KR102336968B1

KR102336968B1 - 자연적으로 처리된 hla-제한 암 펩티드의 절대 정량 방법

Info

Publication number: KR102336968B1
Application number: KR1020177017911A
Authority: KR
Inventors: 토니 바인쉥크; 줄리아 라이볼트
Original assignee: 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2021-12-08
Also published as: CA2972306C; SI3241026T1; CL2017001071A1; ZA201701646B; TWI632370B; CY1124223T1; PL3241026T3; CR20170297A; IL250982B; JP6735741B2; SG11201703841VA; AU2015373584B2; ES2871035T3; US10545154B2; US20240280583A1; TW201631320A; EP3241026B1; US11988669B2; AU2015373584A1; HUE054455T2

Abstract

본 발명은 자연적으로 처리된 HLA-제한 암 펩티드의 절대 정량화 방법, 즉, 세포 당 제시된 펩티드의 카피 수 결정에 관한 것이다. 본 발명은 항체 요법 또는 펩티드 백신의 개발에 사용할 수 있을 뿐만 아니라 분자적으로 정의된 면역-모티터링에 매우 가치가 높고 또한 암, 감염 및/또는 자가 면역 질병에서 각각의 백신과 항체 기반의 요법 또는 입양 T 세포 전이 접근 방법과 같은 면역치료 전략에 대한 새로운 펩티드 항원의 동정 과정에도 유용하다.

Description

자연적으로 처리된 HLA-제한 암 펩티드의 절대 정량 방법{METHOD FOR THE ABSOLUTE QUANTIFICATION OF NATURALLY PROCESSED HLA-RESTRICTED CANCER PEPTIDES}

본 발명은 자연적으로 처리된 HLA-제한 암 펩티드의 절대 정량 방법, 즉, 세포 당 제시된 펩티드의 카피 수 결정에 관한 것이다. 본 발명은 항체 요법 또는 펩티드 백신의 개발에 사용할 수 있을 뿐만 아니라 분자적으로 정의된 면역-모니터링에 매우 가치가 높고 또한 암, 감염 및/또는 자가 면역 질병에서 각각의 백신과 항체 기반의 요법 또는 입양 T 세포 전이 접근 방법과 같은 면역치료 전략에 대한 새로운 펩티드 항원의 동정 과정에도 유용하다.

암 퇴치를 위한 면역계의 T 세포 아암(arm)의 유도를 목적으로 하는 암 면역 요법과 자가면역 및 감염 질병의 면역 요법의 개발은 일차 질병 조직에서의 인간 백혈구 항원(HLA)-결합 펩티드 제시 수준에 대한 심오한 지식에 의해 상당히 개선될 수 있다. 이 정보는 항체 기반 요법이나 특히 펩티드 백신은 물론 단백질, DNA 또는 RNA와 같은 분자 객체에 근거하는 임의의 다른 유형의 T 세포 백신과도 관련이 있다. 과거에는 이러한 종류의 정량 데이터를 세포 척도 당 절대 카피에 대한 환자 유래 조직에서 얻을 수 없었다.

"역 면역학" 연관된 문제를 피하는 위와 같이 펩티드를 동정하는 방법은 EP1508047B1에 공개되어 있다. 위에서 설명한 바와 같이, 이 방법은 상기 펩티드들의 정량화에 사용할 수 없다. 표지 전략을 사용하는 다른 방법은 WO 2005/076009에 공개되었으며 이는 어느 정도의 정량화를 허용하지만 절대 척도에 대한 것은 아니다. 다른 표지들은 예를 들어 WO 03/025576 또는 문헌[Martin et al., Proteomics 2003, 3, 2208-2220]에 공개되어 있다.

또 다른 방법이 포르티에(Fortier) 등에 의해 공개되었다(문헌[MHC 클래스 I 펩티드 레퍼토리는 전사체에 의해 성형된다(The MHC class I peptide repertoire is molded by the transcriptome), JEM, Vol. 205, No. 3, March 17, 2008 595-610]). 이 방법은 산의 용출에 의하여 비MHC-결합 펩티드로부터 MHC-결합 펩티드의 박리가 요구된다는 약점이 있다. 이는 b2m-넉아웃 세포주를 사용하여 수행된다. 따라서, 이 방법은 일차-환자-종양 물질을 위해 사용할 수 없다. 이 방법에서는 일차 쥐과 가슴샘 세포를 쥐과 EL4 세포주와 비교했다. 시작 양은 MHC I 분자를 측정하여 조절된 바 있다. 이것만이 포르티에 등이 공개한 방법의 강력한 제약 사항이다. 또한, 크기 및 조직 원천이 다른 일차 조직에 요구될 정규화는 적용되지 않았다. 오히려, 균형잡힌 시작 물질들을 사용하여 정규화가 필요 없게 되었다. 하지만 정규화는 일차(환자) 물질에는 절대적으로 필요한 것이다.

WO 2011/128448은 표지 접근 방식 없이 일차 조직 검체로부터 관련 있는 HLA-결합 펩티드 항체를 대규모로 정량적으로 동정하는 방법을 공개하고 있다. 이 방법은 적어도 하나의 병든 일차 조직 표본 및 적어도 하나의 일차 건강한 조직, 바람직하게는 병든 조직에 상응하는 조직 표본을 제공하는 단계, 상기 표본(들)으로부터 MHC 펩티드 리간드를 단리하는 단계, 상기 MHC 리간드 펩티드에 대한 HPLC-MS 분석을 수행하는 단계, 분석물로부터 유래하는 각 신호에 대한 전구체 이온 신호 강도(면적)를 추출하는 단계, 상기 MHC 리간드 펩티드의 서열을 식별하는 단계 및 상기 MHC 펩티드 리간드를 표지없이 상대적으로 정량하기 위한 정규화 단계와 데이터 품질 관리 단계로 구성된다.

문헌[Hassan C, et al, 동위원소 표지된 펩티드 MHC 복합체의 응용으로써 MHC-결합 펩티드의 정확한 정량화(Accurate quantitation of MHC-bound peptides by application of isotopically labeled peptide MHC complexes), J Prot (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.jprot.2014.07.009]은 동위원소 표지의 펩티드-MHC 단량체(hpMHC)를 만들어서 세포 용해 이후, 즉, 일반적인 표본 처리 이전에 직접 첨가하는 접근 방식을 공개한다. 이 접근 방식을 사용하면, 표본 처리 동안의 모든 손실을 확인할 수 있으며 특정한 MHC 클래스 I-제시된 리간드의 정확한 측정이 허용된다. 이 연구는 면역정화 단계를 표본 전처리 동안의 비교적 극단적인 손실의 원천으로 지적하며 이러한 손실을 확인하는 해결안을 제안한다. 제시된 전략을 사용하여 에피톱 카피 수에 대한 신뢰할 수 있는 시각을 얻을 수 있으며 백신 설계 및 면역요법 전략의 개선을 허용한다고 할 수 있다.

면역 반응 자극은 숙주 면역계가 항원의 존재를 이질의 것으로 인식하는 것에 의존한다. 종양 연관 항원 및 질병 항원 존재의 발견은 숙주의 면역계를 사용하여 종양 성장에 개입하는 가능성을 제시했다. 면역계의 체액성 및 세포성 아암을 이용하는 다양한 기전이 현재 암 면역 치료에서 탐색되고 있다.

세포 면역 반응의 특이적 요소들은 종양 세포를 특이적으로 인식하고 파괴할 수 있다. 세포 독성 T 세포(CTL)의 종양 침투 세포 집단에서의 또는 말초 혈액에서의 단리는 이런 세포들이 암에 대해 자연 면역 방어로써의 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 특히 CD8-양성 T 세포(T-CD8⁺)는 주 조직적합 복합체(MHC)의 클래스 I 분자에 결합된 펩티드를 인식한다. 보통 8 내지 12개의 아미노산 잔기로 된 이러한 펩티드는 단백질 또는 시토졸에 자리잡은 결점 리보솜 생성물(DRIPS)에서 유래하며 이 반응에서 중요한 역할을 한다. 인간 MHC-분자도 인간 백혈구-항원(HLA)으로 지정된다.

MHC 분자는 두 클래스로 나누어진다. MHC 클래스 I 분자는 핵을 갖는 대부분의 세포에서 찾을 수 있다. MHC 분자는 알파 중쇄와 베타-2-저분자글로불린(MHC 클래스 I 수용체) 또는 알파와 베타 쇄(MHC 클래스 II 수용체)로 각각 구성되어 있다. 이들의 3차원 형태는 결합 홈을 형성하며, 이는 펩티드와의 비공유결합성 상호작용에 사용된다. MHC 클래스 I은 대부분 내인 단백질, DRIP와 큰 펩티드의 단백질분해 분할로 인해 생성된 펩티드를 제시한다. MHC 클래스 II 분자는 대부분 전문적인 항원 제시 세포(APC)에서 찾아 볼 수 있다. 이들은 주로 APC로부터 세포내 섭취 중 섭취된 외인 또는 막전 단백질의 펩티드를 제시하며, 이는 후에 처리된다. 펩티드와 MHC 클래스 I 분자의 복합체는 적당한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 CD8-양성 세포 독성 T 림프구에 의해서 인식되는 반면, 펩티드와 MHC 클래스 II 분자의 복합물은 적당한 TCR을 갖는 CD4-양성 조력 T 세포에 의해 인식된다. TCR, 펩티드 및 MHC가 1:1:1의 화학양론적 양으로 존재한다는 사실은 잘 알려져 있다.

펩티드가 세포 면역 반응을 촉발(유도)하려면 MHC-분자에 결합해야 한다. 이 과정은 MHC-분자의 대립형질 및 그 펩티드의 아미노산 서열의 특이적인 다형성에 의존한다. MHC-클래스 I-결합 펩티드는 대개 길이가 8 내지 12개의 아미노산 잔기이며 대개 그 서열 내에 MHC-분자의 상응하는 결합 홈과 상호작용하는 두 개의 보존되는 잔기("고정")를 포함하고 있다. 이렇게 함으로써 각 MHC 대립형질은 결합 홈에 특이적으로 결합하는 펩티드의 능력을 제어하는 "결합 구조"(binding motif)를 갖는다.

MHC 클래스 I 의존 면역 반응에서, 펩티드는 종양 세포에 의해 발현되는 특정한 MHC 클래스 I 분자와 결합할 수 있어야 하며 또한 특이적 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 T 세포에 의해 인식될 수 있어야 한다.

종양 특이적 세포 독성 T 림프구에 의해 인식되는 항원, 즉 그들의 에피톱은, 발현되고, 같은 원천의 변형 없는 세포들에 비해서, 각각의 종양의 세포에서 상향 조절된 효소, 수용체, 전사 인자 등과 같은 모든 단백질 클래스에서 유도된 분자일 수 있다.

종양 관련 또는 질병 관련 항원의 현재 분류는 다음과 같은 주요 군을 포함한다:

암-고환 항원: 제일 처음으로 T 세포에 의해 인식된 TAA[종양-관련 항원; 질병-관련 항원의 약자는 DAA]는 이 종류에 속하며, 이는 그 구성원들이 조직학적으로 다양한 인간 종양에서 발현되며, 정상 조직 중, 고환의 정모 세포/정원 세포에서만 있으며, 때로는 태반에서도 있기 때문에 암-고환(CT) 항원이라고 최초에 불려졌다. 고환의 세포들이 클래스 I 또는 II HLA 분자를 발현하지 않기 때문에, 이 항원들은 정상 세포에 있는 T 세포에 의해 인식될 수 없으며 면역학적으로 종양 특이적이라고 간주될 수 있다. CT 항원의 잘 알려진 예로는 MAGE 구성원들 또는 NY_ESO_1이 있다.

분화 항원들: 이 TAA는 종양과 종양이 생긴 정상 조직 사이에서 공유된다; 대부분은 흑색종과 정상 멜라닌세포에서 발견된다. 많은 멜라닌세포 혈통-관련 단백질은 멜라닌의 생합성에 관련되어 있으므로 종양 특이적이 아니지만 암 면역치료에 널리 사용된다. 예로는, 티로시나아제 및 흑색종을 위한 멜란-A/MART-1 또는 전립선암을 위한 PSA가 있고 이로 국한되지 않는다.

과발현된 TAA: 일반적으로 낮은 발현 수준이 있는 많은 정상 조직뿐만 아니라 조직학적으로 다른 유형의 종양에서 널리 발현된 TAA를 암호화하는 유전자들이 발견되었다. 정상 조직에 의해 처리되고 잠재적으로 제시되는 많은 에피톱이 T 세포 인식의 임계치 수준보다 낮을 수 있고, 그의 종양 세포에서의 과발현은 이전에 확립된 내성을 중단시켜 항암 반응을 일으킬 수 있다. TAA의 이 종류의 유력한 예로는 Her-2/neu, 서바이빈(Survivin), 텔로머라제(Telomerase) 또는 WT1이 있다.

종양 특이적 항원: 이러한 독특한 TAA는 정상 유전자의 돌연변이로써 발생한다(예컨대, β-카테닌, CDK4 등). 이러한 분자 변경의 일부는 종양 형질전환 및/또는 진행과 관련되어 있다. 종양 특이적 항원은 일반적으로 강한 면역 반응을 정상 조직에 대한 자가 면역 반응에 대한 위험성 없이 유도할 수 있다. 반면에, 대부분의 경우 이러한 TAA는 일반적으로 많은 개별 종양에서 공유되지 않으며 그들이 동정된 정확한 종양에만 적절하다.

비정상 번역 후 변형에서 발생하는 TAA: 이러한 TAA는 종양에서 특이적이지 않고 과발현되지도 않는 단백질에서 발생할 수 있지만 종양에서 주로 활성적인 번역 후 과정에 의해 종양과 관련된다. 이 클래스의 예는 종양 특이적일 수도 아닐 수도 있는 저하 동안의 단백질 접합과 같은 이벤트 또는 MUC1을 위한 종양의 새로운 에피톱으로 이끄는 변경된 당화 패턴에서 발생한다.

종양바이러스 단백질: 이러한 TAA는 종양발생 과정에서 중요한 역할을 할 수 있는 바이러스 단백질이며, 그들이 이질적이기 때문에(인간 태생이 아닌), T 세포 반응을 일으킬 수 있다. 이런 단백질의 예로는 경부 암종에서 발현하는 인간 유두종 유형 16 바이러스 단백질, E6 및 E7이 있다.

세포 독성 T-림프구에 의해 단백질이 종양 특이적 또는 관련 항원, 또는 질병-특이적 또는 관련 항원으로서 인식되고, 치료에 사용되려면, 특정한 전제 조건이 충족되어야 한다. 항원은 주로 종양 세포나 감염된 세포에 의해 발현되어야 하며, 정상의 건강한 조직에 의해서는 전혀 발현되지 않거나 비교적 소량만, 예를 들어 5배, 10배 또는 그 이상 적게 발현되어야 한다.

감염성 질병에는 두 가지 가능성이 있는데, 첫째는 감염된 세포가 건강한 세포에 의해 발현되지 않은 (감염과 직접적으로 관련된) 항원을 발현하거나 감염된 세포가 건강한 세포에 의해 매우 소량으로만 발현되는 항원을 과발현한다(항원의 과발현은 건강한 세포의 펩티드 군에서 보통 발견된다).

더욱이 각각의 항원이 하나의 유형의 종양, 감염 또는 균주에서 뿐만 아니라 높은 농도로 나타나는 것이 바람직하다(즉 세포 당 펩티드의 각 카피 수). 종양 특이적 및 종양-관련 항원, 및 질병-특이적 또는 질병-관련 항원은 종종 기능 때문에, 예를 들어 세포 주기 관리 또는 세포자멸의 억제시 정상 세포를 종양/감염된 세포로 형질전환하는데 직접적으로 연루된 단백질로부터 유도된다.

암의 경우, 형질전환을 직접적으로 일으키는 단백질의 추가의 하류 표적은 상향조절될 수 있으므로 간접적으로 종양-관련될 수 있다. 그런 간접적 종양-관련된 항원은 백신 접근법의 표적이 될 수도 있다(문헌[Singh-Jasuja H., Emmerich N. P., Rammensee H. G., Cancer Immunol. Immunother. 2004 Mar; 453 (3): 187-95]). 두 경우 다 에피톱이 항원의 아미노산 서열에 존재하는 것이 필수적인데, 종양 관련 또는 질병 관련 항원에서 유도된 그런 펩티드("면역성 펩티드")는 시험관 내 또는 생체 내 T 세포-반응을 유도해야 하기 때문이다.

기본적으로, MHC 분자에 결합할 수 있는 임의의 펩티드는 T 세포 에피톱으로 기능할 수 있다. 시험관 내 또는 생체 내 T 세포 반응의 유도의 전제 조건은 상응하는 TCR이 있는 T 세포의 존재와 이 특정 에피톱에 대한 면역성 내성의 부재이다.

따라서, TAA 및 DAA는 종양 백신의 개발을 위한 출발점이다. TAA 및 DAA의 식별과 특성화의 방법은 환자 또는 건강한 대상에서 단리될 수 있는 CTL의 사용에 기반되거나, 종양과 정상 조직 사이의 차등 전사 프로파일 또는 차등 펩티드 발현 패턴에 근거한다.

그러나, 종양 조직 또는 인간 종양 세포주에서 과발현되거나 그런 조직 또는 세포주에서 선택적으로 발현되는 유전자의 식별은 면역 치료에서 이런 유전자에서 전사된 항원의 이용에 대한 정확한 정보를 제공하지 않는다. 이것은 상응하는 TCR이 있는 T 세포가 나타나야 하고 이 특정 에피톱에 대한 면역성 내성이 없거나 최소화 되어야 하므로 개인의 이러한 항원의 에피톱의 소집단이 그런 적용에 적당하지 않기 때문이다. 그러므로 그에 대해 기능성 T 세포를 찾을 수 있는 MHC 분자와 관련하여 제시되는 과발현되거나 선택적으로 발현된 단백질로부터 그러한 펩티드를 선택하는 것이 중요하다. 상기 기능성 T 세포는 특이적 항원에 의해 자극되었을 때 클론적으로 확대되고 효과기 기능("효과기 T 세포")을 실행할 수 있는 T 세포로 정의된다.

조력 T 세포는 항-종양 면역에서 CTL 효과기 기능을 조절하는데 중요한 역할을 한다. CD8-양성 킬러 T 세포의 T_H1 유형 지원 효과기 기능의 조력 T 세포 반응을 일으키는 조력 T 세포 에피톱은, 세포 표면에 종양-관련 펩티드/MHC 복합체를 보이는 종양 세포에 대한 세포 독성 기능을 포함한다. 이런 식으로 종양-관련 조력 T 세포 펩티드 에피톱은, 따로 또는 다른 종양-관련 펩티드와 함께, 항-종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성물의 약학적 유효성분으로 사용될 수 있다.

HLA 클래스 I 또는 II 제시된 리간드의 정확한 카피 수에 대한 지식은 기초 및 임상 면역학에서 중요하다. 현재 최상의 카피 숫자 결정은 알려진 양의 동위원소 표지된 펩티드와 병행하는 단일 반응 모니터링(SRM)을 사용하는 질량 분석법에 근거한다. 하지만 이러한 접근법들은 위의 접근법에 효율적으로 사용할 만큼 아직 충분히 정밀하지는 않다.

이와 관련하여, 따라서 본 발명의 목적은 정밀하고 효율적이고 취급이 용이하며 또한 "고처리량" 수준으로 실행할 수도 있는 HLA 클래스 I 또는 II 제시된 리간드의 카피 수에 대한 절대적 결정 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 다른 목적 및 이점은 다음에 제공되는 설명을 고찰할 때 당업자에게 쉽게 이해될 것이다.

본 발명의 제1 양태에서, 본 발명의 목적은 세포에서 적어도 하나의 MHC 펩티드 리간드의 절대 정량화 방법에 의해 해결되며, 상기 방법은

a) 세포를 포함하는 생물학적 표본으로부터 상기 적어도 하나의 MHC 펩티드를 제시하는 세포를 준비하는 단계;

b) 상기 단계 a)의 제제의 세포수를 결정하는 단계;

c) 정량할 알려진 양의 상기 적어도 하나의 MHC 펩티드 리간드 및/또는 펩티드-MHC 복합체를 단계 a)의 상기 제제에 첨가하는 단계("스파이킹 I");

d) 펩티드 용출물을 얻기 위해 상기 단계 c)의 제제로부터 적어도 하나의 MHC 펩티드 리간드를 단리하는 단계;

e) 정량할 알려진 양의 적어도 하나의 MHC 펩티드 리간드를 상기 펩티드 용출물에 첨가하는 단계("스파이킹 II");

f) 상기 적어도 하나의 MHC 펩티드에 대한 질량 분광 분석을 수행하여
aa) 단계 d)에서 단리 효율에 대한 신호,

bb) 단계 e)에서 첨가된 알려진 양의 상기 적어도 하나의 MHC 펩티드 리간드에 대한 신호, 및

cc) 상기 단계 a)의 준비된 세포로부터 적어도 하나의 MHC 펩티드 리간드에 대한 신호

중 하나 이상의 신호를 형성하는 단계; 및

g) aa) 얻어진 세포수,

bb) 단계 c)에서 첨가된 정량할 상기 적어도 하나의 MHC 펩티드 리간드 및/또는 펩티드-MHC 복합체의 알려진 양, 및

cc) 단계 e)에서 첨가된 정량할 상기 적어도 하나의 MHC 펩티드 리간드의 알려진 양

으로 단계 f)에서 얻어진 신호들의 비교에 근거하여 상기 적어도 하나의 MHC 펩티드 리간드에 대해 정량하는 단계

를 포함하고, 이로써 세포 상에서 적어도 하나의 MHC 펩티드 리간드에 대한 절대 정량화는 적어도 일부 성취된다.

몇몇 표본이 동시에 분석되는 본 발명에 따른 방법에 있어서, 위와 같은 단계 c)는 단리 효율이 확립되면 생략할 수 있으며, 한 표본의 효율을 사용하여 두 번째 MHC 펩티드 리간드 및/또는 MHC 펩티드 리간드 복합체의 단리 효율을 추정할 수 있기 때문이다(즉, 상호참조 값으로서 사용이 가능하다).

또한, 바람직하게는 e)의 내부 검정(스파이킹 II)을 통해 얻은 신호를 상수로서 사용하고 단리된 적어도 하나의 MHC 펩티드 리간드로서 얻은 신호를 보존(대조) 참조로 사용하여 이 두 신호 사이의 비율을 계산하는 방법이다. 이 비율을 매우 동일한 양의 내부 검정 시약도 포함하는 확립된 보정 곡선과 비교하며 바람직하게는 그러한 내부 검정 시약의 동일한 분취량을 사용한다. 그리하면 보정 곡선은 이 비율과 펩티드의 양 사이의 관계를 설명한다. 도 3 및 그 범례도 참조한다.

놀랍게도 본 발명의 맥락에서 본 발명자들은 위의 분석 단계들을 조합함으로써, 몇 가지 다른 비암성 조직이나 비감염 조직 및 기관과 비교하여 암이나 다른 감염 조직 상의 MHC- 바람직하게는 HLA-제한 펩티드 수준에 대한 직접적 절대 정량화가 기능함을 최초로 알아냈다.

본 발명의 맥락에서, "스파이킹"이란 적어도 하나의 알려진 예를 들어 정량할 비결합("자유") MHC 펩티드 리간드의 알려진 양 또는 농도를 예를 들어 제제(여기서는 "스파이킹 I로 지정) 또는 펩티드 용출물(여기서는 "스파이킹 II로 지정)과 같은 표본에 첨가하는 것을 말한다. 첨가할 펩티드(들)의 양/농도는 쉽게 조절이 가능하며 스파이킹 대상의 표본 및 분석에 사용되는 방법에 적어도 일부 의존한다.

본 발명에 따른 바람직한 방법은 적어도 하나의 MHC 펩티드 리간드를 종양 관련 펩티드(TAA) 또는 질병 관련 펩티드(DAA)로부터 선택하는 것이다.

본 발명에 따른 더욱 바람직한 방법은 세포를 포함하는 상기 생물학적 표본을 조직 표본, 혈액 표본, 종양 표본 또는 감염된 조직의 표본으로부터 선택하는 것이다. 본 발명의 맥락에서, 환자와 같은 피험자로부터 직접 유래된 표본은, 예를 들어 확립된 종양 세포주와 같은 세포주의 표본과 대조하여 일차 조직 또는 종양 표본과 같은 "일차" 표본으로 칭한다. 표본이 본 발명에 따른 방법에 적합한 한 그것은 신선하거나 보존될 수 있다(예: 냉동 또는 조리용). 바람직하게는 영구 세포주를 포함하지 않는 생물학적 표본이다.

바람직한 표본으로서, 충격 동결된 (일차) 조직 표본의 HLA 펩티드 풀은, 예를 들어 CNBr-활성화 세파로스와 연결된 HLA-A, -B, -C-특이적 항체 w6/32 또는 HLA-A*02-특이적 항체 BB7.2를 사용하여 고형 조직으로부터의 면역 침전, 그 이후 산 처리 및 한외 여과에 의해 얻을 수 있다. 다른 HLA-대립형질에는 당업계에서 알려진 다른 특이적 항체를 사용할 수 있으며, 예를 들어 A*03 대립형질에는 GAP-A3, B 대립형질에는 B1.23.2가 있다. 당업계에서 잘 알려진, 다른 포유동물의 MHC-클래스 I 펩티드를 얻는 상응하는 방법이 있다.

본 발명에 따른 방법은 예를 들어 댕기열, 에볼라, 마르부르그 바이러스, 폐결핵(TB), 수막염 또는 매독 등 바이러스성 또는 세균성 감염과 같은 감염 질병의 맥락에서도 사용 가능하며, 바람직하게는 이 방법은 표적하는 모이어티가 MHC 클래스 I-결합 펩티드인 한 감염성 생물의 항생제 내성 균주, 관절염과 같은 자가면역 질병, 말라리아와 같은 기생충 감염, 및 MS 및 모비스 파킨슨과 같은 기타 질병에 대해서도 사용된다.

자가면역 질병(자가면역 질병으로 공식적으로 선포되지 않는 질병을 포함)의 예로는 만성 폐색성 폐질환, 강직성 척추염, 크론병(두 가지 유형의 특발성 장 질환("IBP") 중 하나), 피부근육염, 당뇨병 제1형, 자궁내막증, 굿파스처 증후군, 그레이브병, 길랭-바래 증후군(GBS), 하시모토병, 화농성 한선염, 가와사키병, IgA 신장병, 특발성 저혈소판 자색난병, 간질성 방광염, 홍반 루푸스, 혼합 결합조직병, 국소 피부경화증, 중증 근육무력증, 기연증, 신경근긴장증, 보통 천포창, 악성 빈혈, 건선, 건선성 관절염, 다발근육염, 원발성 담관성 간경화, 재발성 다발성 연골염, 류마티스성 관절염, 조현병, 공피증, 쇠그렌 증후군, 강직 증후군, 관자 동맥염(거대세포 동맥염), 궤양성 장염(두 가지 유형의 특발성 장질환("IBP") 중 하나), 혈관염, 백반증 및 베게너 육아종증이 있다.

본 발명은 인간의 질병으로 제한되지 않으며 소, 돼지, 말, 고양이, 쥐와 생쥐같은 설치류, 염소 및 기타 가축에도 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 또 다른 바람직한 구현에 있어서, 세포의 준비는 적어도 일부가 조직의 효소 소화 및/또는 세포 용해를 포함한다.

본 발명에 따른 바람직한 방법에서, 상기 세포수는 세포 핵의 계수, 광도 측정 DNA-결정, 형광 측정 DNA-결정(예를 들어 큐비트(Qubit: 등록상표) 기술의 사용 등) 및 정량적 PCR로부터 선택된 방법을 사용하여 결정된다.

본 발명에 따른 더욱 바람직한 방법은 상기 단계 a)의 준비에서 적어도 한 유형의 HLA-분자 양의 결정을 추가로 포함한다. 그 양의 결정은 특이적 항체가 관여하는 방법(예: ELISA, 겔, 세포 분류 및/또는 크로마토그라피)과 같은 당업계의 일반적인 방법을 사용하여 가능하다.

본 발명에 따른 더욱 바람직한 방법에서, 첨가된 적어도 하나의 펩티드-MHC 복합체 및/또는 첨가된 적어도 하나의 MHC 펩티드 리간드는 표지를 하며 바람직하게는 차등 표지한다. 각 표지는 당업자에게 알려져 있으며, 동위원소 표지, 방사성 및 비방사성 표지, 효소 및 기타 바람직하게 다른 질량의 군을 포함한다. 바람직하게는 표지는 정량할 특이적 펩티드에 대해 특이적이다. 가장 바람직한 것은 이중 표지 TAA/TUMAP이며, 예를 들어 동일한 실험에서 두 가지 차등 표지의 스파이킹이 요구되는 상황이다(다음의 실시예 참조).

본 발명에 따른 바람직한 방법에서, 단리는 친화 크로마토그라피와 같은 크로마토그라피를 포함한다. 따라서, 단리된 MHC/HLA 리간드는 역상 크로마토그라피(예: 나노악퀴티(nanoAcquity) UPLC 시스템, 워터스(Waters)), 이어서 오비트랩(Orbitrap) 하이브리드 질량 분광계(써모일렉트론(ThermoElectron))에서의 검출에 의해 그 소수성에 따라 분리할 수 있다. 각 표본은 바람직하게는 반복(예) LCMS 수행의 취득에 의해 분석한다. 다음 LCMS 데이터는 탠덤-MS (MS/MS) 데이터를 분석함으로써 처리된다.

정량화하는 펩티드의 m/z 값에 초점을 맞추는 특정한 방식으로 기록된 탠덤-MS 스펙트럼 데이터는 바람직하게는 사전 정의된 변환의 사전 선택된 단편 이온의 강도를 추출하는 소프트웨어에 의해 평가한다. 그러한 소프트웨어의 한 예는 스카이라인(Skyline)(문헌[MacLean B et al. Skyline: 특정 단백체학 실험의 생성 및 분석용 오픈 소스 문서 편집기(an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments). Bioinformatics. 2010 Apr 1; 26(7):966-8.], http://dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/btq054)이며, 이는 병렬 반응 모니터링(PRM-표적 MS/MS)을 위한 데이터 비의존적 수집(DIA) 실험의 질량 분광계 데이터를 분석하는 애플리케이션이다. 이 소프트웨어는 특이성 목적을 위한 공동 용출 동위원소-표지 펩티드 및 추가 처리를 위한 단일 변환 강도를 추출하기 위해 사용할 수 있다.

다른 표본 사이에서 동일한 HLA 대립형질로 제약된 펩티드 군들의 비교가능성은, 가능하다면 정제에 사용되는 공통된 대립형질-특이적 항체에 근거하여 또는 다르게는 고정 아미노산 패턴에 의해 공통된 HLA-대립형질에 대한 서열의 지정에 근거하여 가능하다.

통계적 이유에 의하여, 본 발명에 따른 바람직한 방법은, 적어도 하나의 MHC 리간드 펩티드마다 적어도 2번의 반복 질량분석을 수행한다.

따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 분석을 위해 과다제시되고, 과발현되고/거나 종양-특이적 MHC 펩티드 리간드의 선택을 더욱 포함하는 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 방법이 높은 처리량 기반으로, 수행될 수 있거나 수행되며 바람직하게는 50 내지 100개까지의 펩티드 리간드를 동시에 분석 가능한 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법의 또 다른 바람직한 구현에 있어서, 상기 방법의 단계들은 첨부된 청구범위에 표시된 또는 위와 같은 순서대로 수행된다. 본 발명에 따른 또 다른 바람직한 방법에 있어서 상기 방법에 있어서 상기 방법은 상기 및 여기서 표시된 단계들로 구성된다.

본 발명에 따른 방법의 더욱 바람직한 양태에 있어서, 상기 방법은 개인화 요법 및 진단에 관한 것이다. 이를 위하여, 분석되는 표본(들)은 여기서 설명한 것과 같은 의학적 상태로 고생하는 개인이나 개인들의 군으로부터 유래한다. 또한 상기 MHC 펩티드 리간드에 근거하는 개인화 MHC 리간드 프로파일, 바람직하게는 개인화 정량화된 질병-특이적 MHC 리간드 프로파일은 여기서 설명된 본 발명의 방법에 근거하여 생성할 수 있다.

가장 바람직하게는 본 발명에 따른 방법은 시험관 내에서 수행한다.

본 발명에 따른 방법의 더욱 바람직한 양태에서, 상기 방법은 상기 방법에 의해 합성기 상에서 또한 수동으로 정량화된 상기 적어도 하나의 MHC 펩티드 리간드를 합성하는, 바람직하게는 화학적으로 합성하는 단계를 추가로 포함한다. 따라서, 발명의 다른 양태는 공개된 방법에 따라 펩티드의 정량화에 사용되는 면역반응성 펩티드의 준비 방법에 관한 것이며 상기 펩티드는 시험관 내 또는 생체 내에서 화학적으로 합성된다. 펩티드는 당업계에서 알려진 표준 방법에 의해 아미노산의 화학적 결합에 의해 제조할 수 있다.

펩티드는 예를 들어, 무세포 시스템과 같은 시험관 내에서, 세포를 사용하는 생체 내에서 제조할 수 있다. 펩티드는 예를 들어, 레완드로우스키(Lewandrowski) 등의 EP 2111867에 공개된 바와 같이 배합할 수 있다.

또 다른 양태는 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, T-림프구의 존재가 검출되는 추가 단계가 수행된다. 이 방법을 사용하면, 단리되고 동정된 펩티드에 대해 유도된 T-림프구가 환자에서 어느 정도까지 사전 존재하는지 구체적으로 검출하는 것이 가능하다. 이 단계를 수행함으로써, 환자에서 이미 사전 존재하여 T-림프구와 대항하는 펩티드에만 백신으로서 적용하는 것이 가능하다. 다음 그 펩티드는 이러한 특이적 T-림프구의 활성화에 사용할 수 있다.

또 다른 양태는, 백혈구를 항원-제시 분자 및 항원 펩티드의 재구성된 복합체로 표지함으로써 특정한 사전 존재하는 T-림프구의 검출이 수행되는 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법의 또 다른 바람직한 구현에 있어서, 상기 방법은 넉아웃 세포, 세포주 또는 동물의 사용을 더욱 배제한다.

본 발명의 더욱 바람직한 선택적 단계는 표본으로 정의된 수량만큼 스파이킹되는 분자에 근거하는 자동 품질 관리이다.

본 발명에 따른 방법을 통해서, 환자-특이적 펩티드의 파악이 더욱 가능하며, 즉 특정 면역 반응의 유도를 위해 백신으로 사용될 펩티드를 환자에게 정밀하게 일치시키는 것이 가능하다.

본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따른 방법에 의해 정량화된 하나 이상의 TAA 및/또는 DAA 펩티드의 정의된 양으로 구성된 약학 조성물에 관한 것이다.

이 조성물은 제형 및 대상 질병에 따라 예를 들어 비경구적으로, 예를 들어 피하로, 피내로 또는 근육 내로 적용할 수 있거나, 경구적으로 투여할 수 있다. 그렇게 함으로써, 펩티드가 약학적으로 허용가능한 담체, 바람직하게는 수용성 담체에 용해되거나 현탁되고; 이 조성물은 또한 첨가제, 예를 들어 완충제, 결합제 등을 포함한다. 펩티드는 또한 면역자극성 물질, 예를 들어 사이토카인과 함께 투여할 수 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 그 펩티드는 종양성 질병의 치료 및 종양 질병의 치료 약물의 제조에 사용할 수 있다. 치료된 종양성 질병에는 신장, 유방, 췌장, 위, 고환 및/또는 피부의 암과 같은 고형 종양 또는 AML과 같은 혈액암이 포함된다. 이러한 종양 질병의 목록은 예시적일 뿐이며 적용 범위의 제한을 의도하지 않는다.

그 펩티드는 또한 종양 질병의 요법-과정에 대한 평가에 사용할 수 있다.

펩티드는 또한 다른 면역화 또는 요법에서 요법의 모니터링에 사용할 수 있다. 그러므로 펩티드는 치료는 물론 진단으로도 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 항체의 생성을 위한 정량화된 펩티드의 사용에 관한 것이다. 다클론성 항체는 일반적인 방식으로서 펩티드의 주사 및 그 이후 면역글로불린의 정제에 의한 동물의 면역화를 통해 얻을 수 있다. 단클론성 항체는 당업계에 알려진 표준화 프로토콜에 따라 생성할 수 있다.

본 발명은 항체-기반의 접근방식에 대해 특히 관련이 있으며, 표적 세포의 세포 표면에 있는 표적의 카피 수가, 표적이 항체에 대해 적용할 수 있는지, 그렇다면 접합 약물, 독소, T 세포를 유도하는 이중특이성 항체 또는 기타 효과기 세포와 같은 어떤 효과기 기능의 사용이 가능한지를 결정하고/거나 반영한다. 다른 양태들은 압타머(표적-결합하는 올리고핵산 또는 펩티드 분자) 및/또는 용해성 T 세포 수용체(TCR)와 같은 소위 골격 형성 분자의 맥락에서의 사용에 관한 것이다. 여기에서도 항체와 유사하게 카피 수가 필수 산염기강도 및 효과기 기능을 결정한다. 상기 골격 분자.

면역 반응의 자극은 숙주 면역계가 항원의 존재를 이질의 것으로 인식하는 것에 의존한다. 종양 관련 항원 존재의 발견은 숙주 면역계를 사용하여 종양 성장을 개입할 수 있다는 가능성을 제기하였다. 면역계의 체액 및 세포 아암을 이용하는 다양한 기전은 현재 암 면역 치료로 탐구된다.

세포 면역 반응의 특정 요소들은 종양 세포를 특이적으로 인식하고 파괴할 수 있다. 세포 독성 T 세포(CTL)의 종양 침투 세포 집단에서의 또는 말초 혈액에서의 단리는 이런 세포들이 암에 대해 자연 면역 방어로서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 특히 CD8-양성 T 세포는 세포질에 위치한 단백질이나 결손 리보솜 산물들(DRIPS)로부터 유래된 보통 8에서 12개의 주 조직적합 복합체(MHC)-함유 펩티드의 클래스 I 분자를 인지하며, 이 반응에서 중요한 역할을 한다. 인간의 MHC-분자도 인간 백혈구-항원(HLA)으로 지정된다.

MHC 클래스 I 분자는 주로 내생 단백질, 시토솔 또는 핵 단백질, DRIP 및 더 큰 펩티드의 단백질 가수분해 분열로 인한 펩티드를 나타내는 핵을 갖는 대부분의 세포에서 발견된다. 하지만 엔도솜 구획이나 외생 출처로부터 유래된 펩티드 또한 MHC 클래스 I 분자에서 종종 발견된다. 이러한 비고전적 방식의 클래스 I 제시를 문헌에서는 교차-제시라고 칭한다.

종양 특이적 또는 관련된 항원과 같은 세포 독성 T-림프구에 의해 단백질이 인식되고, 치료에 사용되려면, 특정한 전제 조건이 충족되어야 한다. 항원은 주로 종양 세포에 의해 발현되어야 하며 비교적 소량일지라도 정상의 건강한 조직에 의해서는 안 된다. 더 바람직하게는, 각각의 항원이 하나의 유형의 종양에서뿐만 아니라 높은 농도(즉 세포마다 펩티드의 각각의 카피 수)로 존재하는 것이다. 종양 특이적 및 종양-관련 항원은 종종 기능, 예를 들어 세포 주기 관리 또는 세포자멸 때문에 정상 세포를 종양 세포로 변환하는데 직접 관련된 단백질에서 유도된다. 또한, 변환을 직접적으로 일으키는 단백질의 하류 표적도 상향조절될 수 있으며 따라서 간접적으로 종양-연관될 수 있다. 그런 간접적 종양-연관된 항원은 백신 접근법의 표적이 될 수도 있다. 두 경우 다 에피톱이 항원의 아미노산 서열에 존재하는 것이 필수이며, 이는 종양 관련 또는 질병 관련 항원에서 유도된 그런 펩티드("면역성 펩티드")는 시험관 내 또는 생체 내 T 세포-반응을 유도해야 하기 때문이다.

기본적으로, MHC 분자에 결합할 수 있는 임의의 펩티드는 T 세포 에피톱으로서 기능할 수 있다. 시험관 내 또는 생체 내 T 세포 반응의 유도의 전제 조건은 상응하는 TCR이 있는 T 세포의 존재와 이 특정 에피톱에 대한 면역적 내성의 부재이다. 따라서, TAA는 종양 백신의 개발을 위한 출발점이다. TAA의 식별과 특성화의 방법은 환자 또는 건강한 피험자에서 단리될 수 있는 CTL의 사용에 기반하거나, 종양과 정상 조직 사이의 차등 전사 프로파일 또는 차등 펩티드 발현 패턴의 생성에 기반한다(Lemmel et al. 450-54; Weinschenk et al. 5818-27). 그러나, 종양 조직 또는 인간 종양 세포주에서 과발현되거나 그런 조직 또는 세포주에서 선택적으로 발현되는 유전자의 식별은 면역 치료에서 이런 유전자에서 전사된 항원의 이용에 대한 정밀한 정보를 제공하지 않는다. 이것은 상응하는 TCR이 있는 T 세포가 나타나야 하고 이 특정 에피톱에 대한 면역성 내성이 없거나 최소화되기 때문에 개인의 이러한 항원의 에피톱의 소집단만이 그런 응용에 적당하다. 그러므로 그에 대해 기능성 T 세포를 찾을 수 있는 MHC 분자와 관련하여 제시되는 과발현되거나 선택적으로 발현된 단백질로부터 그러한 펩티드를 선택하는 것이 중요하다. 그런 기능성 T 세포는 특이적 항원에 의해 자극되었을 때 클론적으로 확대되고 효과기 기능("효과기 T 세포")을 실행할 수 있는 T 세포로 정의된다.

암 치료와 관련된 중증의 부작용과 비용을 고려할 때보다 나은 예후 및 진단 방법이 절실히 필요하다.

여기에서 "펩티드"란 용어는 인접 아미노산의 알파-아미노와 카보닐 기 사이에서 전형적으로 펩티드 결합으로 서로 연결되는, 일련의 아미노산 잔기를 지정하기 위해 사용한다. 펩티드는 9개 아미노산의 길이가 바람직하지만 8개 아미노산으로 길이가 짧을 수도 있고 10, 11, 12, 13 또는 14개의 아미노산까지 길이가 길 수도 있다.

여기에서 "올리고펩티드"라는 용어는 인접 아미노산의 알파-아미노와 카보닐 기 사이에서 전형적으로 펩티드 결합으로 서로 연결되는, 일련의 아미노산 잔기를 지정하는 데 사용된다. 본 발명에서 올리고펩티드의 길이는 정확한 에피톱 또는 에피톱들이 유지되는 이상 중요하지 않다. 올리고펩티드는 전형적으로 약 30개 아미노산 잔기보다는 길이가 짧고, 약 14개 아미노산보다는 길이가 길다.

"폴리펩티드"라는 용어는 인접 아미노산의 알파-아미노와 카보닐 기 사이에서 전형적으로 펩티드 결합으로 서로 연결되는, 일련의 아미노산 잔기를 지정하는 데 사용된다. 본 발명에서 폴리펩티드의 길이는 정확한 에피톱들이 유지되는 이상 중요하지 않다. 펩티드 또는 올리고펩티드와 다르게, 용어 폴리펩티드는 약 30개 아미노산 잔기 이상의 분자를 가지고 있는 것을 말한다.

이런 분자의 펩티드, 올리고펩티드, 단백질, 또는 폴리뉴클레오티드 암호화는 면역 반응을 유도할 수 있으면 "면역원성"(따라서 본 발명에서의 "면역원")이다. 본 발명의 경우, 면역원성은 T 세포 반응을 유도하는 능력으로 더욱 특이적으로 정의된다. 그러므로, "면역원"은 면역 반응을 유도할 수 있는 분자이고, 본 발명의 경우, T 세포 반응을 유도할 수 있는 분자일 것이다.

T 세포 "에피톱"은 적당한 친화력을 가진 MHC/펩티드 복합체에 결합하는 T 세포 수용체에 일치하는 T 세포에 의해 인식되는 삼항 복합체(MHC 클래스 I 알파 쇄, 베타-2-미세글로블린 및 펩티드)를 생성하는 클래스 I MHC 수용체에 결합하는 짧은 펩티드를 필요로 한다. MHC 클래스 I 분자에 결합하는 펩티드는 전형적으로 길이가 8 내지 14개 아미노산이며, 가장 전형적으로 길이가 9개 아미노산이다.

본 설명에 있어서, 본 발명은 암을 예로 사용한다. 하지만 본 발명의 방법은 각각의 면역의 답이 MHC 클래스 I과 관련된 답인 이상 감염성 질병, 자가면역 질병 및 기생충 감염에서도 적용이 가능하다.

이제 본 발명은 다음 실시예로 추가로 기재되지만 이로써 제한되지 않는다.
도 1은 본 발명에 따른 실험적 접근방식에 대한 일반적인 개략적 개요를 보여준다.
도 2는 표 1의 TUMAP 당 10 fmol과의 TUMAP 혼합물에 의한 비교 MS 분석을 보여준다. 각 펩티드는 다른 MS 신호를 초래하므로 펩티드 의존 검출성을 보여준다. 펩티드 5는 표 1에 나열되지 않으며, 즉 표 1의 서열 1 내지 4는 도 2의 1 내지 4번에 상응하고 표 1의 서열 5 내지 11은 도 2의 6 내지 12번에 상응한다.
더욱이, 도 2의 펩티드 19, 21 및 22는 표 2에 나열되지 않으며, 즉, 도 2의 서열 13 내지 18은 표 2의 12 내지 17번에 상응하고 도 2의 서열 20도 표 2의 18번에 상응하며 도 2의 서열 23 내지 28은 표 2의 19 내지 24번에 상응한다.
도 3은 내부 표준 방법의 원리를 보여준다. TUMAP의 동위원소-표지 버전(연한 회색으로 표시)의 적정에 의해 보정 곡선이 생성된다. 모든 MS 측정에 있어서, TUMAP 내부 표준 펩티드의 다른 동위원소-표지 버전(진한 회색으로 표시)의 일정한 양이 MS 표본에 첨가된다. 보정 곡선 함수는 로지스틱 회귀에 의해 MS 신호의 비율로부터 계산한다. LLOQ는 가시적 검사 및 직선성으로부터의 편차를 고려하여 정의된다. "정량화 표본"(녹색으로 표시)은 TUMAP 수의 절대 정량을 위해 선택된 종양 표본에서 측정된 신호의 강도를 나타낸다.
도 4는 절대 정량을 위해 선택된 HLA-A*02 TUMAP들의 보정 곡선을 보여준다. 세포 당 절대 TUMAP 수("정량 표본")의 분석에 사용된 종양 조직 표본에서 각각의 TUMAP의 MS 결과는 각 차트에 포함된다.
도 5는 절대 정량을 위해 선택된 HLA-A*02 TUMAP의 추가 보정 곡선을 보여준다. 세포 당 절대 TUMAP 수("정량 표본")의 분석에 사용된 종양 조직 표본에서 각각의 TUMAP의 MS 결과는 각 차트에 포함된다.
도 6은 절대 정량을 위해 선택된 HLA-A*02 TUMAP의 추가 보정 곡선을 보여준다. 세포 당 절대 TUMAP 수("정량 표본")의 분석에 사용된 종양 조직 표본에서 각각의 TUMAP의 MS 결과는 각 차트에 포함된다.
도 7은 절대 정량을 위해 선택된 HLA-A*02 TUMAP의 추가 보정 곡선을 보여준다. 세포 당 절대 TUMAP 수("정량 표본")의 분석에 사용된 종양 조직 표본에서 각각의 TUMAP의 MS 결과는 각 차트에 포함된다.
도 8은 모든 분석된 TUMAP의 MS 반복 측정치에 대한 추정 변동을 보여준다. 각 점은 하나의 특이적 조직 표본에서 개별 TUMAP의 MS 반복 측정치에 대한 변동 계수(CV, % 단위)를 나타낸다. 모든 TUMAP에 걸친 CV의 중간값은 MS 반복 실행의 평균 편차로 간주된다.
도 9는 펩티드 MHC 단리 효율을 보여준다. 펩티드 MHC 단리 효율은 A*02 TUMAP(A)의 경우 8개의 A*02-양성 표본에서, A*24 TUMAP(B)의 경우 6개의 A*24-양성 표본에서 결정한다. 단리 효율은 A*02 TUMAP의 경우 평균 24%, A*24 TUMAP의 경우 32% 범위로 변동한다(C).
도 10은 DNA 함량 분석의 평가 방법을 보여준다. A. 주어진 DNA 양으로부터 세포수를 보간하는 3가지 다른 방법의 비교: 종양 세포주(진한 회색)와 건강한 공여자(회색)의 PBMC로부터 작성된 표준 곡선의 사용 및 인간 이배체 게놈(연한 회색)의 이론적 무게의 사용. 생물학적 반복, 즉, 같은 종양의 다른 조각으로부터 얻어진 독립적 조직 용해물 제제(회색으로 강조표시). B. 절대 TUMAP 정량에서 분석한 조직 표본의 총 세포수 결정에 사용된 PBMC 표준 곡선의 좌표.
도 11은 고형의 동결 조직 표본의 세포수 결정을 보여준다. A*02- 및 A*24-양성 종양 표본(A)의 세포수 분석 및 세포수 분석의 추정된 변동(B). 생물학적 반복은 회색으로 강조표시되어 있다.
도 12는 HLA-A*02 TUMAP의 세포 당 펩티드 카피의 결과를 보여준다. 8개의 다른 GC 종양을 분석했으며, 그 가운데 3개는 이중으로 분석되었다(생물학적 이중 반복은 그룹화하여 회색으로 강조표시된다). LLOQ란 한 가지의 MS 실험에서 정량 범위를 말하며 표본- 및 TUMAP-특이적 LLOQ, 즉, 특이적 TUMAP(회색으로 표시)의 특정한 표본에서 정량가능한 가장 작은 카피 수로서 외삽된다.
도 13은 HLA-A*02 TUMAP의 세포 당 펩티드 카피에 대한 추가 결과를 보여준다. 8개의 다른 GC 종양을 분석했으며, 그 가운데 3개는 이중으로 분석되었다(생물학적 이중 반복은 그룹화하여 회색으로 강조표시된다). LLOQ란 한 가지의 MS 실험에서 정량 범위를 말하며 표본- 및 TUMAP-특이적 LLOQ, 즉, 특이적 TUMAP(회색으로 표시)의 특정한 표본에서 정량가능한 가장 작은 카피 수로서 외삽된다.
도 14는 HLA-A*24 TUMAP의 세포당 펩티드 카피에 대한 추가 결과를 보여준다. 6개의 다른 GC 종양을 분석했으며, 그 가운데 3개는 이중으로 분석되었다(생물학적 이중 반복은 그룹화하여 회색으로 강조표시된다). LLOQ란 한 가지의 MS 실험에서 정량 범위를 말하며 표본- 및 TUMAP-특이적 LLOQ, 즉, 특이적 TUMAP(회색으로 표시)의 특정한 표본에서 정량가능한 가장 작은 카피 수로서 외삽된다.
도 15는 HLA-A*24 TUMAP의 세포 당 펩티드 카피에 대한 추가 결과를 보여준다. 6개의 다른 GC 종양을 분석했으며, 그 가운데 3개는 이중으로 분석되었다(생물학적 이중 반복은 그룹화하여 회색으로 강조표시된다). LLOQ란 한 가지의 MS 실험에서 정량 범위를 말하며 표본- 및 TUMAP-특이적 LLOQ, 즉, 특이적 TUMAP(회색으로 표시)의 특정한 표본에서 정량가능한 가장 작은 카피 수로서 외삽된다.
도 16은 MHC/펩티드 단량제 제제에 있어서 500 fmol의 자유 펩티드를 사용하여 표본의 스파이킹에 따른 영향에 대한 시험을 보여준다. 이 분석에 있어서 자유 펩티드는 표시된 펩티드에 대한 상당한 영향을 갖지 못한다.
도 17은 큐비트 HS(형광) 대 표준 곡선을 사용하여 DNA 단리 재현성에 대한 시험 결과를 보여준다. 표본(NSCLC와 같은 암 표본들)은 충분한 동질성을 보여준다. DNA는 3 X 50 ㎕ 분취량으로부터 단리했다.

서열 식별 번호 1 - 24는 실시예에 따른 절대 정량을 위해 선택된 표 1 및 2의 펩티드를 보여준다.

실시예

다음 실시예들은 TAA/암의 맥락에서 본 발명의 방법을 설명한다. 본 발명은 실시예로 제한되지 않으며, 실시예들은 본 발명의 단지 하나의 바람직한 구현이다. 본 발명의 목적상, 여기에 인용된 모든 참조 문헌들은 그 전문이 포함된다.

절대 정량을 위해 선택된 HLA-A*02 TUMAP

번호	펩티드 코드	서열
1	IGF2BP3-001	KIQEILTQV
2	FAP-003	YVYQNNIYL
3	COL12A1-002	FLVDGSWSV
4	MXRA5-001	TLSSIKVEV
5	NCAPG-001	YLLSYIQSI
6	COL6A3-002	FLLDGSANV
7	WNT5A-001	AMSSKFFLV
8	F2R-001	TLDPRSFLL
9	HIF1A-001	ALDGFVMVL
10	MET-001	YVDPVITSI
11	CCNB1-002	ILIDWLVQV

절대 정량을 위해 11개 펩티드가 선택되었다.

절대 정량을 위해 선택된 HLA-A*24 TUMAP

번호	펩티드 코드	서열
12	ASPM-002	SYNPLWLRI
13	SLC6A6-001	VYPNWAIGL
14	MMP3-001	VFIFKGNQF
15	CDC2-001	LYQILQGIVF
16	PLK4-001	QYASRFVQL
17	ASPM-001	RYLWATVTI
18	ATAD2-002	KYLTVKDYL
19	KIF2C-001	IYNGKLFDLL
20	MET-006	SYIDVLPEF
21	AVL9-001	FYISPVNKL
22	PPAP2C-001	AYLVYTDRL
23	UCHL5-001	NYLPFIMEL
24	UQCRB-001	YYNAAGFNKL

절대 정량을 위해 14개 펩티드가 선택되었다. 1개의 펩티드(PLK4-001)의 특성은 추가 실험에 적합하지 않은 것으로 나타났다. 나머지 13개 펩티드에 대해서는, 절대 정량 실험이 완료되었다.

고형 종양 표본에 있어서 세포 당 TUMAP 카피의 정량은 다음에 대한 (하위) 정량이 요구된다:

a) 단리된 TUMAP,

b) 단리 동안 TUMAP의 손실, 및

c) 분석한 조직 표본의 세포수.

본 발명에 따른 실험적 접근 방식에 대한 개요는 도 1에 나와 있다.

나노 LC - MS / MS 에 의한 펩티드 정량

질량 분석 방법에 의한 펩티드의 정확한 정량을 위해서는, 펩티드 수량과 MS 신호 사이의 펩티드-특이적 상관관계에 관한 기본적 지식을 먼저 학습해야 한다. 예를 들면, 펩티드 당 10 fmol과의 펩티드 혼합물에 대한 MS 측정은 MS 신호에 커다란 펩티드-특이적 차이가 있음을 드러낸다(도 2). 이는 또한 MS에 의해 펩티드를 신뢰할 수 있게 정량할 수 있는 범위는 개별적 펩티드 특성에 의존함을 함축한다.

또한, 특정 펩티드의 양과 MS 신호 사이의 선형 상관관계는 특정 범위 내에서만 기대할 수 있다. 그러므로 본 발명자들은 각 펩티드에 대한 개별적 보정 곡선을 측정하기로 결정했다. 각 보정 곡선의 범위는 펩티드의 개별적 정량 범위뿐만 아니라 이전에 분석된 종양 표본에서 각 펩티드의 MS 신호 범위도 반영하도록 선택되었다. 그 목표는 각 보정 곡선이 사용되는 일상적 표본의 적어도 80%의 펩티드-특이적 MS 신호를 포함하여야 하는 것이었다.

정확한 보정 곡선의 생성에는 합성 표준이 요구되며, 이는 독립적 방법으로 정량해야 하며 천연 TUMAP와 동일한 특성을 갖는다. 본 발명자들은 TUMAP의 이중 동위원소-표지 버전을 사용했으며, 즉 2개의 동위원소-표지 아미노산을 TUMAP 합성 동안 포함시켰다. 이중 표지 버전은 표지된 아미노산에 따라 12 내지 18 달톤의 질량 차이만큼 자연 TUMAP와 구별할 수 있다. 질량과 달리, 동위원소 표시는 MS에서 펩티드의 물성을 변형시키지 못하며, 즉 동일한 서열 결과와 다른 동위원소 표지를 가진 펩티드는 동일한 MS 신호 강도를 초래한다(Anderson et al., 2012). 합성 후, 이중 표지 TUMAP는 펩티드 수량과 MS 신호의 정확한 상호관계를 허용하기 위해 질소 분석에 의해 정확하게 정량화했다.

보정 곡선은 적어도 3가지 다른 매트릭스에서 작성했다. 즉, HLA 펩티드는 일상적 MS 표본과 유사한 자연 표본으로부터 용출되며 각 제제는 이중 MS 실행을 통해 측정했다. MS 실행 사이의 모든 기술적 변동을 보상하기 위해, 내부 표준 펩티드를 모든 측정치에 포함시켰다. 고정된 내부 표준에 대한 적정한 펩티드의 MS 신호의 비율을 좌표에 작성했으며, 보정 곡선은 로지스틱 회귀에 의해 계산했다(도 3). 정량의 하한(LLOQ)은 직선성으로부터의 편차를 고려하여 가시적으로 판정했다. 펩티드 FAP-003(도 4)과 같이 직선성으로부터의 편차가 분명하지 않으면, 최소 펩티드 수량의 평균 비율을 사용하여 LLOQ를 계산했다. 정량의 상한, 즉, 더 높은 농도에서의 직선성으로부터의 편차는 모든 보정 곡선에 있어서 도달하지 않았다.

실제의 정량 실험에서, 보정 곡선의 생성에서와 같은 양의 내부 표준을 각 표본마다 첨가했으며, 자연 대 내부 표준 펩티드의 비율을 계산했다. 이러한 "내부 표준 방법"은 MS 기반의 단백질 정량(예를 들면, 생물학적 표본의 바이오마커 분석)에서 일상적인 방법이다(Sturm et al., 2012; Prasad and Unadkat, 2014; Sato et al., 2012). 보정 곡선과 실제 종양 표본에서 측정된 값은 절대 정량을 위해 선택된 모든 TUMAP에 대해 도 4 및 도 5(HLA-A*02), 및 도 6 및 도 7(HLA-A*24)에 각각 나와있다.

정량적 MS 측정의 변동을 추정하기 위해, 각 MS 표본의 펩티드 양에 대한 변동 계수(CV, 단위 %)를 계산했다. MS 표본 당 CV를 좌표에 표시했으며 MS 측정치의 전체 변동을 중간값 CV로서 추정했다(도 8).

펩티드/ MHC 단리 효율

임의의 단백질 정제 공정과 마찬가지로, 조직 표본으로부터의 단백질 단리는 관심 단백질에 대한 일정 손실과 연관된다. TUMAP 단리 효율 결정을 위해, 절대 정량을 위해 선택된 모든 TUMAP에 대한 펩티드 MHC 복합체를 생성했다. 자연 펩티드 MHC 복합체로부터 스파이킹된 것을 구별할 수 있기 위해, TUMAP의 단일-동위원소-표지 버전을 사용했다. 즉, 하나의 동위원소-표지 아미노산을 TUMAP 합성 동안 도입했다. 이 복합체들을 신선하게 준비된 조직 용해물에, 즉, TUMAP 단리 절차에서 가능한 가장 이른 시점에 스파이킹한 다음 추후 친화성 정제에서 자연 펩티드 MHC 복합체와 같이 포획했다. 그러므로 단일 표지 TUMAP의 회수 측정은 개별 자연 TUMAP의 단리 효율에 대한 결론을 허용한다.

단리 효율은 절대 TUMAP 정량을 위해 선택된 바 있는 13개 표본을 통해 판정되었다(HLA-A*02-양성 7개, HLA-A*24-양성 5개, HLA-A*02/A*24 이중-양성 표본 1개). 8개의 A*02-양성 표본은 A*02 TUMAP에, 6개의 A*24-양성 표본은 A*24 TUMAP에 대한 단리 효율을 각각 분석했다(도 9A, 9B). 그 결과는 대부분의 펩티드의 경우 다른 조직 표본들의 단리 효능이 서로 유사함을 시사한다. 이와 반대로 개별 펩티드 간의 단리 효율은 차이가 있다. 이것은 단리 효율이 제한된 수의 조직 표본만을 통해 결정되는 것이라도 임의의 다른 조직의 제제로 외삽할 수 있음을 시사한다. 하지만 각 TUMAP는 개별적으로 분석하는 것이 필요한데 이는 단리 효율을 하나의 펩티드에서 다른 펩티드로 외삽할 수 없기 때문이다.

소수의 사례에서, 단리 효율은 비현실적으로 높고/거나 크게 변동한다(예: 펩티드 NCAPG-001)(도 9A). 예를 들어 펩티드에 의존하는 정량의 어려움으로 인해(예: 펩티드 CCNB1-002, ASPM-001의 높은 LLOQ 수준) 효율을 결정할 수 없거나 계산된 효율이 100%보다 높은 경우, 본 발명자들은 단리 효율을 100%로 가정했다. 이것은 단리 효율을 과다측정할 확률이 매우 높은 보존적인 접근방식이며 궁극적으로 세포 당 펩티드 카피를 과소추정하게 될 것이다.

TUMAP 단리 효율에 대한 변동 추정을 위해, 6 내지 8개의 표본으로부터 개별 TUMAP 단리에 대한 변동 계수(CV, 단위 %)를 도표에 작성했다(도 9C). 전반적으로 A*02 TUMAP 및 A*24 TUMAP의 평균 변동은 각각 24% 및 32%였다.

고체 동결 조직에서의 세포수 결정

세포 당 펩티드 카피 수의 계산에서 중대한 또 다른 요인은 TUMAP 단리에 사용된 조직 표본의 총 세포수의 추정이다. 본 발명자들은 DNA 함량 분석을 사용하기로 결정했으며, 이 방법은 광범위한 다른 출처의 표본들, 가장 중요하게는 동결 표본에 적용된다(Forsey and Chaudhuri, 2009; Alcoser et al., 2011; Alcoser et al., 2011; Silva et al., 2013).

종양 내 이질성을 고려하면, TUMAP 단리에 사용된 완전한 조직 표본에 대한 대표인 조직 분획의 세포수를 결정하는 것이 필요하다. TUMAP 단리 동안 준비된 조직 용해물은 고형 조직의 분획에 비해 더 동질성이므로 DNA 분석의 적합한 표본이다. DNA 단리 후, 총 DNA 농도는 형광 기반 분석(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies), 큐비트 HS DNA 분석)에서 정량했으며, 표본의 총 DNA 함량을 계산했다.

주어진 DNA 양의 세포수 계산을 위해, 본 발명자들은 2가지 다른 방법을 고려했다. 첫째, 세포수는 인간 게놈의 이론적 질량의 사용하여 계산할 수 있으며, 이는 이배체 게놈 당 약 6.67 pg DNA로 추정된 바 있다(Alcoser et al., 2011; Konigshoff et al., 2003). 또는 알려진 세포수의 표본을 사용하여 조직 표본에 사용된 것과 같은 방법으로써 DNA 표준 곡선을 작성할 수 있다. 이 방법은 DNA 단리 및 정량 절차의 임의의 영향을 이미 보상하므로 결과의 정확성을 개선한다. 본 발명자들은 2가지 다른 표준 곡선을 작성했으며, 하나는 7개의 다른 종양 세포주로부터 다른 하나는 6명의 건강한 공여자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 작성했다.

세 가지 모든 평가 방법(이론적 DNA 질량 및 두 개의 다른 세포 기반 표준 곡선)을 비교하기 위해, 몇몇 표본에 대해 1g 조직당 세포수를 계산했다(도 10A). 세포주 표준을 사용한 계산은 PBMC 표준의 사용과 비교해서 상당히 적은 세포수를 초래한다(최대 3.6배의 과소추정). 이것은 종양 세포주가 건강한 이배체 PBMC에 비해 DNA 함량이 더 높은 이수성 세포 비율이 더 크다는 경향이 있음을 고려하면 기대되었다. 문헌에 의하면, 두 배수 위 종양의 비율이 이 연구에서 25 내지 67%의 범위로 변동한다(Hiyama et al., 1995; Tamura et al., 1991; Wiksten et al., 2008; Zhang et al., 2005; Sugai et al., 2005). 조직 표본의 배수성 및 이수성 세포의 분획을 모르므로, 표준 곡선 모두 진정한 세포수에 대한 측정치만을 제공할 수 있으며 개별 조직 표본의 모든 물성을 고려할 수 없다. 변동의 다른 출처는 조직 표본의 모르는 증식 상태 또는 괴사 세포의 존재이다. 특히 증식하는 세포에서 DNA 함량의 배가는 세포수에 대해 DNA의 양을 증가시키므로 세포수 계산을 편향시킨다. 2개의 정상 위 조직 표본에서, 본 발명자들은 모든 세 가지 접근 방식을 통해 종양 표본과 비교해서 1g 조직 당 더 적은 수의 세포를 계산하였다.

보존적 접근방식으로서, 본 발명자들은 PBMC 표준 곡선(도 10B)의 사용을 결정했으며 이것은 초이배체 조직 표본의 부분에서 세포수의 과다추정을 초래할 수 있으며 그 결과 고려한 표본에서 세포 당 펩티드 카피의 과소추정을 초래하게 되는데, 어떠한 표본에서도 세포당 펩티드 카피를 과다추정해서는 안 된다.

절대 TUMAP 정량을 위해 선택된 조직 표본의 분석을 위해, 본 발명자들은 2 또는 3개 분취량의 조직 용해물로부터 DNA를 단리했으며, 형광 기반 분석을 통해 각 DNA 제제를 2 내지 3회 반복하여 정량했다. 총 세포수 및 1g 조직당 세포수를 PBMC 표준 곡선을 사용하여 총 DNA 함량으로부터 계산했다(도 11A). 세포수 분석의 전체 변동의 추정치를 얻기 위해, 각 표본 또는 이용가능한 경우 생물학적 복제물(즉, 동일한 종양의 다른 조각으로부터 얻은 독립적 조직 용해물 제제)의 수준에서 변동 계수(%)를 먼저 결정했다. 이 계산은 조직 용해물의 분취량은 물론 형광 분석에서 반복 측정치 사이의 변동을 고려했다. 이 CV들은 도 11B에 나와 있으며, 전체 변동은 묘사된 CV들의 중간값으로서 결정했다. 변동성은 조직 용해물이 전체적으로 균질화되지 않는, 즉, 해리되지 않는 세포를 함유하는 나머지 조직 입자들은 개별 분리 반복에서 더 높은 세포수를 초래한다는 사실에 의해 부분적으로 설명할 수 있다(예를 들어 도 11A의 GC816T를 참조).

세포 당 펩티드 카피

나노LC-MS/MS 수행에서의 펩티드 정량 데이터("총 펩티드"), TUMAP 단리 효율(% 단리 효율) 및 각 가용한 종양 표본의 세포수를 사용하면, 다음 공식 1에 따라서 세포 당 TUMAP 카피의 수를 계산하는 것이 가능하다.

총 펩티드의 수량은 도 4 내지 도 7에 있는 보정 곡선을 사용하여 2 내지 4회 나노LC-MS/MS 실험의 결과(펩티드/수행[fmol])로부터 계산한다:

[공식 1]

보정 곡선을 사용하여 정의된 LLOQ 위의 MS 측정치만이 절대 펩티드 카피 수의 계산에 사용된다. 이 LLOQ는 나노LC-MS/MS 실험에서의 TUMAP 수량(LLOQ/수행[fmol])을 말한다.

정량 가능한 모든 펩티드에 대한 세포 당 카피 수의 범위는 세포 당 50에서 30000 카피이다(표 3 참조).

HLA-A*02 및 HLA-A*24 TUMAP의 세포 당 카피 수에 대한 개요

HLA 대립형질	펩티드 코드	n개 표본에서 정량 (분석한 표본들의 %)	세포당 카피(개별 표본 및 생물학적 반복의 범위)
A*02	IGF2BP3-001	1 (13%)	350-450
A*02	FAP-003	1 (13%)	200-250
A*02	COL12A1-002	0 (0%)	nq
A*02	MXRA5-001	1 (13%)	450
A*02	NCAPG-001	1 (13%)	1000
A*02	COL6A3-002	0 (0%)	nq
A*02	WNT5A-001	1 (13%)	400
A*02	F2R-001	5 (63%)	50-300
A*02	HIF1A-001	3 (38%)	9000-30000
A*02	MET-001	2 (25%)	200-250
A*02	CCNB1-002	0 (0%)	nq
A*24	ASPM-002	0 (0%)	nq
A*24	SLC6A6-001	2 (33%)	1000-5000
A*24	MMP3-001	2 (33%)	100-250
A*24	CDC2-001	0 (0%)	nq
A*24	ASPM-001	0 (0%)	nq
A*24	ATAD2-001	2 (33%)	1500-6000
A*24	KIF2C-001	1 (17%)	3500
A*24	MET-006	3 (50%)	2500-13500
A*24	AVL9-001	4 (67%)	1000-10000
A*24	PPAP2C-001	5 (83%)	200-1500
A*24	UCHL5-001	1 (17%)	2500
A*24	UQCRB-001	1 (17%)	900

HLA-A*02 TUMAP 및 HLA-A*24 TUMAP는 각각 8개의 표본과 6개의 표본에서 분석되었다(nq = 펩티드 양이 LLOQ 미만이므로 정량되지 않음).

"세포 당 펩티드 카피"의 맥락에서 LLOQ를 가시화하기 위해, "세포 당 LLOQ"를 위에 나와 있는 2가지 공식을 사용하여 각 표본에서의 각 TUMAP를 계산했다. 표본들은 총 세포수가 다르기 때문에, 표본마다 세포 당 LLOQ가 다르다(A*02 TUMAP는 도 12 및 도 13, A*24 TUMAP는 도 14 및 도 15를 참조).

절대 TUMAP 정량의 오차 추정

절대 TUMAP 정량에 대한 변동을 추정하기 위해, 본 발명자들은 위에서 설명한 3가지 주요 실험 결과의 상대 변동을 고려했다:

a) 단리된 TUMAP의 양: 상대 편차 1.8%(A*02) 및 2.1%(A*24)

b) TUMAP 단리 효율: 상대 편차 24%(A*02) 및 32%(A*24)

c) 조직 표본 당 세포수: 상대 편차 27%.

변수 값들의 정상 분포를 가정하면 "세포 당 카피"의 상대 오차(σ)는 각 변수의 제공 상대 오차의 합에 대한 제곱근으로 계산할 수 있다:

[공식 2]

위에 주어진 값을 사용하면, 세포 당 절대 펩티드 카피 수의 변동 계수는 HLA-A*02 펩티드가 약 36%, HLA-A*24 펩티드가 약 42%이다. 이 결과의 변동에 관한 의미를 주기 위해, 모델 펩티드 및 표본에 대한 세포 당 펩티드 카피의 절대 및 상대 오차를 계산했다(표 4).

모델 펩티드의 절대 TUMAP 정량에 있어서 절대 및 상대 오차의 예시적 계산

	값	A*02		A*24
	값	상대 오차 (%)	절대 오차 (%)	상대 오차 (%)	절대 오차 (%)
총 세포수/표본	1x10⁸	27%	-	27%	-
총 펩티드 [fmol]	16.25	1.8%	-	2.1%	-
펩티드 MHC 단리 효율	10%	24%	-	32%	--
세포 당 펩티드 카피	1000	36%	360	42%	420

이 모델 계산은 절대 정량의 복합적 다단계 분석에 있어서 결과의 변동이 여전히 수용가능한 범위에 있음을 시사한다. 개별 TUMAP의 경우, 그 상대 오차는 여기서 계산된 평균 오차로부터 이탈할 수 있다. 세포 당 TUMAP 카피 수는 적합한 항체 및/또는 용해성 T 세포 수용체 표적의 선택이 가능하도록 TUMAP의 우선순위화를 통해 다른 TUMAP들 사이에서 정량적으로 비교할 수 있다.

TUMAP 정량 방법과 알려진 공개된 방법과의 비교

세포 당 MHC-관련 펩티드 카피 수의 절대 정량을 위한 정확한 접근 방식은 아직 제시된 바 없다. 가장 중요하게는 MS 분석을 사용하는 MHC-결합 펩티드의 정량에 대해 과거에 발표된 방법들은 표본 제조 시 항원의 손실을 고려하지 않았다(Tan et al., 2011; Hogan et al., 2005). 피터(Peter A. von Velen) 등은 "MHC-결합 펩티드의 정확한 정량" 방법을 최근에 발표했다(Hassan et al., 2014). 이 기술적 메모에서는 2개의 비핵심 조직적합성 항원들인 LB-NISCH-1A 및 LB-SSR1-1S를 EBV-LCL JYpp65 세포 상에서 정량화하기 위해 한 접근 방식이 사용되었다. 하지만 개별적 실험 단계들은 상당히 다르며 그 내용이 다음 표에 나와있다.

하산(Hassan) 등의 TUMAP 정량 방법들과 본 발명의 비교

	하산 등	본 발명
펩티드 보정 곡선	모든 펩티드가 펩티드 양과 MS 신호 간 동일한 상관관계(기울기 = 1)를 공유하는 다음 가정 하에 직선 범위의 결정에만 사용	직선 범위인, LLOQ의 결정 및 펩티드의 정량; 각 개별 펩티드의 수량과 MS간의 펩티드-특이적 상관관계를 고려
펩티드 정량	1점 보정: 소량 첨가된 표준 펩티드에 대한 신호 비율	펩티드-특이적 보정 곡선에 근거하는 내부 표준 방법, LLOQ 부근의 표본들 정량
단리 효율	2시간의 용해 후 용해물에 펩티드 MHC 복합체의 소량 첨가, 원심분리에 의한 제거, 이 단계들에서의 펩티드 손실은 무시	조직 균질화 직후 펩티드 MHC 복합체의 소량 첨가 즉, 펩티드 분리에 있어서 가장 이른 시점에 첨가
표본	세포주	고형 종양 조직
표본 준비	최종 나노LC-MS/MS 이전에 추가의 C18 크로마토그라피 단계, 표본 복잡성의 감소에 사용.	나노LC-MS/MS를 위한 면역 침전 및 여과된 표본의 즉각적인 사용
세포수의 결정	세포 펠릿 준비 동안 세포의 계수	고형 조직의 용해물로부터의 DNA 함량 분석
오차 계산	MS 반복의 변동(CV 0.1 내지 7.1%)만을 고려하며 펩티드 MHC 분리(각각 26% 및 91%) 그리고 세포수의 변동은 고려하지 않는다.	MS 반복의 변동(평균 CV는 1.8 내지 2.1%), 펩티드 MHC 단리 효율의 변동(평균 CV는 24-32%), 그리고 세포수 결정의 변동(평균 CV는 27%)을 고려한다.

하산 등이 분석한 2가지 펩티드의 카피 수는 생물학적 반복 가운데 각각 세포당 800 내지 5300(상대 편차 74%), 3000 내지 12000(상대 편차 60%) 카피의 변동을 보였다. 이러한 변동의 이유는 분명히 의논되지 않았지만, 다른 MS 기기의 사용에 기인하는 것일 수 있다.

요약하면 본 발명의 보다 세련된 방법은 보다 정확하고 신뢰가능한 결과에 기여하는 것을 기대한다.

낮은 카피 수를 갖는 펩티드의 정량

본 발명의 방법의 힘을 보여주기 위해 다음 표에서 제시된 데이터를 생성했다. 매우 적은 카피 수로만 존재하는 펩티드를 파악했으며, 그 가운데 펩티드 PDE11-001이 포함된다. 이 방법은 세포 당 펩티드 카피를 최소 약 10까지 결정하도록 허용함을 알 수 있다.

카피 수가 적은 펩티드의 정량

펩티드 코드	세포 당 카피			표본 수			출처/HLA
펩티드 코드	최소	중간	최대	> LLOQ	> LOD	평가가능	출처/HLA
펩티드1	20	20	20	1	5	16	NSCLC/A*02
펩티드2	10	30	300	13	16	17	NSCLC/A*02
펩티드3	10	30	50	4	10	18	NSCLC/A*02
펩티드4	10	30	100	17	17	19	NSCLC/A*02
펩티드5	20	20	90	7	8	11	NSCLC/A*02
펩티드6	10	20	50	6	6	10	NSCLC/A*02
펩티드7	< 10	30	200	9	12	15	PC/A*02
PDE11-001	< 10	10	30	8	9	10	PC/A*02

전립선암(PC) 서열 PDE11-001는 ALLESRVNL이다(서열번호 25).

PDE11-001은 포스포디에스터라아제11A(PDE11A)로부터 유래한 HLA-A*02 결합 펩티드이며, 이는 cAMP 및 cGMP의 가수분해를 촉매하므로 각각의 신호 경로를 하향조절한다. PDE11A의 돌연변이는 부신피질 과다형성은 물론 가족성 고환 생식 세포종과도 연관지어진 바 있다. 이 펩티드는 전립선암 표본 상에서 또한 간, 췌장 및 신장 세포 암종에서도 검출되었으나 정상 조직에서는 일절 검출된 바 없다.

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Claims

세포 상의 MHC 펩티드 리간드의 절대 정량 방법으로서,
a) 조직의 효소 분해 및/또는 세포 용해를 포함하는, 생물학적 표본으로부터 MHC 펩티드 리간드를 제시하는 세포를 준비하는 단계로서, 생물학적 표본이 세포를 포함하는 조직 표본, 혈액 표본, 종양 표본 및 감염된 조직의 표본으로부터 선택되는 단계;
b) 세포 핵의 계수, 광도 측정 DNA-결정, 형광 측정 DNA-결정 또는 정량적 PCR을 포함하는, 단계 a)에서 생성된 물질의 세포수를 결정하는 단계;
c) 정량할 알려진 양의 MHC 펩티드 리간드 및/또는 펩티드-MHC 복합체를 조직 균질화 직후 단계 a)에서 생성된 물질에 첨가하는 단계(스파이킹 I);
d) 단계 c)에서 생성된 물질로부터 MHC 펩티드 리간드를 단리하여 펩티드 용출물을 수득하는 단계;
e) 정량할 알려진 양의 MHC 펩티드 리간드를 내부 검정 시약으로서 상기 펩티드 용출물에 첨가하는 단계(스파이킹 II);
f) MHC 펩티드 리간드에 대한 질량 분광 분석을 수행하여
aa) 단계 d)에서 단리 효율에 대한 신호,
bb) 단계 e)의 내부 검정 시약에 대한 신호, 및
cc) 단계 a)에서 준비된 세포로부터의 MHC 펩티드 리간드에 대한 신호
를 생성하는 단계; 및
g) aa) 수득된 세포수,
bb) 단계 c)에서 첨가된 정량할 MHC 펩티드 리간드 및/또는 펩티드-MHC 복합체의 알려진 양, 및
cc) 단계 e)에서 첨가된 정량할 MHC 펩티드 리간드의 알려진 양
으로 단계 f)에서 수득된 신호들의 비교에 근거하여 MHC 펩티드 리간드를 정량함으로써, 정량된 양이 결정된 정량의 하한(LLOQ)보다 클 때 세포 상의 MHC 펩티드 리간드의 절대 정량이 달성되는 단계로서, 정량이 단계 e)의 내부 검정 시약의 신호와 단리된 MHC 펩티드 리간드의 신호 사이의 비율을 계산하고, 상기 비율을 MHC 펩티드 리간드의 확립된 보정 곡선과 비교함을 포함하고, 정량이 동일한 양으로 사용된 내부 검정 시약에 대한 비율에 근거한 펩티드-특이적 보정 곡선의 생성 및 정량될 MHC 펩티드 리간드에 대한 LLOQ의 결정을 추가로 포함하는 단계
를 포함하는, 방법.
제 1 항에 있어서,
MHC 펩티드 리간드가 종양 관련 펩티드(TAA) 또는 질병 관련 펩티드(DAA)인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
단계 a)에서 생성된 물질에서 하나 이상의 유형의 HLA-분자의 양을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
첨가된 펩티드-MHC 복합체 및/또는 첨가된 MHC 펩티드 리간드가 표지되는 방법.
제 4 항에 있어서,
첨가된 펩티드-MHC 복합체 및/또는 첨가된 MHC 펩티드 리간드가 동위원소에 의해 다르게 표지되는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
단리가 크로마토그라피를 포함하는 방법.
제 6 항에 있어서,
크로마토그라피가 친화 크로마토그라피인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
분석을 위해 과다제시된, 과발현된 및/또는 종양-특이적 MHC 펩티드 리간드를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
고처리량 기반으로 수행되는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
표시된 단계들로 구성되는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
생물학적 표본이 한 개인으로부터 또는 동일한 의학적 질환을 앓고 있는 개인들의 집단으로부터 유래하는 방법.
제 11 항에 있어서,
정량된 MHC 펩티드 리간드에 근거하여 개인화 MHC 리간드 프로파일을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 12 항에 있어서,
개인화 MHC 리간드 프로파일이 개인화 질병-특이적 MHC 리간드 프로파일인 방법.