JPH0195800A - 遺伝子発現のアツセイ法及びキツト - Google Patents
遺伝子発現のアツセイ法及びキツトInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、遺伝子の発現の存在またはその量を検定ある
いは測定する方法及びそうした検定に有用なキットに関
する。
いは測定する方法及びそうした検定に有用なキットに関
する。
特定の遺伝子の発現を検出することは、そうした情報が
遺伝学的研究やガンの様な疾患の原因、診断及び治療に
関する医学的研究において価値あるものである為に、強
い関心が持たれている。
遺伝学的研究やガンの様な疾患の原因、診断及び治療に
関する医学的研究において価値あるものである為に、強
い関心が持たれている。
遺伝子発現は、ＤＮＡ中の遺伝情報から蛋白質を合成す
る複雑な過程の結果として得られる。メツセンジャーＲ
Ｎ Ａ （ｍＲＮＡ ）分子は発現したＤＮＡが転写さ
れることによって形成される。１立は蛋白質形成のため
に翻訳される。従って特定の遺伝子の生産物であるｍＲ
ＮＡ分子の存在または量を決定する分析は遺伝子発現に
関し最も直接的なアッセイ法を提供する。
る複雑な過程の結果として得られる。メツセンジャーＲ
Ｎ Ａ （ｍＲＮＡ ）分子は発現したＤＮＡが転写さ
れることによって形成される。１立は蛋白質形成のため
に翻訳される。従って特定の遺伝子の生産物であるｍＲ
ＮＡ分子の存在または量を決定する分析は遺伝子発現に
関し最も直接的なアッセイ法を提供する。
生物学的分子を検出する為の重要な分析法には、標的分
子すなわち検出されるべき物質に選択的に結合す゛る抗
体を利用する方法と標的ＤＮＡあるいはＲＮＡ鎖若しく
は分子と結合しハイブリッド禦妻する遺伝子プローブを
用いる方法がある。この抗体または遺伝子プローブはデ
ィテクタ（’ ｄｅｔｅｃｔｏｒつと称される。それら
が標的分子と結合する際には、その結合物を知らせる手
段が必要である。レボータ（’ ｒｅｐｏｒｔｅｒ “
）と呼ばれる、そうした手段として、放射性原子や螢光
分子を用いる周知の方法等抗体または遺伝子ブロー゛プ
への標識やタグの付加が可能である。抗体の使用に関す
る広範囲の先行技術は、発明者Ｃｈ ｉ ａ −Ｇｅｅ
Ｗａｎ ｇに対し付与された米国特許４，４５４，２
３３ （Ｙ９８４年６月１２日特許）及び米国特許４，
４３６，８２６ （Ｙ９８４年３月１３日特許）におい
て論議されている。これらの特許はいずれも本願におけ
るす（用文献として開示する。
子すなわち検出されるべき物質に選択的に結合す゛る抗
体を利用する方法と標的ＤＮＡあるいはＲＮＡ鎖若しく
は分子と結合しハイブリッド禦妻する遺伝子プローブを
用いる方法がある。この抗体または遺伝子プローブはデ
ィテクタ（’ ｄｅｔｅｃｔｏｒつと称される。それら
が標的分子と結合する際には、その結合物を知らせる手
段が必要である。レボータ（’ ｒｅｐｏｒｔｅｒ “
）と呼ばれる、そうした手段として、放射性原子や螢光
分子を用いる周知の方法等抗体または遺伝子ブロー゛プ
への標識やタグの付加が可能である。抗体の使用に関す
る広範囲の先行技術は、発明者Ｃｈ ｉ ａ −Ｇｅｅ
Ｗａｎ ｇに対し付与された米国特許４，４５４，２
３３ （Ｙ９８４年６月１２日特許）及び米国特許４，
４３６，８２６ （Ｙ９８４年３月１３日特許）におい
て論議されている。これらの特許はいずれも本願におけ
るす（用文献として開示する。
これらの特許は、抗体ディテクタと結合する微小球の使
用、及びＸ線螢光を含む幾つかの方法によって検出され
得る付加（ｔａｇｇｉｎｇ ）あるいは標識（ｌａｂｅ
ｌｌｉｎｇ ）レボータの使用を開示している。
用、及びＸ線螢光を含む幾つかの方法によって検出され
得る付加（ｔａｇｇｉｎｇ ）あるいは標識（ｌａｂｅ
ｌｌｉｎｇ ）レボータの使用を開示している。
同じく本発明者に対し１９８７年５月５日に付与された
米国特許４．６６３．２７７も本願の引用文献として開
示されるが、これは、固相増幅法（Ａｏｌｉｄ ｐｈａ
ｓｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
）を用いたウィルスや蛋白質の検出方法を記述してい
る。標本中の標的ウィルスまたは蛋白質を抗体で被覆し
た固相基質に接触させ、それによって複合体を形成し、
次にその標的複合体に抗体で被覆した微小球を結合する
のである。標識された微小球によって検出の感度は増幅
される。Ｘ線螢光分析法の使用は、異種の標的を同時に
測定し得る方法として開示されている。
米国特許４．６６３．２７７も本願の引用文献として開
示されるが、これは、固相増幅法（Ａｏｌｉｄ ｐｈａ
ｓｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
）を用いたウィルスや蛋白質の検出方法を記述してい
る。標本中の標的ウィルスまたは蛋白質を抗体で被覆し
た固相基質に接触させ、それによって複合体を形成し、
次にその標的複合体に抗体で被覆した微小球を結合する
のである。標識された微小球によって検出の感度は増幅
される。Ｘ線螢光分析法の使用は、異種の標的を同時に
測定し得る方法として開示されている。
遺伝子プローブの使用に関する一般的な事項は、’ Ｍ
ｏ１ｅｃｕ−１ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ
Ｇｅｎｅ ’Ｊａｍｅｓ Ｄ。
ｏ１ｅｃｕ−１ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ
Ｇｅｎｅ ’Ｊａｍｅｓ Ｄ。
Ｗａｔｓｏｎら、第４版、１９８７年第１巻６０８−６
１１及び６３３頁に記されており、この開示内容も本願
のす１用文献として掲げる。遺伝子プローブはＲＮＡま
たはＤＮＡより得られ、それは、細菌コロニー中の特定
配列に対し、はぼ完全に相補的なりＮＡあるいはＲＮＡ
部分を捜し出すことができることが開示されている。そ
うしたプローブを放射性標識と共にサザンブｂｙティン
グ（Ａｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔ−ｉｎｇ ）及びノ
ーザンブロツテイング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉ
ｎｇ ）法に使用する技術が記されている。
１１及び６３３頁に記されており、この開示内容も本願
のす１用文献として掲げる。遺伝子プローブはＲＮＡま
たはＤＮＡより得られ、それは、細菌コロニー中の特定
配列に対し、はぼ完全に相補的なりＮＡあるいはＲＮＡ
部分を捜し出すことができることが開示されている。そ
うしたプローブを放射性標識と共にサザンブｂｙティン
グ（Ａｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔ−ｉｎｇ ）及びノ
ーザンブロツテイング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉ
ｎｇ ）法に使用する技術が記されている。
クローニング、雑種形成、及び放射性遺伝子プローブに
関する技術の詳細は、Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｃｏ
１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ ％ １９８２年’Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ ’の本文中で説明されている。この開示内容
も本願のσ１用文献として掲げられる。
関する技術の詳細は、Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｃｏ
１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ ％ １９８２年’Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ ’の本文中で説明されている。この開示内容
も本願のσ１用文献として掲げられる。
本発明によれば、アッセイを行う特定の標的ｍＲＮＡ分
子を含むｍＲＮＡ分子な固相基質に結合し、その固相基
質を遺伝子グローブ分子の結合した標識マイクロビーズ
の水懸濁液に接触させ、その際上記遺伝子プローブ分子
は、アッセイを行う上記特定標的ｍＲＮＡ分子によって
構成され且つそのｍＲＮＡ分子を特徴づける配列とノ・
イブリッド半徘する配列から成り、且つ上記標識マイク
ロビーズを。
子を含むｍＲＮＡ分子な固相基質に結合し、その固相基
質を遺伝子グローブ分子の結合した標識マイクロビーズ
の水懸濁液に接触させ、その際上記遺伝子プローブ分子
は、アッセイを行う上記特定標的ｍＲＮＡ分子によって
構成され且つそのｍＲＮＡ分子を特徴づける配列とノ・
イブリッド半徘する配列から成り、且つ上記標識マイク
ロビーズを。
上記支持体に結合したアッセイを行う上記特定標的ｍＲ
ＮＡ分子に選択的に結合させ、上記標的ｍＲＮＡ分子に
結合していないマイクロビーズから同相基質を分離し、
上記標識結合マイクロビーズの存在あるいは量を判定す
ることにより遺伝子発現を選択的にアッセイすることか
ら成る遺伝子発現のアッセイ法が提供される。
ＮＡ分子に選択的に結合させ、上記標的ｍＲＮＡ分子に
結合していないマイクロビーズから同相基質を分離し、
上記標識結合マイクロビーズの存在あるいは量を判定す
ることにより遺伝子発現を選択的にアッセイすることか
ら成る遺伝子発現のアッセイ法が提供される。
本発明はまた、分析される特定の標的ｍＲＮＡ分子を含
むｍＲＮＡ分子を含有する水性標本中の遺伝子発現をア
ッセイする為のキットを提供する。当ＮＡまたはＤＮＡ
ポリマーが結合した固相基質、及び（ｂ）複数のＲＮＡ
またはＤＮＡポリマーが結合している標識マイクロビー
ズの水懸濁液から成り、上記結合ＲＮＡまたはＤＮＡポ
リマーは、上記標識マイクロビーズの表面にその一端が
共有結合し、他の一端がＲＮＡｔたはＤＮＡ遺伝子プロ
ーブ分子の一端に結合しており、上記遺伝子プローブ分
子はアッセイを行う上記特定標的ｍＲＮＡ分子により構
成され且つそのｍＲＮＡ分子を特徴づけるセン列から成
る。
むｍＲＮＡ分子を含有する水性標本中の遺伝子発現をア
ッセイする為のキットを提供する。当ＮＡまたはＤＮＡ
ポリマーが結合した固相基質、及び（ｂ）複数のＲＮＡ
またはＤＮＡポリマーが結合している標識マイクロビー
ズの水懸濁液から成り、上記結合ＲＮＡまたはＤＮＡポ
リマーは、上記標識マイクロビーズの表面にその一端が
共有結合し、他の一端がＲＮＡｔたはＤＮＡ遺伝子プロ
ーブ分子の一端に結合しており、上記遺伝子プローブ分
子はアッセイを行う上記特定標的ｍＲＮＡ分子により構
成され且つそのｍＲＮＡ分子を特徴づけるセン列から成
る。
遺伝子プローブを用いる１固相増幅’ （’ Ｓｏｌｉ
ｄＰｈａｓｅＡｍｐｌ １ｆｉｃａｔｉｏｎ “）（Ｓ
ＰＡ）の技術においてマイクロビーズをレポーターエレ
メントとして使用することにより、ここでゝ５ＰＡｐ
’として言及されている新技術は、標的配列の分析感
度を容易に１０−１８モルのレベルに到達させることが
できる。５ＰＡｐシステムは半液相ハイブリッド形成に
おいて非常に小さな標本から幾つかの異なったｍＲＮＡ
標的を同時に検出し、その結果を定量的に報告すること
が可能である。精密度を増す為に内標準を用いることが
できる。
ｄＰｈａｓｅＡｍｐｌ １ｆｉｃａｔｉｏｎ “）（Ｓ
ＰＡ）の技術においてマイクロビーズをレポーターエレ
メントとして使用することにより、ここでゝ５ＰＡｐ
’として言及されている新技術は、標的配列の分析感
度を容易に１０−１８モルのレベルに到達させることが
できる。５ＰＡｐシステムは半液相ハイブリッド形成に
おいて非常に小さな標本から幾つかの異なったｍＲＮＡ
標的を同時に検出し、その結果を定量的に報告すること
が可能である。精密度を増す為に内標準を用いることが
できる。
本発明の具体例においては、腫瘍組織をそれらの発がん
遺伝子配列の発現について分析し得、それによって病気
の診断を迅速且つ便利に行うことができる。様々な生物
医学上の必要性及び関心に応える５ＰＡｐシステムが開
発され得る。
遺伝子配列の発現について分析し得、それによって病気
の診断を迅速且つ便利に行うことができる。様々な生物
医学上の必要性及び関心に応える５ＰＡｐシステムが開
発され得る。
第１図は、本発明アッセイの具体例の概要を図示したも
のである。
のである。
第２図は、本発明アッセイの他の具体例のａ要を図示し
たものである。
たものである。
モノクローナル抗体及び遺伝子グローブは、生物医学上
関心を持たれる分子を分析する為に近年開発された二大
ディテクタである。これらのディテクタは標的リガンド
の認識が非常に特異的であり、プローブ試薬は種々の目
的に適合する様調製し得る。診断用に用いる為には、こ
れら多目的に使用し得しかも特異的なディテクタには更
にそれらが結合していることを示す為に便利なレポータ
が必要である。現在最も多く使用されているレポータに
はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはドツトプロッ
トハイブリダイゼーション（ａＯｔｂｌｏｔ ｈｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎ ）に用いる放射性原子、螢光免疫
法（ＦＩＡ）に用いる螢光分子、及び酵累結合抗体免疫
吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ ）または遺伝子プローブの
（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ）に用いる酵素分子が
含まれる。遺伝子プローブディテクタと共に本発明にお
いて使用されるＳＰＡレボータ、すなわち５ＰＡｐシス
テムは感度が高いという利点な有し、更には、本発明の
具体例においてレポータがＸ線螢光分析によって検出さ
れる場合、一つの操作過程で複数の標的を同時に検出し
報告することができる。
関心を持たれる分子を分析する為に近年開発された二大
ディテクタである。これらのディテクタは標的リガンド
の認識が非常に特異的であり、プローブ試薬は種々の目
的に適合する様調製し得る。診断用に用いる為には、こ
れら多目的に使用し得しかも特異的なディテクタには更
にそれらが結合していることを示す為に便利なレポータ
が必要である。現在最も多く使用されているレポータに
はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはドツトプロッ
トハイブリダイゼーション（ａＯｔｂｌｏｔ ｈｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎ ）に用いる放射性原子、螢光免疫
法（ＦＩＡ）に用いる螢光分子、及び酵累結合抗体免疫
吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ ）または遺伝子プローブの
（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ）に用いる酵素分子が
含まれる。遺伝子プローブディテクタと共に本発明にお
いて使用されるＳＰＡレボータ、すなわち５ＰＡｐシス
テムは感度が高いという利点な有し、更には、本発明の
具体例においてレポータがＸ線螢光分析によって検出さ
れる場合、一つの操作過程で複数の標的を同時に検出し
報告することができる。
生物医学的診断にＳＰＡを用いる場合、レポータエレメ
ントはディテクタエレメントから化学的に分離される。
ントはディテクタエレメントから化学的に分離される。
ＳＰＡの原理を示す周知の例はイムノゴールド法である
。電子顕′ａ鏡下で調べると、抗体（Ａｂ ）で板積さ
れた全ての微粒子は一個ずつ計数し得るので一個の標的
リガンドの存在を実質的に知らせることができる。しか
しながら広い組織の調製その他の制限が存在する場合に
はイムノゴールド法は殆んどの診断に対し非実用的とな
ってしまう。本発明の５ＰＡｐシステムは電子顕微ｆａ
ｆ必要とせず、また、固相ハイブリッド形成を使用しな
い。ＳＰＡのレポータは、１移動性固相′（’ ｍｏｂ
ｉｌｅ ５ｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ’ ）としての微小
球に付加された種々の、元素周期表中の追跡子から成る
ことが好ましい。これらの追跡子の粒子はディテクタと
して様々な遺伝子プローブと共有結合する。診断におい
てはアッセイ感度は検出機能と同程度、報告機能に依存
する。ＳＰＡレボータは個々の標的リガンドのレベルの
感度迄持ち得、その値は限定された結合親和性を有する
いかなるディテクタの感度をもはるかに上回るので、従
って正確性、信頼性、スピード、便利さ及びコストに関
し最良の検出機能を達成するアッセイ法が得られる０ 本発明のアッセイ法は多くの遺伝子発現の分析に用いら
れ得る。このアッセイ法においては、標的分子はヌクレ
オチドの特徴的配列、すなわちこれらの分子を特徴づけ
、それらに対応する相補的遺伝子プローブ分子が、それ
らの認識及びそれらとのハイブリッド形成の為得られあ
るいは設計されるところの１センス（意味のある）“配
列を含有する。
。電子顕′ａ鏡下で調べると、抗体（Ａｂ ）で板積さ
れた全ての微粒子は一個ずつ計数し得るので一個の標的
リガンドの存在を実質的に知らせることができる。しか
しながら広い組織の調製その他の制限が存在する場合に
はイムノゴールド法は殆んどの診断に対し非実用的とな
ってしまう。本発明の５ＰＡｐシステムは電子顕微ｆａ
ｆ必要とせず、また、固相ハイブリッド形成を使用しな
い。ＳＰＡのレポータは、１移動性固相′（’ ｍｏｂ
ｉｌｅ ５ｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ’ ）としての微小
球に付加された種々の、元素周期表中の追跡子から成る
ことが好ましい。これらの追跡子の粒子はディテクタと
して様々な遺伝子プローブと共有結合する。診断におい
てはアッセイ感度は検出機能と同程度、報告機能に依存
する。ＳＰＡレボータは個々の標的リガンドのレベルの
感度迄持ち得、その値は限定された結合親和性を有する
いかなるディテクタの感度をもはるかに上回るので、従
って正確性、信頼性、スピード、便利さ及びコストに関
し最良の検出機能を達成するアッセイ法が得られる０ 本発明のアッセイ法は多くの遺伝子発現の分析に用いら
れ得る。このアッセイ法においては、標的分子はヌクレ
オチドの特徴的配列、すなわちこれらの分子を特徴づけ
、それらに対応する相補的遺伝子プローブ分子が、それ
らの認識及びそれらとのハイブリッド形成の為得られあ
るいは設計されるところの１センス（意味のある）“配
列を含有する。
特定の蛋白質を大量に産生ずる特異的に分化した細胞を
除いて、殆んどの細胞は１ 、０００種を超える異なっ
たＲＮＡ分子を含有する。従って標本は膨大な数の異な
る遺伝子発現を含む。本発明の方法においては、そうし
た多数の異なったｍＲＮＡ分子を含有し得る標本な固相
基質に接触させ、そこに異なったｍＲＮＡ分子を結合さ
せる。これらの中には、検定しようとする特定の標的ｍ
ＲＮＡ分子があり、これらは、検定しようとするｍＲＮ
Ａ分子に％機前な配列とハイブリッド彬看する配列から
成る遺伝子プローブ分子によって同定あるいは検出され
る。そうした遺伝子プローブを結合した標識マイクロビ
ーズの水懸濁液を使用し、これをｍＲＮＡ分子を結合し
た固相基質に接触させる。遺伝子プローブ分子はアッセ
イを行うｍＲＮＡ分子とバイブ分子に選択的に結合する
。次いで同相基質を洗浄等の方法により上記標的ｍＲＮ
Ａ分子に結合していないマイクロビーズから分離し、標
的結合マイクロビーズの存在または量を決定する。その
ようなマイクロビーズは、本質的に、アッセイを行うｍ
ＲＮＡ分子にのみ結合するので、この決定は結果として
遺伝子発現の選択的アッセイとなる。
除いて、殆んどの細胞は１ 、０００種を超える異なっ
たＲＮＡ分子を含有する。従って標本は膨大な数の異な
る遺伝子発現を含む。本発明の方法においては、そうし
た多数の異なったｍＲＮＡ分子を含有し得る標本な固相
基質に接触させ、そこに異なったｍＲＮＡ分子を結合さ
せる。これらの中には、検定しようとする特定の標的ｍ
ＲＮＡ分子があり、これらは、検定しようとするｍＲＮ
Ａ分子に％機前な配列とハイブリッド彬看する配列から
成る遺伝子プローブ分子によって同定あるいは検出され
る。そうした遺伝子プローブを結合した標識マイクロビ
ーズの水懸濁液を使用し、これをｍＲＮＡ分子を結合し
た固相基質に接触させる。遺伝子プローブ分子はアッセ
イを行うｍＲＮＡ分子とバイブ分子に選択的に結合する
。次いで同相基質を洗浄等の方法により上記標的ｍＲＮ
Ａ分子に結合していないマイクロビーズから分離し、標
的結合マイクロビーズの存在または量を決定する。その
ようなマイクロビーズは、本質的に、アッセイを行うｍ
ＲＮＡ分子にのみ結合するので、この決定は結果として
遺伝子発現の選択的アッセイとなる。
本発明の好ましい具体例においては、遺伝子発現は、ア
ッセイを行う特定の標的ｍＲＮＡ分子を含むｍＲＮＡ分
子を含有する水性標本を、上記ｍＲＮＡ分子の３′ポリ
（Ａ）末尾とハイブリッド十分するＲＮＡまたはＤＮＡ
の結合した固相基質に接触させ、それによってｍＲＮＡ
分子を上記固相基質に結合させ、上記水性標本から上記
固相基質を分離し、複数のＲＮＡまたはＤＮＡポリマー
の結合した標識マイクロビーズの水懸濁液と上記固相基
質を接触させ、上記結合ＲＮＡあるいはＤＮＡポリマー
は一端において上記標識マイクロビーズの表面に共有結
合し、他の一端においてＲＮＡまたはＤＮＡ遺伝子プロ
ーブ分子の一端に結合し、上記遺伝子プローブ分子が、
アッセイを行う特定の標的ｍＲＮＡによって構成され且
つその標的ｍＲＮＡを特徴づけるセンス配列とハイブリ
ッド÷僕し得るアンチセンス配列から成り、上記遺伝子
プローブ分子をアッセイすべき上記特定標的ｍＲＮＡ分
子とハイブリッド十分し、それにより上記固相基質に結
合したアッセイすべき上記特定標的ｍＲＮＡ分子に上記
標識マイクロビーズを選択的に結合し、上記標的ｍＲＮ
Ａ分子に結合していないマイクロビーズから固相基質を
分離し、そして、上記の標識された結合マイクロビーズ
の存在または量を決定して上記遺伝子発現を選択的にア
ッセイすることから成る。
ッセイを行う特定の標的ｍＲＮＡ分子を含むｍＲＮＡ分
子を含有する水性標本を、上記ｍＲＮＡ分子の３′ポリ
（Ａ）末尾とハイブリッド十分するＲＮＡまたはＤＮＡ
の結合した固相基質に接触させ、それによってｍＲＮＡ
分子を上記固相基質に結合させ、上記水性標本から上記
固相基質を分離し、複数のＲＮＡまたはＤＮＡポリマー
の結合した標識マイクロビーズの水懸濁液と上記固相基
質を接触させ、上記結合ＲＮＡあるいはＤＮＡポリマー
は一端において上記標識マイクロビーズの表面に共有結
合し、他の一端においてＲＮＡまたはＤＮＡ遺伝子プロ
ーブ分子の一端に結合し、上記遺伝子プローブ分子が、
アッセイを行う特定の標的ｍＲＮＡによって構成され且
つその標的ｍＲＮＡを特徴づけるセンス配列とハイブリ
ッド÷僕し得るアンチセンス配列から成り、上記遺伝子
プローブ分子をアッセイすべき上記特定標的ｍＲＮＡ分
子とハイブリッド十分し、それにより上記固相基質に結
合したアッセイすべき上記特定標的ｍＲＮＡ分子に上記
標識マイクロビーズを選択的に結合し、上記標的ｍＲＮ
Ａ分子に結合していないマイクロビーズから固相基質を
分離し、そして、上記の標識された結合マイクロビーズ
の存在または量を決定して上記遺伝子発現を選択的にア
ッセイすることから成る。
第１図に示す様にＲＮＡあるいは１）ＮＡポリマーはそ
れらの３′末端において標識マイクロビーズに共有結合
し、それらの５′末端においては遺伝子プ四−ブ分子の
５′末端と結合する。第１図に示す配列中、遺伝子プロ
ーブのアンチセンス配列のヌクレオチドは標的ｍＲＮＡ
のセンス配列のヌクレオチドに対し相補的である。第２
図は、本発明による他の配列を例示している。この具体
例では、ＲＮＡまたはＤＮＡポリマーはその５′末端に
おいて標識マイクロビーズと結合し、その３′末端にお
いては遺伝子ブ四−ブ分子の３′末端に結合している。
れらの３′末端において標識マイクロビーズに共有結合
し、それらの５′末端においては遺伝子プ四−ブ分子の
５′末端と結合する。第１図に示す配列中、遺伝子プロ
ーブのアンチセンス配列のヌクレオチドは標的ｍＲＮＡ
のセンス配列のヌクレオチドに対し相補的である。第２
図は、本発明による他の配列を例示している。この具体
例では、ＲＮＡまたはＤＮＡポリマーはその５′末端に
おいて標識マイクロビーズと結合し、その３′末端にお
いては遺伝子ブ四−ブ分子の３′末端に結合している。
アッセイしようとするものを含むｍＲＮＡ分子は基質表
面に結合したＲＮＡｔたはＤＮＡポリマーと結合させる
ことにより固相基質に結合され得る０結合ポリマーは通
常それらの５′末端において基質に共有結合する。そう
したポリマーはポリ（ｄＰ）あるいはポリ（ト）ホモポ
リマーであって良い。
面に結合したＲＮＡｔたはＤＮＡポリマーと結合させる
ことにより固相基質に結合され得る０結合ポリマーは通
常それらの５′末端において基質に共有結合する。そう
したポリマーはポリ（ｄＰ）あるいはポリ（ト）ホモポ
リマーであって良い。
ＲＮＡまたはＤＮ人ポリマーの末端への結合により、遺
伝子プローブ分子をマイクロビーズに結合させる際は、
標識されたマイクロビーズに結合したポリマーは、ポリ
（Ｘ）ホモポリマーであり、遺伝子プローブ分子は、そ
の末端に結合したポリ（Ｙ）ホモポリマーによって延長
され、そのホモポリマーが上記マイクロビーズに結合さ
れる。この場合、ＸはｄＣでＹはＧ１ ＸはＣでＹはＧ１ ＸはｄＧでＹはＣ１ ＸはＧでＹはＣ１ ＸはｄＣでＹはｄＧ。
伝子プローブ分子をマイクロビーズに結合させる際は、
標識されたマイクロビーズに結合したポリマーは、ポリ
（Ｘ）ホモポリマーであり、遺伝子プローブ分子は、そ
の末端に結合したポリ（Ｙ）ホモポリマーによって延長
され、そのホモポリマーが上記マイクロビーズに結合さ
れる。この場合、ＸはｄＣでＹはＧ１ ＸはＣでＹはＧ１ ＸはｄＧでＹはＣ１ ＸはＧでＹはＣ１ ＸはｄＣでＹはｄＧ。
ＸはＣでＹはｄＧ 、 、
ＸはｄＧでＹはｄＣあるいは
ＸはＧでＹはｄＣである。
本発明で使用するマイクロビーズは、Ｐｏ１ｙ ５ｃｉ
−ｅｎｃｅ社製（Ｐａｕｌ Ｖａｌｌｅｙ Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉａｌ Ｐａｒｋ、 ％ｒｒｉｎｇ−ｔｏｎ、 Ｐ
Ａ １８９７６ ）等の小型のラテックスビーズであ
ることが好ましい。マイクロビーズのサイズ（直径）は
０．３マイクロメーター以下が良い。感度を高める為に
は、マイクロビーズは０．２５マイクロメ−゛ター以下
にするは５が良い。０．０５マイクロメーターを下回る
サイズのマイクロビーズでは検出段階で得られるシグナ
ルが弱くなるので好ましくない。
−ｅｎｃｅ社製（Ｐａｕｌ Ｖａｌｌｅｙ Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉａｌ Ｐａｒｋ、 ％ｒｒｉｎｇ−ｔｏｎ、 Ｐ
Ａ １８９７６ ）等の小型のラテックスビーズであ
ることが好ましい。マイクロビーズのサイズ（直径）は
０．３マイクロメーター以下が良い。感度を高める為に
は、マイクロビーズは０．２５マイクロメ−゛ター以下
にするは５が良い。０．０５マイクロメーターを下回る
サイズのマイクロビーズでは検出段階で得られるシグナ
ルが弱くなるので好ましくない。
を含有させる等の手段により標識する。標識は溶液中で
安定でありＸ線螢光によって検出し得る金属元素あるい
は化合物であることが好ましい。標識は、そのＸ腺螢光
特性が空気中で極度に弱まらない様に、原子量が５０を
上回る重い元素であるほうが良い。そのような元素とし
て、Ｆｅ 、 Ｎｉ 。
安定でありＸ線螢光によって検出し得る金属元素あるい
は化合物であることが好ましい。標識は、そのＸ腺螢光
特性が空気中で極度に弱まらない様に、原子量が５０を
上回る重い元素であるほうが良い。そのような元素とし
て、Ｆｅ 、 Ｎｉ 。
Ｃｕ 、 Ｃｏ等が例示される。
固相基質はｍＲＮＡ分子が結合することのできるもので
あれば、いかなる材料から成るものでも良いが、ガラス
製あるいは親水性重合体ラテックスがより好ましい。そ
の固形体は、ロンドやデイツプスティック等様々な形状
を採り得る。
あれば、いかなる材料から成るものでも良いが、ガラス
製あるいは親水性重合体ラテックスがより好ましい。そ
の固形体は、ロンドやデイツプスティック等様々な形状
を採り得る。
マイクロビーズは金属元素で標識するのがより好ましく
、それにより標識、結合されたマイクロビーズの存在ま
たはその量がＸ線螢光分析により決定される。この、よ
り好ましい具体例においてはマイクロビーズの各々が、
その存在を表示する数百万個の追跡（ｔｒａｃｅ ）原
子から成るＳＰＡレホータの役割を演じる。追跡子（ｔ
ｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ）あるいは増幅因子（ａｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ）の世が多け
れば多い程レボーティングは容易且つ高感度となる。個
々のアッセイは特定のレボ−ティング追跡子による同定
を行うものであるから、数個のアッセイを、各々に対応
する追跡子を用いることにより単一の過程で行うことが
できる。Ｘ線螢光分析において数種の異なった追跡子の
報告機能を測定することは一項目（ｏｎｅ −ｉｔｅｍ
）分析に要する以上の労力を必要とするものではない
。
、それにより標識、結合されたマイクロビーズの存在ま
たはその量がＸ線螢光分析により決定される。この、よ
り好ましい具体例においてはマイクロビーズの各々が、
その存在を表示する数百万個の追跡（ｔｒａｃｅ ）原
子から成るＳＰＡレホータの役割を演じる。追跡子（ｔ
ｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ）あるいは増幅因子（ａｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ）の世が多け
れば多い程レボーティングは容易且つ高感度となる。個
々のアッセイは特定のレボ−ティング追跡子による同定
を行うものであるから、数個のアッセイを、各々に対応
する追跡子を用いることにより単一の過程で行うことが
できる。Ｘ線螢光分析において数種の異なった追跡子の
報告機能を測定することは一項目（ｏｎｅ −ｉｔｅｍ
）分析に要する以上の労力を必要とするものではない
。
Ｘ線を照射したマイクロビーズの典型的Ｘ線スペクトル
においては、各々の追跡子の計数率（ｃｏｕｎｔ’−ｉ
ｎｇ ｒａｔｅ ）あるいは１チヤンネル“（’ ｃｈ
ａｎｎｅｌ“）はその特定の追跡子を伴う照射マイクロ
ビーズの数に比例する。典型的な元素はＣｒ 、 Ｆｅ
、 Ｚｎ 。
においては、各々の追跡子の計数率（ｃｏｕｎｔ’−ｉ
ｎｇ ｒａｔｅ ）あるいは１チヤンネル“（’ ｃｈ
ａｎｎｅｌ“）はその特定の追跡子を伴う照射マイクロ
ビーズの数に比例する。典型的な元素はＣｒ 、 Ｆｅ
、 Ｚｎ 。
及びＢａである。
従って固相基質に結合した標的ｍＲＮＡに２以上のタイ
プの異なる標ｍを付したマイクロビーズが結合するとそ
の異なる標識な有するマイクロビーズは、異なった金属
原子の標識を特徴づけるＸ線螢光によって各々が同時に
検出され得る。こうしたマルチプルアッセイによって異
なる遺伝子発現を同時に定量的に検出することができる
。
プの異なる標ｍを付したマイクロビーズが結合するとそ
の異なる標識な有するマイクロビーズは、異なった金属
原子の標識を特徴づけるＸ線螢光によって各々が同時に
検出され得る。こうしたマルチプルアッセイによって異
なる遺伝子発現を同時に定量的に検出することができる
。
この様に不発明は、固相基質に結合したｍＲＮＡ分子が
異種の、アッセイしようとする標的ｍＲＮＡ分子を含有
する場合の具体例をも包含する。この場合における標的
ｍＲＮＡ分子は、上記固相基質を異種のマイクロビーズ
の水懸濁液に接触させ、異種のマイクロビーズには各々
それに対応する異なったタイプの遺伝子プローブ分子が
結合し、その異なったタイプの遺伝子は上記のアッセイ
しようとする異種のｍＲＮＡ分子のうちの特定のものと
ノ＼イブリツドキ域することができ、異種のマイクロビ
ーズは各々、異なったタイプの遺伝子プローブ分子の各
々に対応する異なった金属元素で標識され、それによっ
て対応する異なる標識を有するマイクロビーズを、上記
固相基質に結合した上記のアッセイしようとする異種の
標的ｍＲＮＡ分子に選択的に結合させ、ぞして異なる金
属元素の各々を特徴づけるＸ線螢光分析によって、異な
る標識を有するマイクロビーズの存在または量を同時且
つ別個に決定することにより分析される。
異種の、アッセイしようとする標的ｍＲＮＡ分子を含有
する場合の具体例をも包含する。この場合における標的
ｍＲＮＡ分子は、上記固相基質を異種のマイクロビーズ
の水懸濁液に接触させ、異種のマイクロビーズには各々
それに対応する異なったタイプの遺伝子プローブ分子が
結合し、その異なったタイプの遺伝子は上記のアッセイ
しようとする異種のｍＲＮＡ分子のうちの特定のものと
ノ＼イブリツドキ域することができ、異種のマイクロビ
ーズは各々、異なったタイプの遺伝子プローブ分子の各
々に対応する異なった金属元素で標識され、それによっ
て対応する異なる標識を有するマイクロビーズを、上記
固相基質に結合した上記のアッセイしようとする異種の
標的ｍＲＮＡ分子に選択的に結合させ、ぞして異なる金
属元素の各々を特徴づけるＸ線螢光分析によって、異な
る標識を有するマイクロビーズの存在または量を同時且
つ別個に決定することにより分析される。
異なった標的分子を同時に同定する為の複数のチャンネ
ルがあることに加え、多くのＸ線チャンネルがあるとい
うことは、もう一つの重要な利点、すなわち内部調整（
Ｙｎｔｅｒｎａｌ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ）の可能
性、を提供する。典型的アッセイにおいて、Ｐ Ｉ−Ｉ
温度、インキュベーションの時間等の内的変数（Ｙｎｔ
ｅｒｎａｌ ｖａｒｉａｂｌｅ ）を既知ｆｔ ｆ）
特定（７） 物質のアッセイを行う個々の参照チャンネ
ル（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｃｈａｎｎｅｌ ）とすること
ができ、それに対応するＸ線レボ−ティングチャンネル
は他の全てのチャンネルのデータあるいは検量（ｃｏｕ
ｎｔｓ ）の調整に用いられ得る。既知のチャンネルを
内標準として使用することにより他のチャンネルが定量
分析の正確なプロフィールを形成することができる。定
量的な内標準を用いこのプロフィールを病気や同順に関
する分析に応用することにより個々の生物医学的問題に
応えることができる。
ルがあることに加え、多くのＸ線チャンネルがあるとい
うことは、もう一つの重要な利点、すなわち内部調整（
Ｙｎｔｅｒｎａｌ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ）の可能
性、を提供する。典型的アッセイにおいて、Ｐ Ｉ−Ｉ
温度、インキュベーションの時間等の内的変数（Ｙｎｔ
ｅｒｎａｌ ｖａｒｉａｂｌｅ ）を既知ｆｔ ｆ）
特定（７） 物質のアッセイを行う個々の参照チャンネ
ル（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｃｈａｎｎｅｌ ）とすること
ができ、それに対応するＸ線レボ−ティングチャンネル
は他の全てのチャンネルのデータあるいは検量（ｃｏｕ
ｎｔｓ ）の調整に用いられ得る。既知のチャンネルを
内標準として使用することにより他のチャンネルが定量
分析の正確なプロフィールを形成することができる。定
量的な内標準を用いこのプロフィールを病気や同順に関
する分析に応用することにより個々の生物医学的問題に
応えることができる。
本発明の内部調整の具体例は、上記方法によってアッセ
イし得、固相基質に結合することの可能な、既知量の標
準物質を標本に加え、上記標準物質に選択的に結合する
ことが可能で、アッセイを行う標的ｍＲＮＡ分子に結合
するマイクロビーズの標識とは異なる金属元素で標識し
た、マイクロビーズなマイクロビーズの水懸濁液中に含
有させ、異なる金属元素のＸ線螢光特性を分析すること
により、上記のアッセイを行う標的ｍＲＮＡ分子に結合
したマイクロビーズの量と上記標準物質に結合したマイ
クロビーズの量とを同時且つ別個に測定し、標準物質の
アッセイ結果を元に遺伝子発現のアッセイ結果を調整す
ることから成る。
イし得、固相基質に結合することの可能な、既知量の標
準物質を標本に加え、上記標準物質に選択的に結合する
ことが可能で、アッセイを行う標的ｍＲＮＡ分子に結合
するマイクロビーズの標識とは異なる金属元素で標識し
た、マイクロビーズなマイクロビーズの水懸濁液中に含
有させ、異なる金属元素のＸ線螢光特性を分析すること
により、上記のアッセイを行う標的ｍＲＮＡ分子に結合
したマイクロビーズの量と上記標準物質に結合したマイ
クロビーズの量とを同時且つ別個に測定し、標準物質の
アッセイ結果を元に遺伝子発現のアッセイ結果を調整す
ることから成る。
ｍＲＮＡ分子と結合することのできるＲＮＡあるいはＤ
ＮＡポリマーをπする固相基質と、遺伝子プローブの結
合する標識されたマイクロビーズの水懸濁液とは、本発
明によれば、アッセイを行う特定の標的ｍＲＮＡ分子を
含むｍＲＮＡ分子を含有する水性標本中の遺伝子発現を
アッセイする為のキットとして提供し得る。本発明のキ
ットは、各構成要素として、（ａ）上記ｍＲＮＡ分子の
３′ポリ（Ａ）末尾とハイブリッド今昔し得るＲＮＡ−
＄たはＤＮＡポリマーの結合した固相基質、（ｂ）各々
その一端が標識マイクロビーズの表面にミ他の一端がＩ
（、Ｎ ＡあるいはＤＮＡ造伝子ブ四−ブ分子の末端に
共有結合した複数のＲＮＡまたはＤＮＡポリマーの結合
した標識されたマイクロビーズの水懸濁液、から成り、
上記遺伝子プローブ分子は、上記アッセイを行う％定ｍ
ＲＮＡ分子によって構成され且つそのｍＲＮＡ分子を％
徴づけるセンス配列とハイブリッド形成し得るアンチセ
ンス配列から成る。
ＮＡポリマーをπする固相基質と、遺伝子プローブの結
合する標識されたマイクロビーズの水懸濁液とは、本発
明によれば、アッセイを行う特定の標的ｍＲＮＡ分子を
含むｍＲＮＡ分子を含有する水性標本中の遺伝子発現を
アッセイする為のキットとして提供し得る。本発明のキ
ットは、各構成要素として、（ａ）上記ｍＲＮＡ分子の
３′ポリ（Ａ）末尾とハイブリッド今昔し得るＲＮＡ−
＄たはＤＮＡポリマーの結合した固相基質、（ｂ）各々
その一端が標識マイクロビーズの表面にミ他の一端がＩ
（、Ｎ ＡあるいはＤＮＡ造伝子ブ四−ブ分子の末端に
共有結合した複数のＲＮＡまたはＤＮＡポリマーの結合
した標識されたマイクロビーズの水懸濁液、から成り、
上記遺伝子プローブ分子は、上記アッセイを行う％定ｍ
ＲＮＡ分子によって構成され且つそのｍＲＮＡ分子を％
徴づけるセンス配列とハイブリッド形成し得るアンチセ
ンス配列から成る。
このキットのマイクロビーズはＸ線螢光技術による分析
に適する金属元素で標識することが好ましい。キットの
同相基質に使用する結合ポリマー及びマイクロビーズに
ついては上記の通りである。
に適する金属元素で標識することが好ましい。キットの
同相基質に使用する結合ポリマー及びマイクロビーズに
ついては上記の通りである。
更にキットは複数の異なる遺伝子発現の同時検出を可能
にする構成要素で形成することができる。
にする構成要素で形成することができる。
キットのこの具体例においては上記構成要１（ｂ）は異
種のマイクロビーズの水懸濁液であってそれら各種マイ
クロビーズは各々対応する異なったタイプの遺伝子プロ
ーブ分子を結合し、これら異なるタイプの遺伝子プロー
ブ分子は、アッセイを行う異種のｍＲＮ人のうちの特定
のものとハイブリッド形成し得、各種マイクロビーズは
各々異なったタイプの遺伝子プローブ分子に対応する様
に異なる金属元素で標識されている。この具体例におい
ては、異なったタイプの遺伝子プローブ分子の結合する
異なった標識を有するマイクロビーズは各々異なるタイ
プのマイクロビーズの水懸濁液として別７１：Ｗ器に分
は得る。
種のマイクロビーズの水懸濁液であってそれら各種マイ
クロビーズは各々対応する異なったタイプの遺伝子プロ
ーブ分子を結合し、これら異なるタイプの遺伝子プロー
ブ分子は、アッセイを行う異種のｍＲＮ人のうちの特定
のものとハイブリッド形成し得、各種マイクロビーズは
各々異なったタイプの遺伝子プローブ分子に対応する様
に異なる金属元素で標識されている。この具体例におい
ては、異なったタイプの遺伝子プローブ分子の結合する
異なった標識を有するマイクロビーズは各々異なるタイ
プのマイクロビーズの水懸濁液として別７１：Ｗ器に分
は得る。
また、キットには、内標準を用いたアッセイを行う為の
構成要素金含有させることもできる。この具体例ではキ
ットは各構成要素として（ｃ）上記遺伝子発現のアッセ
イで７ツセイされ得、固相基質に結合し得る、既知量の
標準物質、及び（ｄ）構成髪素（ｂ）のマイクロビーズ
で、更に異なる種類のマイクロビーズであってΦ）の水
＠濁液中に含まれるかまたは別々の水懸濁液として別々
な容器に入れられているマイクロビーズを含有し、上記
の更に畳なる種類のマイクロビーズは上記標準物質に選
択的に結合し得、アッセイを行う標的ｔｎＲＮＡ分子に
結合するマイクロビーズの標識とは異なった金属元素で
標識されている。
構成要素金含有させることもできる。この具体例ではキ
ットは各構成要素として（ｃ）上記遺伝子発現のアッセ
イで７ツセイされ得、固相基質に結合し得る、既知量の
標準物質、及び（ｄ）構成髪素（ｂ）のマイクロビーズ
で、更に異なる種類のマイクロビーズであってΦ）の水
＠濁液中に含まれるかまたは別々の水懸濁液として別々
な容器に入れられているマイクロビーズを含有し、上記
の更に畳なる種類のマイクロビーズは上記標準物質に選
択的に結合し得、アッセイを行う標的ｔｎＲＮＡ分子に
結合するマイクロビーズの標識とは異なった金属元素で
標識されている。
非特異的結合部位を遮断する為に、遺伝子プローブン付
着させたマイクロビーズな粉乳蛋白質（ｐｏｗｄｅｒｅ
ｄ ｍ１ｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ） （例えば、Ｃａｒ
ｎａｔ ｔｏｎ脱脂粉乳）甘たはサケ精液Ｄ Ｎ Ａで
処理し、あるいは被覆ｔまたほうが良い。Ｐｔ、ＮＡ
ａｓｅ （ＲＮＡケ分１痒する酵素）を可１−ない類似
の製品を用いても良い、基質はＲＮＡａｓｅの比較的少
なり標本と共に使用され得る。
着させたマイクロビーズな粉乳蛋白質（ｐｏｗｄｅｒｅ
ｄ ｍ１ｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ） （例えば、Ｃａｒ
ｎａｔ ｔｏｎ脱脂粉乳）甘たはサケ精液Ｄ Ｎ Ａで
処理し、あるいは被覆ｔまたほうが良い。Ｐｔ、ＮＡ
ａｓｅ （ＲＮＡケ分１痒する酵素）を可１−ない類似
の製品を用いても良い、基質はＲＮＡａｓｅの比較的少
なり標本と共に使用され得る。
不発明においては、当該５ＰＡｐシステムによる発がん
遺伝子の発現に関する研究を例示したが、この方法は他
の多くの遺伝子発現にも等しく使用され得る。
遺伝子の発現に関する研究を例示したが、この方法は他
の多くの遺伝子発現にも等しく使用され得る。
発がんの研究における最近の最も重要な進歩は、様々な
新生物への変換が特定の異常な発がん遺伝子の発現に何
らかの結びつきを有することが判明したことである。
新生物への変換が特定の異常な発がん遺伝子の発現に何
らかの結びつきを有することが判明したことである。
異常な発現には基本的に２つのグループがある。
その一つは突然変異の起きた発がん遺伝子によるもの、
他の一つは過度に活性化した発がん遺伝子によるもので
ある。より多くのウィルス発がん遺伝子、及び腫瘍細胞
由来の変換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ）配列が単離
され、分子クローニングされると、凡そ２４の発がん遺
伝子に対するプローブが、それらの発現と悪性疾患との
間の関係を評価するのに使用され得るようになった。ヒ
ト腫瘍細胞中では発がん遺伝子の発現が突然変異を起こ
しているのみならず、光道していることがしばしば発見
された。［ホットスポットＪ （’ ｈｏｔ −５ｐｏ
ｔｓ ’ ）と呼ばれる部位及び高められた発現が遺伝
子配列の特定の発現に結びつくことが追跡により判明し
た。
他の一つは過度に活性化した発がん遺伝子によるもので
ある。より多くのウィルス発がん遺伝子、及び腫瘍細胞
由来の変換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ）配列が単離
され、分子クローニングされると、凡そ２４の発がん遺
伝子に対するプローブが、それらの発現と悪性疾患との
間の関係を評価するのに使用され得るようになった。ヒ
ト腫瘍細胞中では発がん遺伝子の発現が突然変異を起こ
しているのみならず、光道していることがしばしば発見
された。［ホットスポットＪ （’ ｈｏｔ −５ｐｏ
ｔｓ ’ ）と呼ばれる部位及び高められた発現が遺伝
子配列の特定の発現に結びつくことが追跡により判明し
た。
しかしながら殆んどの発がん遺伝子は常に新生物への転
換（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎ ）に関与しているわけではない。υ咀遺伝子のグ
ループはその一例である。ヒトのゲノムはＨ−ｒａｓ−
１及びＨ−ｒａｓ −２及びＫ −ｒａｓ−１及びに−
ｒａｓ−２遺伝子に対し相同な少なくとも２つの部位を
含有する。Ｈ−一（徂−１及びＫ −ｒａｓ −２のみ
が機能的であり、残りのＨ−ｒａｓ −２及びに−ｒａ
ｓ−１は非機能的偽遺伝子（ｎｏｎ −ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎａｌ ｐｓｅｕ−ｄｏｇｅｎｅｓ ）に対応する。Ｈ
−ｒａｓ−１、Ｋ −ｒａｓ−−２及びＮ−ｒａｇはす
べて、１８９個のアミノ酸残基を有する高度に関連する
「蛋白質−２１Ｊ （’ｐｒｏ−１ｅｉｎ−２１ ’
） （ｐ２１ ）をコードする類似の４つのエクソン配
列を有する。既知のｒａｓ遺伝子の遺伝子産物中には３
つの構造的に重要な、定義されたドメインが存在する。
換（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎ ）に関与しているわけではない。υ咀遺伝子のグ
ループはその一例である。ヒトのゲノムはＨ−ｒａｓ−
１及びＨ−ｒａｓ −２及びＫ −ｒａｓ−１及びに−
ｒａｓ−２遺伝子に対し相同な少なくとも２つの部位を
含有する。Ｈ−一（徂−１及びＫ −ｒａｓ −２のみ
が機能的であり、残りのＨ−ｒａｓ −２及びに−ｒａ
ｓ−１は非機能的偽遺伝子（ｎｏｎ −ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎａｌ ｐｓｅｕ−ｄｏｇｅｎｅｓ ）に対応する。Ｈ
−ｒａｓ−１、Ｋ −ｒａｓ−−２及びＮ−ｒａｇはす
べて、１８９個のアミノ酸残基を有する高度に関連する
「蛋白質−２１Ｊ （’ｐｒｏ−１ｅｉｎ−２１ ’
） （ｐ２１ ）をコードする類似の４つのエクソン配
列を有する。既知のｒａｓ遺伝子の遺伝子産物中には３
つの構造的に重要な、定義されたドメインが存在する。
実質的に同一な第一のドメインはＰ２１の最初の８０個
のアミノ酸残基を包含し、次の８０個のアミノ酸残基は
ｐ２１蛋白質が相互にわずかに異なっている（ Ｈ−ｒ
ａｓ−１、Ｎ−ｒａｓ、及びＣ−ｒａｓ −２のいずれ
の対の間の相同性も８５％）、第二のドメインな足腺す
る。
のアミノ酸残基を包含し、次の８０個のアミノ酸残基は
ｐ２１蛋白質が相互にわずかに異なっている（ Ｈ−ｒ
ａｓ−１、Ｎ−ｒａｓ、及びＣ−ｒａｓ −２のいずれ
の対の間の相同性も８５％）、第二のドメインな足腺す
る。
最後に、生理学的特異性を可能にする、著しい差異を有
するカルボキシ−末端可変領域がある。
するカルボキシ−末端可変領域がある。
ｒａｓ蛋白質は高度に保存されたアミノ末端ドメインに
おける１個のアミノ酸の置換によるｐ２１蛋白質産物の
わずかな変化によって悪性を発揮し得るようになる。ヒ
ト腫瘍細胞において２つの活性化のホットスポットが検
出され、動物においてその悪性が誘導された。この２つ
は最初のエクソン中のコドン１２と第二のエクソン中の
コドン６１である。コドン１２の突然変異の場合、例え
ば、原形質膜の内側に位置する正常なｐ２１のアミン末
端を分子の中核（ｃｏｒｅ ）にたたみ込ませてＧＴＰ
ａｓａ活性に関与する柔軟な蝶番領域が、変換されたＩ
）２１においては消失し、ＧＴＰを加水分解することの
できない、より硬い三次構造となる。この突然変異を検
出する為には十分な感度によるアッセイが必要である。
おける１個のアミノ酸の置換によるｐ２１蛋白質産物の
わずかな変化によって悪性を発揮し得るようになる。ヒ
ト腫瘍細胞において２つの活性化のホットスポットが検
出され、動物においてその悪性が誘導された。この２つ
は最初のエクソン中のコドン１２と第二のエクソン中の
コドン６１である。コドン１２の突然変異の場合、例え
ば、原形質膜の内側に位置する正常なｐ２１のアミン末
端を分子の中核（ｃｏｒｅ ）にたたみ込ませてＧＴＰ
ａｓａ活性に関与する柔軟な蝶番領域が、変換されたＩ
）２１においては消失し、ＧＴＰを加水分解することの
できない、より硬い三次構造となる。この突然変異を検
出する為には十分な感度によるアッセイが必要である。
レトロウィルスのエンハンサ−によって媒介される様な
ｒａｇ発がん遺伝子前駆体ωｒｏｔ。
ｒａｇ発がん遺伝子前駆体ωｒｏｔ。
−ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ）の非常に光道した発現もまた
新生物への変換を惹起し得る。後者のような種類の発現
の分析はｍｙｃ発がん遺伝子前駆体の発現と同様の方法
で行うことができる。
新生物への変換を惹起し得る。後者のような種類の発現
の分析はｍｙｃ発がん遺伝子前駆体の発現と同様の方法
で行うことができる。
ヒトバーキットリンパ腫に特徴的なＣ−ｍｙｃ部位の染
色体の転座は、もう一つの重要な、発がん遺伝子前駆体
による新生物への転換である。質的変化というよりもむ
しろＣ−ｍｙｃの発現の亢進ということがこの場合の発
がんに関与していると思われる。バーキットリンパ腫細
胞はＣ−ｍｙｃ遺伝子を有する染色体８の長いアームの
末端と、各々免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎮、入軽鎖、及
びに軽鎖の部位を担持する染色体１４．２あるいは２２
との間の相互交換によって特徴づけられる。腫瘍によっ
てＣ−ｍｙｃ転写はかなり異なるが、Ｃ−ｍｙｃ部位の
転座は、免疫グロブリン部位のエンハンサ−要素によっ
てその遺伝子の発現を増加させる。
色体の転座は、もう一つの重要な、発がん遺伝子前駆体
による新生物への転換である。質的変化というよりもむ
しろＣ−ｍｙｃの発現の亢進ということがこの場合の発
がんに関与していると思われる。バーキットリンパ腫細
胞はＣ−ｍｙｃ遺伝子を有する染色体８の長いアームの
末端と、各々免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎮、入軽鎖、及
びに軽鎖の部位を担持する染色体１４．２あるいは２２
との間の相互交換によって特徴づけられる。腫瘍によっ
てＣ−ｍｙｃ転写はかなり異なるが、Ｃ−ｍｙｃ部位の
転座は、免疫グロブリン部位のエンハンサ−要素によっ
てその遺伝子の発現を増加させる。
Ｃ−ｍｙｃの発現は、増殖反応の初期相（Ｇｏ／Ｇ、
’）に結びつき得、それはｃ−ｆｏｓ及びｒ −ｆｏｓ
発がん遺伝子前駆体に類似する。
’）に結びつき得、それはｃ−ｆｏｓ及びｒ −ｆｏｓ
発がん遺伝子前駆体に類似する。
Ｃ−ｍｙｃの発現の増幅に加え、腫瘍が発育を開始する
為には、第二の遺伝学的イベントとして、姐娠などの適
切なホルモン的環境が必要である。
為には、第二の遺伝学的イベントとして、姐娠などの適
切なホルモン的環境が必要である。
ヒト神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ）の
場合、この疾患の末期においてＮ −ｍｙｃ増＠ （ａ
ｎｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が示され、小細胞肺がん（
ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒ−ｃｉｎｏｍ
ａｓ ）の場合Ｌ−ｍｙｃが示されることが８ｅａｇｅ
ｒら、Ｎ、 Ｅｎｇｌ、 ＪｏＭｅｄ、 ３１３ 、１
１１１ 、１９８５に記されている。この棟の発がん遺
伝子前駆体の発現の光道は、広範囲のヒト悪性新生物（
ｍａｌ ｉｇｎａｎｃｉｅｓ ）の発育に決定的役割を
演じ得る。
場合、この疾患の末期においてＮ −ｍｙｃ増＠ （ａ
ｎｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が示され、小細胞肺がん（
ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒ−ｃｉｎｏｍ
ａｓ ）の場合Ｌ−ｍｙｃが示されることが８ｅａｇｅ
ｒら、Ｎ、 Ｅｎｇｌ、 ＪｏＭｅｄ、 ３１３ 、１
１１１ 、１９８５に記されている。この棟の発がん遺
伝子前駆体の発現の光道は、広範囲のヒト悪性新生物（
ｍａｌ ｉｇｎａｎｃｉｅｓ ）の発育に決定的役割を
演じ得る。
ヒトの発がんに関する知識は不完全であるが、発がん遺
伝子の発現を定量的及び定性的変化によりテストする遺
伝子プローブを設計することは可能である。現在存在す
る核酸のアッセイはそのテストを行う為に多くの段階を
必要とし、診断は組織によって異なった結果となり、ま
たアッセイを行う環境に変化があるという問題点を抱え
ている。
伝子の発現を定量的及び定性的変化によりテストする遺
伝子プローブを設計することは可能である。現在存在す
る核酸のアッセイはそのテストを行う為に多くの段階を
必要とし、診断は組織によって異なった結果となり、ま
たアッセイを行う環境に変化があるという問題点を抱え
ている。
本発明の５ＰＡｐシステムを使用すれば、内標準を用い
、感度、スピード及び便利さにおいて優れたアッセイの
プロフィールが得られ、それは病気の診断に活用し得そ
れによってまた治療や病気の進行のモニターに役立てる
ことができる。
、感度、スピード及び便利さにおいて優れたアッセイの
プロフィールが得られ、それは病気の診断に活用し得そ
れによってまた治療や病気の進行のモニターに役立てる
ことができる。
Ｘ線螢光によるより好ましい検出方法を包含する本発明
の方法は、２４個あるいはそれ以上の発がん遺伝子の幾
つかあるいはその全てを同時に定量的に検出する可能性
を提供する。それは非常に高感度においてなされ得、少
量のサンプルで正確な結果が得られる。このことは、サ
ンプルが、がん組織から採取したもののような組織標本
である場合には極めて重要である。少量のサンプルを使
用するということは組織の非常に狭い領域からサンプル
を採ることであるから、それによって遺伝子発現のアッ
セイ結果は、問題の罹患組織の部位に密接なものとなる
。先行技術の方法においては、分析には非常に大きなサ
ンプルを必要としたので、検出された様々な遺伝子発現
は必ずしも問題の組織部位に特異的であるとは限らなか
った。先行技術において小さなサンプルを使用する別法
は分析に十分適する大きさのサンプルを得る為組織培養
物を用いなければならなかった。この技術は、それが可
能な場合、数週間余計に時間を要し賽た他の不確定性を
加えるものである。
の方法は、２４個あるいはそれ以上の発がん遺伝子の幾
つかあるいはその全てを同時に定量的に検出する可能性
を提供する。それは非常に高感度においてなされ得、少
量のサンプルで正確な結果が得られる。このことは、サ
ンプルが、がん組織から採取したもののような組織標本
である場合には極めて重要である。少量のサンプルを使
用するということは組織の非常に狭い領域からサンプル
を採ることであるから、それによって遺伝子発現のアッ
セイ結果は、問題の罹患組織の部位に密接なものとなる
。先行技術の方法においては、分析には非常に大きなサ
ンプルを必要としたので、検出された様々な遺伝子発現
は必ずしも問題の組織部位に特異的であるとは限らなか
った。先行技術において小さなサンプルを使用する別法
は分析に十分適する大きさのサンプルを得る為組織培養
物を用いなければならなかった。この技術は、それが可
能な場合、数週間余計に時間を要し賽た他の不確定性を
加えるものである。
以下の実施例を本発明を例示する目的で呈示する０
実施例
Ａ、 ５ＰＡｐサンドイツチアツセイｒａｓ及びｍｙ
ｃ発がん遺伝子をモデルシステムとして選択した、な
ぜならばこれらはヒトの悪性新生物においてその発現が
示唆されることが文献で証明されているからである。第
１図にサンドイッチアラ七イを示す。
ｃ発がん遺伝子をモデルシステムとして選択した、な
ぜならばこれらはヒトの悪性新生物においてその発現が
示唆されることが文献で証明されているからである。第
１図にサンドイッチアラ七イを示す。
ポリ（ｄＴ）及びポリ（ｄＣ）ホモポリマーに夫々共有
結合した２つの固相支持体を作製する。ポリ（ｄＴ）分
子の５′末端に結合した、デイツプスチック」二の一方
の固相（ガラス）調製物は、標本からｍＲＮＡの３′ポ
リ（Ａ）末尾を通じてｍＲＮＡを集めるのに用いられる
。もう一つの固相（０，２マイクロメータのマイクロビ
ーズ）調製物は、レボータとして、μ阻に対してＣｒ
、 ｒｎｙｃに対してＴｉの追跡子を含有し、ポリ（ｄ
Ｃ）の３′末端に結合しているがこれは第１図に示す様
に、ポリ０によって延長された発がん遺伝子プローブの
配列の結合を通じプローブ複合体を形成するのに使用さ
れる。ポリ（ｄＴ）及びポリ（ｄＣ）の鎖の長さは約１
５０乃至２００で、それは溶液相中のｍＲＮＡとポリ０
付加発がん遺伝子のハイブリッド形成を確実にする為で
ある。商業的に入手可能なデオキシヌクレオチドホモポ
リマーを使用する。化学反応の詳細は上記Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、’ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ’
に記されている。
結合した２つの固相支持体を作製する。ポリ（ｄＴ）分
子の５′末端に結合した、デイツプスチック」二の一方
の固相（ガラス）調製物は、標本からｍＲＮＡの３′ポ
リ（Ａ）末尾を通じてｍＲＮＡを集めるのに用いられる
。もう一つの固相（０，２マイクロメータのマイクロビ
ーズ）調製物は、レボータとして、μ阻に対してＣｒ
、 ｒｎｙｃに対してＴｉの追跡子を含有し、ポリ（ｄ
Ｃ）の３′末端に結合しているがこれは第１図に示す様
に、ポリ０によって延長された発がん遺伝子プローブの
配列の結合を通じプローブ複合体を形成するのに使用さ
れる。ポリ（ｄＴ）及びポリ（ｄＣ）の鎖の長さは約１
５０乃至２００で、それは溶液相中のｍＲＮＡとポリ０
付加発がん遺伝子のハイブリッド形成を確実にする為で
ある。商業的に入手可能なデオキシヌクレオチドホモポ
リマーを使用する。化学反応の詳細は上記Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、’ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ’
に記されている。
ポリ０で延長されたプローブを調製するためには、選択
された発がん遺伝子ＤＮＡ断片を平滑末端で、約５０塩
基対のボＩＪ （ｄＧ）またはボＩＪ （ｄＣ）ホモポ
リマーＤＮＡに結合させ、ポリ（ｄＧ）の３′末端がそ
のプローブの非転写鎖（ａｎｔｉ −５ｅｎｓｅｓｔｒ
ａｎｄ ）の５′末端に結合するようにする。ＤＮＡ複
合体は９０１Ｍベクターのポリ−リンカ−領域のＳｍａ
Ｉ部位でクローンされる。プローブインサートの３′
末端で予めカットしたプラスミドのＳＰｂまたはＴ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼ転写は所望のポリ（ｄＧ）−付加アン
チセンスプローブを生じる。このシステムによれば、特
定元素を含有する（ｄＣ）−付加固相レボータに結合す
る為の一定量のアンチセンスＲＮＡプローブを調製する
ことができる。
された発がん遺伝子ＤＮＡ断片を平滑末端で、約５０塩
基対のボＩＪ （ｄＧ）またはボＩＪ （ｄＣ）ホモポ
リマーＤＮＡに結合させ、ポリ（ｄＧ）の３′末端がそ
のプローブの非転写鎖（ａｎｔｉ −５ｅｎｓｅｓｔｒ
ａｎｄ ）の５′末端に結合するようにする。ＤＮＡ複
合体は９０１Ｍベクターのポリ−リンカ−領域のＳｍａ
Ｉ部位でクローンされる。プローブインサートの３′
末端で予めカットしたプラスミドのＳＰｂまたはＴ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼ転写は所望のポリ（ｄＧ）−付加アン
チセンスプローブを生じる。このシステムによれば、特
定元素を含有する（ｄＣ）−付加固相レボータに結合す
る為の一定量のアンチセンスＲＮＡプローブを調製する
ことができる。
マイクロビーズを結合したアンチセンスプローブを調製
する為の別法として一本鎖アンチセンスＤＮＡにポリ（
ｄＧ）を結合させることができる。
する為の別法として一本鎖アンチセンスＤＮＡにポリ（
ｄＧ）を結合させることができる。
これは、二本鎖プローブＤＮＡ断片を変性して得られる
アンチセンスＤＮＡの３′末端の１０乃至１５ヌクレオ
チドに５′末端において結合した１０乃至１５ （ａｃ
）を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより為さ
れる。オリゴヌクレオチドは非転写鎖ＤＮＡプローブへ
のポリ（ｄＧ）の結合を容易にするテンプレートの役割
を果たす。このプローブの一つの利点は、ハイブリッド
形成が行なわれている間、溶液中でより分解しにくいと
いう点である。
アンチセンスＤＮＡの３′末端の１０乃至１５ヌクレオ
チドに５′末端において結合した１０乃至１５ （ａｃ
）を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより為さ
れる。オリゴヌクレオチドは非転写鎖ＤＮＡプローブへ
のポリ（ｄＧ）の結合を容易にするテンプレートの役割
を果たす。このプローブの一つの利点は、ハイブリッド
形成が行なわれている間、溶液中でより分解しにくいと
いう点である。
また、このプローブは第２図に示す具体例に従ってマイ
クロビーズに結合させることができる。
クロビーズに結合させることができる。
Ｂ、プローブ及び細胞システムの選択
ＳＰＡプローブハイブリッド形成に適した発がん遺伝子
プローブとセルラインを選択し得る。様々な商業的に入
手可能なウィルス及び細胞の工及びμ１ｓＤＮＡクロー
ンが使用され得る。エクソンを含有する適切なりＮＡ断
片を上述の組み合わせの為に調製する。異なるレベルの
ｍｙｃ及びｒａｓ配列を発現することの知られた様々な
セルライン及び−次組ｆｌｆ７． （ｐｒｉｍａｒｙ
ｃｅｌｌｇ ）が検査に用いられる。
プローブとセルラインを選択し得る。様々な商業的に入
手可能なウィルス及び細胞の工及びμ１ｓＤＮＡクロー
ンが使用され得る。エクソンを含有する適切なりＮＡ断
片を上述の組み合わせの為に調製する。異なるレベルの
ｍｙｃ及びｒａｓ配列を発現することの知られた様々な
セルライン及び−次組ｆｌｆ７． （ｐｒｉｍａｒｙ
ｃｅｌｌｇ ）が検査に用いられる。
Ｃ，ＲＮＡの調製とハイブリッド形成
チオシアン酸グアニジン処理及び遠心によって全ての細
１［ＬＮＡを抽出する。ｍＲＮＡのポリ（ｄＴ）被覆ガ
ラス固相デイツプスティックへの連結は、高濃度食塩（
０，５Ｎ ＮａＣ７１）存在下既知量のｍＲＮＡ抽出物
を含有する溶液にデイツプスティックを浸すことにより
行われる。ポリ（ト）含有ＲＮＡのポリ（ｄＴ）への結
合は非常に迅やかに行われる。５乃至１０分間インキュ
ベートした後、デイツプスティックを濃度を軽減した食
塩水（０，Ｉ ＮＮａＣＪ ）に続けて浸すことにより
洗浄する。こうしてｍＲＮＡを担持するデイツプスティ
ックは、ノＡイブリッド形成の行える状態となる。Ｔｉ
で標識したポリ（ｄＣ）−被覆マイクロビーズレポータ
とポリ０で延長したｍｙｃのアンチセンスプローブをポ
リ（ｄＴ）とポリ四のハイブリッド形成と同様の方法に
より混合する。Ｃｒで標識したもう一方のボＩＪ（ｄＣ
）被覆マイクロビーズレポータとμ咀に対するプローブ
もこの方法で処理するマイクロビーズの結合したプロー
ブを遠心によって回収し、濃度の軽減された食塩水（０
，１Ｎ ＮａＣ１）で洗浄し、再びペレット化する。常
時撹拌しながら通常の条件（上記Ｍａｎｉａｔｉｓら参
照）により、デイツプスティックに結合したｍＲＮＡと
マイクロビーズレポータに結合したアンチセンスプロー
ブとのハイブリッド形成を行う。一定の時間ハイブリッ
ド形成を行った後デイツプスティックを洗浄して非特異
的ハイブリッド形成を除去し次いで上述の様にＴｉ及び
ＣｒのｈのカウントについてＸ＠分析を行った。洗浄す
る間、ポリ（ｄＣ）−ポリ０二重らせんより安定性の弱
いボＩＪ（ｄＴ）−ポリ（２）二重らせんが安定性を失
うのを防止する為の注意を払う。対照区は、単独の既知
量のポリ（ｄＣ）とプラスミドＤＮＡを結合したマイク
ロピーズを含有し、それらは、プローブを結合したマイ
クロピーズの標識に用いたＴｉ及びＣｒと異なった元素
で標識されている。Ｔｉのカウントからはｍｙｃの濃度
が、Ｃｒのカウントからはｒａｓの濃度が定量的に求め
られる。
１［ＬＮＡを抽出する。ｍＲＮＡのポリ（ｄＴ）被覆ガ
ラス固相デイツプスティックへの連結は、高濃度食塩（
０，５Ｎ ＮａＣ７１）存在下既知量のｍＲＮＡ抽出物
を含有する溶液にデイツプスティックを浸すことにより
行われる。ポリ（ト）含有ＲＮＡのポリ（ｄＴ）への結
合は非常に迅やかに行われる。５乃至１０分間インキュ
ベートした後、デイツプスティックを濃度を軽減した食
塩水（０，Ｉ ＮＮａＣＪ ）に続けて浸すことにより
洗浄する。こうしてｍＲＮＡを担持するデイツプスティ
ックは、ノＡイブリッド形成の行える状態となる。Ｔｉ
で標識したポリ（ｄＣ）−被覆マイクロビーズレポータ
とポリ０で延長したｍｙｃのアンチセンスプローブをポ
リ（ｄＴ）とポリ四のハイブリッド形成と同様の方法に
より混合する。Ｃｒで標識したもう一方のボＩＪ（ｄＣ
）被覆マイクロビーズレポータとμ咀に対するプローブ
もこの方法で処理するマイクロビーズの結合したプロー
ブを遠心によって回収し、濃度の軽減された食塩水（０
，１Ｎ ＮａＣ１）で洗浄し、再びペレット化する。常
時撹拌しながら通常の条件（上記Ｍａｎｉａｔｉｓら参
照）により、デイツプスティックに結合したｍＲＮＡと
マイクロビーズレポータに結合したアンチセンスプロー
ブとのハイブリッド形成を行う。一定の時間ハイブリッ
ド形成を行った後デイツプスティックを洗浄して非特異
的ハイブリッド形成を除去し次いで上述の様にＴｉ及び
ＣｒのｈのカウントについてＸ＠分析を行った。洗浄す
る間、ポリ（ｄＣ）−ポリ０二重らせんより安定性の弱
いボＩＪ（ｄＴ）−ポリ（２）二重らせんが安定性を失
うのを防止する為の注意を払う。対照区は、単独の既知
量のポリ（ｄＣ）とプラスミドＤＮＡを結合したマイク
ロピーズを含有し、それらは、プローブを結合したマイ
クロピーズの標識に用いたＴｉ及びＣｒと異なった元素
で標識されている。Ｔｉのカウントからはｍｙｃの濃度
が、Ｃｒのカウントからはｒａｓの濃度が定量的に求め
られる。
本発明の重要な利点は、以下のことからも明白である。
診断用のモノクローナル抗体は、１９８１年より商業的
に入手可能であり、それらを使用した多（の新規な使い
易いフォーマットが開発されてきた。
に入手可能であり、それらを使用した多（の新規な使い
易いフォーマットが開発されてきた。
それとは対照的に遺伝子プローブテストは一般に、より
複雑である。典型的な場合、それら・は杉酸抽出、ハイ
ブリッド形成、及び、多くの非放射性テストフォーマッ
トにおいては、酵素免疫アッセイと同等のものを包含す
る。典型的な遺伝子プローブテストは、以下のような操
作を行う為最低数十時間を要するものである。
複雑である。典型的な場合、それら・は杉酸抽出、ハイ
ブリッド形成、及び、多くの非放射性テストフォーマッ
トにおいては、酵素免疫アッセイと同等のものを包含す
る。典型的な遺伝子プローブテストは、以下のような操
作を行う為最低数十時間を要するものである。
１）試料の調製、精製、及び変性（数分乃至数時間）；
２）不活性固相支持体への結合；
３）支持体の非特異的結合部位の除去（長時間）；４）
結合した標本と同相セツティング中の大量の遺伝子プロ
ーブとのハイブリッド形成（数時間乃至数十時間）； ５）ハイブリッド形成しなかった遺伝子プ四−プを除去
する為の洗浄（長時間）； ６）オートラジオグラフィー（数時間乃至数日間）また
は酵素反応（数十分乃至数時間）のシグナルの発生。
結合した標本と同相セツティング中の大量の遺伝子プロ
ーブとのハイブリッド形成（数時間乃至数十時間）； ５）ハイブリッド形成しなかった遺伝子プ四−プを除去
する為の洗浄（長時間）； ６）オートラジオグラフィー（数時間乃至数日間）また
は酵素反応（数十分乃至数時間）のシグナルの発生。
この操作手順を迅速あるいは容易にする幾つかの遺伝子
プローブ法が最近紹介された。一つの方法は１ポリメラ
一ゼ鎖反応′のような配列増幅（Ａｅｑｕｅｎｃｅ ａ
ｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ）を使用し、それにより、
２０乃至３０回繰返された反応サイクルの後特定の標的
配列において１００万倍に効率を上げる溶液相における
拮抗的（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ）ハイブリッド形成
の方法もあり、この場合には、短い標識シグナル鎖は、
より長い標的鎖が同じハイブリッド二重鎖にアニールす
るとそのハイブリッドから除去される。これらの新しい
システムはいずれも放射性原子凍たは酵素分子をレボ−
ティングに用いるが各々は独自の利点と難点を有する。
プローブ法が最近紹介された。一つの方法は１ポリメラ
一ゼ鎖反応′のような配列増幅（Ａｅｑｕｅｎｃｅ ａ
ｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ）を使用し、それにより、
２０乃至３０回繰返された反応サイクルの後特定の標的
配列において１００万倍に効率を上げる溶液相における
拮抗的（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ）ハイブリッド形成
の方法もあり、この場合には、短い標識シグナル鎖は、
より長い標的鎖が同じハイブリッド二重鎖にアニールす
るとそのハイブリッドから除去される。これらの新しい
システムはいずれも放射性原子凍たは酵素分子をレボ−
ティングに用いるが各々は独自の利点と難点を有する。
Ｓｌａｍｏｎら、ＳＣＩ器ＣＥ上、 １７７ 、１９８
７に開示されている様に乳がんにおいて１．襲１発がん
遺伝子の増幅は再発（ｒｅｌａｐｓｅ ）に要する時間
がより短いこと、生存率がより低いこと、及びリンパ腺
の数において陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｎｕｍｂｅｒ
ｏｆ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ ）であることに相関し
得る。神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓ−ｔｏｍａ
）及び小細胞肺がん（ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ
ｃａｒ−ｃｉｎｏｍａ ）においても同様のことが示
唆されている。小さな細胞群から、特に新鮮な標本から
得られる発がん遺伝子の発現をアッセイする為には多大
な努力が必要とされるであろう。本発明の８ＰＡｐシス
テムの様な迅速で感度が高くしかも正確な診断法は、腫
瘍学において治療のみならず研究の為にも極めて有用な
補助を提供し得る。次の表はイムノゴールド（Ｉｍｍｕ
ｎｏｇｏｌｄ ）及びノーザンプロット（Ｎｏｒｔｈｅ
ｒｎ Ｂｌｏｔ ）法と比較シタ本発明ノ８ ＰＡｐシ
ステムの概要を示す。
７に開示されている様に乳がんにおいて１．襲１発がん
遺伝子の増幅は再発（ｒｅｌａｐｓｅ ）に要する時間
がより短いこと、生存率がより低いこと、及びリンパ腺
の数において陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｎｕｍｂｅｒ
ｏｆ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ ）であることに相関し
得る。神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓ−ｔｏｍａ
）及び小細胞肺がん（ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ
ｃａｒ−ｃｉｎｏｍａ ）においても同様のことが示
唆されている。小さな細胞群から、特に新鮮な標本から
得られる発がん遺伝子の発現をアッセイする為には多大
な努力が必要とされるであろう。本発明の８ＰＡｐシス
テムの様な迅速で感度が高くしかも正確な診断法は、腫
瘍学において治療のみならず研究の為にも極めて有用な
補助を提供し得る。次の表はイムノゴールド（Ｉｍｍｕ
ｎｏｇｏｌｄ ）及びノーザンプロット（Ｎｏｒｔｈｅ
ｒｎ Ｂｌｏｔ ）法と比較シタ本発明ノ８ ＰＡｐシ
ステムの概要を示す。
イムノゴールド ノーザンプロット ５ＰＡｐデ
イテクタ 抗体 ＤＮＡ配列 Ｄ
ＮＡ配列 レポータ 金マイクロビーズ 放射性原子 標識
マイクロピーズ ディテクター いや２間詰合 吸収 化学的 ７
９ブリット形成ｖｇ−ｆ′ｆ７３’電子線遮断 放射
能 Ｘ線螢光するもの 標本の 。っ内。真空誓合された 環境 フンダムな固体 半
一溶液１１ｍ−４４ｆｌｌ固−液 固−液
溶液間の結合 分析時間 数時間 数十時間 数分＋、ｌｉ闇学
す誌明 第１図は、本発明アッセイの具体例の概要を図示したも
のである。
イテクタ 抗体 ＤＮＡ配列 Ｄ
ＮＡ配列 レポータ 金マイクロビーズ 放射性原子 標識
マイクロピーズ ディテクター いや２間詰合 吸収 化学的 ７
９ブリット形成ｖｇ−ｆ′ｆ７３’電子線遮断 放射
能 Ｘ線螢光するもの 標本の 。っ内。真空誓合された 環境 フンダムな固体 半
一溶液１１ｍ−４４ｆｌｌ固−液 固−液
溶液間の結合 分析時間 数時間 数十時間 数分＋、ｌｉ闇学
す誌明 第１図は、本発明アッセイの具体例の概要を図示したも
のである。
第２図は、本発明アッセイの他の具体例の概要を図示し
たものである。
たものである。
代理人 三 宅 正 夫 他１名
（Ｉ＋う）
′−９
手 続 補 正 書（自発）
昭和６３年９月１９日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、遺伝子発現をアツセイする方法であつて以下の事項
から成る方法： 特定の標的ｍＲＮＡ分子を含むｍＲＮＡ分子を固相支持
体に結合し； 上記固相支持体を遺伝子プローブ分子の結合した標識マ
イクロビーズの水懸濁液に接触させ、上記遺伝子プロー
ブ分子が、上記のアツセイを行う特定標的ｍＲＮＡ分子
によつて構成され且つその標的ｍＲＮＡを特徴づける配
列とハイブリッド形成する配列から成り、それにより上
記標識マイクロビーズを上記支持体に結合した上記アツ
セイを行ラ特定標的ｍＲＮＡ分子に選択的に結合し； 固相支持体を上記標的ｍＲＮＡ分子に結合されないマイ
クロビーズから分離し； そして、上記標識、結合したマイクロビーズの存在また
は量を決定し； それによつて、上記遺伝子の発現を選択的にアッセイす
る。 ２、上記マイクロビーズが金属元素で標識され、標識さ
れ結合したマイクロビーズの存在または量がＸ線螢光分
析により決定されることを特徴とする特許請求の範囲第
１項による方法。 ３、固相支持体に結合したｍＲＮＡ分子が異なつた種類
の、アツセイを行う標的ｍＲＮＡ分子を含有し、上記ｍ
ＲＮＡ分子は上記固相支持体を異種のマイクロビーズの
水懸濁液に接触させることによりアツセイされ、異種の
マイクロビーズの各々には対応する異なつたタイプの遺
伝子プローブ分子が結合し、各々のタイプの遺伝子プロ
ーブ分子は、アツセイを行う上記の異なつた種類のｍＲ
ＮＡ分子のうちの特定のものとハイブリッドでき、異種
のマイクロビーズの各々は、各々の異なつたタイプの遺
伝子プローブ分子に対応する異なつた金属元素で標識さ
れ、それによつてアツセイを行う上記の異なつた種類の
標的ｍＲＮＡ分子に、対応する異なつた標識を有するマ
イクロビーズを選択的に結合させ、各々の異なつた金属
元素に特徴的なＸ線螢光の分析により、異なつた標識を
有するマイクロビーズの存在または量を同時且つ別個に
決定することを特徴とする特許請求の範囲第２項による
方法。 ４、特許請求の範囲第２項または第３項による方法であ
つて、当該方法によりアツセイし得、固相支持体に結合
し得る、既知量の標準物質を標本に加え、マイクロビー
ズ水懸濁液に上記標準物質に選択的に結合し得、アツセ
イを行う標的ｍＲＮＡ分子に結合するマイクロビーズの
標識とは異なる金属元素で、対応する様に標識したマイ
クロビーズを含有させ、異なる金属元素に特徴的なＸ線
螢光を分析することにより、上記アツセイを行う。 標的ｍＲＮＡ分子に結合したマイクロビーズの量と上記
標準物質に結合したマイクロビーズの量とを同時且つ別
個に測定し、標準物質のアツセイ結果に対し遺伝子発現
のアツセイ結果を調整することから成ることを特徴とす
る方法。 ５、アツセイを行う特定の標的ｍＲＮＡ分子を含むｍＲ
ＮＡ分子を含有する水性標本中で遺伝子発現をアツセイ
する為のキットであつて、独立の構成要素として、 （ａ）上記ｍＲＮＡ分子の３′ポリ（Ａ）テイルとハイ
ブリッドし得るＲＮＡまたはＤＮＡポリマーが結合した
固相支持体； （ｂ）複数のＲＮＡまたはＤＮＡポリマーが結合した標
識マイクロビーズの水懸濁液であつて、上記の結合した
ＲＮＡまたはＤＮＡポリマーが一方の末端において上記
標識マイクロビーズの表面に共有結合し、他の一方の末
端においてＲＮＡまたはＤＮＡ遺伝子プローブ分子の末
端に結合し、上記遺伝子プローブ分子は、上記アツセイ
を行う特定の標的ｍＲＮＡ分子によつて構成され且つそ
の標的ｍＲＮＡ分子に特徴的なセンス配列とハイブリツ
ドし得るアンチセンス配列から成る、標識マイクロビー
ズの水懸濁液、から成ることを特徴とする遺伝子発現を
アツセイする為のキット。 ６、上記マイクロビーズが、Ｘ線螢光の分析に適した金
属元素で標識されていることを特徴とする、特許請求の
範囲第５項によるキット。 ７、標識されたマイクロビーズに結合したポリマーがポ
リ（Ｘ）ホモポリマーであつて、遺伝子プローブ分子は
、その末端に結合したポリ（Ｙ）ホモポリマーによつて
延長され、そのホモポリマーが上記マイクロビーズに結
合され、この場合、 ＸはｄＣでＹはＧ、 ＸはＣでＹはＧ ＸはｄＧでＹはＣ ＸはＧでＹはＣ ＸはｄＣでＹはｄＧ ＸはＣでＹはｄＧ ＸはｄＧでＹはｄＣあるいは ＸはＧでＹはｄＣである、特許請求の範囲第５項または
６項によるキット。 ８、構成要素（ｂ）が異なつた種類のマイクロビーズの
水懸濁液であつて、異なつたマイクロビーズの各々の種
類には対応する異なつたタイプの遺伝子プローブ分子が
結合され、遺伝子プローブ分子の各々のタイプが、アツ
セイを行う異なつた種類のｍＲＮＡ分子のうちの特定の
ものとハイブリッドし得、マイクロビーズの各々の種類
が各々の異なつたタイプの遺伝子プローブ分子に対応す
る異なつた金属元素により標識されていることを特徴と
する、特許請求の範囲第６項によるキット。 ９、異なつたタイプの遺伝子プローブ分子の結合した異
なつた標識を有するマイクロビーズが異なつた各々の種
類のマイクロビーズの水懸濁液として別な容器に入れら
れていることを特徴とする特許請求の範囲第８項による
キット。 １０、構成要素として更に以下のものを含有することを
特徴とする特許請求の範囲第６項による方法： （ｃ）上記遺伝子発現アツセイによつてアツセイされ得
、固相支持体要素に結合し得る、既知量の標準物質；及
び （ｄ）（ｂ）の水懸濁液に含有され、または別々の水懸
濁液として容器に入れられた構成要素（ｂ）のマイクロ
ビーズの更に他の種類。当該更に他の種類のマイクロビ
ーズは、上記標準物質に選択的に結合し得、アツセイを
行う標的ｍＲＮＡ分子に結合するマイクロビーズの標識
とは異なつた金属元素によつて、対応して、標識されて
いる。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9078987A | 1987-08-28 | 1987-08-28 | |
| US090.789 | 1987-08-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0195800A true JPH0195800A (ja) | 1989-04-13 |
Family
ID=22224313
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63212293A Pending JPH0195800A (ja) | 1987-08-28 | 1988-08-26 | 遺伝子発現のアツセイ法及びキツト |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0304845A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0195800A (ja) |
| CA (1) | CA1321746C (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7642086B2 (en) | 2005-08-09 | 2010-01-05 | Canon Kabushiki Kaisha | Labeled probe bound object, method for producing the same and method for using the same |
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