WO2004042401A1 - 癌細胞の検査方法及びそのための試薬 - Google Patents

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WO2004042401A1
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Hiroshi Takahashi
Shuichi Hanada
Makoto Mitsunaga
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Hiroshi Takahashi
Shuichi Hanada
Makoto Mitsunaga
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles

Definitions

  • the present invention relates to a method for testing cancer cells and a reagent therefor.
  • a characteristic antigen expressed on a cell As a marker and collect cells expressing the characteristic antigen.
  • the most commonly used method involves reacting a fluorescently labeled antibody with an antigen on cells and separating cells based on flow cytometry using fluorescent labeling of the antibody bound on the cells.
  • this device is called a cell sorter.
  • a cell sorter is an expensive device, each of which costs tens of millions of yen, and is convenient, the purity of the collected cell population is not always high enough.
  • An object of the present invention is to provide a method for easily and efficiently testing cancer cells without using an expensive device, and a reagent therefor.
  • the inventors of the present application have collected cancer cells expressing the SF-25 antigen by binding them to magnetic beads using an anti-SF-25 antibody, The present inventors have found that cancer can be diagnosed by examining cells, and completed the present invention.
  • the present invention relates to a method of treating a cancer cell isolated from a living body, which expresses SF-25 antigen on the cell surface, with an antigen-antibody reaction between the cancer cell and an anti-SF-25 antibody or an antigen-binding fragment thereof. To bind to the magnetic beads, and then collect the magnetic beads by a magnetic force.
  • a method for testing cancer cells comprising testing the cancer cells bound to a cancer cell.
  • the present invention also provides a cancer cell test reagent for performing the above method of the present invention, comprising a magnetic bead on which an anti-SF-25 antibody or an antigen-binding fragment thereof is immobilized.
  • cancer cells can be easily and efficiently tested without using an expensive device such as a cell sorter.
  • the collection of magnetic beads can be performed manually using a magnet-based device or a magnet, and can be performed at a much lower cost than when a cell sorter is used.
  • the purity of the collected cells is higher than that in the case of using a cell sorter, that is, only the SF-25 antigen-expressing cells can be collected accurately. Therefore, the subsequent inspection can be performed efficiently and accurately.
  • FIG. 1 shows that in the example of the present invention, mononuclear cells in peripheral blood of acute ATL patients, chronic ATL patients, smoldering AT patients, healthy ATL carriers and healthy persons (HTLV-1 non-infected persons) were tested.
  • FIG. 4 is a view showing the ratio of SF-25 antigen-positive mononuclear cells to all mononuclear cells, as measured by flow cytometry using an anti-SF-25 monoclonal antibody as a sample.
  • FIG. 2 is a diagram showing the relationship between the fluorescence intensity and the number of cycles when various concentrations of the pX gene were amplified in the examples of the present invention.
  • a cancer cell expressing the SF-25 antigen on the cell surface which is isolated from a living body, is combined with the cancer cell and an anti-SF-25 antibody or antigen binding thereof. It is bound to magnetic beads using an antigen-antibody reaction with a sexual fragment.
  • the SF-25 antigen is a known glycoprotein antigen with a molecular weight of about 125 kDa discovered in 1987 (W089 / 05307, EP 0 397 700, US Pat. No. 5,212,085, Takahashi H, Wilson B, Ozturk, Motte P, Strauss W, Isselbacher KJ and Wands JR.In vivo localization of colon adenocarcinoma by monoclonal antibody bin ding to a highly expressed eel I surface anti en. Cancer Research 1988; 48: 6573-6579.
  • SF-25 antigen is a human colon cancer cell line (e.g., LS180 (ATCC No.CL0187), C0L0320 (ATCC No.CCL-220.1), WiDr (ATCC No.CGL-218), Gaco-2 (HTB-37) and human liver cancer cell lines (eg, F0GUS (Lun H. et al., In Vitro 20; 493-504 (1984))).
  • Anti-SF-25 monoclonal antibodies are also known (W089 / 05307, EP 0397700, US Pat. No. 5,212,085), and a hybridoma producing an anti-SF-25 monoclonal antibody has been Deposited (ATCC No. HB9599) 0
  • the anti-SF-25 antibody is preferably a monoclonal antibody.
  • anti-SF-25 monoclonal antibodies are known and have been deposited.
  • c Monoclonal antibodies produced by the hybridoma ATCG No.HB9599 were obtained by immunizing mice using the above-mentioned human hepatoma cell line F0GUS as an immunogen and preparing monoclonal antibodies to produce monoclonal antibodies by a conventional method. It was obtained by selecting from among the monoclonal antibodies, those monoclonal antibodies that react with the various human colon cancer cell lines described above as antigen-antibody antibodies.
  • the deposited anti-SF-25 monoclonal antibody can be used, or another monoclonal antibody produced by a similar method can be used.
  • a large number of hybridomas producing an anti-SF-25 monoclonal antibody other than ATGG No. HB9599 can be obtained in one production operation.
  • the monoclonal antibody used in the method of the present invention is not at all limited to those produced by the deposited hybridoma.
  • a fragment having an antigen-binding property such as a Fab fragment or an F (ab ') 2 fragment, can be used.
  • Magnetic beads are particles that have been magnetized by a method such as blending ferrite with latex particles / polystyrene particles, and those carrying an antigen or antibody are well known in the field of immunoassay, and are commercially available. Has also been. In the method of the present invention, commercially available magnetic beads for immunoassay can be suitably used. Further, as the magnetic particles used in the present invention, particles that do not adsorb cells other than target cells that bind via the SF-25 antibody by non-specific interaction are desirable, and Dynabeads (trade name, Dynal Biotech) can be used.
  • Cancer cells isolated from a living body, which express the SF-25 antigen on the cell surface, are subjected to magnetic beads by utilizing an antigen-antibody reaction between the cancer cells and an anti-SF-25 antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • the direct method is a method in which an anti-SF-25 antibody or an antigen-binding fragment thereof is immobilized on magnetic beads, and the cancer cells are directly bound to the magnetic beads by an antigen-antibody reaction between the antibody and the cancer cells.
  • the direct method requires only one antigen-antibody reaction and can be performed quickly and easily. There are advantages.
  • the method itself for immobilizing an antibody or an antigen-binding fragment thereof on magnetic beads is well known.
  • the method can be carried out by adding magnetic beads to a solution of the antibody or the antigen-binding fragment thereof and physically adsorbing the antibody or the antigen-binding fragment on the magnetic beads.
  • the concentration of the antibody or antigen-binding fragment thereof in the mixture is not particularly limited, but is usually about 0.001 to 1% by weight, and the concentration of the magnetic beads is not particularly limited. ⁇ 50 weight ⁇ 1 ⁇ 2.
  • the conditions for physical adsorption are not particularly limited. Generally, the adsorption can be carried out at 4 ° C. to 45 ° C. for about 0.5 to 48 hours.
  • the immobilization of the antibody or the antigen-binding fragment thereof on the magnetic beads is not limited to physical adsorption, but may be performed by other known methods, for example, such as amino group-carboxyl group binding on magnetic beads. It is also possible to adopt a method of making a covalent bond using a functional group.
  • a cancer cell is reacted with a labeled or unlabeled anti-SF-25 antibody or an antigen-binding fragment thereof by an antigen-antibody reaction to bind the antibody or the antigen-binding fragment thereof to cells. Then, or simultaneously, the antibody or the antigen-binding fragment thereof or a label bound thereto is specifically reacted with the magnetic beads, and the cells are then transferred to the magnetic beads via the antibody or the antigen-binding fragment thereof. It is a method of binding to. When an unlabeled antibody or an antigen-binding fragment thereof is used, an antibody or an antigen-binding fragment thereof that reacts with the antibody or the antigen-binding fragment with the magnetic beads is immobilized on the magnetic beads.
  • the anti-SF-25 antibody to react with cancer cells is mouse IgG
  • the anti-mouse IgG antibody can be immobilized on magnetic beads.
  • an antibody to the label or an antigen-binding fragment thereof or a substance that specifically binds to the label is immobilized on a magnetic bead.
  • any label may be used as long as it has antigenicity and does not interfere with the antigen-antibody reaction between cancer cells and the anti-SF-25 antibody or antigen-binding fragment thereof. Can be.
  • a well-known fluorescent label such as fluorescein thiosocyanate (FITG) is bound to an anti-SF-25 monoclonal antibody as a label, and this FITG is immobilized on an anti-FG antibody.
  • FITG fluorescein thiosocyanate
  • biotin may be used as a label, and biotin may be bound to magnetic beads on which an avidin derivative such as avidin or streptavidin is immobilized. Therefore, a label that can specifically bind to other substances, such as biotin, and does not interfere with the antigen-antibody reaction between cancer cells and the anti-SF-25 antibody or antigen-binding fragment thereof If so, any of them can be adopted.
  • the anti-mouse IgG antibody-immobilized magnetic beads, anti-FITG antibody-immobilized magnetic beads, and streptavidin-immobilized magnetic beads used in the indirect method are widely used in the field of immunoassay. It is also commercially available due to its high versatility. In the method of the present invention, these commercially available magnetic beads can be preferably used.
  • the cancer cells that can be tested by the method of the present invention may be any cancer cells, as long as they express the SF-25 antigen on their surface, and may be leukemia cells, colon cancer Cells, small intestine cancer cells, gastric cancer cells, esophageal cancer cells, bile duct cancer cells, gallbladder cancer cells, thyroid cancer cells, parathyroid cancer cells, prostate cancer cells, uterine cancer cells, ovarian cancer cells, villous epithelial cancer cells, testicular tumor cells And bladder cancer cells, renal cancer cells, adrenal cancer cells, brain tumor cells, malignant melanoma cells, skin cancer cells, lung cancer cells, breast cancer cells, Teng cancer cells, and liver cancer cells.
  • Leukemia cells include cancerous lymphocytes and mononuclear cells. In Example 1 below, adult T-cell leukemia (adult Tee le I leukemia: ATL), which is a cancerous lymphocyte, was tested, but SF- The expression of 25 antigens was not previously known.
  • blood or cells separated from blood is used as the test sample.
  • various cancer cells leukemia cells are contained in blood, so it is natural that blood or cells separated from blood are subject to the method of the present invention.
  • Solid cancer cells such as cells, lung cancer cells, breast cancer cells, thyroid cancer cells, and liver cancer cells can also be obtained by exfoliating tissues from blood, cerebrospinal fluid, bone marrow, pleural effusion, ascites, peritoneal fluid, duodenal juice, bile, Since it is contained in feces or urine, the method of the present invention also enables the examination of these solid cancer cells using blood or the like.
  • a biopsy is required.
  • a blood sample that is much easier and safer to collect than a biopsy of an organ tissue is tested. Used as a sample This is advantageous because
  • the conditions of the antigen-antibody reaction between the magnetic beads on which the antibody or the antigen-binding fragment thereof is immobilized and the cancer cells are not particularly limited, but the target cells (a mixture of normal cells and cancer cells) If the cell suspension has already been separated, the cell suspension and the magnetic beads may be contacted, for example, at a temperature of about 4 ° C to 45 ° C for about 0.5 to 24 hours. it can.
  • the cell density in the mixture is particularly limited, such bur normally one m I ⁇ 1 0 about six m I, also, the concentration of the magnetic beads is not particularly limited, usually, It is about 0.1% to 10% by weight.
  • the blood When the blood is brought into contact with the magnetic beads, for example, the blood can be brought into contact at a temperature of about 4 ° C. to 45 ° C. for about 0.5 to 24 hours.
  • the concentration of the magnetic beads in the mixture may be the same as described above.
  • the concentration of the anti-SF-25 antibody or an antigen-binding fragment thereof that causes an antigen-antibody reaction with cancer cells is not particularly limited, but is usually about 0.001% by weight to 1% by weight.
  • the conditions of the antigen-antibody reaction are as follows: the reaction between cancer cells and an anti-SF-25 antibody or an antigen-binding fragment thereof; and the generated antigen-antibody complex and the antibody on magnetic beads or the antigen-binding fragment thereof.
  • an antigen-antibody reaction between cancer cells and an anti-SF-25 antibody or an antigen-binding fragment thereof may be performed first, and then the generated antigen-antibody complex may be reacted with magnetic beads.
  • the above two reactions may be performed in parallel in the presence of a cancer cell, an anti-SF-25 antibody or an antigen-binding fragment thereof, and magnetic beads.
  • a specific binding substance such as biotin
  • the reaction may be performed under well-known conditions for each label.
  • the magnetic beads are collected by magnetic force.
  • an immunoassay method using magnetic beads is well known, and an apparatus for collecting magnetic beads by magnetic force is also commercially available. Therefore, the method can be easily performed using a commercially available apparatus. Alternatively, it can be done manually using a simple magnet.
  • cells expressing the SF-25 antigen on the surface are bound to the magnetic beads.
  • the cancer cells bound to the magnetic beads are examined. Prior to the test, it is necessary to wash the magnetic beads with a buffer solution and collect them again by magnetic force. Is preferred.
  • the cell inspection itself can be performed by a known method for each cancer cell. For example, tests that can identify each cancer cell, such as nucleic acid tests, pathological tests, and biochemical tests, are performed.
  • DNA was collected from mononuclear cells derived from adult T-cell leukemia (ATL) patients, and the virus of HTLV-I, which is the virus responsible for ATL, which was proviral, was subjected to inverse PCR and ATL is diagnosed by detection by Southern blotting. Nucleic acid tests for detecting marker genes of such pathogenic viruses and various cancers can be mentioned as preferred examples.
  • HTLV-1 ATL
  • Rb retinoblastoma, lung cancer, breast cancer
  • p53 colonal cancer, breast cancer, lung cancer, etc.
  • WTI Wildms tumor
  • APC colonrectal cancer, gastric cancer
  • p1b malignant Melanoma, esophageal cancer
  • NFI malignant melanoma, neuroblastoma
  • 2 meningioma, esophageal cancer
  • VHL kidney cancer
  • DPG-4 engagement cancer
  • SKIAD2 colonrectal cancer
  • PTEN glioblastoma
  • PTG skin basal cell carcinoma
  • int-2 / hst-1 / cycD1 head and neck cancer, esophageal cancer, bladder cancer
  • MD-2 sarcoma, brain tumor
  • erbB1 many Glioma, breast cancer
  • erbB2 neutral
  • EGF receptor breast cancer, etc.
  • p53 protein colonal cancer, liver cancer
  • VEGF vascular epidermal growth factor
  • TGF-S annexin- Inspections
  • 4F2 gene or PCD1 gene whose expression is increased in ubictus in various cancer cells, by RT-PCR (see Example 4).
  • GenBank http: // www. Ncbi. Nlm. Nih.
  • the base sequence can be easily known by searching using the pathogenic virus name or cancer marker name as a key word.
  • the nucleotide sequence of the gene or cDNA is known, for example, any region in the sequence is amplified by a known nucleic acid amplification method such as PCR. By examining whether amplification will occur, cells will be able to detect the pathogenic viral genes or oncogenes. It is possible to check whether each gene has one gene or is expressed in a cell.
  • the length of the primer used for the PCR is 15 bases or more, preferably about 18 bases to 50 bases.
  • a nucleic acid amplification method is carried out using a target nucleic acid gene or a cancer marker gene or a part of the base sequence of cDNA or their complementary strand as a primer and a test nucleic acid as type I, If the test nucleic acid is not contained in the sample while the test nucleic acid is amplified, amplification does not occur.Therefore, by detecting the amplification product, it is known whether or not the test nucleic acid is present in the sample. be able to.
  • the amplification product can be detected by electrophoresis of the reaction solution after amplification and staining the band with ethidium bromide, or by immobilizing the amplification product after electrophoresis on a solid phase such as a nylon membrane, This can be carried out by hybridizing with a labeled probe that specifically hybridizes with, washing, and then detecting the label. Further, by performing so-called real-time detection PCR using a quencher fluorescent dye and a reporter fluorescent dye (see Examples below), the amount of the test nucleic acid in the sample can be determined. It should be noted that a kit for real-time detection PCR is also commercially available, so it can be easily performed.
  • test nucleic acid may be mRNA or cDNA reversely transcribed from mRNA.
  • NASBA method 3SR method, TMA method
  • the NASBA method itself is well known, and a kit therefor is commercially available, so that the method can be easily carried out using the pair of primers.
  • a pathogenic virus or cancer marker gene or its cDNA can also be detected by using a nucleic acid probe.
  • a method using a nucleic acid probe is also well known. If the base sequence of the nucleic acid to be detected is known, a labeled nucleic acid probe complementary to a partial region thereof is hybridized with the target nucleic acid, and the label is detected. It can be done by doing.
  • the target pathogenic virus gene Alternatively, a labeled probe in which a nucleic acid complementary to a part of the nucleotide sequence of a cancer marker gene or their cDNA is labeled with a fluorescent label, a radiolabel, a biotin label, or the like can be used.
  • test nucleic acid or its amplified product is immobilized, hybridized with a labeled probe, washed, and the label bound to the solid phase is measured to determine whether the test nucleic acid is present in the sample be able to.
  • immobilize the nucleic acid for measurement hybridize the test nucleic acid, and detect the test nucleic acid bound to the solid phase with a labeled probe or the like.
  • the measurement nucleic acid bound to the solid phase is also called a probe.
  • Pathological tests include the detection of Philadelphia chromosomes in chronic myeloid leukemia, the detection of signet-ring cell carcinoma found in gastric cancer cells, etc., and the appearance of coffee beans found in cancer cell nuclei. Or detection of tumor markers expressed by cancer cells, e.g., CEA (carcinoembryonic antigen), AFP (alfa-feto protein), CA 19-9. DUPAN-2, TPA (tissue polypeptide antigen), etc. Is mentioned.
  • Examples of the biochemical test include measurement by ELISA, which is one of the tumor markers expressed by cancer cells, and measurement of an isozyme of an enzyme expressed by cancer (for example, LDH isozyme 5′-NPD-V isozyme).
  • Reference example 1 ATL detection
  • Mononuclear cells were isolated from peripheral blood of 7 patients with acute ATL, 5 patients with chronic ATL, 9 patients with smoldering ATL, 2 2 healthy ATL carriers 4 and 8 healthy individuals (HTLV-1 non-infected persons).
  • the separation of monocytes was specifically performed as follows. Lytnphaprep (trade name) (Axis-S held PoC AS, Oslo, Norway) Take 5 ml of the sample into a centrifuge tube, and gently overlay 5 ml of heparinized venous blood obtained from the subject. Thereafter, the mixture was centrifuged at 400 g for 30 minutes, and the mononuclear cells floating on the band between the plasma and the separated liquid were collected with a capillary pipe. Phosphorus collected mononuclear cells It was centrifugally washed three times using an acid buffered saline (PBS) and used for the following experiments.
  • PBS acid buffered saline
  • Mouse anti-SF-25 monoclonal antibody (produced by ATGC No. HB9599) is labeled with FITG by a conventional method, and the obtained fluorescently labeled anti-SF-25 monoclonal antibody is used. Cytometry was performed. The flow cytometry was specifically performed as follows. Dispense 0.1 ml aliquots from a mononuclear cell suspension adjusted to 5 x 10 6 / ml in PBS into two small test tubes, and use one of them to add diluted fluorescently labeled anti-SF-25 monoclonal antibody. In addition, 10 JLH and FITG-labeled mouse IgG1 were added to the other one similarly. The reaction was carried out at 4 ° C. for 30 minutes while gently mixing every 10 minutes.
  • the use of the SF-25 antigen on mononuclear cells as a marker allows ATL to be compared with a group of healthy individuals + healthy carriers and an acute + chronic 10 smoldering type. It can be clearly distinguished from the group.
  • HTLV-1 gene had been transformed into the chromosome DNA of the mononuclear cell expressing the SF-25 antigen was examined by inverse PCR and Southern plots. These were specifically performed as follows.
  • Phosphorus Mononuclear 10 7 from the peripheral blood of Li-type ATL patients were separated as described above Kusubu
  • the cells were suspended in acid-buffered saline (primary buffer containing pH 7.2, 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA) at 60 jUl.
  • acid-buffered saline primary buffer containing pH 7.2, 0.5% bovine serum albumin and 2 mM EDTA
  • the cells were resuspended with 90 I buffer, 10 I Anti-FITC micromagnetic beads (Miltenyi Biotech GmbH, Bergish Gladbach, Germany, particle diameter 50 nm) were added, and labeled at 6 ° C for 15 minutes. Mononuclear cells with SF-25 antigen on the surface were bound to magnetic beads. The cells were washed twice to remove unadsorbed magnetic beads, and then resuspended in 500 jI buffer. The cells were transferred to a MACS separation positive selection MS column (Miltenyi Biotec GmbH, Bergish Gladbach, Germany) (Miltenyi Biotec GmbH, Bergish Gladbach, Germany) (which had been washed once with buffer 500 I). After application, cells labeled with magnetic beads by magnetic force (SF-25 antigen-positive cells) and cells not labeled with magnetic beads (SF-25 antigen-negative cells) were fractionated and used as specimens in the following experiments. .
  • primer 1 5'-aagccggcagtcagtcgtga-3 '(HTLV-1 nucleotide sequence 8946-8927)
  • primer 2 5'-aagtaccggcaactctgctg-3' (HTLV-I nucleotide sequence 8958-8977)
  • primer 3 5'-gaaagggaaag gggtggaac-3 '(HTLV-I salted rooster C924's 8924-8905
  • primer 4 5' A second stage nested PCR was performed with -ccagcgacagcccatt ctat-3 '.
  • Incorporation of the HTLV-1 gene in ATL patients is random between each case Force 1 patient Incorporation of the HTLV-1 gene in ATL cells is monoclonal and 3 'LTR of HTLV-1 containing chromosomal DNA
  • Force 1 patient Incorporation of the HTLV-1 gene in ATL cells is monoclonal and 3 'LTR of HTLV-1 containing chromosomal DNA
  • the method of the present invention can detect acute, chronic and smoldering ATL by the method of the present invention.
  • Magnetic particles for cell separation (DYNAL, M-270 Carboxylic Acid) lOOmg
  • the cells were suspended in a MES buffer solution (5 mM, pH 6.0) to a concentration of 5%.
  • EDC hydrochloride (1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), which is a water-soluble carbodiimide reagent, is used.
  • the plate was washed once with a HEPES buffer solution (0.1 ⁇ , ⁇ 7.4) and dispersed in 2 mL of the same buffer solution.
  • Magnetic particles are separated by magnetic separation, PB containing 0.5% BSA and 0.6% citrate Wash three times with S to remove cells that have weakly adsorbed to the particles, then wash once with PBS containing 2mM EDTA, magnetically separate and remove the washings, adversely affecting the nucleic acid amplification reaction Cuic acid was removed.
  • To elute nucleic acids from the cells captured by the magnetic particles add 50 ⁇ of Proteinase K solution (0.8 mg / mL) diluted with lOmM Tris-HCl (pH 8.3) and react at 55 ° C for 15 minutes. To lyse the cells. Subsequently, the reaction was carried out at 95 ° C for 20 minutes to inactivate the proteinase K used for cell lysis and to inactivate the substance that inhibits the cell-derived nucleic acid amplification reaction.
  • KUT-2 cells were quantified by quantitative PCR. Quantification of KUT-2 cells was performed by amplifying and quantifying the 102mer in the pX gene region derived from HTLV-1 virus. The sequences of the primers and probes are shown in Table 2.
  • the total number of captured KUT-2 cells and normal human cells is determined by amplifying and quantifying the llOmer in the ⁇ -globin gene, and the quantified value of KUT-2 cells is calculated therefrom. Asked by subtracting.
  • the sequences of the primers and probes are shown in Table 3.
  • the quantitative PCR used ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). The number of cells from DNA was determined by extrapolating from the number of cycles (Th cycles) in which the fluorescence intensity exceeded a certain reference value (Threshold: Th) during 50 amplification steps to a calibration curve created simultaneously. was.
  • the PCR reaction solution used a hot start reagent (manufactured by Roche Diagnostics) and had the composition shown in Table 4. Amplification was performed by adding 20 ⁇ l of the nucleic acid extract obtained above to 30 ⁇ l thereof. Table 4 Composition of PGR reaction solution
  • PCR conditions were as follows. Polymerase activation 95 ° C for 10 minutes
  • This PCR cycle was repeated 50 times.
  • target KUT-2 cells could be recovered with high efficiency and high purity by a simple operation.
  • the DNA eluted from the collected cells had sufficient purity to be subjected to quantitative PCR. According to the method of the present invention, the accuracy of genetic diagnosis of cells can be improved, and diseases such as cancer can be detected earlier.
  • Heparin-collected blood from a healthy individual was centrifuged to collect a buffy coat. This was overlaid on Ficoll-Paque Plus (Amersham Pharmacia) and centrifuged. And normal human nucleated cell fraction was collected.
  • Human gastric cancer cells 0CUM-2M LN (Fujihara T, Sawada T, Chung KH-YS, Yashiro M, Inoue T and Sowa M. Establishment of lymph node metastatic model for hu man gastric cancer in nude mice and analysis of factors associated with metastasis ), Lung cancer cell Calu-6 (ATCC Number: HTB-56, J Fogh (editor) .Hum an tumor cells in vitro.New York: Plenum Press) 1975.pp. 115-159.), Knee cancer cell Capan-2 (ATCC Number: HTB-80, Dahiya R, Kwak KS, Byrd JC, Ho S, Yoon W, and Kim YS.
  • EX-R & D Smitest EX-R & D (Genome Science Laboratories) was used to extract nucleic acids from human normal cells and various human cancer cells. Specifically, after centrifuging the cell suspension, the supernatant was removed, 151 enzyme solutions, 480 specimen diluents, and 51 co-precipitants were added, mixed, and reacted at 55 ° C for 30 minutes. . 400 1 of the protein solution was added, mixed, and reacted at 55 ° C for 15 minutes. Further, isopropanol 800 was added, mixed, and then centrifuged to remove the supernatant. After washing with 70% ethanol 5001, the mixture was centrifuged and the supernatant was removed in the same manner. It was dissolved in DNase / RNase Free water to obtain a nucleic acid extract.
  • Genes were amplified and quantified from the nucleic acid extract by quantitative RT-PCR.
  • the reverse transcription reaction used Omniscript reverse transcriptase (manufactured by QIAGEN) in the composition shown in Table 6.
  • the nucleic acid extract 51 obtained above was added to the reaction mixture 15 and reacted.
  • RNasin liponuclease inhibitor (Promega) (40 Unit / 1) 0.25 jUl Omniscript reverse transcription enzyme ⁇ ⁇ . 1
  • the reverse transcription reaction was performed under the following conditions.
  • the obtained single-stranded DNA was amplified and quantified by a PCR reaction.
  • target genes to be amplified and quantified lOlmer in the PCD1 gene region and lOlmer in the 4F2 gene region, which are genes whose expression is increased in various cancer cells, were used.
  • the sequences of these primers and probes are shown in Tables 7 and 8.
  • human endogenous housekeeping genes, human beta-actin, human GAPDH, and 18S ribosomal RNA were similarly amplified and quantified.
  • ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (manufactured by Applied Biosystems) was used.
  • the PCR reaction solution used was QuantiTect Probe PCR (manufactured by QIAGEN) and had the composition shown in Table 9.
  • the reaction solution 61 obtained from the reverse transcription reaction was In addition, amplification was performed.
  • the PCR reaction was performed under the following conditions (
  • the ratio of the expression of the human endogenous housekeeping gene to the PCD1 gene and 4F2 gene in human normal cells and human cancer cells was determined. It was revealed that the expression of 4F2 gene and PCD1 gene for human endogenous housekeeping gene was increased from several cell levels in human cancer cells compared to normal human cells.
  • cancer cells in blood can be collected with high efficiency and high purity, and the identified genes can be detected by RT-PCR. It becomes.
  • the method of the present invention enables early detection and diagnosis of cancer using a sample separated from a living body such as blood.
  • cancer cells can be easily and efficiently tested without using an expensive device such as a cell sorter.

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Abstract

高価な装置を用いることなく、簡便に効率良く癌細胞の検査を行うことができる方法及びそのための試薬が開示されている。本発明の癌細胞の検査方法では、SF-25抗原を細胞表面上に発現している､生体から分離された癌細胞を､該癌細胞と抗SF-25抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を利用して磁性ビーズに結合させる。次いで、磁性ビーズを磁力により集め、磁性ビーズ上に結合された前記癌細胞を検査する。

Description

明細書
癌細胞の検査方法及びそのための試薬
技術分野
本発明は、 癌細胞の検査方法及びそのための試薬に関する。
背景技術
従来より、 細胞上に発現される特徴的な抗原をマーカーとして利用し、 該特徴 的抗原を発現している細胞を収集することが行われている。 現在、 最も一般的に 行われている方法は、 蛍光標識した抗体を細胞上の抗原と反応させ、 細胞上に結 合された抗体の蛍光標識を利用したフローサイトメ トリーに基づいて細胞を分離 する方法であり （例えば、日経バイオ最新用語辞典第 5版 Γセルソーター」 の項 ) 、この装置はセルソーターと呼ばれている。 しかしながら、セルソーターは 1台 が数千万円もする高価な装置であり、 便利ではあるが、収集される細胞集団の純 度は必ずしも満足できるほど高くはない。
また、細胞表面上に発現されるマーカー抗原に対する抗体を固定化した磁性ビ ーズを用いて該マーカー抗原を細胞表面上に発現している細胞を分離、 収集する 方法も知られている （例えば、 特表平 8— 5 1 0 3 9 0号公報及び特表 2 0 0 1 —5 2 2 8 0 6号公報） 。 しかしながら、磁性ビーズを用いて収集した細胞集団 の核酸を検索し、 癌の検査に用いることは知られていない。
発明の開示
本発明の目的は、高価な装置を用いることなく、 簡便に効率良く癌細胞の検査 を行うことができる方法及びそのための試薬を提供することである。
本願発明者らは、 鋭意研究の結果、 抗 SF- 25抗体を利用して、 SF-25抗原を発現 している癌細胞を磁性ビーズに結合させて収集し、 磁性ビーズ上に結合された細 胞を検査することにより、 癌の診断を行うことができることを見出し、 本発明を 完成した。
すなわち、本発明は、 SF - 25抗原を細胞表面上に発現している、生体から分離され た癌細胞を、該癌細胞と抗 SF - 25抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を 利用して磁性ビーズに結合させ、 次いで、 磁性ビーズを磁力により集め、 磁性ビ ーズ上に結合された前記癌細胞を検査することを含む癌細胞の検査方法を提供す る。 また、本発明は、抗 SF- 25抗体又はその抗原結合性断片を固定化した磁性ビー ズを含む、 上記本発明の方法を行うための癌細胞検査用試薬を提供する。
本発明の方法によれば、 セルソーターのような高価な装置を用いることなく、 簡便に効率良く癌細胞の検査を行うことができる。 磁性ビーズの収集は、 磁石を 用いた装置又は磁石を用いて手動で行うことができ、 セルソーターを用いる場合 に比べて遥かに安価に行うことができる。 また、磁性ビーズを用いた本発明の方 法では、 セルソーターを用いる場合に比べ、収集される細胞の純度が高く、すなわ ち、 SF- 25抗原発現細胞のみを的確に収集することができ、 このため、その後の検 査も効率良く正確に行うことができる。
図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の実施例において、 急性 ATL患者、 慢性 ATL患者、 くすぶり型 AT し患者、 健常 ATLキャリア及び健常人 （HTLV-1非感染者） の末梢血中の単核球を被 検試料とし、 抗 SF- 25モノクローナル抗体を用いたフローサイトメ トリーにより 測定した、 全単核球中の SF-25抗原陽性単核球の割合を示す図である。
図 2は、 本発明の実施例において、 種々濃度の pX遺伝子を増幅した際の、 蛍 光強度一サイクル数の関係を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
上記の通り、 本発明の癌細胞の検査方法では、 SF- 25抗原を細胞表面上に発現し ている、生体から分離された癌細胞を、該癌細胞と抗 SF - 25抗体又はその抗原結合 性断片との抗原抗体反応を利用して磁性ビーズに結合させる。
SF- 25抗原は、 1987年に発見された分子量約 125 kDaの公知の糖タンパク抗原で ある（W089/05307, 欧州特許第 0 397 700号、 米国特許第 5, 212, 085号、 Takahashi H, Wi lson B, Ozturk , Motte P, Strauss W, Isselbacher KJ and Wands JR. In vivo localization of colon adenocarcinoma by monoclonal antibody bin ding to a highly expressed eel I surface anti en. Cancer Research 1988； 4 8： 6573-6579. 、 Wi lson B, Ozturk M, Takahashi H, Motte P, ew M, Isselba cher KJ and Wands JR. Cel l surface changes associated with transformati on of human hepatocytes to the ma I i gnant phenotype. Proc. Natl. Acad. Sc ん USA 1988； 85： 3140-3144. , Takahashi H, Carlson R, Ozturk M, Sun S, Mo tte P, Strauss W, Isselbacher KJ, Wands JR and Shouva I D. Radioimmunoloc a I ization of hepatic and pulmonary metastasis of human colon adenocarcin oma. Gastroenterology 1989； 96： 1317-1329.、 Hurwitz E, Stancovski I, Wi I check M, Shouva I D, Takahashi H, Wands JR, Sela M. A conjugate of 5-F I uo rourodine- poly (l_ - lysine) and an antibody reacti e with human colon carci noma. Biocon jugate Chemistry 1990； 1: 285—290·、 Wands JR, Takahashi H. S tudies on eel I surface changes associated with transformation of human h epatocytes to the ma I i gnant phenotype and their role as potential immuno targeting sites. In Frontiers of Mucosal Immunology. Volume 2. Eds by Ts uchiya . 1991 pp. 295-298. Hurwitz E, Adler R, Shouva I D, Takahashi H， Wands JR, Sela M. Immunotar eting of daunomycin to localized and metasta tic human colon adenocarcinoma in athymic mice. Cancer Immunology Immuno therapy 1992； 35： 186-192.、 Takahashi H, Nakada T, Puisieux I. Inhibitio n of human colon cancer growth by antibody-directed human LAK eel Is in S CID mice. Science 1993； 259： 1460— 1463.、 Takahashi H, Nakada T, Nakaki M, Wands JR. Inhibition of hepatic metastases of human colon cancer in nu de mice by a chimeric SF-25 monoclonal antibody. Gastroenterology 1995； 108： 172-182. ) 0 SF-25抗原は、 ヒ卜大腸癌細胞株 (例えば、 LS 180 (ATCC No. CL0187), C0L0 320 (ATCC No. CCL-220.1), WiDr (ATCC No. CGL-218), Gaco-2 (HTB- 37)や、 ヒ卜肝癌細胞株 (例えば F0GUS (Lun H. et al. , in Vitro 20； 493 - 504 (1984))の表面上に発現していることが知られている。 また、 抗 SF-25モノク ローナル抗体も公知であり（W089/05307, 欧州特許第 0397 700号、 米国特許第 5, 212, 085号）、 抗 SF-25モノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマが ATCCに寄 託されている（ATCC No. HB9599) 0
抗 SF- 25抗体は、 モノクローナル抗体であることが好ましい。 上記の通り、 抗 S F- 25モノクローナル抗体は公知であり、 寄託もされている。 寄託されている、 ハ イブリ ドーマ ATCG No. HB9599により産生されるモノクローナル抗体は、 上記し たヒト肝癌細胞株 F0GUSを免疫原としてマウスに免疫し、 常法によりモノクロ一 ナル抗体を産生するハイプリ ドーマを作製し、 得られたモノクローナル抗体のう ち、 上記した各種ヒ卜大腸癌細胞株と抗原抗体反応するモノクローナル抗体を選 択することにより得られた。 本発明の方法には、 この寄託された抗 SF- 25モノク ローナル抗体を用いることもできるし、 同様な方法で作製される他のモノクロ一 ナル抗体を用いることもできる。 なお、 ATGG No. HB9599を記載している W089/05 307, 欧州特許第 0 397 700号及び米国特許第 5, 212, 085号の実施例に具体的に記 載されているように、 上記の方法により、 抗 SF-25モノクローナル抗体を産生す るハイプリ ドーマは、 ATGG No. HB9599以外にも 1回の作製操作で多数得られて いるから、 抗 SF-25モノクローナル抗体は、 公知の方法により容易に作製可能な ものであり、 したがって、 本発明の方法に用いられるモノクローナル抗体は、 寄 託されたハイプリ ドーマが産生するものに限定されるものでは全くない。 また、 抗体自体のみならず、 Fabフラグメントや F (ab' ) 2フラグメントのような、 抗原と の結合性を有する断片も用いることができる。
磁性ビーズは、ラテックス粒子ゃポリスチレン粒子に、フェライ トを配合する等 の方法により磁性を持たせた粒子であり、これに抗原又は抗体を担持させたもの は免疫測定の分野において周知であり、 市販もされている。 本発明の方法におい ては、 免疫測定用の市販の磁性ビーズを好適に使用することができる。 また、 本 発明に用いる磁性粒子としては、 SF-25抗体を介して結合する標的細胞以外の細 胞を非特異的な相互作用によって吸着しない粒子が望まれ、 好適にはダイナビー ズ （商品名、 Dyna l Biotech社製） 等を用いることが出来る。
SF- 25抗原を細胞表面上に発現している、生体から分離された癌細胞を、該癌細 胞と抗 SF-25抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を利用して磁性ビー ズに結合させる方法には、 直接法と間接法があり、いずれをも採用することがで きる。 直接法は、磁性ビーズに抗 SF- 25抗体又はその抗原結合性断片を固定化し、 これと癌細胞との間の抗原抗体反応により、 癌細胞を磁性ビーズに直接結合させ る方法である。 直接法は、 抗原抗体反応が 1回でよいので迅速、 簡便に実施でき る利点がある。
磁性ビーズに抗体又はその抗原結合性断片を固定化する方法自体は周知である。 例えば、 抗体又はその抗原結合性断片の溶液に磁性ビーズを加え、磁性ビーズ上 に抗体又はその抗原結合性断片を物理吸着させることにより行うことができる。 この場合、 混合物中の抗体又はその抗原結合性断片の濃度は、特に限定されない が、 通常、 0. 001〜1重量％程度であり、磁性ビーズの濃度は、 特に限定されない 力 通常、 0. 1〜50重量 <½程度である。 また、物理吸着の条件は特に限定されない 力 通常、 4 °C〜 4 5 °Cで 0. 5時間〜 4 8時間程度インキュべ一卜することにより 行うことができる。 なお、磁性ビーズ上への抗体又はその抗原結合性断片の固定 化は、 物理吸着に限定されるものではなく、他の公知の方法、例えば磁性ビーズ上 に結合されたアミノ基ゃカルボキシル基等の官能基を利用して共有結合させる方 法等を採用することも可能である。
. 一方、 間接法は、癌細胞と、 標識した又は標識していない抗 SF - 25抗体又はその 抗原結合性断片とを抗原抗体反応させて、該抗体又はその抗原結合性断片を細胞 に結合させ、 次いで若しくはこれと同時に、 該抗体若しくはその抗原結合性断片 又はこれに結合されている標識と、磁性ビーズとの特異的反応により、 該抗体又 はその抗原結合性断片を介して細胞を磁性ビーズに結合させる方法である。 標識 していない抗体又はその抗原結合性断片を用いる場合には、 磁性ビーズには、該 抗体又はその抗原結合性断片と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を 固定化する。 例えば、 癌細胞と反応させる抗 SF-25抗体がマウス I g Gである場 合には、 磁性ビーズに抗マウス I g G抗体を固定化することができる。 また、標 識抗体又はその抗原結合性断片を癌細胞に結合させる場合には、 その標識に対す る抗体若しくはその抗原結合性断片又は該標識と特異的に結合する物質を磁性ビ ーズに固定化する。 したがって、 標識としては、 抗原性を有し、 癌細胞と抗 SF-2 5抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を妨害しないものであれば、いず れのものをも採用することができる。 例えば、 下記実施例では、 蛍光標識として 周知のフルォレツセィンィソチオシァネ一ト（FI TG)を標識として抗 SF- 25モノク ローナル抗体に結合し、 この FI TGを、抗 F G抗体固定化磁性ビーズに結合させて いる。 あるし、は、標識としてビォチンを用い、 アビジン又はストレプトアビジン のようなアビジン誘導体を固定化した磁性ビーズにビォチンを結合させてもよい。 したがって、 標識としては、 また、ビォチンのような、他の物質と特異的に結合可 能であり、 癌細胞と抗 SF- 25抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を妨 害しないものであれば、いずれのものをも採用することができる。 なお、間接法で 用いられる、抗マウス I g G抗体固定化磁性ビーズ、 抗 F I TG抗体固定化磁性ビー ズ及びストレプトァビジン固定化磁性ビーズ等は、免疫測定の分野で広く用いら れており、 汎用性が高いので市販もされている。 本発明の方法では、 これらの市 販の磁性ビーズを好ましく用いることができる。
本発明の方法により、 検査を行 ことができる癌細胞としては、その表面上に S F - 25抗原を発現している癌細胞であれば、いずれの癌細胞であってもよく白血病 細胞、 大腸癌細胞、 小腸癌細胞、 胃癌細胞、 食道癌細胞、 胆管癌細胞、 胆のう癌 細胞、 甲状腺癌細胞、 副甲状腺癌細胞、 前立腺癌細胞、 子宮癌細胞、 卵巣癌細胞、 絨毛上皮癌細胞、 睾丸腫瘍細胞、 膀胱癌細胞、 腎癌細胞、 副腎癌細胞、 脳腫瘍細 胞、 悪性黒色種細胞、 皮膚癌細胞、 肺癌細胞、 乳癌細胞、 滕臓癌細胞、 又は肝癌 細胞を挙げることができる。 白血病細胞としては、 癌化したリンパ球や単核球を 挙げることができる。 なお、下記実施例 1では、 癌化したリンパ球である成人型 T細胞白血病 (adu l t T ee l I l eukem i a : ATL) を検査しているが、 癌化したリン パ球上に SF - 25抗原が発現していることはこれまでに知られていなかった。
本発明の好ましい態様では、 被検試料として血液又は血液から分離された細胞 が用いられる。 上記した各種癌細胞のうち、 白血病細胞は、 血液中に含まれてい るから、血液又は血液から分離された細胞が本発明の方法の対象になるのは当然 であるが、 大腸癌細胞、 胃癌細胞、 肺癌細胞、 乳癌細胞、 滕臓癌細胞及び肝臓癌 細胞等の固形癌細胞も、組織から剥離した細胞が血液、脳脊髄液、骨髄、 胸水、 腹 水、塍液、十二指腸液、胆汁、 糞便又は尿中に含まれているので、 血液等を利用し てこれらの固形癌細胞の検査も本発明の方法により可能になる。 固形癌細胞を、 臓器組織から採取する場合には、 生検が必要となるが、 本発明の方法によれば、 臓器組織の生検に比べてはるかに採取が容易で安全な血液を被検試料として用い ることができるので有利である。
直接法の場合、 抗体又はその抗原結合性断片が固定化された磁性ビーズと癌細 胞との抗原抗体反応の条件は、 特に限定されないが、対象となる細胞 （正常細胞 と癌細胞の混合物） が既に分離されている場合には、細胞浮遊液と磁性ビーズと を、例えば、 4 °C〜4 5 °C程度の温度下で 0. 5時間〜 2 4時間程度接触させること により行うことができる。 この場合の、 混合物中の細胞密度は、 特に限定されな いが、 通常、 1個 m I 〜 1 0 6個 m I程度であり、 また、磁性ビーズの濃度 は、 特に限定されないが、 通常、 0. 1重量％〜1 0重量％程度である。 また、血液 を磁性ビーズと接触させる場合には、 例えば、 4 °C〜4 5 °C程度の温度下で 0. 5 時間〜 2 4時間程度接触させることにより行うことができる。 この場合の、混合 物中の磁性ビーズの濃度は、 上記と同様でよい。 間接法の場合、 癌細胞と抗原抗 体反応させる抗 SF- 25抗体又はその抗原結合性断片の濃度は、 特に限定されない が、 通常、 0. 001重量％〜1重量《½程度でぁリ、 また、抗原抗体反応の条件は、 癌 細胞と抗 SF-25抗体若しくはその抗原結合性断片との反応、 及び、 生成された抗 原抗体複合物と、 磁性ビーズ上の抗体又はその抗原結合性断片との反応のいずれ も、上記した直接法と同様な条件下で行うことができる。 また、間接法の場合、 癌 細胞と抗 SF - 25抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を先ず行い、 つい で、 生成された抗原抗体複合物を磁性ビーズと反応させてもよいし、 癌細胞、 抗 SF - 25抗体又はその抗原結合性断片及び磁性ビーズを共存させて上記 2つの反応 を並行して行わせてもよい。 また、標識として、 ビォチン等の特異結合性物質を 用いる場合には、 各標識にとつて周知の条件で反応を行えばよい。
次いで、 磁性ビーズを磁力により集める。 上記の通り、 磁性ビーズを用いた免 疫測定法は周知であり、 磁力により磁性ビーズを収集するための装置も市販され ているので、 市販の装置を用いて容易に行うことができる。 あるいは、単に磁石 を用いて手動で行うこともできる。
以上の工程により、 表面上に SF-25抗原を発現している細胞が磁性ビーズに結 合される。 次に磁性ビーズに結合された癌細胞の検査を行う。 なお、検査に先立 ち、 磁性ビーズを緩衝液で洗浄し、 磁力により再度収集する、洗浄工程を行うこ とが好ましい。 細胞の検査自体は、 各癌細胞について公知の方法により行うこと ができる。 例えば、 核酸検査、 病理検査、生化学的検査等、 各癌細胞であること を同定することができる検査を行う。 下記実施例 1及び 3では、 成人 T細胞白血 病 (ATL)患者由来の単核球から D N Aを採取し、 プロウィルス化した、 ATLの原因 ウィルスである HTLV-Iの遺伝子をインバース P C R及びその後のサザンブロット 法により検出することにより、 ATLの診断を行っている。 このような病原ウィル スゃ、各種癌のマーカー遺伝子を検出する核酸検査を好ましい例として挙げるこ とができる。 例えば、 HTLV-1 (ATL) 、Rb (網膜芽細胞腫、 肺癌、 乳癌)、 p53 (大腸 癌、 乳癌、 肺癌など） 、WTI (Wi lms腫瘍)、 APC (大腸癌、 胃癌)、 p1b (悪性黒色腫、 食 道癌)、 NFI (悪性黒色腫、 神経芽腫） 、 2 (髄膜腫、 食道癌)、 VHL (腎臓癌)、 DPG - 4 (滕臓癌） 、SKIAD2 (大腸癌） 、 PTEN (神経膠芽腫） 、 PTG (皮膚基底細胞癌） 、in t-2/hst-1/cycD1 (頭頸部癌、 食道癌、膀胱癌） 、 MD -2 (肉腫、 脳腫瘍） 、erbB1 (多型グリオ一マ、 乳癌） 、erbB2(neu) (乳癌、 胃癌、卵巣癌） 、G- myc (子宮癌、 肺小細胞癌、 乳癌） 、N-myG (神経芽細胞腫、肺小細胞癌、 肉腫） 、H- ras (子宮癌 ) 、K - ras (胃癌）、 c-met (胃癌) ,Κ-sam (胃癌) 、AKT- 1， AKT-2 (S/T-PK) (ともに 胃癌、 卵巣癌） 、Aurora - 2(S/T - PK) (大腸癌） を挙げることができる。 さらに、核 酸検査以外でも、例えば、 EGF受容体 （乳癌等） 、 p53タンパク （大腸癌、 肝臓癌 ) 、血管上皮増殖因子 (VEGF) (肝臓癌、 大腸癌等） 、TGF -S、 annexin - 1等のよう な検査を例示することができる。 また、 各種の癌細胞においてュビクタスに発現 の増加が認められる 4F2遺伝子あるいは PCD1遺伝子の発現を RT-PCRで検索するこ とが好ましい （実施例 4参照） 。 これらの病原ウィルス遺伝子や癌マーカー遺伝 子又はその c D N Aの塩基配列は公知であり、 GenBank等のデータベース （http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/Genbank/ index, htmlで無料で利用可能) に収録されて いるので、 上記病原ウィルス名又は癌マーカー名をキーヮ一ドにして検索するこ とにより、 その塩基配列を容易に知ることができる。 病原ウィルス遺伝子や癌マ 一力一遺伝子の検出は、 遺伝子又は c DN Aの塩基配列がわかっていれば、 例え ば、 該配列中の任意の領域を P C R等の周知の核酸増幅法により増幅し、 増幅が 起きるか否かを調べることにより、 細胞がその病原ウィルス遺伝子若しくは癌マ 一力一遺伝子を有しているか又は細胞内で発現しているか否かを調べることがで さる。
P C R等の核酸増幅法やその後の増幅産物の検出方法は、 この分野において周 知であり、 そのための試薬キット及び装置も市販されているので、 当業者が容易 に実施することができる。 なお、 P C Rに用いるプライマーの長さは 1 5塩基以 上、 好ましくは 1 8塩基〜 5 0塩基程度である。 標的病原ウィルス遺伝子若しく は癌マーカー遺伝子又はそれらの c D N Aの塩基配列の一部及びその相補鎖の一 対をプライマーとして用い、 被検核酸を錶型として用いて核酸増幅法を行うと、 被検核酸が増幅されるのに対し、 検体中に被検核酸が含まれない場合には増幅が 起きないので、 増幅産物を検出することにより検体中に被検核酸が存在するか否 かを知ることができる。 増幅産物の検出は、 増幅後の反応溶液を電気泳動し、 バ ンドをェチジゥムブロミ ド等で染色する方法や、 電気泳動後の増幅産物をナイ口 ン膜等の固相に不動化し、 被検核酸と特異的にハイブリダィズする標識プローブ とハイブリダィズさせ、 洗浄後、 該標識を検出することにより行うことができる。 また、 クェンチヤ一蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いたいわゆるリアルタイ ム検出 P C R (下記実施例参照） を行うことにより、 検体中の被検核酸の量を定 量することも可能である。 なお、 リアルタイム検出 P C R用のキットも市販され ているので、 容易に行うことができる。 さらに、 電気泳動バンドの強度に基づい て被検核酸を半定量することも可能である。 なお、 被検核酸は、 m R N Aでも、 m R N Aから逆転写した c D N Aであってもよい。 被検核酸として m R N Aを増 幅する場合には、 上記一対のプライマーを用いた NASBA法 (3SR法、 TMA法） を採 用することもできる。 NASBA法自体は周知であり、 そのためのキットも市販され ているので、 上記一対のプライマーを用いて容易に実施することができる。
病原ウィルス若しくは癌マーカー遺伝子若しくはその c D N Aは、 核酸プロ一 ブを用いることによつても検出することができる。 核酸プローブを用いる方法も 周知であり、 検出対象となる核酸の塩基配列がわかっていれば、 その一部の領域 に相補的な標識核酸プローブを対象核酸とハイプリダイズさせ、 該標識を検出す ることにより行うことができる。 プローブとしては、 標的病原ウィルス遺伝子若 しくは癌マーカー遺伝子又はそれらの c D N Aの塩基配列の一部に相補的な核酸 に蛍光標識、 放射標識、 ビォチン標識等の標識を付した標識プローブを用いるこ とができる。 被検核酸又はその増幅物を固相化し、 標識プローブとハイブリダィ ズさせ、 洗浄後、 固相に結合された標識を測定することにより、 検体中に被検核 酸が存在するか否かを調べることができる。 あるいは、 測定用核酸を固相化し、 被検核酸をハイブリダィズさせ、 固相に結合した被検核酸を標識プローブ等で検 出することも可能である。 このような場合、 固相に結合した測定用核酸もプロ一 ブと呼ばれる。
また、 上記方法によリ磁気ビーズ上に捕捉した癌細胞の病理検査及び生化学的 検査としては、 次のようなものを例示することができる。 病理検査としては、 慢 性骨髄性白血病におけるフィラデルフィア染色体の検出、 胃癌細胞などで認めら れる印環細胞癌 （signet- ring cell carcinoma) の検出、 癌細胞の核に認めら れるコーヒービーン様所見の検出、 あるいは癌細胞が発現する腫瘍マーカー、 例 ぱ、 C E A (carcinoembryonic antigen) 、 A F P (alfa-feto protein) 、 C A 1 9 - 9 . D U P A N- 2、 T P A (tissue polypeptide antigen) 等の検 出が挙げられる。 また、 生化学的検査としては癌細胞が発現する前記腫瘍マーカ 一の E L I S Aによる測定や癌が発現する酵素のアイソザィム （例えば、 L D H アイソザィムゃ 5 ' - N P D- Vアイソザィム） の測定が挙げられる。
以下、 本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。 もっとも、 本発明は下 記実施例に限定されるものではない。
参考例 1 ATLの検出
1 . 試料の調製
急性 ATL患者 7名、 慢性 ATL患者 5名、 くすぶり型 ATL患者 9名、 健常 ATLキヤリ ァ 4 2名及び健常人 （HTLV-1非感染者） 8名の末梢血から単核球を分離した。 単 核球の分離は、 具体的に次のようにして行った。 Lytnphaprep (商品名） （Axis - S held PoC AS, Oslo, Norway) 5m I を遠心管にとり、 前記対象から得られたへパ リン加静脈血 5m lを静かに重層する。 その後 400g、 30分遠心し血漿と分離液の中 間に帯上に浮遊する単核球を毛細管ピぺッ卜で回収した。 回収した単核球をリン 酸バッファー生理食塩水 (PBS)を用いて 3回遠心洗浄し、 以下の実験に用いた。
2 . フローサイトメ トリー
マウス抗 SF-25モノクローナル抗体 (ATGC No. HB9599により産生）を常法により、 F I TGで標識し、 得られた蛍光標識抗 SF- 25モノクローナル抗体を用い、 上記 1で 分離した単核球についてフローサイトメ トリーを行った。 フローサイトメ トリー は、 具体的に次のようにして行った。 PBS中に 5x106/m lとなるよう調整した単核 球浮遊液から、 0. 1 m lずつ 2本の小試験管に分注し、 1本には希釈した蛍光標識 抗 SF- 25モノクローナル抗体を 10 I加え、 他の 1本には同様に F I TG標識マウス I g G1を 1 0 JLH加えた。 1 0分ごとに静かに混和させながら、 4 °C 3 0分間反応させ た。 反応終了後 PBSを加え、 2回遠心洗浄後フローサイトメーター (EPICS XL (商 品名） 、Coulter， Miami, Florida, U. S. A. )にアプライし、 F G標識マウス l gG1 をコントロールとして約 1万個の細胞をカウントし陽性細胞の比率を求めた。
上記フローサイトメ 卜リーにより、 全単核球中の、 SF - 25抗原を発現している 単核球の割合を計測した。 結果を下記表 1及び図 1に示す。
表 1
Figure imgf000013_0001
表 1及び図 1から明らかなように、 単核球上の SF-25抗原をマーカーとして利 用することにより、 ATLについて、 健常人 +健常キャリアの群と、 急性 +慢性十く すぶり型の群とは明瞭に区別することが可能である。
実施例 1
磁性ビーズを用いた SF- 25抗原発現単核球の収集及びその核酸検査
SF - 25抗原を発現している単核球の染色体 D N Aに、 HTLV- 1遺伝子がプロウイ ルス化して揷入されているか否かをィンバース P C R及びサザンプロットによリ 調べた。 これらは、 具体的に次のようにして行った。
(1 ) SF-25抗原発現単核球の収集
くすぶリ型 ATL患者の末梢血から上記のようにして分離した単核球 107をリン 酸緩衝生食水 （pH 7. 2、 0. 5%牛血清アルブミンおよび 2mM EDTAを含む一以下バ ッファー） 60 jU lに浮遊させた。 次に、 FITC標識したマウス抗 SF-25モノクロ一 ナル抗体 (ATGG No. HB9599により産生）溶液 （濃度 0. 1 %) 10 u I を加え 4°C5分 間反応させ、 2回洗浄し未吸着の抗体を除去した。 この細胞に 90 I のバッフ ァ-を加え再浮遊させ、 10 Iの Anti - FITC マイクロ磁性ビ-ズ（Miltenyi Biote c GmbH, Bergish Gladbach, Germany 粒子直径 50nm)を加え、 6°C15分間標識 し、 SF - 25抗原を表面に有する単核球を磁性ビーズと結合させた。 未吸着の磁性 ビーズを除去するため細胞を 2 回洗浄後、 500j« I のバッファーに再浮遊させた。 マツヮス 于イセッ卜 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergish Gladbach, Germany; を用いて、 この細胞を MACS分離ポジティブセレクション MSカラム（Miltenyi Bi otec GmbH, Bergish Gladbach, Germany) (一度バッファー 500〃 I で洗浄した もの） にアプライし、 磁力により磁性ビーズで標識された細胞 （SF-25抗原陽性 細胞） と磁性ビーズで標識されなかった細胞 （SF - 25抗原陰性細胞） を分画し、 以下の実験で検体として用いた。
(2) インバース P C R
Takemoto Sらによる報告 （Blood Vol 84 No9 3080-3085, 1994) に基づき 以下のよつに 1了った。 DNAzo l (Molecular Research Center, Inc. , Montgomery R d. , Cincinnati, Ohio. )を用いて各検体より染色体 D N Aを抽出し、 この DNA を Sau3AIを用いて切断し、 T4 DNA ligaseをもちいてセルフライゲージヨンを 行った。 この方法により、 HTLV-l 5'LTR及び gag sequnceからなるものと、 HTL V - 1 3'一 LTRと染色体 DNAからなるものとができる。 HTLV- 1の 5' proviral DNAか らなるものを除く目的で、 Sac IIで加熱処理した。 この DNAをテンプレートと して primer 1： 5'-aagccggcagtcagtcgtga-3' (HTLV - 1 塩基配列の 8946 - 8927) 、 primer 2： 5'-aagtaccggcaactctgctg-3' (HTLV-I 塩基配列の 8958- 8977)で第 —段階の PCRを if了し、、 次し、で nested primerとして primer 3 : 5'-gaaagggaaag gggtggaac-3' (HTLV-I 塩き酉 C歹リの 8924 - 8905) primer 4: 5'-ccagcgacagcccatt ctat-3'. (HTLV-I 塩基配列の 8986-9005) で第二段階の nested PCR を行った。 各 PCRは Thermal Cycler を用いて 94°C20秒、 55°C20秒、 72°C30秒のサイクル を第一段階は 50回、 第二段階は 35回行った。 この PGR産物 5μ Ι をとリ 2% ァ ガロースゲル電気泳動を行い、 ェチジゥムブロマイドで染色後、 バンドを確認し HTLV-Iのクローナルな組み込みの有無をみた。
(3) サザンプロット
上記の泳動産物を、 ナイロンメンブランフィルタ-にトランスファ一し、 オリ ゴヌクレチド（5，- Gtccaggagagaaatttagtacac- 3' HTLV-I塩基配列の 9012-9035)を プローブとして HTLV-Iの組み込みを確認した。 Takemotoらによる報告によると、 この方法により染色体遺伝子を含む HTLV-1の 3'LTRの U5領域が増幅されると考え られる。 ATL患者における HTLV-1遺伝子の組み込みは各症例間でランダムである 力 1人の患者 ATL細胞における HTLV- 1遺伝子の組み込みはモノク口一ナルであり、 染色体 DNAを含む HTLV - 1の 3'LTRの U5領域を増幅することで、 モノクローナルな増 殖であるか否かを決定できる。 事実彼らは染色体 DNAを含む HTLV- 1の 3'LTRの U5領 域の DNA sequence行うことによリそのことを確認している。
その結果、 SF-25抗原を発現する単核球では、 HTLV- Iプロウィルス化 D N Aが、 モノクローナルに組み込まれており、 SF- 25陰性細胞では、 HTLV- Iのプロウィル ス化は検出されなかった。 このことから、 本発明の方法により、 本発明の方法で、 急性、 慢性及びくすぶリ型 ATLが検出できることが確認された。
実施例 2
SF - 25抗体感作磁性粒子の合成
細胞分離用磁性粒子 （DYNAL社製、 M- 450 Goat anti-Mouse IgG) 10mL (固形 分 300mg) を PBSで 4回リンスした後、 6mLの PBSに分散した。 ここに、 SF - 25 抗体 （1. 0mg/mL)を 0. 60mL添加し、 20°Cで 4時間反応させた後、 生理食塩水で 洗浄して SF-25抗体で感作した磁性粒子を得た。 得られた粒子は 0. 1%ゥシ血清 アルブミン (BSA)を添加したリン酸緩衝溶液 (PBS)に固形分が 2%となるように分 散させた。
実施例 3
SF-25抗体感作磁性粒子の合成 （化学的抗体感作法）
細胞分離用磁性粒子 （DYNAL社製、 M- 270 Carboxylic Acid) lOOmgを、 固形分 濃度が 5%になるように MES緩衝溶液（5mM， pH6. 0)に懸濁した。 この磁性粒子の力 ルポキシル基に抗体を化学的に結合するために、 水溶性カルポジイミド試薬であ る EDC塩酸塩（1 -ェチル -3 (3 -ジメチルァミノプロピル）カルポジイミドヒドロク 口ライド）を 20rag添加し、 20°Cで 1時間反応させて活性化した後、 HEPES緩衝溶 液 (0. 1Μ，ρΗ7. 4)で一回洗浄し、 同緩衝溶液 2mLに分散させた。 そこへ、 SF-25抗 体（1. OmL/mL)を 0. 4mL添加し、 20°Cで 4時間反応させた後、 生理食塩水で洗浄し て SF-25抗体が化学的に結合された磁性粒子を得た。 得られた粒子は 0. 1% BSA を添加した PBSに固形分が 2%となるように分散させた。
実施例 4
KUT-2細胞の分離
健康人からクェン酸採血した血液 5mLを遠心分離し、 バフィ一コートを採取し た。 これに 0. 17M塩化アンモニゥ厶水溶液 10mLを加え室温で 10分放置したのち 遠心分離し、 得られた沈殿を 2mM EDTA含有 PBSで 2回洗浄し、 4. 5mLの 0. 5% BS A及び 0. 6%クェン酸を含有する PBSに浮遊させ、 1. 2 X 106細胞/ mLのヒト正常 有核細胞浮遊液を得た。
10% FCS添加 RPMI1640培地を用いて、 37°C、 5%C02インキュベータで培養した KUT-2細胞 (Hanada S, Tsubai F and Namba Y. The Characteristics of T - eel 1 lines derived from peripheral blodd of patients with adult T-cell leuk emia—丄 ymphoma. Recent Advances in RES Research 1985； 25： 124— 133) ¾r:is心 分離し、 得られた沈殿を 2mM EDTA含有 PBSで 2回洗浄し、 4. OmLの 0. 5% BSA及 び 0. 6%クェン酸含有 PBSに浮遊させ、 6. 0 X 105細胞/ mLの KUT - 2細胞浮遊液を 得た。 上記で得た正常ヒト細胞浮遊液および KUT- 2細胞浮遊液から、 表 5に示し た細胞仕込み数となるように両者を混合し、 合計液量が 1. OmLとなるように 0. 5 % BSA及び 0. 6%クェン酸含有 PBSで希釈した。 この細胞混合液から、 実施例 2お よび実施例 3で合成した SF - 25抗体感作磁性粒子を用いて KUT-2細胞を標的とし て選択分離を試みた。 細胞混合液 1. OmLに実施例 2および実施例 3で合成した S F - 25抗体感作磁性粒子を 50μί (粒子分 lmg) 添加し、 30分間 4°Cで転倒混和を 行った。 磁気分離により磁性粒子を分離し、 0. 5% BSA及び 0. 6%クェン酸含有 PB Sで 3回洗浄して粒子に弱い相互作用で吸着した細胞を除去した後、 2mM EDTA含 有 PBSで 1回洗浄し、 磁気分離して洗浄液を除去して核酸増幅反応に悪影響を及 ぼすクェン酸を除いた。 磁性粒子に捕捉された細胞から核酸を溶出するために、 lOmM Tris-HCl (pH8. 3)で希釈した Proteinase K 溶液 （0. 8mg/mL)を 50μί添加 し、 55°Cで 15分反応して細胞を溶解した。 続いて、 95°Cで 20分反応し、 細胞溶 解に用いた Proteinase Kを失活させると共に、 細胞由来の核酸増幅反応を阻害 する物質を失活させた。
この核酸溶液から 20 Lずつを用いて、 定量 PCR法により磁性粒子に捕捉され た KUT - 2細胞数と正常ヒト細胞数を定量した。 KUT-2細胞の定量は、 HTLV- 1ウイ ルス由来の pX遺伝子領域内の 102merを増幅 '定量することによって行った。 プ ライマーとプローブの配列は表 2に示した。
正常ヒト細胞の定量方法は、 β - グロビン遺伝子内の llOmerを増幅■定量す ることによって、 捕捉した KUT- 2細胞と正常ヒト細胞の合計数を求め、 そこから KUT- 2細胞の定量値を差し引くことで求めた。 プライマーとプローブの配列は表 3に示した。
定量 PCRは、 ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosyst ems 社製）を用いた。 DNAからの細胞数の定量には、 50回の増幅過程において、 蛍光強度が一定の基準値 （Threshold: Th)を越えたサイクル数 （Thサイクル） から、 同時に作成した検量線に外挿して求めた。
この pX遺伝子および ;8 - グロビン遺伝子の検量線作成には、 一定量の KUT - 2 細胞、 あるいは正常ヒト細胞に、 Proteinase K 溶液 （0. 8mg/mL)を添加し、 55°C で 15分反応して細胞を溶解したあと、 95°Cで 20分反応して得られた核酸溶液の 希釈系列を用いた。 図 2に、 pX遺伝子を増幅した際の、 蛍光強度 -サイクル数 の図を示した。 0. 5細胞から 5 X 105細胞の範囲で定量的な増幅を確認した。 この とき、 （細胞数) =1(Γ (30. 77/3. 46- Thサイクル /3. 46)、 相関係数 r=1. 00であつ た。 表 2
Figure imgf000018_0001
表 3
Figure imgf000018_0002
PCR反応液はホットスタート用試薬 （ロシュ 'ダイァグノスティックス社製) を用い、 表 4に示す組成で使用した。 その 30μ1に上記で得た核酸抽出液 20μ1 を加えて増幅を行った。 表 4 PGR反応液組成
PCRグレ一ド蒸留水 17. 95 μΐ
X 10反応 buffer 3 μΐ
MgCl2 (25mM) 5 μΐ
dATP, dGTP, dCTP (lOmM) 各 0. 5 μΐ
dUTP (20mM) 0. 5 μΐ
フォワードプライマー （50μΜ) 0. 6 μΐ
リバースプライマ一 （50μΜ) 0. 6 μΐ
TaqManプローブ（25μΜ) 0. 2 μΐ
FastStart DNAポリメラーゼ （5U/ L) 0. 4 μΐ
ROXレファレンスダイ 0. 25 μΐ
— (インビトロジヱン社製） 一
合計 30 μΐ
PCR条件は以下の通りに行った。 ポリメラーゼの活性化 95°C 10分間
PCR サイクル 60°C 60秒間
95°C 10秒間
この P C Rサイクルは 50回繰リ返した。
得られた KUT - 2細胞の定量値および正常ヒ ト細胞の定量値から、 KUT - 2細胞の 捕捉率、 純度を以下の計算式から求め、 10回の測定値を平均して表 5にまとめ た。 捕捉率 (%) =捕捉した KUT- 2細胞数 ÷仕込み KUT-2細胞数 X 100、 純度 (%) = 捕捉した KUT - 2細胞数 ÷ (捕捉した KUT - 2細胞数 +捕捉した正常ヒト細胞数） X 100 表 5
Figure imgf000019_0001
表 5に示したように、 SF- 25抗体感作磁性粒子を用いることによって、 簡便な 操作で標的の KUT-2細胞を高効率■高純度で回収することができた。 回収した細 胞から溶出させた DNAは定量 PCRに供するに十分な純度を有していた。 本発明の 方法により、 細胞の遺伝子診断の精度アップが可能となり、 癌などの疾患をより 早期に発見する事が可能となる。
実施例 4
ヒト癌細胞からの核酸抽出および増幅
健常人からへパリン採血した血液を遠心分離しバフィ一コートを採取した。 こ れを Ficoll- Paque Plus (Amersham Pharmacia社製) に重層し、 遠心分離した後 に PBSに浮遊させ、 ヒト正常有核細胞分画を採取した。
ヒ卜胃癌細胞 0CUM-2M LN (Fujihara T, Sawada T, Chung K H - YS， Yashiro M, Inoue T and Sowa M. Establishment of lymph node metastatic model for hu man gastric cancer in nude mice and analysis of factors associated with metastasis) 、 肺癌細胞 Calu- 6 (ATCC Number : HTB-56, J Fogh (editor) . Hum an tumor cells in vitro. New York: Plenum Press ) 1975. pp. 115- 159. ) 、 膝癌細胞 Capan- 2 (ATCC Number : HTB- 80、 Dahiya R， Kwak KS， Byrd JC, Ho S, Yoon W， and Kim YS. Mucin synthesis and secretion in various human epit helial cancer cell lines that express the MUC- 1 mucin gene. Cancer Resea rch 1993； 53 : 1437-1443. ) 、 大 S昜癌細胞 HT- 29 (ATCC Number: HTB- 38、 J Fog h (editor) . Human tumor cells in vitro, pp. 115-159. New York: Plenum Pr ess ; 1975. ) 、 子宫癌細胞 HeLa (ATCC Number: CCL-2 Gey GO, Coffman WD and Kubicek MT. Tissue culture studies of the proliferative capacity of cer vical carcinoma and normal epithelium. Cancer Research 1952；
12 : 264-265. ) を PBSに浮遊させ、 一定濃度の細胞浮遊液に調製した。
ヒト正常細胞および各種ヒト癌細胞から核酸を抽出するためにスマイテスト E X-R&D (ゲノムサイエンス研究所社製） を用いた。 具体的には、 細胞浮遊液を遠 心後に上清を除去し、 酵素溶液 15 1、 検体希釈液 480 1、 共沈剤溶液 5 1を 添加し、 混和後 55°Cで 30分間反応させた。 蛋白溶解液 400 1を添加し、 混和 後 55°Cで 15分間反応させた。 更にイソプロパノール 800 を添加し混和の後、 遠心し上清を除去した。 70%エタノール 500 1を加え洗浄後、 遠心し上清を同様 に除去した。 DNase/RNase Freeの水にて溶解し核酸抽出液とした。
この核酸抽出液より定量 RT-PCR反応により遺伝子を増幅■定量した。
逆転写反応には Omniscript 逆転写酵素 （QIAGEN社製） を用い、 表 6に示す組 成で使用した。 その 15 j« 1に上記で得た核酸抽出液 5 1を加えて反応させた。 表 6 逆転写反応液組成
X 10反応バッファー 2〃1 dNTP mix (5mM) 2 fl l ランダムへキサマープライマ一 （CL0NTECH社製） （20 M)
RNasinリポヌクレアーゼ阻害剤 （Promega社製） （40Unit/ 1) 0. 25 jU l Omniscript 逆 ΐ云写酵素 Ι μ. 1
RNase Free 水 8. 75 J« 1 合計
逆転写反応は以下の条件にて行った。
逆転写酵素の活性化 37°C、 60分間
逆転写酵素の不活化 93°C、 5分間
次に、 得られた一本鎖 DNAを PCR反応にて増幅'定量した。 増幅■定量するタ ーゲッ卜遺伝子として、 各種癌細胞で発現が増加する遺伝子である PCD1遺伝子 領域内の lOlmerおよび 4F2遺伝子領域内の lOlmerを用いた。 これらのプライマ —とプローブの配列を表 7および表 8に示した。 一方、 ヒト内在性ハウスキ一ピ ング遺伝子であるヒ卜ベータァクチン、 ヒト GAPDH、 18Sリボソーム RNAを同じ く増幅 "定量した。
表 7
Figure imgf000021_0001
表 8
Figure imgf000021_0002
定量 PCR反応は ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosy stems社製） を用いた。 PCR反応液は QuantiTect Probe PCR (QIAGEN社製） を用 い、 表 9に示す組成で使用した。 その 47 1に逆転写反応で得た反応液 6 1を 加えて増幅を行った。
表 9 定量 PCR反応液組成例
2xQuantiTect Probe PCR Master Mix 25 il
フォワードプライマー （IOOJWM) 0.2/ l
リバースプライマー （100 jUM) 0.2^1
TaqManプローブ (13 0.36 il
蒸留水 18.24 l
合計 44 l
PCR反応は以下の条件にて行った (
ポリメラーゼの活性化 95°C、 15分間
PCRサイクル 94°C、 15秒間
60°C、 60秒間
この PCRサイクルは 50回繰り返した。 RT-PCRからの遺伝子発現の定量には 50 回の増幅過程において、 蛍光強度が一定の基準値 （Threshold :Th) から、 同時に 作成した検量線に外挿して求めた。 検量線の作成には一定細胞量の希釈系列を用 いた。
ヒト正常細胞およびヒト癌細胞においてヒト内在性ハウスキーピング遺伝子と PCD1遺伝子、 4F2遺伝子の発現の比を求めた。 ヒト癌細胞はヒト正常細胞よりも ヒト内在性ハウスキーピング遺伝子に対する 4F2遺伝子、 PCD1遺伝子の発現が 数細胞レベルから上昇していることが明らかとなつた。
少量の細胞からも癌細胞で強く発現する遺伝子の増幅がみられた。 癌特異的 S F-25抗体感作磁性粒子を用いることによって、 血中の癌細胞を高効率■高純度 で回収でき、 また、 特定した遺伝子の定量 RT - PCR反応にて検出することが可能 となる。 本発明の方法によって、 血液など生体から分離された試料を用いた癌の 早期発見及び診断が可能となる。
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、 セルソーターのような高価な装置を用いることなく、 簡便に効率良く癌細胞の検査を行うことができる。

Claims

請求の範囲
1 . SF- 25抗原を細胞表面上に発現している、生体から分離された癌細胞を、該 癌細胞と抗 SF - 25抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を利用して磁性 ビーズに結合させ、 次いで、 磁性ビーズを磁力により集め、 磁性ビーズ上に結合 された前記癌細胞を検査することを含む癌細胞の検査方法。
2 . 前記癌細胞を、 前記磁性ビーズに結合させる工程は、 抗 SF-25抗体若しく はその抗原結合性断片を固定化した磁性ビーズと、前記癌細胞とを抗原抗体反応 させることにより行われるか、 又は、 標識した若しくは標識していない抗 SF-25 抗体若しくはその抗原結合性断片と前記癌細胞とを抗原抗体反応させ、 次いで若 しくはこれと同時に、 生成された抗原抗体複合物と特異的に結合する物質を固定 化した磁性ビーズと該生成された抗原抗体複合物とを反応させることにより行わ れる請求項 1記載の方法。
3 . 前記癌細胞が、 血液、脳脊髄液、骨髄、 胸水、 腹水、隧液、十二指腸液、胆汁、 糞便又は尿中に含まれる癌細胞である請求項 1又は 2記載の方法。
4 . 前記癌細胞が、 白血病細胞、 大腸癌細胞、 小腸癌細胞、 胃癌細胞、 食道癌 細胞、 胆管癌細胞、 胆のう癌細胞、 甲状腺癌細胞、 副甲状腺癌細胞、 前立腺癌細 胞、 子宮癌細胞、 卵巣癌細胞、 絨毛上皮癌細胞、 睾丸腫瘍細胞、 膀胱癌細胞、 腎 癌細胞、 副腎癌細胞、 脳腫瘍細胞、 悪性黒色種細胞、 皮膚癌細胞、 肺癌細胞、 乳 癌細胞、 塍臓癌細胞、 又は肝癌細胞である請求項 1ないし 3のいずれか 1項に記 載の方法。
5 . 前記癌細胞が白血病細胞、 ヒ卜胃癌細胞、 肺癌細胞、 滕癌細胞、 大腸癌細 胞又は子宮癌細胞である請求項 4記載の方法。
6 . 前記癌細胞が白血病単核球細胞である請求項 5記載の方法。
7 . 前記検査が核酸検査である請求項 1ないし 6のいずれか 1項に記載の方法。
8 . 抗 SF-25抗体又はその抗原結合性断片を固定化した磁性ビーズを含む、 請 求項 1ないし 7のいずれか 1項に記載の方法を行うための癌細胞検査用試薬。
9 . 抗 SF-25抗体又はその抗原結合性断片を固定化した磁性ビーズの、 癌細胞 検査用試薬の製造のための使用。
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