和所述第一校准曲线，计算所述测试样本中的分析物的浓度；和
（ii）使用步骤（d）中的反应基底的每个所述捕捉点的平均测量信号强度值和所述第二校准曲线，计算每个所述参考标准中的分析物的浓度。
通过采用TukeyBiweight算法来实施对校准矩阵和样本捕捉矩阵的每个点的测量信号强度值的标准化。
在本发明的方法的一个实施例中，分析物捕捉矩阵的点的总数至少等于校准矩阵的点的总数。在所述方法的另一个实施例中，存在3至20个之间的对应于线性稀释液系列的分析物的不同理论浓度。在所述方法的另一个实施例中，对于校准标准的每个理论浓度，存在3至15个之间的点。
在本发明的一个实施例中，被标记的报告化合物为荧光标记的抗体。
在本发明的另一个实施例中，多个反应基底采取多孔化验板的形式。在本发明的又一个实施例中，多个反应基底采取多个珠子的形式。
在本发明的另一个实施例中，测试样本为生物样本。
在本发明的另一方面中，提供了根据上述任一实施例的方法的应用，其中生物样本是从患者处获得的，所述应用包含以下任一种：
（a）监测所述患者疾病的进展；
（b）测量对所述疾病的治疗效果；和
（c）在所述疾病的所述治疗期间，测量所述患者的药物的浓度；
其中，有待量化的一个或多个分析物为表示所述疾病的生物标记。
在本发明的又一方面中，提供了一种用于诊断对象的类风湿性关节炎的、根据上述实施例的方法的应用，其包括：
（1）在从所述对象处获得的生物样本中，测量：
类风湿因子-IgA、类风湿因子-IgG和类风湿因子-IgM中的每一个的浓度水平；和
选自由抗环瓜氨酸肽-IgG、抗环瓜氨酸肽-IgA和抗环瓜氨酸肽-IgM构成的组中的至少一个抗环瓜氨酸肽抗体的浓度水平，
其中，提供了用于类风湿因子-IgA、类风湿因子-IgG和类风湿因子-IgM中的每一个和所述至少一个选定的抗环瓜氨酸肽抗体的已知浓度的参考标准；和
（2）（i）将类风湿因子-IgA、类风湿因子-IgG和类风湿因子-IgM中的每一个的测量浓度水平与类风湿因子-IgA、类风湿因子-IgG和类风湿因子-IgM的对应指标正常水平进行比较，和
（ii）将选定的抗环瓜氨酸肽抗体的测量浓度水平与选定的抗环瓜氨酸肽抗体的对应指标正常水平进行比较；
其中，将超过指标正常水平的上述生物标记的任何测量浓度水平诊断为类风湿性关节炎。
在本发明的另一方面中，提供了一种根据上述实施例的方法的应用，其用于监测患有类风湿性关节炎的对象的类风湿性关节炎的治疗，其包含测量以下浓度水平：类风湿因子-IgA、类风湿因子-IgG和类风湿因子-IgM的浓度水平；和选自由抗环瓜氨酸肽-IgG、抗环瓜氨酸肽-IgA和抗环瓜氨酸肽-IgM构成的组中的至少一个抗环瓜氨酸肽抗体的浓度水平。在治疗期间，对上述生物标记的浓度水平的测量被实施多次。
在用于诊断类风湿性关节炎和/或监测类风湿性关节炎的治疗的方法的上述应用的另一个实施例中，所述微阵列包括校准矩阵，所述校准矩阵包含多个含有预定量的校准化合物的点，每个点对应于校准化合物的理论浓度；第一分析物捕捉矩阵，其包含多个含有预定量的类风湿因子的点；和第二分析物捕捉矩阵，其包含多个含有预定量的环瓜氨酸肽的点。
在用于诊断类风湿性关节炎和/或监测类风湿性关节炎的治疗的上述方法的应用的又一个实施例中，所述微阵列还包含以下中的一个或多个：
（i）正控制矩阵，其包含多个含有预定量的IgA或其碎片、预定量的IgG或其碎片和预定量的IgM或其碎片的点；
（ii）负控制矩阵，其包含多个不含以下的点：
与被标记的报告化合物相互作用的任何化合物；
任意可选择地结合至以下选自由类风湿因子-IgA、类风湿因子-IgG和类风湿因子-IgM构成的组中的任何一个的化合物；和任意可选择地结合至以下选自由抗环瓜氨酸肽-IgG、抗环瓜氨酸肽-IgA和抗环瓜氨酸肽-IgM构成的组中的任何一个的化合物；和
（iii）样本控制矩阵，其包含多个含有试剂的点，所述试剂可选择地结合有与所述生物样本相关的分析物，其中，所述分析物为在所述生物样本中自然产生的化合物或者为添加到所述生物样本中的外来化合物；具有以下附加条件：所述分析物不是类风湿因子-IgA、类风湿因子-IgG、类风湿因子-IgM、抗环瓜氨酸肽-IgG、抗环瓜氨酸肽-IgA或抗环瓜氨酸肽-IgM。
当使用根据上述实施例的本发明的方法来诊断或治疗类风湿性关节炎时，该方法可以在多孔化验板上实施，其中化验板的孔包括如上所述的微阵列，且其中多孔化验板包含一个或多个置信度确认标准化标准和控制。可选地，该方法可以在多个珠子上完成，其中单个珠子包含如上所述的微阵列，且其中多个珠子包含一个或多个置信度确认标准化标准和控制。
在用于诊断类风湿性关节炎和/或监测类风湿性关节炎治疗的方法的上述使用的另一个实施例中，所述多个反应基底（其要么可以是上述多孔化验板的一个或多个单独的孔，要么是上述多个珠子中的一个或多个珠子）可进一步包含一个或多个以下控制：
*用于类风湿因子-IgA、类风湿因子-IgG、类风湿因子-IgM中的每一个的至少一个正控制；和用于所述被选择的抗环瓜氨酸肽的至少一个正控制；
*用于类风湿因子-IgA、类风湿因子-IgG、类风湿因子-IgM中的每一个的至少一个负控制；和用于所述被选择的抗环瓜氨酸肽的至少一个负控制；
*用于类风湿因子-IgA、类风湿因子-IgG和类风湿因子-IgM的参考标准中的每一个的至少一个正控制；和用于所述被选择的抗环瓜氨酸肽的每个参考标准的至少一个正控制；
*用于确定矩阵定位、矩阵旋转、矩阵位移和每个阵列的点数的一个或多个结构控制；
*用于确定复制信号强度的一个或多个复制控制；
*用于血清确定、背景信号和液体体积转移确定的一个或多个过程控制；
*用于确定内校准曲线的一个或多个结构控制；和
*用于确定标准化曲线的一个或多个结构控制。
本发明的优势在于其提供了一种基于微阵列的、用于量化测试样本中目标分析物的量的改进的方法，该方法修正了所应用的探针和校准标准的量的固有差异。该方法可以用于测量单个反应容器内的测试样本中的一个或多个分析物。通过使用多重微阵列，该方法尤其对准确量化测试样本中的多个目标分析物的量是有用的。
本发明的另一个优势在于其提供了一种更准确地量化生物样本中与临床相关的的生物标记以用于诊断或预后目的的方法。此处所公开的方法也可以用于更准确地监测疾病的进程以及疾病治疗的效果。
从下面结合所附附图对其实施例的详细描述中，本发明的其它和进一步的优势和特点对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图说明
根据下面参考附图而对本发明实施例的详细描述，将会进一步理解本发明，其中：
图1是例示了用于实施多重分析的初始校准和参考标准化步骤的流程图；
图2是包含多个点矩阵的多重微阵列的示意性图解，所述点矩阵包括：A-校准矩阵；B-第一分析捕捉矩阵；C-第二分析捕捉矩阵；D-用于患者样本的正控制矩阵；E-第一分析物正控制矩阵；F-负控制矩阵；G-第二分析物正控制矩阵；和H-第三分析物正控制测试矩阵；
图3是初始校准曲线，其是通过绘制被标准化的测量信号强度与12个不同浓度水平处的一系列校准标准的理论浓度的对比而制备的；
图4是参考标准曲线，其绘制了一系列校准标准的复制分析物当量浓度值（AEC2值）与以IU/ml或U/ml表示的已知参考标准浓度的对比，以及，使用所述参考标准曲线由测试点的AEC1值（用箭头表示）来确定修正后的目标分析物浓度；
图5是用于类风湿性关节炎的多重微阵列诊断分析的示例性图解，其含有标记的一系列点矩阵。
图6是柱状图，其例示了测得的类风湿因子-IgA（RF-IgA）、类风湿因子-IgG（RF-IgG）、类风湿因子-IgM（RF-IgM）和抗环瓜氨酸肽-IgG(CCP-IgG)水平和其各自的临床界限值。
具体实施方式
使用微阵列来检测和量化测试样本中，比如从患者处获得的生物样本中的目标分析物是公知的。典型地，用于量化测试样本中目标分析物的量的过程涉及提供包含试剂（也被称作“探针”）的微阵列，所述试剂可选地结合至目标分析物，其中探针首先被固定在微阵列的固体表面上（也被称作“基底”）。在基底是相对平直的表面时，诸如多孔化验板（也被称作“微滴定板”或者“微型板”）的孔底部，通过制备含有已知浓度探针的测量点位溶液并且在表面上印刷预定体积的测量点位缓冲液而将探针固定到微阵列表面上，从而提供捕捉点（也被称作“测试点”），该捕捉点会结合测试样本中的目标分析物（如果存在的话）。类似地，在基底为球形表面时，比如可以在通常用于生物化学分析的珠子上被发现的球形表面的基底，通过制备含有已知浓度探针的涂覆溶液并将珠子浸入到涂覆溶液中，可以将探针固定至珠子的表面上。
已知浓度目标分析物的校准标准可用于构建校准曲线的目的。所述校准标准也可以是具有与目标分析物类似的生物化学特性的替代化合物。在基底表面相对平直的实例中，以与含有用于目标分析物的探针的捕捉点相同的方式，可以将校准标准应用于微阵列，以形成“校准点”。因此，微阵列可含有被固定在微阵列的基底表面上的多个校准点，其每一个包括预定量的目标分析物或者替代化合物。提供了一种用于检测结合至微阵列的分析物的量的报告系统。例如，通常使用的报告系统为可选择地结合至分析物的荧光标记抗体。通过将曲线与图表进行拟合而生成校准曲线，该图表将用于校准点（y轴）的标记报告物的测量信号强度与校准标准的理论浓度（x轴）进行对比。可以通过熟知的数学和统计方法，比如线性回归来将曲线与图表进行拟合。然后基于测得的捕捉点的信号强度，将校准曲线用于确定测试样本中分析物的浓度，其中将测得的捕捉点的信号强度取为y值绘制在校准曲线上，且将测试样本中的分析物浓度取为相应的x值。
典型地，在印刷过程中，并不是所有的探针和校准标准都会附着至微阵列的基底表面。而且，在分析过程中，小的且未知量的探针和校准标准可以在应用和移除分析试剂期间被冲掉。因此，在分析过程中被固定至表面的探针或校准标准的实际量小于理论印刷量，即：基于探针或校准标准在其各自的测量点位缓冲液中的已知浓度和应用于表面的测量点位缓冲液的体积而计算得到的量。然而，现有技术中用于量化测试样本中的分析物的量的方法不考虑固定在微阵列上的探针和校准标准的理论量和实际量之间的差异。
现在提供了一种基于微阵列的、用于量化测试样本中目标分析物的量的改进的方法，其修正了所应用的探针和校准标准的量中的这些固有差异。所述方法也可以用于多重微阵列，以测量在单个反应容器中的测试样本中的多于一个的目标分析物。
参考图1，根据下面的描述，可以理解本文发明的方法的实施例。
所述方法含有如图1（“Fig.1”）例示的两个阶段。
为了实施如下所描述的方法，提供了多个离散反应基底，每个基底具有印刷在其上的微阵列。可以使用现有技术中熟知的传统方法、通过印刷或涂覆而将微阵列固定到每个反应基底的表面上。在本实施例中，假定反应基底是平直的表面，比如由多孔化验板的孔基底所提供的表面。然而，可以理解的是，也可使用其它类型的反应基底，比如珠子。如在此处所使用的，术语“微阵列”指的是附着至固体基底的、特定化合物的一系列离散沉淀，也称作“点”，该特定化合物为比如蛋白质或核苷酸序列。
每个微阵列含有以下点的组：
（i）一个或多个捕捉点（“分析物捕捉矩阵”），每个捕捉点含有探针，该探针特定地结合至测试样本中的目标分析物；和
（ii）多个校准点（“校准矩阵”），每个校准点含有预定量的目标分析物，使得每个校准点对应于已知（理论）浓度的校准标准。如上所述，给定校准点的目标分析物的已知浓度实际上为理论值，因为未知量的目标分析物可能已在该校准点的印刷期间和分析试剂的使用和移除期间丢失。此处所使用的术语“预定量”指的是基于含有校准标准的测量点位缓冲液的已知浓度和印刷在反应容器上的测量点位缓冲液的已知体积而计算得到的校准标准的量。校准标准的识别将取决于目标分析物的性质。校准标准可以是目标分析物自身，在这种情况下，校准标准和参考标准将会相同。在这类实施例中，微阵列将包括用于每个目标分析物的单独的校准标准。可选地，微阵列可以包括具有校准点的单个校准矩阵，该校准点含有每个目标分析物。在可选实施例中，校准标准是替代化合物。例如，如果目标分析物是抗体，可被用于校准标准的合适的替代化合物可以是不同的抗体，但是具有与目标抗体相同种类的免疫球蛋白。在这类实施例中，可以只需要一个校准矩阵。
在根据图1的方法中，提供了多个微阵列，其中每个微阵列被印刷在离散反应基底的表面上。该离散反应基底可以采取珠子或多孔化验板的形式，其中每个单独的孔具有印刷在其上的一个或多个微阵列。在优选的实施例中，使用适合于将微阵列印刷在其上的多孔化验板来实施所述方法。在每个微阵列内，分析物捕捉矩阵和校准矩阵的量将取决于目标分析物的量和目标分析物的性质。
对每个有待分析的测试样本和每个参考标准提供了单独的反应基底。如此处所使用的，术语“参考标准”指的是含有已知量的目标分析物的溶液，比如可购买到的生物分子的标准溶液。如果可能的话，参考标准是一种这样建立的标准：即其等同于并可追溯到适合在本分析中使用的国际认可的标准，并已被证明在其声明的终止日期前是稳定的。对于给定的目标分析物，处于不同浓度的参考标准的量可在3至16之间的范围内，且更优选地在从5至8之间变化。该参考标准可采取线性稀释液系列的形式，该线性稀释液的浓度落入用于读取微阵列的检测系统的动态范围内。
在所述方法的第一阶段中（图1，阶段1），将含有未知浓度的目标分析物的测试样本应用于反应基底之一，该反应基底含有如上述（图1，（a1）和（b1））的微阵列。同样，将两个或多个参考标准，其每个含有已知浓度的目标分析物，应用于剩余的反应基底，每个反应基底含有如上所述（图1，（a2）和（b2））的一组点（i）和（ii）。对于测试样本和每个参考标准，还提供了报告系统，其提供可以被检测和测量的信号强度（“测量信号强度”）。测量信号强度以相对于目标分析物或校准标准（其存在于微阵列上任意给定的点中）的量成正比地变化。合适的报告系统的实例是可特定地结合至目标分析物的荧光标记抗体，其中荧光的强度可以测得并与所结合的抗体的量成比例。
下面将测试样本和一个或多个参考标准应用于微阵列的离散基底表面，将来自每个基底的校准点组的测量信号强度（y轴）与校准点的各个理论浓度（x轴）进行对比而绘制该测量信号强度。回归分析和/或其它熟知的数学和统计方法可被用于制备标准曲线，该曲线与数据点最佳拟合，由此形成了初始校准曲线。因此，存在从暴露于测试样本的校准点导出的第一初始校准曲线（图1，（c1）），和从暴露于参考标准的校准点导出的第二初始校准曲线（图1，（c2））。
其次，通过将每个基底上的捕捉点的测量信号强度绘制为各个初始校准曲线上的y值，求得对应的x值（x轴以浓度为单位）来确定“分析物当量浓度”（“AEC”），由此确定测试样本（图1，（d1））和参考标准（图1，（d2））中的目标分析物的浓度。这样做提供了以下值：
（1）测试样本中未知浓度的目标分析物的第一分析物当量浓度（“AEC1”；图1，（e1））；和
（2）已知浓度的目标分析物的一个或多个参考标准中的每一个的第二分析物当量浓度（“AEC2”；图1，（e2））。
应该注意的是，如在所述方法的该第一阶段中获得的分析物当量浓度值AEC1和AEC2，其既没有考虑分析动力学中的偏离或变化，也没有考虑微阵列之间微小的批量间变化，比如可能在印刷捕捉和校准点期间以及在应用和移除分析试剂期间产生的变化。
在所述方法的第二阶段中（图1，阶段2），通过将用于参考标准的分析物当量浓度AEC2与参考标准的各个已知浓度（“参考浓度”）进行对比来绘制该当量浓度。然后使用回归分析和/或其它熟知的数学和统计方法来确定与数据点最佳拟合的标准曲线，其被称作“参考标准化曲线”（图1，f）。
其次，在参考标准化曲线上绘制用于测试样本的分析物当量浓度AEC1，且AEC1的对应的x值被作为修正后的目标分析物浓度（分别为图1，（g）和（h））。
图2例示了实施例，其中，提供了有益于对结合至两个不同探针化合物的多个分析物进行量化的微阵列。例如，所例示的微阵列有益于对结合至两个不同抗原的抗体进行量化。
如图2所例示的微阵列包括校准矩阵A。该校准矩阵可以印刷在离散反应基底的表面上，其采取线性的、成比例的稀释液系列的形式，该稀释液系列的理论浓度落入用于读取微阵列的检测系统的动态范围内。校准标准的不同浓度水平的量可以在3至20之间的范围内，且更优选地在从5至12之间变化。校准矩阵也可以包括用于每个理论浓度的复制点。对于每个浓度水平，该复制点的量可在3至15之间的范围内，且更优选地在从5至8个点之间变化。在如图2所示的本实施例中，可能只需要单个校准矩阵，但是可以理解的是，在微阵列中可以包括多于一个的校准矩阵。在如图2所示的本实例中，该校准标准可以是不同于目标抗体的抗体，且其通过另外区别地标记的抗体来识别。例如，该校准标准可以是容易得到的且廉价的抗体，比如人类IgA和人类IgM。
该微阵列还含有分析物捕捉矩阵，其为点的子矩阵，该点含有可选择地结合至目标分析物的试剂（也被称作“探针”）。在目标分析物是蛋白质的实施例中，该探针可以是特定地结合至目标分析物的抗体或其碎片。可转换地，在目标分析物是抗体的实施例中，探针可以是被该抗体特定地结合的抗原。该微阵列可用于检测和捕捉该可选择地结合至两个不同抗原的抗体。在如图2所示的本实例中，所例示的微阵列含有分析物捕捉矩阵B和C，由分别含有第一和第二抗原的分析物捕捉点组成。
典型地，分析物捕捉矩阵中的复制点的总数至少等于校准矩阵中参考标准的每个预定浓度的复制点的总数。例如，如果校准矩阵含有用于参考标准的每个预定浓度的7个复制点，那么样本捕捉矩阵将含有至少7个用于目标分析物的复制点。
该微阵列可进一步含有用于每个目标分析物的正控制矩阵。如此处所使用的，术语“正控制矩阵”指的是含有配对的目标分析物和试剂的点的子阵列，该试剂可选择地结合至该目标分析物。在使用时，每个正控制矩阵的信号强度的读数确定了报告系统（例如，可选择地结合至目标分析物的荧光标记抗体）和微阵列扫描仪在给定通道内恰当地运行。另外，在每个正控制矩阵中，信号强度的读数容许“点”查找诸如SQiDworksTM诊断平台(SQI诊断系统公司)中的那些算法，以识别微阵列中的所有点的强度值，以用于自动分析。
图2所示的微阵列包含用于有待量化的每个类型的抗体的正控制矩阵。IgA的正控制矩阵H为含有IgA抗体或IgA碎片的点的子阵列，以核实：报告系统的IgA特别标记的报告物和扫描仪通道是恰当地运行的。IgM的正控制矩阵E为含有IgM抗体或IgM碎片的点的子阵列，以核实：报告系统的IgM特别标记的报告物和扫描仪通道正在运行。IgG的正控制矩阵G为含有IgG抗体或IgG碎片的点的子阵列，以核实：报告系统的IgG特别标记的报告物和扫描仪通道正在运行。
微阵列也可含有负控制矩阵F。如此处所使用的，术语“负控制矩阵”指的是的不含任何与可检测水平的任意分析的分析物或任意标记的报告物相互作用的化合物的点的子阵列。在使用时，在该微阵列区域中的负信号强度读数确认：在有差别的可检测标签和微阵列之间不存在伪相互作用。
微阵列可以进一步含有样本控制矩阵D。如此处所使用的，术语“样本控制矩阵”指的是包含试剂的点的子阵列，该试剂可选择地结合至与生物样本相关联的化合物。该化合物可以是在生物样本中自然产生的化合物，附带条件是：该化合物与目标分析物是不相同的。可选地，化合物可以是添加到生物样本中的外来化合物。
组成微阵列的每个矩阵可以被印刷到反应基底的表面上，比如珠子或化验板的孔的表面上。在优选的实施例中，矩阵被印刷到化验板的孔底部上的预定的X-Y坐标上。
在所述方法的第一阶段中，如上面描述和图1所例示的，图2的微阵列用于确定测试样本和参考标准中的目标分析物的分析物当量浓度。
将预定体积的测试样本和预定体积的每个参考标准应用于离散反应基底。将单独的反应基底用于每个测试样本和每个参考标准。测试样本和参考标准中的目标分析物被容许结合至分析物捕捉点中的探针。使用可选择地结合至目标分析物的标记过的报告物来测量被结合的分析物的量。杂交条件和标记过的报告物的选择将取决于目标分析物的性质并可以使用传统方法对其进行确定。在优选实施例中，报告系统可包括使用被差别地标记的抗体，该抗体特定地识别多个不同的目标分析物。
使用传统方法来测量信号强度值，其对应于微阵列内每个点中的被结合的标记过的报告物的量。例如，在涉及多个目标分析物的量化的实施例中，可使用区别标记的报告物，例如荧光标记的抗体，其每一个以不同的特征波长发出荧光。在该实施例中，可使用电荷耦合装置（CCD）阵列扫描仪来测量由通过每个点发出的必不可少的染料波长所产生的特定荧光信号强度。该扫描仪生成每个点的多色强度图像映射。所产生的信号的强度与包含在被印刷的校准点内的报告物的量以及来自被结合至被印刷的分析物捕捉点的测试样本或参考标准的分析物的量成正比例。对于每个反应基底，测得了每个分析物捕捉点和每个校准点的信号强度值。
对于每一个反应基底，通过如上面图1，（c1）和（c2）中描述的、将曲线拟合至与校准标准的理论浓度进行对比的测量信号强度值来生成校准曲线。然后通过在如图3（同样参见图1，（d1）和（d2），和上面关于同样问题的有关描述）所示的校准曲线上绘制测试样本或参考标准的测量信号强度值并使用所述初始校准曲线来确定用于测试样本（AEC1）或用于参考标准（AEC2）的分析物当量浓度。
图3例示了由采用12个不同浓度水平（在下面的表1（a）中表示为AGM-01至AGM-12）的校准标准所进行的分析的结果制备的初始校准曲线。相对于校准标准的各个理论浓度水平（x轴），绘制每个校准标准的测量信号强度值（y轴）。然后使用熟知的回归分析方法将曲线与数据点进行拟合，从而获得初始校准曲线。对于校准标准的每个浓度水平，对于每个理论浓度水平（作为x值），通过识别校准曲线上对应的y值，对所测量的强度值进行标准化，对应的y值被标识为“拟合信号强度”。
表1（a）系列校准点的拟合信号强度
校准点参考号 理论浓度（x轴） 拟合信号强度（y轴）
AGM-01 0.16 102
AGM-02 0.44 207
AGM-03 0.73 332
AGM-04 1.21 582
AGM-05 2.02 1147
AGM-06 3.36 2576
AGM-07 5.6 6690
AGM-08 9.33 18064
AGM-09 15.55 38573
AGM-10 21.77 49938
AGM-11 30.48 55118
AGM-12 42.67 56369
然后，可以如下确定测试样本（AEC1）或参考标准（AEC2）的分析物当量浓度。将一组捕捉点的测量信号强度的平均值作为y值绘制在校准曲线上。然后对应的x值将为分析物当量浓度。如表1（b）所概括的，对于给定捕捉点的平均测量信号强度7187，从如图3中例示的校准曲线中计算得到的对应的AEC1值将为5.8。
表1（b）从图3的校准曲线中计算得到的捕捉点的AEC1
平均测量信号强度 计算得到的AEC1
测试样本（捕捉点） 7187 5.8
在校准矩阵包含用于校准标准的每个浓度水平的复制点的实施例中，可如下生成初始校准曲线。对于给定的校准化合物的理论浓度的每个复制点的测量强度信号，其可被标准化为平均测量强度信号值，并且使用熟知的回归分析方法，将曲线与用于校准标准的每个理论浓度的平均测量强度信号值进行拟合。类似地，如果分析物捕捉矩阵包含复制捕捉点，则可以将每个复制点的测量强度信号值标准化为平均测量强度信号值，并且通过在校准曲线上绘制平均测量强度信号值来计算目标分析物的浓度，从而确定测试样本或参考标准中的目标分析物的浓度。
在优选的实施例中，对校准矩阵和样本捕捉矩阵的每个点的测量强度信号值的标准化是通过应用算法来实施的。在又一个优选的实施例中，所述算法优选为TukeyBiweight算法，其是一种不怎么关注数值的可接受的统计算法，因为这些数值进一步来自于所有包含的复制品的中值（Mosteller,F.和Tukey，J.W.数据分析和回归：统计学的第二过程；Addison-Wesley:阅读，1977年；第203-209页）。
将参考标准的分析物当量浓度（AEC2值）用于所述方法的第二阶段，以调节或修正测试样本的分析物当量浓度（AEC1值），从而提供对测试样本中目标分析物量的更加准确的测量（同样参见图1、阶段2和涉及相同问题的以上相关描述）。通过将曲线与图表拟合而生成参考标准化曲线，该图表将参考标准的分析物当量浓度（AEC2值；y轴）与参考标准的已知浓度（x轴）进行比对。然后通过修正分析物当量浓度来确定测试样本中目标分析物的量。这通过在参考标准化曲线上绘制测试样本的分析物当量浓度（AEC1）并获得对应的x值（该值被看作是修正后的目标分析物浓度）来完成。通过这样做，将分析动力学中小的随机偏差和变化与反应容器之间微小的批量间变化相结合。因此，修正后的目标分析物浓度值是对目标分析物的更加准确的量化。
图4例示了采用参考标准的8个不同浓度水平的分析结果，每个浓度水平是在两个复制点中提供的。对于每个参考标准（在下面的表2（a）中表示为RAS0至RAS7），如上面讨论的那样确定其分析物当量浓度（AEC2）。相对于参考标准的各个已知浓度（x轴），绘制每个参考标准的分析物当量浓度AEC2值（y轴）。然后使用熟知的回归分析方法将曲线与数据点拟合，因此形成如图4所示的参考标准化曲线。然后，每个已知浓度水平（x值）的每组AEC2值被标准化为所述参考标准化曲线上对应的y值，以提供标准化后的AEC2值。标准化后的AEC2值和上述对应的已知浓度值（x值）被概括在下面的表2（a）中。
表2（a）已知浓度的一系列参考标准的AEC2值（标准化）
然后，将测试样本的分析物当量浓度AEC1=5.8绘制在参考标准化曲线上，以提供修正后的目标分析物浓度42.36（参见下面的表2（b））。修正后的目标分析物浓度可以被表示为浓度，即每体积中的量（例如：μg/mL；单位/mL），或，如果相对于公认的可追溯的、国际公认的参考校准器而被标准化，则以每体积的国际单位（IU）（例如，IU/mL）进行表示。可以理解：相关测量单位将取决于有待分析的目标分析物以及是否使用了可追溯的参考标准。
表2（b）从图4的参考标准曲线确定的、计算得到的测试样本中目标
分析物浓度
此处公开的方法可以被用于更准确地量化生物样本中临床相关的生物标记，以用于诊断或预后目的。例如，对于与疾病相关的生物标记，修正后的目标分析物浓度可与为该生物标记建立的指标正常水平进行比较。超过指标正常水平的、修正后的目标分析物浓度水平可以被确定为诊断患有疾病。此处公开的方法也可以用于监测疾病的进展以及对疾病的治疗效果。在治疗期间多次使用所公开的方法可以量化临床相关的生物标记的水平。生物标记水平中的下降趋势可能与患者对治疗的积极反应相关。
当将此处公开的方法用在临床环境中时，可以提供一组内部质量控制规则，以用于评价分析结果的目的。这些规则可以由安全和危险分析来确定，以减少比如丢失测试样本和在免疫化学反应中失败的一般风险。其可包括用于检查校准与标准化曲线的拟合性的质量控制规则，以及用于测量报告物活性和样本存在的控制阀值。当发现数据与所需的控制水平或规则不匹配时，则终止数据的进一步处理，并且可以报告：该值“无结果”。内部质量控制规则或失效规则可以存在于数据处理的每个水平处。例如，可以为单个分析物结果的失效提供该规则，其中存在高的复制捕捉点偏差系数。如果存在不恰当的校准曲线或控制阀值，则可为给定微阵列或给定反应基底的结果的失效提供该规则。可为由于不恰当的标准化曲线而产生的结果失效提供该规则。
本发明的优选实施例的进一步细节可以在下面的实例中例示，该实例不能被理解为是对所附权利要求的限制。
实例1—用于分析类风湿性关节炎生物标记的多重微阵列
图5例示了有益于诊断类风湿性关节炎和用于监测患有类风湿性关节炎的患者的治疗效果的微阵列。该微阵列可用于量化与类风湿性关节炎相关的生物标记：类风湿因子-IgA（RF-IgA）、类风湿因子-IgG（RF-IgG）、类风湿因子-IgM（RF-IgM）以及抗环瓜氨酸肽-IgG（CCP-IgG）、抗环瓜氨酸肽-IgA（CCP-IgA）和抗环瓜氨酸肽-IgM（CCP-IgM）。注意到，该微阵列可与报告系统一起使用，该报告系统含有特定地识别IgA、IgG和IgM抗体的区别标记的抗体。报告物抗体可以是区别标记的荧光抗体。
将微阵列印刷在96-孔化验板的每个孔上。该微阵列包含两个不同的样本捕捉矩阵，每个捕捉矩阵包含21个捕捉点。每个捕捉点包含预定的相关量的类风湿因子，其用于捕捉RF-IgA、RF-IgG和RF-IgM，且包含第二分析物捕捉矩阵，其含有预定的相关量的抗环瓜氨酸肽，用于捕捉CCP-IgG、CCP-IgA和/或CCP-IgM。注意到，该微阵列可包含用于捕捉RF-IgA、RF-IgG和RF-IgM以及至少一个抗环瓜氨酸肽抗体（CCP-IgG、CCP-IgA和/或CCP-IgM）的样本捕捉矩阵。在本实例中，微阵列包含用于所有上述生物标记的捕捉点。该微阵列还含有校准矩阵。校准标准为IgGFab，其由IgG报告物抗体识别。在微阵列上提供校准标准的十二个（12）不同浓度，其覆盖了大于200-倍的浓度范围。另外，该校准矩阵含有用于该12个不同的浓度水平中的每一个的7个复制点。
该微阵列还含有用于每种类型的有待量化的抗体的负控制矩阵和正控制矩阵。该负控制矩阵和正控制矩阵中的每一个含有7个复制点。
该负控制矩阵包含多个点，该点不包含任何可在任何进行分析的分析物或者任何标记的报告物的可检测水平下相互作用的化合物。
IgA正控制矩阵是含有IgA抗体或其碎片的点的子阵列，以核实：报告系统中的IgA特定标记的报告物和扫描仪通道是恰当运行的。IgM正控制矩阵是含有IgM抗体或其碎片的点的子阵列，以核实：报告系统中的IgM特定标记的报告物和扫描仪通道正在运行。IgG正控制矩阵是含有IgG抗体或其碎片的点的子阵列，以核实：报告系统中的IgG特定标记的报告物和扫描仪通道正在运行。
该微阵列含有测试控制矩阵，该测试控制矩阵含有点的子阵列，所述点含有辅助的抗人体IgM抗体，该抗体可选择地结合至任何血清IgM抗体，以确定在分析期间测试样本被加入到反应容器中。
世界卫生组织64/2英国第一类风湿性关节炎血清的参考制备，以12个不同的已知浓度被用做分析的参考标准（Anderson、S.G.等人，“类风湿性关节炎血清的国际参考制备”，世界卫生组织公报，1970年，42卷，第311-318页）。
通过将预定体积（100微升，μL）的患者的血清样本应用于多孔化验板的单独反应孔上来实施分析。在应用于反应孔之前，将测试样本与IgA、IgG和IgM的特定报告物抗体结合。该测试样本与报告物抗体反应约2分钟，然后被分配到反应孔中。典型地，对于每个患者样本，至少有2个复制孔。类似地，参考标准中的每一个与报告物抗体反应，并被应用到化验板的单独反应孔中。典型地，对于每个参考标准，至少有2个复制孔。对于每个反应孔，为包含在每个反应孔中的微阵列的每个点生成多色强度图像映射。
对于每个多孔化验板，该化验板包含一个或多个置信度确认标准化标准和控制，其包括：
*每个化验板的96个分析孔中的72个中的每一个含有至少一个正控制，其用于RF-IgA、RF-IgG和RF-IgM中的每一个；
*每个化验板的96个分析孔中的72个中的每一个含有至少一个正控制，其用于CCP-IgG、CCP-IgA和/或CCP-IgM；
*每个化验板的96个分析孔中的72个中的每一个含有至少一个负控制，其用于RF-IgA、RF-IgG和RF-IgM中的每一个和CCP-IgG、CCP-IgA和/或CCP-IgM中的至少一个；
*每个化验板的96个分析孔中的72个中的每一个含有至少一个正控制，其用于RF-IgA、RF-IgG、RF-IgM的以及CCP-IgG、CCP-IgA和/或CCP-IgM中的至少一个的可追溯的参考标准中的每一个；
*每个化验板的96个分析孔中的92个中的每一个含有用于确定矩阵位置、矩阵转动、矩阵移动和每个阵列中点的量的一个或多个结构控制；
*每个化验板的96个分析孔中的92个中的每一个含有用于确定复制信号强度的一个或多个替代复制控制；
*每个化验板的96个分析孔中的92个中的每一个含有用于血清确定、背景信号和液体体积转移确定的一个或多个过程控制；
*每个化验板的96个分析孔中的92个中的每一个含有用于确定内部标准曲线的一个或多个结构控制；
*每个化验板的96个分析孔中的92个中的每一个含有用于确定标准化曲线的一个或多个结构控制。
对于校准标准的每个浓度水平，通过应用TukeyBiweight算法对每个复制校准的测量信号强度进行标准化，以提供每个浓度水平的平均测量信号强度值。通过将曲线与校准标准的每个浓度的平均测量信号强度值进行拟合来生成初始校准曲线。
对于IgA，IgG和IgM检测通道中的每一个，通过应用TukeyBiweight算法对每个分析物捕捉点的测量信号强度进行标准化，从而提供平均测量信号强度值，该平均测量信号强度值与测试样本或参考标准中存在的IgA，IgG或IgM的量成比例。在初始校准曲线上绘制该平均测量信号强度值，以提供测试样本中和参考标准中的RF-IgA、RF-IgG、RF-IgM中的每一个和CCP-IgG、CCP-IgA和CCP-IgM中的至少一个的分析物当量浓度。
对于RF-IgA、RF-IgG、RF-IgM中的每一个和CCP-IgG、CCP-IgA和CCP-IgM中的至少一个，生成参考标准化曲线。每个标准化曲线是通过将曲线与参考标准的每个浓度的分析物当量浓度值（AEC2值）进行拟合而生成的。通过在参考标准化曲线上绘制适当的分析物当量浓度值，对测试样本中RF-IgA、RF-IgG、RF-IgM中的每一个和CCP-IgG、CCP-IgA和CCP-IgM中的至少一个的分析物当量浓度（AEC1值）进行修正，以提供每个上述生物标记的修正后的目标分析物浓度。
然后，可将所生成的修正后的浓度与每个生物标记的指数正常水平进行比较，即与用于诊断类风湿性关节炎的临床相关的界限值进行比较。在图6中，柱状图例示了测得的类风湿因子-IgA（RF-IgA）、类风湿因子-IgG（RF-IgG）、类风湿因子-IgM（RF-IgM）和抗环瓜氨酸肽-IgG（CCP-IgG）水平及其各个临床界限值。所发现的高于每个生物标记的正常水平的、生物标记测量水平被识别为类风湿性关节炎的诊断。
鉴于所获得的结果，可推断：类风湿性关节炎的生物标记水平的测量可用于通过在治疗周期中多次测量生物标记水平而监测治疗效果。
尽管参考例示的实施例对本发明进行了描述，将要理解的是，本发明不局限于这些准确的实施例。在不偏离下面权利要求中所限定的本发明的保护范围的情况下，对于上述本发明的具体实施例可以做出许多修改、变化和调整。

Claims (11)

1.一种用于量化测试样本中的一个或多个蛋白质分析物的方法，其包括：
(a)提供多个离散反应基底，每个基底具有印制在其上的微阵列，每个反应基底在反应容器之内,所述微阵列包括：
含有多个校准点的校准矩阵，每个校准点含有预定量的校准化合物，所述校准化合物为一个或多个所述分析物，其中每个校准点对应于所述校准化合物的理论浓度，其中所述多个校准点对应于所述校准化合物的浓度范围，且其中每个预定量的校准化合物有至少两个复制点；和
分析物捕捉矩阵，其包含多个捕捉点，每个捕捉点含有预定量的试剂，所述试剂可选择地结合至所述分析物；
(b)将预定体积的测试样本应用于所述离散反应基底中的一个；
(c)提供多个参考标准，每个参考标准具有已知浓度且每个参考标准含有预定量的一个或多个所述分析物的每个；
(d)将预定体积的每个参考标准应用于与测试样本不同的离散反应基底中的一个，但每个反应基底只能被一个参考标准应用，和；
(e)在来自步骤(b)和步骤(d)的每个离散反应基底上：
(i)应用被标记的报告化合物，其中所述被标记的报告化合物提供可测量的信号强度，所述信号强度与结合至每个点的分析物或者校准化合物的量成正比；
(ii)测量所述微阵列内的每个点的信号强度值；
(iii)对步骤(b)中的反应基底生成第一校准曲线，并对步骤(d)中的反应基底生成第二校准曲线，在每种情况下，所述校准曲线是通过将曲线与图表进行拟合而制备的，所述图表将信号强度值与校准化合物理论浓度进行对比；
(iv)使用所述第一校准曲线，确定所述测试样本的第一分析物当量浓度，并且使用所述第二校准曲线，确定每个所述参考标准的第二分析物当量浓度；
(f)通过将曲线与图表进行拟合来生成参考标准化曲线，所述图表将所述第二分析物当量浓度与每个参考标准的已知浓度进行对比；和
(g)使用所述参考标准化曲线，对所述测试样本的第一分析物当量浓度进行标准化，以获得修正后的分析物浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤(e(iii))中，所述第一和第二校准曲线通过以下生成：
(1)在所述校准矩阵中，将每个复制校准点的信号强度值标准化为每个所述校准点的平均信号强度值；和
(2)将曲线与图表进行拟合，所述图表将每个所述校准点的平均信号强度值与每个对应校准标准的对应的理论浓度进行对比。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(e(iv))中，所述测试样本或者所述参考标准中的分析物的浓度是由以下确定的：
(3)在步骤(b)和步骤(d)中的每个反应基底的所述分析物捕捉矩阵中，如果所述分析物捕捉矩阵含有两个或多个复制捕捉点，则将每个复制捕捉点的所述信号强度值标准化为平均信号强度值；和
(4)(i)使用步骤(b)中的反应基底的每个所述捕捉点的平均信号强度值和所述第一校准曲线，计算所述测试样本中的所述分析物的浓度；和
(ii)使用步骤(d)中的所述反应基底的每个所述捕捉点的平均信号强度值和所述第二校准曲线，计算每个所述参考标准中的所述分析物的浓度。
4.如权利要求2所述的方法，其中，通过采用TukeyBiweight算法来实施对校准矩阵的每个所述点的测量信号强度值的标准化。
5.如权利要求3所述的方法，其中，通过采用TukeyBiweight算法来实施对所述分析物捕捉矩阵的每个所述点的测量信号强度值的标准化。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述分析物捕捉矩阵的点的总数至少等于所述校准矩阵的点的总数。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述校准化合物存在3至20个之间的对应于线性稀释系列的分析物的不同理论浓度，且其中对于所述校准化合物的每个理论浓度存在3至15个之间的点。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述被标记的报告化合物为荧光标记的抗体。
9.如权利要求1所述的方法，其中，所述多个离散反应基底采取多孔化验板的形式。
10.如权利要求1所述的方法，其中，所述多个离散反应基底采取多个珠子的形式。
11.如权利要求1所述的方法，其中，所述测试样本为生物样本。
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