CN101044402B - 测量动态内部校准真值剂量反应曲线的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种测定样品溶液中被分析物的量的方法。该方法包括使用一种具有基本上是平的测定表面的测定装置。在该表面上印制有多个校准点、一个测试点。校准点含有预定量的被分析物，而测试点包括用于结合被分析物的捕获抗体。被分析物被混入具有用于被分析物的样品抗体的溶液中，其中抗体用可检测的标记物标记。将样品溶液引入测定装置的装载部以输送至所述读数部。下一步骤为测量校准点中可检测标记物的强度。然后，利用获得的数据，绘制所述校准点中被分析物的量与所述可检测标记物的强度的相互关系的校准曲线。可以测量测试点中可检测标记物的强度，通过比较可检测标记物的强度与所述校准曲线中强度相应的被分析物的量计算所述测试点中存在的被分析物的量。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定装置以及制造所述测定装置的方法，所述测定装置用于检测生物样品中存在的被分析物及其含量。
背景技术
免疫测定的质量标准在传统上由外部校准参照标准带动(driven)。当前用于典型免疫诊断测定的分析方法提供了基于通常接受的外部标准参照测量的诊断测试结果。当进行测定时，许多公知的差异已经显然地导致定量误差，这导致测试结果的变化。例如，测定灵敏度的测量通过基于下述测量的标准的统计分析描述灵敏度：反复测量低浓度的样品以确定样品结果在统计上不为零。由于产生的标准误差与实际测量数的平方根成反比，该方法不实际测量固有的测定灵敏度。进一步的改进已经获得一些改善。在本技术领域称为分析灵敏度的零点标准被测量几次并且灵敏度限度成为等于自M(平均值)等于2-3SD(标准偏差)的浓度。然而，该理论上确定的精密度的不正确程度可达一个数量级。任何导出的外部校准曲线的伴随配合线不产生真值动态剂量反应曲线，这在实际的灵敏度中导致相当大的误差。
为了进一步测量该分析测量的精确性，精确度被用于限定平均测量值与真值的接近。测量上的差异被认为是偏差或精确程度。偏差可以超过测定的范围。本技术领域中用于测量该真值的方法需要发展。
测定的可复验性或在分析测定中估计的误差在本技术领域中被称为变异系数百分比(％CV)。样品的浓度、温度、热以及边缘效应的变化、颗粒的不完全悬浮以及固相沉淀可以影响自动测定分析机器。分级分离(fraction separation)以及计算误差也影响精密度结果。在光学系统中，由于浊度的影响、荧光团的存在、灯以及检测装置的老化以及试剂随着时间的老化会产生误差。这些因素通常引起信噪比的显著降低。差的吸量作用(pipetting)以及仪器的准备周期可引起机械操作误差。 作为直接的结果，用于任何分析方法的精密度的评估均要求使用限定的或标准的对照溶液测量已知以及有关的浓度的变异性以产生基线校准标准。这种校准器的精确测定基于测量在预定的间隔的系列稀释的已知浓度，然后将其以内插值替换。可以使用商品参照溶液以及自行制备的参照溶液或参照标准，但通常使用标准的或共有的基质(pooledmatrices)校准，这些基质可能与实际的病人测试样品相差甚远。克服这些误差的部分解决方案为在宽浓度范围内绘制精密度图以获得精密度分布图或测定的校准。
交叉反应、测定专一性、偏差引起的干扰、抗原、抗体、结合部位的改变、低剂量(竞争测定)以及高剂量(三明治夹心测定)钩状效应(hook effects)、异嗜性抗体干扰、内源性干扰的自体抗体、补体、类风湿因子、固相抗体结合中的干扰、内源信号发生物质、酶抑制剂、催化剂以及辅助因子也已经被显示出表现测定中的混杂活性(confoundingactivity)，该混杂活性包括交叉反应、基质效应以及自动免疫测定仪器与取样器中样品的遗留物(carry over)。
对于诊断应用而言，质量控制的样品可能不反映病人体内的实际临床浓度，可能不反映处理中的被分析物的光谱并且干扰样品基质而不再反映病人样品的含量。质量控制的样品可以测量不同浓度差的性能，该性能可能不反映临床决定要点。
因此，需要一种能可靠地校准的免疫测定。
发明内容
本发明涉及一种测定装置的内部动态校准方法，所述测定装置具有测定表面，用于确定样品中被分析物的浓度。含有预定量的被分析物的多个校准点印制在测定表面上。含有用于与所述被分析物结合的试剂的测试点也印制在测定表面上。在引入测定装置之前，用可检测的标记物复合物标记被分析物。被分析物-可检测的标记物复合物在测试点与试剂结合。样品中抗原的量与测试点中可检测的标记物的强度成比例。校准点含有不同预定量的被分析物。任何未标记的可检测的标记物将与校 准点结合。这样，获得一条内部校准的校准曲线。测试点中可检测的标记物的强度可以与该校准曲线比较以获得一绝对值。
该方法提供了一种通过使用一单个测定装置迅速实施的定量分析，为了满足作为每测试量的被分析物浓度的函数的被分析物的已知浓度，该测定装置具有含有已知最少量的测试流体的能力，也具有使流体流过该装置的能力。校准点以及测试点都印制在一单个测定装置内，从而该测定装置只需涂覆一单一的、含有被分析物以及过量的优选地为抗体的检测试剂的预混合溶液。
本发明还包括一种通过在一共同的测试平台装置上印制校准物以及测试样品而获得动态真值剂量反应曲线的方法。该测试平台至少具有一个测试点。每个测试点具有多个相应的校准点。将在标示的X/Y坐标处获得的比较浓度动态校准点的总数的信号集合以形成动态内部校准真值剂量反应曲线。在类似的处理中，未知的测试点标记反应读数也通过所有获得的读数集合。使用平台形式的多重测试阵列或矩阵意味着已获得正确测试结果时接近100％的置信限度。共同的测试平台与相同的测试流体接触，并且由于校准物及测试样品与相同的测试流体同时接触，通过产生的真值剂量反应校准曲线确定测试样品中存在的被分析物浓度的精确测量。本发明提供了意料不到的结果：当使用该披露的方法以及装置处理测试样品时，未出现使用已知技术中的方法所导致的各种误差。
根据本发明的一方面，提供了一种测定样品溶液中被分析物的量的方法，该方法包括下述步骤：
●准备一种测定装置，该测定装置具有一测定表面，所述测定表面上印制有多个校准点以及一个测试点，校准点含有预定量的被分析物，测试点含有用于与所述被分析物结合的试剂；
●准备一种含有用于与被分析物结合的试剂的溶液，所述试剂用可检测标记物标记；
●将被分析物引入所述溶液以形成样品溶液；
●将所述样品溶液引到所述测定装置上；
●测量所述校准点中可检测标记物的强度；
●绘制所述校准点中被分析物的量与所述可检测标记物的强度的相关性的校准曲线；
●测量所述测试点中可检测标记物的强度；以及
●通过比较可检测标记物的强度与所述校准曲线中所述强度对应的被分析物的量计算所述测试点中存在的被分析物的量。
附图说明
图1是用于实施固定阵列测试的本发明的一种测定装置的俯视图；
图2所示证实：单一的以及集合的免疫复合物是可以计量的；
图3所示说明：测试样品中的抗原浓度不影响校准点中的荧光强度；
图4是PicoTip阵列印制、点大小以及阵列矩阵的图解；
图5所示说明了使用动态真值剂量反应测量的被分析物浓度与荧光的相互关系；以及
图6是用于测试与人体血浆中已存在的微生物反应的各个抗体的存在性的测定装置的俯视图。
具体实施方式
本方法用于校准一种测定装置。图1示出了一种优选的测定装置。该测定装置具有一个测定表面10，该表面优选地包含一个装载区域18以及一个读数区域16。在读数区域16上至少印制一个、优选地至少印制两个测试点20。更优选地，检测被分析物存在的多个点印制在读数区域16上。测试点20包括与蛋白质被分析物特异地结合的试剂。优选地，该试剂是与被分析物特异地结合的结合抗体。也可以使用本技术领域中已知的结合特异被分析物的其它试剂。在本发明的下述讨论中，试剂所指的将是一种抗体。
该结合抗体优选地在空间上隔开以使各个结合抗体可以在没有与相邻的抗原复合体发生空间位阻的情况下与测试抗原结合。优选地，不反应的蛋白质在测试点将结合抗体隔开。
读数区域16上印制有校准点22。该校准点包括预定量的所述被分析 物，以用于与未反应的与可检测的标记物结合的、在器具中的试剂反应。校准点可以使所述标记的强度与存在的抗原的量相关。因而，测试点中的标记强度可用于获得存在的抗原的量。
校准点具有与被分析物的动态范围相一致的被分析物的浓度。该动态范围是病人中通常发现的被分析物浓度。定量需要在最低浓度与最高浓度的范围内并且与临床有关的浓度相关。
与当前用于免疫测定的典型方法相关联的许多问题源自通过引入用于校准的外部标准参照样品确定的测定校准。通过不使用这些标准的外部校准样品，本发明方法提供了更精确的结果。
在开发用于测量各分析物数量的平台装置时，校准点以及未知浓度的测试点都被印制在相同的测试平台上，未使用外部标准以产生校准线或基线。校准测试点以已知浓度的被分析物印制。测试点也以预定的X-Y位置被印制，该测试点只包含捕获试剂，该捕获试剂优选地为一种特异于用于测试中的被分析物的抗体。然后，将测试样品与过量的、优选为抗体的标记物试剂和被分析物结合。标记物抗体之前与一个单独的、在适当波长(例如，650纳米)发光的荧光标记物结合。然后，使用层流使标记抗体/抗原复合物以及游离的、剩余的标记物抗体流过测试平台。然而，本领域普通技术人员可以理解也可以使用不依赖于层流的其它测定装置。例如，为了本发明的目的，也可以应用一种导管形式的装置，其通过扩散限制的动力学，抗体/抗原复合物以及剩余的游离标记物抗体流过该装置。
在此种方式中，标记抗体/未知浓度的抗原复合物被捕获抗体测试点结合，而游离的标记抗体与已知浓度的预印制抗原点结合。待测量的未知浓度的测试点以及包含被分析物动态范围的已知浓度的校准点同时与同样的测试流体样品接触。层流有效地将被分析物组分置于各个结合部位的附近以增大各个缔合常数的最佳附着动力。
当由适当波长的辐射激活时，在读数器中检查测试平台以确定与平台上的点相结合的各个荧光标记物的浓度。校准点，优选地最初印制被分析物达十种不同的浓度，产生一动态内部真值剂量反应曲线，该曲线 为测定提供非常准确的校准参照。由未知浓度的测试点读取的强度与该校准线进行比较。该未知测试浓度准确地且有效地插入由已知的校准点获得的动态内部真值剂量反应校准中。
测试的每一测定装置提供类似的准确且可再现的结果，该结果确认用于平台上动态校准的本发明方法提供一种准确的、提高的且灵敏的确定被分析物的方法，该方法用于人类以及动物临床应用中的诊断使用以及被分析物的检测的定量测定和定性测定。该直接且显著的益处说明当使用所描述的方法(动态内部校准TM)处理时，这些测定没有表现出所描述的由当前使用的源自外部校准标准的其它方法进行这些测定时所产生的误差。
可以同时校准与测试的功能也提高了确保获得的测量值是真值的置信水平。本发明的方法允许在同一测定装置上同时进行几种不同的被分析物测试。用于测试不同被分析物的几套测试点或测试阵列以及用于不同被分析物的多套相应的校准点或校准阵列可以在同一测定装置上同时进行。为了达到优于99％的测试置信水平，该测试需进行至少三次。也可以在一单个测试平台上同时使用和进行多组不同的测试。本发明的出乎意料的结果证明测试中的误差消除了，可复验性提高了，用于任何测试的动态范围被容易地延伸至包括必需的被分析物浓度范围，显著地提高了灵敏度以及变异系数。相对于现有技术的这些优点的集合也相当多地节省了测试结果的时间。一个重要的优点在于本发明的形式为独立的装置并且可以由本领域普通技术人员应用。
所描述的测定装置和方法有效地阐述了一种用于被分析物和/或标记物浓度准确测定的新颖的、定量的以及快速的方法，通常用于与疾病处理相关的诊断性临床标记物。标记物浓度的迅速、准确测量的直接好处是允许标记物浓度的迅速的动态检测，该标记物浓度作为诸如提高、稳定或降低浓度的疾病处理的指标；也允许用于在生产特异标记物蛋白质的修饰基因表达中迅速地定量监测药效以指示药效。
实施例
实施例1：定量荧光免疫测定
三明治夹心免疫测定基质采用了一特异于感兴趣的抗原的捕获抗体以及一用于检测被分析物和免疫复合物的结合有荧光的二级抗体。人体绒膜促性腺激素(HCG)是人体怀孕的一个标志物，其在该平台测定中作为用于测试的抗原。当前，该测试的动态分析范围在使用5μL的测定体积时在1至150fmol/uL(280-37,600mIU/mL)之间。使用该装置计算的HCG浓度与已知的浓度比较，在数值之间(图2，y＝1.0717x+9.9313)具有极好的一致性，并且在各个测试浓度的平均值之间具有高度的相关性(r＝0.9786)。图2所示图形表明：当与该装置平台结合时，单一的以及集合的免疫复合物提供了可计量的荧光。
实施例2：在各种样品抗原浓度测量抗原点荧光
测定原理是基于定量的、非竞争性的、异质的免疫测定。第一发生(generation)装置印制有用于标准曲线自动校准的浓度递减的一系列抗原点；这些抗原点之后是捕获抗体点。含有抗原的测试样品用已经结合了各自的指示剂或染料的冻干检测抗体处理。该测试样品与标记物反应2分钟，然后被分配入待嵌入读数器中的芯片测定装置中。测量各点的荧光强度。读数器软件将未知抗原浓度的捕获抗体点的荧光与已知浓度的真值剂量反应标准曲线的荧光比较、计算测试抗原的浓度。图3所示数据证实了：测试样品中的抗原浓度不影响校准点中抗原的荧光强度。
实施例3：印制在测定装置平台上的高级阵列
如图4所示，含有100个测试点的四个10×10矩阵各使用2.6mmx2.6mm平台区域。点至点的中央至中央的间隔为260μm。在每斑点散布的小滴数目的增量为每阵列矩阵每点1至4小滴。总的芯片测定装置读数区域为8000μmx10000μm。该印制模式允许在平台读数区域上印制1200点。每次测试最少具有5个点，3个用于校准，2个用于测试点，每个平台支持240次测试。该技术优点允许fmol/ml的抗原检测灵敏度以及为了通过能倍增需要的测试矩阵以使校准曲线最优化而获得诊断结果中的最佳置信度，增加多元测试阵列数目。图4提供了在芯片测定装置平台上的高级PicoTip Array印制技术的图解。
实施例4：使用真值剂量反应阵列测量校准的荧光强度与人体副甲状腺荷尔蒙浓度的相关性
如图5所示，测量人体副甲状腺荷尔蒙的浓度以确定动态内部真值剂量反应校准曲线。该测试证实：该真值的剂量反应在测试的整个动态范围内精确地绘制。
实施例5：当测试人体血浆中12种不同抗体与12种微生物接触反应时，多元格式的布局
如图6所示，测试阵列以每次测试的四种浓度被印制成三重阵列，而在人体I gG免疫球蛋白的情形下，校准阵列在6种浓度以三重阵列印制。4点×5点阵列被用于以二进位编码形式测量荧光标记物(Dy647)的反应以当测定平台被嵌入读数装置时确定该测定平台的特性。
本领域普通技术人员将认识到或可以确定：仅仅通过常规的实验，可以得到许多上述本发明实施方案的等同实施方式。这些等同实施方式是意图包括在下述权利要求范围之中的。
Claims (19)
1.一种测定样品中被分析物的量的方法，所述方法包括下述步骤：
●准备一种测定装置，该测定装置具有一表面，所述表面上印制有多个校准点以及一测试点，所述校准点含有预定量的被分析物，所述测试点含有用于与所述被分析物结合的试剂；
●准备一种含有特异用于被分析物的样品试剂的溶液，所述样品试剂用可检测标记物标记；
●将所述样品引入所述溶液中，以形成样品溶液；
●将所述样品溶液引到所述测定装置上；
●测量所述校准点中可检测标记物的强度；
●绘制所述校准点中被分析物的量与所述可检测标记物的强度的相关性的校准曲线；
●测量所述测试点中可检测标记物的强度；以及
●通过比较可检测标记物的强度与所述校准曲线中所述强度对应的被分析物的量计算所述测试点中存在的被分析物的量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂是捕获抗体，并且所述样品试剂是与所述被分析物特异结合的抗体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述测定装置具有用于接收样品溶液的装载部以及读数部，在所述读数部上印制有所述多个校准点以及印制有所述测试点。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述校准点在1微微升至1微升的体积范围内印制。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体积范围为1微微升至4微微升。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述校准点在1微微米至12毫米的量范围内印制。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述校准点在25微米至300微米的量范围内印制。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述校准点以预定的X-Y坐标印制在阵列中。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述校准阵列在预定的浓度印制。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述校准点印制所用的被分析物的浓度范围包含根据测试样品待发现的测试基质的动态范围。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述校准阵列印制所用的被分析物的浓度范围包含根据测试样品待发现的测试基质的动态范围。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定装置的表面是平的。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述校准点具有与被分析物的动态范围相一致的被分析物浓度。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述校准点布置在至少三个阵列中，以实施测试的三次或更多次重复。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测试点布置在至少三个阵列中，以实施相同测试的三次或更多次重复。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单个测试中的单个被分析物在所述测定装置上测量。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述相同测试的多个阵列中的单个被分析物在所述测定装置上测量。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，不同的被分析物在所述测定装置上同时测量。
19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，多次不同测试中的多种不同的被分析物在所述测定装置上同时测量。
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