CN1472527A

CN1472527A - 多标志物生物芯片信号分析系统

Info

Publication number: CN1472527A
Application number: CNA021363706A
Authority: CN
Inventors: 胡赓熙
Original assignee: SHUKANG BIO-TECHNOLOGY Co Ltd SHANGHAI
Current assignee: Shanghai Changrun Biotechnology Co ltd
Priority date: 2002-08-02
Filing date: 2002-08-02
Publication date: 2004-02-04
Anticipated expiration: 2022-08-02
Also published as: AU2003211848A1; WO2004013627A1; CN1255671C

Abstract

本发明涉及多标志物生物芯片信号分析系统，该系统包括图像采集系统、图像处理系统、数据分析和输出系统；本发明分析系统作为生物芯片检测系统的配套分析系统，当生物芯片检测系统的反应完成后，芯片上的特定位置产生发光信号，通过致冷型CCD(cool CCD)同时拍摄多个生物芯片上的光信号，并将其转化为图像数据，传输至计算机并对信号进行一系列数据分析，根据各标准品中所含各标志物的浓度值求得未知样本中各标志物的浓度值，并将求得值以报表的形式输出。本发明信号分析系统实现了对多个生物芯片(每个生物芯片上有多个被测物质的信号)的信号进行同时读取和计算，极大地节省了数据分析时间。该信号分析系统可靠稳定，适用范围大，不仅可用于生物芯片试剂盒临床应用时的定量仪器，还可与其它生物芯片结合使用。

Description

多标志物生物芯片信号分析系统

技术领域：

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种多标志物生物芯片的信号分析系统。

背景技术：

生物芯片技术是二十世纪九十年代中期兴起的一种新型生物学技术。它以生物大分子(核酸、蛋白质等)间相互作用的大规模并行分析方法为基础，结合微电子、微机械、化学、物理、计算机等多领域的技术，将生命科学研究中所涉及的样品反应、检测、分析等过程连续化、集成化、微型化，已成为当今生命科学研究领域发展最快的技术之一。目前国际上已经有几家大公司如PACKARD公司、HP公司、GENERAL SCANNING公司和TELECHEN公司等都在开发生物芯片检测分析系统，并在点样、芯片检测、数据采集和处理等若干方面做出了重大贡献。这些设备性能优良、操作简单方便，但是价格昂贵。国内对这类仪器的开发仍处于研究阶段，因而有必要对系统的性能进行改进和提高。

同时，在生物芯片的应用中，特别是表达谱芯片的应用中，由于很多情况下是针对被测物的表达量变化进行测定，而非对表达与否进行测定，所以需要一种检测芯片检测物的定量系统。而现有的很多芯片检测系统都是基于对表达与否进行检测，即定性的检测，并不适用于定量检测。

CCD(电荷耦合器件)图像传感器用一种高感光度的半导体材料制成，能把光信号转变为电信号，再由模数转换器芯片转换成数字信号。在同样的最大拍摄图像的分辨率下，CCD的分辨率越大越好。从理论上讲，任何放大电路都存在热噪声。减小热噪声，提高信噪比的最好办法是将感光片和放大电路置于低温的环境中。以往的芯片研究中通常使用荧光发光的方法，其生成的图像亮度低、对比度低，不利于读取。由于生物芯片的一个特性是微量的生物信号，信号的绝对值通常很弱，在这样的情况下，提高信号读取仪器的信噪比是必要的。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是通过化学发光方法，采用CCD图像传感器、X-Y-Z-θ定位装置及软件系统，提供一种重现性好，可定量检测、定量分析待测液浓度的多标志物生物芯片信号分析系统。

本发明公开的多标志物生物芯片信号分析系统是与生物芯片检测系统配套使用的分析系统，其中生物芯片检测系统包括多个生物芯片、多个标准品、质控品、反应液、洗涤液、检测液；多标志物生物芯片信号分析系统包括图像采集系统、图像处理系统、数据分析和输出系统；图像采集系统包括CCD摄像系统和光密封的X-Y-Z-θ定位装置；图像处理系统和数据分析输出系统由软件构成，图像处理系统可实现本底处理、调整对比度、放大缩小、旋转、填充(杂点去除)、直方图显示、畸边校准和Morphological等多项功能；数据分析和输出系统可实现生物芯片上各标志物的信号-浓度标准曲线的制作，测试样品中各标志物浓度的定量及报表输出。

本发明信号分析系统是通过下述步骤实现对芯片检测系统的定量分析：

1)芯片检测系统的各组分进行反应：将未知样本、各标准品和质控品(溶液或冻干品复溶液)均加入生物芯片与之反应，洗涤后再分别加入反应液进行反应。检测液加入到与反应液反应后的生物芯片中，使芯片上的特定位置产生发光信号。

2)通过信号分析系统中的致冷型CCD(cool CCD)同时拍摄多个生物芯片上的光信号，并将其转化为图像数据，传输至计算机并对信号进行一系列数据分析，根据各标准品中所含各标志物的浓度值求得未知样本中各标志物的浓度值，并将求得值以报表的形式输出。

针对芯片光信号较弱的特点，本发明的CCD摄像系统中所用CCD为致冷型(cool CCD)。cool CCD在低温状态(低于0℃)正常工作，与一般CCD相比，cool CCD拍摄的图像噪声低，所以分辨率和灵敏度高，且信噪比更好。

常见的图象处理系统中，CCD进行拍摄时，与X-Y-Z三维定位装置配合使用，X-Y平面调节被测物的水平位置，Z方向调节被摄物与镜头的距离。而在本发明中，首次使用X-Y-Z-θ定位装置，X-Y和Z的含义不变，但增加了在水平面上对被摄物的角度旋转的调节功能。由于生物芯片信号分析系统用于对大量信号的同时拍摄和分析，所以各信号所在位置若有所变化，会使得分析变得困难，严重时会导致数据的错误。

本发明中的θ定位装置是用蜗轮蜗杆的原理简化后形成的，将直线运动转换成圆周运动的一种结构，对平面上的方位进行角度调节，可实现-30度到+30度的调节范围。

本发明系统中数据分析的软件对未知样本进行定量的原理为：通过读取对与各标准品反应的生物芯片上信号值，建立标准品中各标志物浓度与相应的生物芯片上信号值之间关系的曲线，再通过读取未知样本的相应信号值计算未知样本的浓度。

下面对本发明系统中各部分功能作进一步描述：

1、图像采集系统：对芯片检测进行参数设置，并拍摄图象。

2、图象处理系统：可实现本底处理、调整对比度、放大缩小、旋转、填充(杂点去除)、直方图显示、畸边校准和Morphological等多项功能。主要实现以下三个功能：

1)将选定的图象区域进行放大；

2)增大图象的对比度；

3)对图象上有杂点处进行杂点去除。

3、数据分析和输出系统

1)作标准曲线

根据各标准品中每个标志物的浓度值、在生物芯片上的相应信号值，作各标志物的“信号-浓度”标准曲线。

2)对未知样本中各标志物浓度的定量

采用大模板对多个子阵列进行一次定位，再采用小模板对每个子阵列的样本进行定位。取每个样本信号中最亮的4个象素灰度平均值作为各点的信号值，从图像中获取信号值，由标准曲线得到浓度值。

3)报表输出

在Excel中以报表的形式给出每个未知样本中各标志物含量的测定结果。

为实现上述功能，本发明检测分析系统采用的软件以VC为技术平台。具体实现方法如下：

1.获取图像

本发明所述系统设置曝光时间为10秒至5分钟中的一个定值，一般为15秒或60秒。实现方法为：从图1所示的曝光时间设置对话框中输入曝光时间m_ExpTime，传给变量exposure_time，由函数PICM_SetExposure(exposure_time，&error)来实现曝光时间。

本发明所述系统设置CCD温度为-10℃到-50℃的任何一个值，一般为-20℃。实现方法为：从图2所示的温度设置对话框中输入设置的温度setTmp，由函数PICM_Set_Temperature(setTmp)来控制CCD温度。

在“获取指令”下由摄像系统获取芯片图像，存贮在计算机中。(在购买CCD时，厂家提供的图象采集卡中软件即具备此功能。)

2.图象处理

在“图象变换”指令下按需要主要执行“放大”、“对比度增强”等指令，来调整图象显示的大小、对比度等，必要时用“填充”指令去除芯片图象中的异常点。实现方法如下：

1)放大

先用鼠标选定要放大的图象区域，计算x、y方向的放大倍数tx＝子窗口宽度rectClient.right/选定图象的宽度，ty＝子窗口高度rectClient.bottom/选定图象的高度，图象放大倍数m Scale取tx，ty中较小值；

计算选定区域放大前的中心位置Centerl，则放大后的中心位置为Center2＝Center1*m_Scale，图象放大m_Scale倍后，视图滚动条需水平滚动Scrollpt.x＝Center2.x-rectClient.right/2，垂直滚动Scrollpt.y＝Center2.y-rectClient.bottom/2。

2)调整对比度

①用鼠标选定要调节对比度的区域，计算区域中象素的个数nValidPixel，将这nValidPixel个象素的灰度值放在nSort中，用函数heapsort(nSort，nValidPixel)按灰度值大小对nSort排序，取第95％个象素的灰度值作为上限，dSMax＝nSort[(0.95*nValidPixel-1)]，取第5％个象素的灰度值作为下限，dSMin＝nSort[0.05*nValidPixel]；

②计算图象显示时的灰度值mybits(取值0~255)，若图象原始灰度值data(0~4095)大于dSMax，则mybits＝255；若小于dSMin，则mybits＝0；否则按图12所示的直线计算mybits的值，即mybits＝(int)(*data*dA+dB)，dA＝255.0/(double)(dSMax-dSMin)，dB＝-dA*dSMin。

3)填充

对于杂点进行填充处理，先用鼠标选定杂点区域，用值SpotValue来替填充该区域，SpotValue的计算方法是：在选定的杂点区域外(3个象素宽度)，找灰度值在40~150之间的象素，取这些象素的平均值作为SpotValue，若点的个数为0，则SpotValue取80。

3.数据分析和输出(工作界面见图3)

1)作标准曲线

实现方法是建立指标对话框。当分析对象涉及x个指标(分别为指标1、指标2、……、指标x)时，在对话框中输入各种指标的浓度值，依次赋值给变量m_指标1、m_指标2、……、m_指标x，输入各浓度梯度值，存到数组StandardC[x][n](n指浓度梯度的数量)中，再从图像中读出各标准品的信号值，方法是：用小模板给每个标准品阵列定位，调节该模板的阵列行数、列数、行间距、列间距、模板大小、模板位置使定位后的模板所有方格刚好固定了一个生物芯片的所有信号点，且每个小方格只含有1个信号点。取每个小方格中最亮4个象素灰度平均值作为各点的信号值StandardPixAve[i][SD]，根据浓度值、信号值分别拟合出x种标志物的标准曲线，拟合方式见图13，对应于各浓度梯度Ci，拟合出的信号值记为Huidu[i][SD]，对每个肿瘤标志物可使用不同拟合方式，如x＝ay²+by+c，y＝a lg(x)+b，y＝a+bx^c/(1+dx^c)等(其中x为浓度值，y为信号值或x为信号值，y为浓度值)；也可使用多种拟合方式的组合。

2)对未知样本中各肿瘤标志物浓度的定量

本软件运行时既可对单个未知样本(对应于一个生物芯片)的信号进行分析，也可对多个未知样本(对应于多个生物芯片)的信号进行分析。它们的实现方法略有不同。

若一次只处理单个未知样本：用小模板给每个未知样本对应的阵列定位(该模板阵列行、列，大小、位置均可调)，取每个小方格中最亮4个象素灰度平均值作为各点的信号值StandardPixAve[i][SD]，根据前述2作出的标准曲线的方程，计算出各点的浓度值。

若一次性处理多个未知样本：假设样本数是48个，排列为6*8个子阵列。

(1)调整大模板的大小，同时上下左右移动其位置，使其与图像的各个阵列大致重叠，以该模板中48个方格的左上角坐标位置作为每个子阵列的理想位置LS_IdealPoint[i][j]，然后用小模板对每个子阵列定位。

(2)小模板定位后，会出现定位信息对话框，见图11，点击对话框的“定位”按钮，保存该模板左上角的坐标，作为该子阵列的实际坐标位置LS_ActualPoint[i][j]，计算并搜索该坐标距离最近的LS_IdealPoint[i][j]，设定其为该位置的阵列(如A1子阵列)，隐藏该阵列所对应的按钮，据此方法依次给每个子阵列定位。

(3)由记录的LS_ActualPoint[i][j]，一次性计算出每个子阵列的信号值，由信号值得出浓度值，见3.数据分析部分；

(4)将各个子阵列各个指标的浓度值全部输出在Excel中，用每个子阵列的位置代表每个子阵列和其样本来源。

本发明系统的工作流程见图4。

本发明生物芯片信号分析系统重现性好，稳定可靠，操作简便直观，具有很高的实用价值。特别是该信号分析系统能对多个生物芯片(每个生物芯片上有多个被测物质的信号)的信号进行同时读取和计算，极大地节省了数据分析时间。该分析系统不仅可用于蛋白芯片试剂盒临床应用时的定量仪器，还可与其它生物芯片结合使用。

下面结合实施例对本发明检测分析系统作进一步的描述。

附图说明：

图1.曝光时间设置对话框

图2.温度设置对话框

图3.软件的工作界面

图4.软件操作流程框图

图5.对比度调整前芯片信号图像举例

图6.对比度调整后芯片信号图像举例

图7.多个阵列大模板定位举例

图8.各子阵列小模板定位举例

图9.拟合的标准曲线举例

图10.以报表形式输出的检测结果报告单举例

图11.定位信息对话框

图12.对比度变换曲线

图13.标准曲线拟合流程

具体实施方式：

用于检测12种肿瘤标志物浓度的生物芯片信号分析系统。配套计算机的配置为：PentiumIII 600处理器，256M内存，20G硬盘，256色SVGA，操作系统为Windows98，应用软件为Office97及本发明所述生物芯片图像分析系统软件。

所述系统作为48人份“多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统”的配套设备，可同时对血清中AFP、PSA、free-PSA、HGH、β-hCG、CEA、NSE、CA19-9、CA242、CA15-3、CA125、Ferritin等12种临床常用的肿瘤标志物含量进行定量测定，不仅提高了对单种肿瘤的诊断准确度，并且实现了对多种肿瘤的联合辅助诊断。该系统不仅应用于临床对肿瘤的检测，更适用于对无症状人群的肿瘤普查。

此系统使用时需要先设置：CCD温度为-20℃，曝光时间为60秒。然后对反应结束的48人份“多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统”进行拍摄。对拍摄后的图象依次进行放大、对比度调整(见图5.对比度调整前芯片信号图像举例、图6.对比度调整后芯片信号图像举例)、对6*8阵列同时定位(见图7.6*8的大阵列定位)、对各子阵列的信号定位(见图8.信号排列为5*5的子阵列定位))、作标准曲线(见图9.以二次方程拟合的CA125标准曲线)、计算未知样本中12个肿瘤标志物各自浓度、数据输出(见图10.与A1位置的芯片反应的样本中12个肿瘤标志物浓度显示)。

Claims

1.一种多标志物生物芯片信号分析系统，包括图像采集系统、图像处理系统、数据分析和输出系统。其特征在于图像采集系统包括CCD摄像系统和光密封的X-Y-Z-θ定位装置；图像处理系统和数据分析输出系统由软件构成，图像处理系统可实现本底处理、调整对比度、放大缩小、旋转、填充、直方图显示、畸边校准和Morphological等多项功能；数据分析和输出系统可实现生物芯片上各标志物的信号-浓度标准曲线的制作，测试样品中各标志物浓度的定量及报表输出。

2.一种如权利要求1所述的多标志物生物芯片信号分析系统，其特征在于：

(1)图像采集系统可根据具体的实验要求设置CCD温度、曝光时间，芯片规格和样品信息等，然后进行图象拍摄；

(2)图像处理系统可对图象中感兴趣的区域进行本底处理、反差处理、放大缩小、旋转、填充、直方图显示、畸边校准和Morphological等多项操作；

(3)数据分析和输出系统可以：

(3.1)作标准曲线：一次性可对单个或多个子阵列中的各点信号进行定位；计算对应于各标准品的芯片上各信号的强度值，作浓度与信号值的关系曲线；

(3.2)对被测定物进行定量：计算对应于未知样本的芯片上各信号的强度值，根据标准曲线，得出浓度值；

(3.3)数据输出。

3.一种如权利要求1或2所述的多标志物生物芯片信号分析系统，其特征在于其中所述图像采集及处理以下述方法实现：

1)获取图像

(1.1)从曝光时间设置对话框中输入曝光时间m_ExpTime，传给变量exposure_time，由函数PICM_SetExposure(exposure_time，&error)来实现曝光时间；

(1.2)从温度设置对话框中输入设置的温度setTmp，由函数PICM_Set_Temperature(setTmp)来控制CCD温度；

2)图像处理

(2.1)放大

先用鼠标选定要放大的图象区域，计算x、y方向的放大倍数tx＝子窗口宽度rectClient.right/选定图象的宽度，ty＝子窗口高度rectClient.bottom/选定图象的高度，图象放大倍数m_Scale取tx，ty中较小值；计算选定区域放大前的中心位置Center1，则放大后的中心位置为Center2＝Center1*m_Scale，图象放大m_Scale倍后，视图滚动条需水平滚动Scrollpt.x＝Center2.x-rectClient.right/2，垂直滚动Scrollpt.y＝Center2.y-rectClient.bottom/2；

(2.2)调整对比度①用鼠标选定要调节对比度的区域，计算区域中象素的个数nValidPixel，将这nValidPixel个象素的灰度值放在nSort中，用函数heapsort(nSort，nValidPixel)按灰度值大小对nSort排序，取第95％个象素的灰度值作为上限，dSMax＝nSort[(0.95*n ValidPixel-1)]，取第5％个象素的灰度值作为下限，dSMin＝nSort[0.05*nValidPixel]；②计算图象显示时的灰度值mybits，取值0～255，若图象原始灰度值data(0～4095)大于dSMax，则mybits＝255；若小于dSMin，则mybits＝0；否则按直线计算mybits的值，即mybits＝(int)(*data*dA+dB)，dA＝255.0/(double)(dSMax-dSMin)，dB＝-dA*dSMin；

(2.3)填充

对于杂点进行填充处理，先用鼠标选定杂点区域，用值SpotValue来替填充该区域，SpotValue的计算方法是：在选定的杂点区域外，3个象素宽度，找灰度值在40～150之间的象素，取这些象素的平均值作为SpotValue，若点的个数为0，则SpotValue取80；

3)数据分析和输出

(3.1)作标准曲线

建立指标对话框，在对话框中输入各指标，共x种的浓度值，依次赋值给变量m_指标1，m_指标2，……，m_指标x，输入各浓度梯度值，存到数组StandardC[x][n]中，再从图像中读出各标准品的信号值。方法是：用小模板给每个标准品阵列定位，调节该模板的阵列行数、列数、行间距、列间距、模板大小、模板位置使定位后的模板所有方格刚好固定了一个生物芯片的所有信号点，且每个小方格只含有1个信号点。取每个小方格中最亮4个象素灰度平均值作为各点的信号值StandardPixAve[i][SD]，根据浓度值、信号值分别拟合出x种标志物的标准曲线，对应于各浓度梯度Ci，拟合出的信号值记为Huidu[i][SD]；

(3.2)对未知样本中各肿瘤标志物浓度的定量

若一次只处理单个未知样本：用小模板给每个未知样本对应的阵列定位，取每个小方格中最亮4个象素灰度平均值作为各点的信号值StandardPixAve[i][SD]，根据前述拟合标准曲线的方程，计算出各点的浓度值；

若一次性处理多个未知样本：

(a)调整大模板的大小，同时上下左右移动其位置，使其与图像的各个阵列大致重叠，以该模板中多个方格的左上角坐标位置作为每个子阵列的理想位置LS_IdealPoint[i][j]，然后用小模板对每个子阵列定位；

(b)小模板定位后，会出现定位信息对话框，点击对话框的“定位”按钮，保存该模板左上角的坐标，作为该子阵列的实际坐标位置LS_ActualPoint[i][j]，计算并搜索该坐标距离最近的LS_IdealPoint[i][j]，设定其为该位置的阵列，隐藏该阵列所对应的按钮，据此方法依次给每个子阵列定位；

(c)由记录的LS_ActualPoint[i][j]，一次性计算出每个子阵列的信号值，由信号值得出浓度值；

(3.3)将各个子阵列各个指标的浓度值全部输出在Excel中，用每个子阵列的位置代表该子阵列中测试的样本；

4.一种如权利要求1所述的多标志物生物芯片信号分析系统，其特征在于其中所述的数据分析系统的标准曲线拟合方式为二次曲线，双曲线，对数曲线或各种曲线的组合。

5.一种如权利要求1所述的多标志物生物芯片信号分析系统，其特征在于其中所述的图像采集系统设置的CCD温度范围为-50℃至-10℃。

6.一种如权利要求5所述的多标志物生物芯片信号分析系统，其特征在于其中所述的图像采集系统设置的CCD温度范围为-20℃。

7.一种如权利要求1所述的多标志物生物芯片信号分析系统，其特征在于其中所述的图像采集系统设置的曝光时间范围为10秒至5分钟。

8.一种如权利要求7所述的多标志物生物芯片信号分析系统，其特征在于其中所述的图像采集系统设置的曝光时间为60秒。

9.一种如权利要求1所述的多标志物生物芯片信号分析系统，其特征在于其中所述的数据分析系统所作标准曲线以信号值和标准样品浓度为变量。

10.一种如权利要求1或9所述的多标志物生物芯片信号分析系统，其特征在于其中所述的数据分析系统的特征在于对各信号点进行定位，通过软件识别亮点灰度并转换为信号值。