JP4743719B2 - 動的内部較正の真の用量応答曲線を測定するための方法 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、生物学的サンプル中の分析物の存在およびその品質を検出するためのアッセイデバイスおよびそのようなアッセイデバイスを構築するための方法に関する。

（発明の背景）
免疫アッセイのための品質基準は、伝統的に、外部の較正参照標準によりもたらされている。代表的な免疫診断アッセイのための分析の現在の方法は、一般的に受け入れられている外部標準の参照測定に基づき、診断試験結果を提供する。多くの公知の矛盾が、アッセイが実施される場合にもたらされる定量誤差であることが明らかとなっており、これは試験結果の変動へと導く。例えば、アッセイ感度の概念は、低濃度サンプルを反復して測定し、そのサンプル結果が０とは統計学的に異なっていないことを確認することに基づく、古典的な統計学的分析によって感度を特徴付けることを企図する。課せられる標準誤差が実際の測定数の数の平方根に反比例する場合、この方法は、本来のアッセイ感度を実際には測定しない。さらなる洗練はいくらかの改善へと導いている。分析感度として当該分野で公知である、０標準がいくつかの場合に測定され、そして感度限界は、平均（Ｍ）からの２〜３の標準偏差（ＳＤ）に等しい濃度になる。しかしながら、この理論上の決定に関する精度は、大規模によって不正確になり得る。導かれる外部較正曲線について同時に適合させることは、実際の感度において考慮すべき誤差を導き得る、真なる値の動的用量応答曲線を作成しない。

このような分析測定の正確さをさらに測定するため、正確さは、測定される平均値がその真なる値にどのくらい近いのかを定義するために使用される。測定の差異は、正確さの偏りまたは程度として公知である。偏りは、アッセイの範囲にわたって変動し得る。この真なる値を測定するための方法が開発される必要があることは、当該分野で公知である。分析アッセイにおけるアッセイの再現性または見積もられる誤差は、変動率係数（％ＣＶ）として当該分野で公知である。自動化アッセイ分析機械において、サンプルの濃度、温度、加熱作用および端作用における変動性、粒子の不完全な懸濁および固相沈着物により影響され得る。正確な効果はまた、画分の分離およびエラーの計数から生じる。光学系において、エラーは、濁度、蛍光物質の存在、ランプおよび検出器の劣化、ならびに経時的な試薬の劣化に起因の作用する。これらの要因は、一般的に、シグナル対ノイズ比の有意な低下を導く。機械操作上のエラーは、貧弱なピペッティングおよび装置の乏しい準備期間から生じ得る。

直接的な結果として、任意の分析方法の正確さについての評価は、規定コントロール溶液または標準コントロール溶液を使用して基底の較正標準を作成することによる、既知かつ適切な濃度において得られる変動性の測定を必要とする。このような標準物質の正確な決定は、所定の間隔での系列希釈における既知濃度の測定に基づき、次いでこの間隔に内挿される。市販の参照溶液または参照標準、および社内で調製した参照溶液または参照標準が利用可能であるが、しばしば標準または乏しいマトリクスを用いて較正され、これらは実際の患者試験サンプルからかなり変動し得る。これらのエラーを克服するための溶液部分は、アッセイの正確なプロフィールまたは較正を得るため、広範な濃度に対する精密さをプロットすることである。

交差反応性、アッセイ特異性、偏向を生じる障害、抗原、抗体、抗原結合部位の変更、低用量（競合アッセイ）および高用量（サンドイッチアッセイ）、フック効果、ヘテロフィル抗体の障害、内在性障害性自己抗体、補体、リューマチ因子、固相抗体結合における障害、内在性シグナル生成物質、酵素インヒビター、触媒および補因子もまた、アッセイにおいて同時に見られる活性を表すことを示されており、自動化免疫アッセイ装置およびサンプラーにおけるサンプルの交差反応性、マトリクス効果およびキャリーオーバーが挙げられる。

診断適用に関して、品質管理サンプルは、患者における現実的な医療濃度を反映しなくてもよいし、現在の分析物のスペクトルを反映しなくてもよいし、そして患者サンプルの内容をもはや反映しないサンプルマトリックスとは干渉しなくてもよい。品質管理サンプルは、医療的決断の要点を反映しなくてもよい矛盾した濃度間隔において効力を測定し得る。

従って、信頼ある較正可能にされ得る免疫アッセイについての必要性が存在する。

本発明は、サンプルにおける分析物の濃度を決定するための、アッセイデバイスの内部動的較正のための方法に関し、ここで、このアッセイデバイスは、アッセイ表面を有する。所定の分量の分析物を含む複数の較正ドットが、そのアッセイ表面上にプリントされる。その分析物を結合するための試薬を含む試験ドットもまた、そのアッセイ表面上にプリントされる。分析物は、アッセイデバイスへの導入の前に、検出可能なマーカーで標識される。この分析物−検出可能なマーカー複合体が、試験ドットにおける試薬に結合する。サンプルにおける抗原の量は、試験ドットにおける検出可能なマーカーの量と比例する。較正ドットは、異なる所定の分量の分析物を含む。任意の標識されていない検出可能なマーカーが、較正ドットに結合する。したがって、内部較正された較正曲線が作成される。試験ドットにおける検出可能なマーカーの強度は、その較正曲線と比較され得、絶対値を得ることができる。

上記方法は、単一アッセイデバイスを使用して迅速に実施される定量的分析を提供する。このアッセイデバイスは、既知の最低量の試験流体を含有する性能、および試験した容量当たりの分析物濃度の関数として知られる分析物濃度と一致させるために、流体をそのデバイスを通して流す能力を有する。較正ドットおよび試験ドットはいずれも、単一のアッセイデバイス内にプリントされ、分析物を含む単一の予め混合された溶液および過剰量の検出試薬（これは、好ましくは、抗体である）の適用のみを必要とする。

本発明はさらに、較正物質および試験サンプルを共通の試験プラットフォームデバイス上にプリントすることによって、動的な真の用量応答曲線を得るための方法を包含する。この試験プラットフォームは、最低１つの試験ドットを有する。各試験ドットは、複数の対応する較正ドットを有する。指標を付けられたＸ−Ｙ座標において、比較的な濃度の動的較正ドットの総数から得られるシグナルが統合され、動的な内部較正された真の用量応答曲線を形成する。同様のプロセスにおいて、未知の試験ドットの標識反応の読み取りもまた、全体の得られた読み取りと統合される。プラットフォーム形式における複数の試験アレイまたはマトリックスの使用は、正確な試験結果を得たという、１００％に達する信頼限界であることを意味する。共通の試験プラットフォームは、同一の試験流体に曝露される。抗生物質および試験サンプルが、同じ試験流体に同時に曝露されるので、その試験サンプル内に存在する分析物濃度の正確な測定値が、得られる真の用量応答較正曲線によって決定される。本発明は、当該分野における公知の方法を使用すると生じる種々の誤差が試験サンプルが本明細書中で開示される方法およびデバイスを用いて処理され場合は、反映されないという驚くべき結果を提供する。

本発明の一局面によると、サンプル溶液における分析物の量を決定する方法が提供される。この方法は、以下：
・アッセイ表面を有するアッセイデバイスを提供する工程であって、その表面は、表面上にプリントされた複数の較正ドットおよびその表面上にプリントされた試験ドットを有し、この較正ドットは所定の分量の分析物を含み、試験ドットはその分析物への結合のための試薬を含む、工程；
・その分析物への結合のための試薬を有する溶液を提供する工程であって、その試薬は、検出可能なマーカーで標識されている、工程；
・分析物を溶液に導入し、サンプル溶液を形成する、工程；
・そのサンプル溶液を、アッセイデバイス上に導入する工程；
・較正ドットにおいて、検出可能なマーカーの強度を測定する工程；
・検出可能なマーカーの強度に対する較正ドットにおける分析物の量に相関する較正曲線を作成する工程；
・試験ドットにおける検出可能なマーカーの強度を測定する工程；ならびに
・較正曲線において、検出可能なマーカーの強度と、その強度に対応する分析物の量とを比較することによって、試験ドット中に存在する分析物の量を算出する工程；
を包含する。

（発明の詳細な説明）
本発明の方法は、アッセイデバイスの較正のためのものである。好ましいアッセイデバイスは、図１に示される。このアッセイデバイスは、好ましくは充填領域１８および読み取り領域１６を備えるアッセイ表面１０を有する。この読み取り領域１６は、その上にプリントされた少なくとも１つの、好ましくは少なくとも２つの試験ドット２０を有する。より好ましくは、分析物の存在を検出するための複数のドットが、読み取り領域１６上にプリントされる。この試験ドット２０は、タンパク質分析物に特異的に結合する試薬を含む。好ましくは、この試薬は、分析物に特異的に結合する結合抗体である。特異的な分析物に結合する当該分野で公知の他の試薬もまた、使用され得る。本明細書における考察のバランスをとるために、この試薬は抗体であるものとする。

この結合抗体は、好ましくは、各結合抗体が隣接する抗原複合体からの立体障害なしで試験抗原に結合することができるようにするために、好ましくは間隔が空いている。好ましくは、非反応性タンパク質が、試験ドットにおいて、その結合抗体を分離させる。

読み取りエリア１６は、その上に、較正ドット２２がプリントされている。較正ドットは、容器内の未反応の試薬と反応するための、検出マーカーと結合体化した所定量の上記分析物を含む。較正ドットは、標識の強度を存在する抗原の量に相関させる。試験ドット内の標識の強度は、存在する抗原の量を導くために使用され得る。

較正ドットは、分析物のダイナミックレンジに対応する、分析物の濃度を有する。ダイナミックレンジは、患者において通常見られる分析物の濃度である。定量化は、この最低濃度と最高濃度内であり、そして、臨床的に適切な濃度に関連している必要がある。

イムノアッセイに代表的な現行の方法に伴う問題の多くは、較正のために、外部標準参照サンプルを導入することによって決定されるアッセイの較正に由来する。本発明の方法は、これらの外部標準較正サンプルを使用しないことによって、より正確な結果を提供する。

それぞれの分析物の量を測定するためのプラットフォームデバイスを開発する際、較正または基線を作成するために外部標準を使用する代わりに、未知の濃度の較正ドットならびに試験ドットの両方を、同じ試験プラットフォーム上にプリントする。較正試験ドットは、分析物の既知の濃度でプリントされる。これらの試験ドットはまた、所定のＸ−Ｙ位置においてプリントされ、捕捉試薬（好ましくは、調査中の分析物について特異的な抗体である）のみを含む。試験サンプルは、次いで、過剰量のマーカー試薬（好ましくは、抗体である）および分析物と結合体化される。このマーカー抗体は、予め、それぞれの蛍光標識と結合体化されており、適切な波長（例えば、６５０ナノメートル）を放射する。マーカー抗体／抗原複合体、ならびに、遊離した残余のマーカー抗体は、次いで、層流を用いて、試験プラットフォームの上を流される。しかし、当業者は、層流に拠らない他のアッセイデバイスもまた使用され得ることを理解する。例えば、抗体／抗原複合体、ならびに、残余の遊離したマーカー抗体が、拡散律速の動態学によってデバイス中を移動するような、容器の形状のアッセイデバイスもまた、本発明の目的のために使用され得る。この様式において、マーカー抗体／未知濃度の抗原複合体が、捕捉抗体の試験ドットによって結合されるのに対し、遊離したマーカー抗体は、既知濃度の予めプリントされた抗原ドットに結合する。測定されるべき未知濃度の試験ドット、および、分析物のダイナミックレンジを包含する既知濃度の較正ドットの両方が、同時に、同じ試験流体サンプルに暴露される。層流は、これらの分析物の成分を、それぞれの結合部位の近くに効率的に配置し、それぞれの結合定数についての最適な付着動態学を促進する。

試験プラットフォームは、適切な波長での照射により活性化された場合、プラットフォーム上のドットに結合した蛍光標識のそれぞれの濃度を決定するために、リーダー内で試験される。好ましくは、最初に１０までの異なる濃度で分析物がプリントされた較正ドットは、動的な内部の真の用量応答曲線をもたらし、アッセイのための非常に正確な較正参照を提供する。未知濃度の試験ドットから得られる強度の読みは、この較正ラインと比較される。未知の試験濃度は、既知の較正スポットから得られたこの動的な内部の真の用量応答較正内に、正確かつ効率的に内挿する。

試験される各アッセイデバイスは、同様に、正確かつ再現性のある結果を提供し、プラットフォーム上での動的較正のための本発明の方法が、ヒトおよび動物についての臨床的な使用における、診断的な使用および分析物の検出のための、定量的アッセイならびに定性的アッセイの両方において、正確で、改良され、かつ、感度の良い分析物の測定を提供することを確実なものとする。この即時的かつ有意な利点は、これらのアッセイが、記載される方法（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ^ＴＭ）を用いて処理される場合に、外部に由来する較正標準を用いてこれらのアッセイを行うための現行の他の方法に関連して記載される誤差を反映しないことである。

同時に較正および試験する能力もまた、得られた測定値が正しいものであることを保証する、信頼水準を向上させる。本発明のこの方法論は、いくつかの異なる分析物の試験を、同じアッセイデバイス上で同時に行うことを可能にする。異なる分析物を試験するための複数のセットの試験ドットまたは試験アレイ、ならびに、異なる分析物についての複数のセットの対応する較正ドットまたは較正アレイが、同じアッセイデバイス上で同時に行われ得る。試験について９９％より良い信頼水準に到達するために、試験は、最低３回は行われる必要がある。異なる試験の複数のパネルがまた、単一の試験プラットフォーム上で、全て同時に、使用および実行され得る。本発明の驚くべき結果は、これらの試験における誤差が排除され、再現性が向上し、そして、あらゆる試験についてのダイナミックレンジが、必要とされる分析物の濃度範囲を包含するように容易に拡大され、感度および分散係数が、劇的に改善されることを示している。先行技術を上回るこれらの利点の組み合わせは、試験結果に対して、かなりの時間の節約をもたらす。本発明のフォーマットは、デバイスに依存しないものであり、そして、当業者により適用され得ることが、重要な利点である。

記載されるアッセイデバイスおよび方法は、事実上、代表的には、疾患プロセスに関連する診断用の臨床マーカーについて、分析物および／またはマーカーの濃度を正確に決定するための新規な定量的かつ高速の方法を意味する。迅速かつ正確なマーカー濃度の測定による即時性の利点は、疾患プロセスの指標としてのマーカー濃度（例えば、増加する濃度、安定な濃度、または、減少する濃度）の迅速かつ動的な検出、ならびに、薬物の効率を示すための、特定のマーカータンパク質を産生するための遺伝子発現の修正においてこの薬物の効率を迅速かつ定量的にモニタリングすることを可能にする。

（実施例１：定量的な蛍光イムノアッセイ）
サンドイッチイムノアッセイマトリクスは、目的の抗原に特異的な捕捉抗体と、分析物および免疫複合体を検出するための、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を結合体化した二次抗体とを組み込む。ヒトにおける妊娠のマーカーである、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）を、このプラットフォームアッセイの試験のための抗原として使用した。現在、この試験についての分析のダイナミックレンジは、５μＬのアッセイ用量で、１ｆｍｏｌ／μＬと１５０ｆｍｏｌ／μＬとの間（２８０〜３７，６００ｍＩＵ／ｍＬ）である。既知のＨＣＧ濃度と、このデバイスを用いたＨＣＧ濃度の計算値との比較は、値間での優れた一致性（図２、ｙ＝１．０７１７ｘ ＋ ９．９３１３）と、試験した各濃度についての平均値間での高い相関性（ｒ＝０．９７８６）を有する。図２は、デバイスプラットフォームに結合させた場合に、単一および凝集した免疫複合体が、定量化可能な蛍光を提供することの確認を示すグラフである。

（実施例２：種々のサンプル抗原濃度における抗原ドットの蛍光の測定）
アッセイの原理は、定量的、非競合的、かつ異種性のイムノアッセイに基づく。第一世代のデバイスに、標準曲線による自動較正のための減少濃度の一連の抗原ドットをプリントし；その後、捕捉抗体ドットをプリントした。抗原を含む試験サンプルを凍結処理し、それぞれの指示薬または色素に予め結合体化させた抗体を検出した。試験サンプルを、２分間標識と反応させ、次いで、チップアッセイデバイス内に分配し、これを、リーダーに挿入した。各ドットの蛍光強度を測定した。リーダーのソフトウェアは、既知の抗原濃度を有する捕捉抗体ドットの蛍光と、既知の濃度を有する真の用量応答標準曲線の蛍光とを比較し、そして、試験抗原の濃度を計算する。図３は、試験サンプルにおける抗原の濃度が、較正ドットにおける抗原の蛍光強度に影響を及ぼさないことを確認するデータを示すグラフである。

（実施例３：アッセイデバイスプラットフォームにおける高度なアレイプリンティング）
図４に示されるような、１００個の試験ドットを含む、４つの１０×１０のマトリクスの各々は、２．６ｍｍ×２．６ｍｍのプラットフォーム面積を使用した。ドットの中心間は、２６０μｍ離れていた。各スポットに分配される液滴の数は、１アレイマトリクスあたりのドットあたり、１〜４の液滴で増加する。チップアレイデバイスの読み取り面積全体は、８０００μｍ×８０００μｍであった。このプリンティングパターンは、プラットフォームの読み取りエリア上に１２００個のドットがプリントされることを可能にした。１回の試験あたり、最低５の液滴、較正３回、および２個の試験ドットで、各プラットフォームが２４０の試験を支持する。この技術は、ｆｍｏｌ／ｍｌの抗原検出感度と、較正曲線を最適にするために必要とされる試験マトリクスを多重化することを可能にすることによって、診断結果に最適な信頼性を得るための、多重試験アレイ数の増加とを可能にする。図４は、チップアッセイデバイスプラットフォームにおける高度なＰｉｃｏＴｉｐアレイプリンティング技術の例を提供する。

（実施例４：真の用量応答性アレイ測定を用いて較正した蛍光強度との、ヒト甲状腺ホルモン濃度の相関）
図５に示されるように、ヒト甲状腺ホルモン濃度を測定して、動的な内部の真の用量応答較正曲線を決定した。この試験は、真の用量応答が、試験したダイナミックレンジ全体にわたり、正確にプロットされたことを確認する。

（実施例６：１２の微生物に対する暴露に応答させた１２の異なる抗体についてヒト血漿を試験した場合の、多重フォーマットのレイアウト）
図６に示されるように、試験アレイを、各試験につき４つの濃度の、三連のアレイとしてプリントする一方で、較正アレイ（この場合は、ヒトＩｇＧ免疫グロブリンについて）は、６つの濃度で、三連にてプリントする。４ドット×５ドットのアレイを用いて、蛍光標識（Ｄｙ６４７）の応答を２進コード様式で測定し、読み取りデバイスに挿入したときに、このアッセイプラットフォームの同一性を確認した。

当業者は、多くの上記の本発明の実施形態に対する等価物を認識するか、または、１以上の慣用的な実験を用いて、これらを確認することができる。このような等価物は、添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。

図１は、固定アレイ試験を実施するための、本発明のアッセイデバイスの平面図である。 図２は、単一免疫複合体および凝集免疫複合体が定量可能である証明を示すプロットである。 図３は、試験サンプルにおける抗原濃度は、較正スポットにおける蛍光強度に影響しないことを示すプロットである。 図４は、ＰｉｃｏＴｉｐアレイプリンティング、スポットサイズ、およびアレイマトリックスの図示である。 図５は、動的な真の用量応答測定を使用した、分析物濃度と蛍光との相関を示すプロットである。 図６は、ヒトの血漿に存在している微生物に対する、各抗体反応の存在について試験するためのアッセイデバイスの平面図である。

Claims (20)

1. サンプルにおける分析物の量を決定する方法であって、該方法は、以下：
   （ａ）表面を有するアッセイデバイスを提供する工程であって、該表面は、該表面上にプリントされたマイクロアレイを有し、該マイクロアレイは、複数の較正ドットおよび少なくとも１つの試験ドットを有し、該較正ドットは所定の量の該分析物を含み、該試験ドットは該分析物への結合のための第一の試薬を含み、該第一の試薬は該表面上に固定されている、工程；
   （ｂ）該分析物に特異的な第二の試薬を含む溶液を提供する工程であって、該第二の試薬は、検出可能なマーカーで標識されており、該サンプルおよび該較正ドットに存在する分析物の量と比較して過剰量で提供される、工程；
   （ｃ）該サンプルを該溶液に導入して混合し、予め混合されたサンプル溶液を形成する、工程；
   （ｄ）該予め混合されたサンプル溶液を、該アッセイデバイスの該表面上にプリントされた該マイクロアレイ上に導入する工程；
   （ｅ）該較正ドットの各々において、該検出可能なマーカーの強度を測定する工程；
   （ｆ）該検出可能なマーカーの該強度に対する該較正ドットの各々における分析物の量に相関する較正曲線を作成する工程；
   （ｇ）該試験ドットにおける検出可能なマーカーの強度を測定する工程；ならびに
   （ｈ）該較正曲線において、該試験ドットにおける該検出可能なマーカーの該強度と、該強度に対応する分析物の量とを比較することによって、該試験ドット中に存在する分析物の量を算出する工程；
   を包含し、ここで、工程（ａ）において、該分析物および該第一の試薬は、工程（ｄ）における該予め混合されたサンプル溶液の導入の前に該表面上に固定されている、方法。
2. 前記第一の試薬は捕捉抗体であり、前記第二の試薬は前記分析物に特異的に結合する抗体である、請求項１に記載の方法。
3. 前記アッセイデバイスは、前記予め混合されたサンプル溶液を受容するための充填部分および読み取り部分を有し、該読み取り部分は、該読み取り部分上にプリントされた前記複数の較正ドットおよび該読み取り部分上にプリントされた前記試験ドットを有する、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 前記較正ドットは、１ピコリットル〜１マイクロリットルの範囲の容量でプリントされている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記容量が、１ピコリットル〜４ピコリットルの範囲である、請求項４に記載の方法。
6. 前記較正ドットは、１ピコメートル〜１２ミリメートルの範囲の長さでプリントされている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記較正ドットは、２５マイクロメートル〜３００マイクロメートルの範囲の長さでプリントされている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記較正ドットは、所定のＸ−Ｙ座標にアレイでプリントされている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記較正アレイは、所定の濃度でプリントされている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記較正ドットは、試験基質のダイナミックレンジを包含する濃度でプリントされ、該ダイナミックレンジは、前記試験サンプルごとに見出される、請求項１に記載の方法。
11. 前記較正アレイは、試験基質のダイナミックレンジを包含する濃度でプリントされ、該ダイナミックレンジは、前記試験サンプルごとに見出される、請求項１に記載の方法。
12. 前記アッセイデバイスの表面は、実質的に平面である、請求項１に記載の方法。
13. 前記較正ドットは、前記分析物のダイナミックレンジに対応する該分析物の濃度を有する、請求項１に記載の方法。
14. 前記較正ドットは、三連以上の試験を行うために、少なくとも３つのアレイで配列されている、請求項１に記載の方法。
15. 前記試験ドットは、三連以上の同じ試験を行うために、少なくとも３つのアレイで配列されている、請求項１に記載の方法。
16. 前記試験が、同じものであっても、異なったものであってもよい、請求項１４または１５に記載の方法。
17. 単一の試験において単一の分析物が、前記アッセイデバイスにおいて測定される、請求項１に記載の方法。
18. 同一の試験に対して、複数のアレイにおいて単一の分析物が、前記アッセイデバイスにおいて測定される、請求項１に記載の方法。
19. 異なる分析物が、前記アッセイデバイス上で同時に測定される、請求項１に記載の方法。
20. 複数の異なる試験における複数の異なる分析物が、前記アッセイデバイスにおいて同時に測定される、請求項１に記載の方法。

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