TW201631320A - 天然加工的hla限制性癌胜肽絕對定量方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種天然加工的HLA限制性癌胜肽絕對定量方法，即，每細胞呈現胜肽拷貝數的測定。本發明不僅可用於開發抗體療法或胜肽疫苗，而且對分子免疫監測有很高的價值，對辨識免疫治療策略中新胜肽抗原的程序有用，如，各個疫苗、基於抗體的療法或癌症、感染性及/或自體免疫疾病中過繼T細胞轉移方法。

Description

天然加工的HLA限制性癌胜肽絕對定量方法
本發明涉及一種天然加工的HLA限制性癌胜肽絕對定量方法，即，每細胞呈現胜肽拷貝數的測定。本發明不僅可用於開發抗體療法或胜肽疫苗，而且對分子免疫監測有很高的價值，對辨識免疫治療策略中新胜肽抗原的程序有用，如，各個疫苗、基於抗體的療法或癌症、感染性及/或自體免疫疾病中過繼T細胞轉移方法。
深入瞭解人類白細胞抗原(HLA)結合胜肽在原發疾病組織中的表現水平可大大改進開發癌症免疫療法以及自身免疫和感染疾病的免疫治療，從而誘發免疫系統T細胞對抗癌症。該資訊與基於抗體療法或胜肽疫苗相關，特別地，與基於蛋白質、DNA或RNA等分子實體的任何其他類型的T細胞疫苗相關。對於患者來源組織，之前沒有每個細胞規模絕對拷貝的這種量化資料。
EP1508047B1中披露了上述避免「反向免疫學」相 關問題的胜肽的一種辨識方法。如前述，該方法不能用於所述胜肽的定量分析。WO 2005/076009中披露了運用標記策略的另一種方法，其中允進行一些定量分析，但不能在絕對的規模上進行。例如，WO 03/025576中披露了其他標記方法，Martin等人在《蛋白質組學》(Proteomics 2003,3,2208-2220)一文中也進行了披露。
Fortier等人披露了另一種方法(The MHC class I peptide repertoire is molded by the transcriptome,JEM,Vol.205,No.3,March 17,2008 595-610)。該方法的缺點是：由於酸洗脫，需要從非MHC結合胜肽中剝離出MHC結合胜肽。這使用b2m-剔除細胞株實施。因此，該方法不能用於原發患者腫瘤材料。在該方法中，原發鼠胸腺細胞與鼠EL4細胞株進行了對比。起始量透過測量MHC-I分子進行了調整。僅此一項大大限制了Fortier等人披露的方法。另外，沒有應用不同尺寸和來源的原發組織所需要的正態化。相反，使用均衡的起始原料，讓正態化過時。然而，對於主要(患者)材料正態化是絕對必要的。
WO2011/128448披露了從大規模原生組織標本中定量辨識相關HLA-結合胜肽抗原而無需標記的一種方法。該方法包括提供至少一個患病初生組織取樣和至少一個初生健康組織取樣的步驟，初生健康組織較佳對應於患病組織，從所述取樣中分離MHC胜肽配體，對所述MHC配體胜肽執行HPLC-MS分析，提取每個信號的前體離子信號強度(面積)(如來自於分析)，決定所述MHC配體胜肽的序列，和使其 他步驟以及資料品質控制步驟正常化，以便相對量化所述MHC胜肽配體而無須標記。
Hassan等人(在：Hassan C,et al,Accurate quantitation of MHC-bound peptides by application of isotopically labeled peptide MHC complexes,J Prot(2014),http：//dx.doi.org/10.1016/j.jprot.2014.07.009)中披露一種方法，在這種方法中，在細胞溶解後(即，正常取樣加工之前)製備和直接加入同位素標記胜肽MHC單體(hpMHC)。使用這種方法，取樣加工期間所有的損失均可計入，並且可對特定的MHCI類呈現配體進行準確測定。該研究查明了免疫純化步驟是取樣預處理期間極端損失的原因，並為這些損失提供瞭解決方案。提出的策略可用於獲得表位拷貝數的可靠視圖，因此，可改進疫苗設計和免疫治療策略。
能否刺激免疫反應取決於是否存在被宿主免疫系統視為異物的抗原。發現存在腫瘤相關以及疾病抗原增加了運用宿主免疫系統幹預腫瘤生長的可能性。目前，針對癌症免疫治療，正在探索利用免疫系統的體液和細胞進行免疫的各種機制。
細胞免疫反應的特定元素能特異性地辨識和破壞腫瘤細胞。從腫瘤浸潤細胞群或外周血中分離出的細胞毒性T-細胞(CTL)表明，這些細胞在癌症的天然免疫防禦中發揮了重要作用。尤其是辨識與主要組織相容性複合體(MHC)I類分子結合的胜肽的CD8陽性T細胞(T-CD8+)。通常8至12個胺基酸殘基的這些胜肽源自蛋白質或位於細胞質的缺損核糖體產物 (DRIP)，在這種反應中發揮重要作用。人MHC分子也稱為人白細胞-抗原(HLA)。
MHC分子有兩類：大部分有細胞核的細胞上都可發現的MHC-I類分子。MHC分子分別由一條α重鏈和β-2-微球蛋白(MHC-I類受體)或一條α和一條β鏈(MHC-II類受體)組成。其三維構造形成一個結合槽，用於與胜肽進行非共價相互作用。MHC-I類分子呈現主要為內源性的蛋白、DRIPS和較大胜肽裂解產生的胜肽。MHC II類分子主要發現於專業抗原呈現細胞(APC)上，並且主要呈現在內吞作用程序中由APC佔據並且隨後被加工的外源性或跨膜蛋白的胜肽。胜肽和MHC I類分子的複合體由負載相應TCR(T細胞受體)的CD8陽性細胞毒性T淋巴細胞進行辨識，而胜肽和MHC II類分子的複合體由負載相應TCR的CD4陽性輔助T細胞進行辨識。因此，TCR、胜肽和MHC按照1：1：1的化學計量呈現，這一點已是共識。
對於觸發(引發)細胞免疫反應的胜肽，它必須與MHC分子結合。這一程序依賴於MHC分子的等位基因以及胜肽胺基酸序列的特異性多態性。MHC-I類-結合胜肽的長度通常為8-12個胺基酸殘基，並且在其與MHC分子相應結合溝槽相互作用的序列中通常包含兩個保守殘基(「錨」)。這樣，每個MHC等位基因都有一個「結合基序」，可控制胜肽與結合溝槽特異性結合的能力。
在MHC-I類依賴性免疫反應中，胜肽不僅能與腫瘤細胞表現的某些MHC-I類分子結合，而且它們還必須能被T細胞特異性T細胞受體(TCR)辨識。
腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞所辨識的抗原，即它們的表位，可以是源自所有蛋白類型的分子，如酶、受體、轉錄因子等，它們在相應的腫瘤細胞中被表現，並且與同源未變的細胞相比，其表現上調。
目前將腫瘤相關抗原或疾病相關抗原分類為以下主要幾組：癌-睾丸抗原：T細胞能夠辨識的最先確認的TAA[腫瘤相關抗原；疾病相關抗原縮寫為DAA]屬於這一類抗原，由於其成員表現於組織學相異的人腫瘤中、正常組織中、僅在睾丸的精母細胞/精原細胞中、偶爾在胎盤中，因此，它最初被稱為癌-睾丸(CT)抗原。由於睾丸細胞不表現HLA I類和II類分子，所以，在正常組織中，這些抗原不能被T細胞辨識，因此在免疫學上可考慮為具有腫瘤特異性。CT抗原大家熟知的例子是MAGE家族成員或NY-ESO-1。
分化抗原：腫瘤和正常組織(腫瘤源自該組織)都含有TAA，大多數TAA發現於黑色素瘤和正常黑色素細胞中。許多此類黑色素細胞譜系相關蛋白參與黑色素的生物合成，因此這些蛋白不具有腫瘤特異性，但是仍然被廣泛地用於癌症的免疫治療。例子係包括，但不僅限於，黑色素瘤的酪胺酸酶和Melan-A/MART-1或攝護腺癌的PSA。
過量表現的TAA：在組織學相異的腫瘤中以及許多正常組織中都檢測到了基因編碼被廣泛表現的TAA，一般表現水平較低。有可能許多由正常組織加工和潛在呈現的表位低於T細胞辨識的閾值水平，而它們在腫瘤細胞中的過量表現 能夠透過打破先前確立的耐受性而引發抗癌反應。這類TAA的典型例子為Her-2/neu、生存素、端粒酶或WT1。
腫瘤特異性抗原：這些獨特的TAA產生於正常基因(如β-catenin、CDK4等)的突變。這些分子變化中有一些與致瘤性轉化及/或進展相關。腫瘤特異性抗原一般可在不對正常組織帶來自體免疫反應風險的情況下誘導很強的免疫反應。另一方面，這些TAA在多數情況下只與其上確認了有TAA的確切腫瘤相關，並且通常在許多個體腫瘤之間並不都共用TAA。
由異常後-轉譯修飾產生的TAA：此類TAA可能由腫瘤中既不具有特異性也不過量表現的蛋白產生，但其仍然具有腫瘤相關性(該相關性由主要對腫瘤具有活性的轉譯後加工所致)。此類TAA產生於變糖基化模式的改變，導致腫瘤產生針對MUC1的新型表位或在降解程序中導致諸如蛋白拼接的事件，這可能具有也可能不具有腫瘤特異性。
腫瘤病毒蛋白：這些TTA是病毒蛋白，可在致癌程序中發揮關鍵作用，並且由於它們是外源性蛋白(非人源蛋白)，所以能夠激發T細胞反應。這類蛋白的例子有人乳頭狀瘤16型病毒蛋白、E6和E7，它們在宮頸癌中表現。
對於被細胞毒性T淋巴細胞辨識為腫瘤特異性或相關性抗原、或疾病特異性或相關性抗原以及用於治療的蛋白質，必須具備特殊的條件。該抗原應主要由腫瘤細胞或受感染細胞表現，而並非完全由正常健康組織表現，或表現數量相對較少，例如：少於因數5、10或更多。
在傳染病中有兩種可能性，第一，受感染細胞表現一種健康細胞不表現的抗原-與感染直接相關-或受感染細胞過量表現一種只有健康細胞極少量表現的抗原-抗原過量表現通常存在於健康細胞的多胜肽中。
更為適宜的情況是，該相應抗原不僅出現於一種腫瘤、感染或緊張中，而且濃度(即每個細胞的相應胜肽拷貝數目)高。腫瘤特異性和相關性抗原以及疾病特異性或相關性抗原往往是源自直接參與因細胞週期控制或凋亡抑制中的一項功能而發生的正常細胞向腫瘤細胞/受感染細胞轉化的蛋白。
在癌症的情況下，這些直接導致轉化的蛋白的其他下游靶標也可能會被上調，因此可能間接與腫瘤相關。這些間接腫瘤相關抗原也可能是預防接種方法的靶標(Singh-Jasuja H.,Emmerich N.P.,Rammensee H.G.,Cancer Immunol.Immunother.2004 Mar；453(3)：187-95).在這兩種情況中，至關重要的是，都要存在抗原胺基酸序列的表位，所以這種來自腫瘤相關或疾病相關抗原的胜肽(「免疫原性胜肽」)可導致體外或活體內T細胞反應。
基本上，任何能與MHC分子結合的胜肽都可能充當一個T細胞表位。誘導體外或活體內T細胞反應的前提是存在具有相應TCR的T細胞，並且不存在對該特定表位的免疫耐受性。
因此，TAA和DAA是開發腫瘤疫苗的起點。辨識和表徵TAA和DAA的方法基於對患者或健康受試者CTL的使用 情況，或基於腫瘤與正常組織胜肽之間差別轉錄特性或差別表現模式的產生。
然而，對腫瘤組織或人腫瘤細胞株中過量表現或選擇性表現的基因的辨識並不提供在免疫療法中使用這些基因所轉錄抗原的準確資訊。這是因為，有著相應TCR的T細胞必須要存在，而且對這個特定表位的免疫耐受性必須不存在或為最低水平，因此，這些抗原的表位只有一部分適合這種應用。因此，只選擇那些蛋白過量表現或選擇性表現的胜肽，並且這些胜肽是與可找到對抗性功能性T細胞的MHC分子結合在一起被呈現，這一點非常重要。這種功能性T細胞被定義為在以特異性抗原刺激後能夠克隆地擴展並能夠執行效應子功能(「效應子T細胞」)的T細胞。
輔助T細胞在編排抗腫瘤免疫的CTL效應子功能中發揮著重要作用。觸發TH1細胞反應的輔助T細胞表位支援CD8陽性殺傷T細胞的效應子功能，其中包括直接作用於腫瘤細胞的細胞毒性功能(該類腫瘤細胞表面顯示有腫瘤相關胜肽/MHC複合體)。這樣，單獨形式的或與其他腫瘤相關胜肽形成組合物的腫瘤相關T輔助細胞胜肽表位可作為刺激抗腫瘤免疫反應疫苗組合物的活性藥物成分。
瞭解HLA-I或II類呈現配體胜肽的準確拷貝數在基礎與臨床免疫學中非常重要。目前，拷貝數最好的決定方法是基於質譜法，採用單反應監測(SRM)結合已知量的同位素標記胜肽。然而，這些方法仍不足夠精確以被有效地用在上述方法中。
因此，鑒於上述情況，本發明的目的是提供一種HLA-I或II類呈現配體拷貝數的絕對判定方法，其精確、高效、易於處理，並且還可在「高通量」水平上進行。技藝人士在研究本發明的以下說明時，本發明的其他目標和優勢將變得明瞭。
在本發明的第一個方面，本發明的目的透過一種方法解決，即細胞上至少一種MHC胜肽配體的絕對定量方法，所述方法包括a)製備呈現來自包含細胞的生物取樣的至少一種MHC胜肽配體的細胞，b)測定步驟a)製備的細胞數，c)添加已知量待量化的至少一種胜肽-MHC配體及/或胜肽-MHC配體複合物至步驟a)的製備品(「加樣I」)，d)分離來自步驟c)的製備品的至少一種MHC胜肽配體，以獲得胜肽洗脫物，e)添加已知量待量化的至少一種MHC胜肽配體至胜肽洗脫物(「加樣II」)，f)在至少一種MHC胜肽配體上進行質譜分析，以產生至少一個aa)用於步驟d)中分離效率的信號，bb)步驟e)中添加的已知量的至少一種MHC胜肽配體的信號，及cc)來自步驟a)的製備細胞的至少一種MHC胜肽配體的信號，以及；g)基於步驟f)中獲得的信號與下列各者的比較來定 量至少一種MHC胜肽配體aa)獲得的細胞計數，bb)步驟c)中添加的待量化的已知量的至少一種胜肽-MHC配體及/或胜肽-MHC配體複合物，和cc)步驟e)中添加的待量化的已知量的至少一種MHC胜肽配體，其中至少部分實現了細胞上至少一種MHC胜肽配體的絕對定量。
在根據本發明的一種方法中，其中幾種取樣進行了並行分析，如果分離效率已經決定可省略上述步驟c)，這是因為一個取樣的效率可用來估計第二個MHC胜肽配體及/或MHC胜肽配體複合物的分離效率(即，可以作為一個交叉參考值)。
較佳方法進一步使用從e)中內部校準獲得的信號(加樣Ⅱ)作為從至少一種MHC胜肽配體分離獲得的信號的常數和保存(對照)參照物(透過計算這兩信號之間的比例)。此比例與決定的校準曲線相比較，其中還包括在非常相同量的內部校準物，較佳透過使用此類內部校準的相同等分試樣。那麼，校準曲線描述了這些比率和胜肽量之間的關係。參見第3圖及圖說。
令人驚訝的是，在本發明的背景下，發明人發現，透過組合上述分析步驟，與幾種不同的非癌組織或未感染組織和器官相比癌症或其他受感染組織的MHC-(較佳HLA限制)胜肽水平直接絕對定量首次成為可能。
在本發明的背景中，「加樣(spiking)」是指加入已知量或濃度的至少一種，例如，未結合(「遊離」)待量化MHC胜肽配體至一種樣品，如，製備品(這裏指定為「加樣I」)或胜肽洗脫物(這裏指定為「加樣Ⅱ」)。加入胜肽的量/濃度容易調節，並至少部分依賴於有待加樣的取樣以及用於分析的方法。
根據本發明所述的一種方法為較佳，其中至少一種MHC胜肽配體選自一種腫瘤相關胜肽(TAA)或疾病相關胜肽(DAA)。
根據本發明的一種方法為更進一步較佳，其中所述包括細胞的生物取樣選自一份組織取樣、血液取樣、腫瘤取樣或一份受感染組織取樣。在本發明的情況下，直接源自受試者(例如：患者)的取樣被稱為「原發」取樣，例如：原發組織或腫瘤取樣，而細胞株取樣為例如：已建立的腫瘤細胞系。樣品可以是新鮮的也可以是保存的(如：冷凍或製備)，只要它們適用於根據本發明所述的方法即可。較佳為一種不含永久細胞系的生物取樣。
作為一個較佳實例，可使用與CNBr活化的瓊脂糖凝膠耦合之後經酸處理和超濾的HLA-A、HLA-B、HLA-C特異性抗體W6/32或HLA-A*02特異性抗體BB7.2以固體組織的免疫沉澱法獲得匯集自激凍(原發)組織取樣的HLA胜肽。對於不同的HLA等位基因，本領域已知的其他特異性抗體可用作為，例如：A*03的GAP-A3，B等位基因的B1.23.2。存在相應的方法來獲得本領域已知的其他哺乳動物的MHC-I類胜肽。
根據本發明所述的方法也可用於傳染性疾病，例如：病毒或細菌感染，如：登革熱、埃博拉病毒、馬爾堡病毒，結核病(TB)、腦膜炎或梅毒，較佳情況是，該方法用於抗生素耐藥菌株的傳染性生物體、自體免疫疾病，如：關節炎、寄生蟲感染，瘧疾和其他疾病，如：MS和Morbus帕金森，只要靶向基團是MHC-I類結合胜肽。
自體免疫疾病的實例(包括未正式宣佈為自體免疫疾病的疾病)有慢性阻塞性肺疾病、僵直性脊柱炎、克羅恩病(兩種特發性炎症性腸道疾病[「IBD」]中的一種)、皮肌炎、I型糖尿病、子宮內膜異位症、Goodpasture氏徵候群、Graves氏病、格林-巴厘徵候群(GBS)、橋本氏病、化膿性汗腺炎、川崎病、IgA腎病、原發性血小板減少性紫癜、間質性膀胱炎、紅斑狼瘡、混合性結締組織病、硬斑病、重症肌無力、嗜睡症、神經性肌僵直、尋常型天皰瘡、惡性貧血、銀屑病、銀屑病關節炎、多發性肌炎、原發性膽汁性肝硬化、復發性多軟骨炎、類風濕關節炎、精神分裂症、硬皮病、乾燥徵候群、僵人徵候群、顳動脈炎(巨細胞動脈炎)、潰瘍性結腸炎(特發性炎症性腸病[「IBD」]兩種類型之一)、脈管炎、白癜風以及韋格納肉芽腫。
本發明不局限於人類疾病，但可用於哺乳動物，如：牛、豬、馬、貓、狗，齧齒類動物，如：大鼠、小鼠、山羊和其他家畜。
在本發明的方法的另一較佳實施方案中，細胞製備至少部分地包括組織的酶分解及/或細胞溶解。
根據本發明所述的方法為較佳，其中所述細胞計數使用選自計數細胞核、光度DNA測定法、螢光DNA測定法(例如，使用Qubit®技術)以及定量PCR的一種方法進行測定。
此外，根據本發明所述的方法為較佳，進一步包括測定在步驟a)所述製備品中至少一種類型HLA分子的量。測定含量可使用本領域中常用的方法，例如涉及特異性抗體(如ELISA、凝膠、細胞分選及/或層析)的方法來完成。
根據本發明所述的一種方法為進一步較佳，其中添加的至少一種胜肽MHC複合物及/或添加的至少一種MHC胜肽配體被標記，較佳為差異性標記。各標記物為所屬技術領域具有通常知識者熟知，且包括同位素標記、放射性和非放射性標記、酶、和較佳不同品質的其他基團。較佳情況是，標記特異性針對待定量的特定胜肽。最佳的情況是雙標記TAA/TUMAP，例如，在相同的實驗中需要兩種差異化標記進樣的情況(參見下文的實施例)。
根據本發明所述的一種方法為首選，其中分離包括層析，如：親和層析。因此，孤立的MHC/HLA配體根據其疏水性可用反相色譜(例如：nanoAcquity UPLC系統，Waters)分離，之後在Orbitrap雜交質譜(ThermoElectron)中檢測。每個取樣透過採集複製LCMS(舉例)操作結果而進行較佳分析。然後，LCMS資料透過分析串聯質譜(MS/MS)資料而進行處理。
有針對性方法記錄、著眼於待量化胜肽m/z值的串聯MS譜較佳透過一種提取預定義過渡預選碎片離子強度的軟體 進行評價。此類軟體的一個實例為Skyline(MacLean B et al.Skyline：an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.Bioinformatics.2010 Apr 1；26(7)：966-8.,http：//dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/btq054)，分析資料獨立採集(DIA)實驗質譜儀資料進行並行反應監測的應用程式(PRM-靶向MS/MS)。此軟體可為了特定目的而用於共洗脫同位素標記胜肽相關事項，也可用於提取單個過渡強度以便進一步處理。
根據用於純化的共同等位基因特異性抗體(如果有的話)、或者根據透過錨胺基酸模式將序列分配給共同HLA等位基因的情況，可以比較不同取樣之間限於相同HLA等位基因的胜肽組別。
由於統計的原因，根據本發明所述的一種方法為較佳，其中對於每個至少一種MHC配體胜肽進行至少兩次重複質譜運行。
因此，本發明的另一個方面涉及根據本發明的一種方法，還包括選擇過量呈現、過量表現及/或腫瘤特異性的MHC胜肽配體進行分析。
本發明的又一個方面涉及根據本發明的一種方法，其中所述方法能夠在高通量的基礎上正在執行或執行，較佳至多50~100個胜肽配體可以並行進行分析。
在本發明的方法的另一較佳實施方案中，按所附請求項中所示順序或上述順序實施所述方法的步驟。在本發明 的另一較佳方法中，所述方法包括上述和此處所述的步驟。
在本發明所述方法的另一方面，所述方法與個人化治療和診斷相關。對於這一點，分析的所述取樣源自個體或有如本文所述相同病症的一群個體。此外，基於量化的所述MHC胜肽配體，個人化MHC配體特點，較佳為個人化量化疾病特定MHC配體特點，可用本文所述的本發明方法產生。
最佳情況為，在活體外實施本發明中所述的方法。
在本發明所述方法的另一較佳方面，所述方法進一步包括透過所述方法用合成器或手動定量而合成，較佳為化學合成所述至少一個MHC胜肽配體胜肽的步驟。因此，本發明的另一個方面涉及到製備一種免疫活性胜肽的一種方法，其中根據所披露的方法可量化一種胜肽，並且所述胜肽可在體外或體內進行化學合成。胜肽可用本領域已知的標準方法透過對胺基酸進行化學聯接而製備。
胜肽可在活體外製備，例如，在無細胞系統中製備，以及使用細胞在活體內製備。胜肽可按照披露的方法製備，例如：Lewandrowski等人的EP2111867發明中的方法。
另一方面涉及根據本發明所述的方法，其中實施另一步驟，其中檢測T淋巴細胞的存在。使用這種方法，可特定檢測針對分離和決定胜肽的T淋巴細胞在多大程度上預先存在於患者中。透過實施此步驟，可將T淋巴細胞已經預先存在於患者時的那些胜肽用作一種疫苗。然後，胜肽可用來啟動這些特異性T淋巴細胞。
另一方面涉及根據本發明所述的方法，其中透過用 抗原呈現分子和抗原胜肽的重組複合物標記白細胞而檢測預先存在的特定T淋巴細胞。
在本發明所述方法的另一較佳實施方案中，所述方法進一步排除了使用基因剔除細胞、細胞株或動物。
本發明的進一步較佳可選步驟為：根據摻入所定數量取樣的加標分子而進行的自動品質控制。
運用根據本發明所述的方法，可進一步決定患者特定胜肽，即，可將用作疫苗的胜肽與患者精確匹配，從而誘導特異性免疫反應。
本發明的另外方面則涉及一種藥物組合物，包括根據本發明所述的方法量化的決定量的一或多個TAA及/或DAA胜肽。
例如，組合物可應用於腸外、皮下、皮內或肌肉內，也可口服，這取決於劑型和目標疾病。為了達到這樣的目的，胜肽在藥用載體中溶解或懸浮，較佳為水載體；組合物可進一步包括添加劑，例如緩衝劑、粘合劑等。胜肽也可與免疫刺激物質共同給藥，例如：細胞因子。
根據本發明的一個方面，胜肽可用於治療腫瘤性疾病以及製備一種治療腫瘤疾病的藥物。要治療的腫瘤疾病包括實體瘤，如腎、乳腺、胰腺、胃、睾丸及/或皮膚癌或血液癌症，如：AML。該腫瘤疾病清單僅為示例，並不用於限制應用領域。
胜肽可以進一步用於評估腫瘤疾病的療程。
胜肽還可用於監測其他免疫接種的治療或某些治療 。因此，胜肽不僅可用於治療，還可用於診斷。
本發明的另一方面涉及使用量化的胜肽產生抗體。多克隆抗體可用一般方式獲得，方法是透過注射胜肽對動物進行免疫接種隨後純化免疫球蛋白。單克隆抗體可根據本領域已知的標準化方案產生。
本發明與基於抗體的方法特別相關，因為靶細胞細胞表面上的靶拷貝數可決定及/或反映該靶是否可以由抗體解決問題，如果可以，可使用哪些效應功能，例如共軛藥物、毒素、雙特異性抗體招募T細胞或其他效應細胞。其他方面涉及在所謂的支架形成分子中的使用，如核酸適體(靶-結合寡核酸或胜肽分子)及/或可溶性T細胞受體(TCR)。在這裏，類似於抗體，拷貝數量決定所需的親合力和效應功能。對於所述支架分子。
能否刺激免疫反應取決於是否存在被宿主免疫系統視為異物的抗原。發現腫瘤相關抗原增加了運用宿主免疫系統幹預腫瘤生長的可能性。對於癌症免疫療法，目前正在探索控制免疫系統中的體液和細胞免疫的各種機制。
細胞免疫反應的特定元素能特異性地辨識和破壞腫瘤細胞。從腫瘤浸潤細胞群或外周血中分離出的細胞毒性T-細胞(CTL)表明，這些細胞在癌症的天然免疫防禦中發揮了重要作用。特別是CD8陽性T細胞在這種反應中發揮重要作用，它能辨識源自蛋白或位於細胞質的缺損核糖體產物(DRIP)的通常8至12個胺基酸殘基，由主要組織相容性複合體(MHC)I類分子所載的胜肽。人MHC分子也稱為人白細胞-抗原(HLA) 。
MHC-I類分子，在細胞核呈現因主要內源性、細胞質或細胞核蛋白質、DRIPS和較大胜肽，蛋白裂解產生的胜肽的大多數有核細胞上都能發現。然而，源自內體結構或外源性來源的胜肽也經常在MHC-I類分子上發現。這種I-類分子非經典呈現方式在文件中被稱為交叉呈現。
對於被細胞毒性T淋巴細胞辨識為腫瘤特異性抗原或相關性抗原以及用於治療的蛋白質，必須具備特殊的條件。該抗原應主要由腫瘤細胞表現，而正常健康組織根本不表現或表現數量較少。更為適宜的情況是，該相應抗原不僅出現於一種腫瘤中，而且濃度(即每個細胞的相應胜肽拷貝數目)高。腫瘤特異性抗原和腫瘤相關抗原通常是源於由於細胞週期調控或凋亡等功能在正常細胞轉化為腫瘤細胞中直接受累的蛋白。另外，這些直接導致轉化的蛋白的下游靶標也可能會被上調，因此間接與腫瘤相關。這些間接腫瘤相關抗原也可能是預防接種方法的靶標。至關重要的是，在這兩種情況中，都存在抗原胺基酸序列的表位，所以這種來自腫瘤相關或疾病相關抗原的胜肽(「免疫原性胜肽」)可導致體外或體內T細胞反應。
基本上，任何能與MHC分子結合的胜肽都可能充當一個T細胞表位。誘導體外或體內T細胞反應的前提是存在具有相應TCR的T細胞並且不存在對該特定表位的免疫耐受性。因此，TAA是腫瘤疫苗研製的起點。辨識和表徵TAA的方法基於對患者或健康受試者CTL的使用情況，或基於腫瘤與正 常組織胜肽之間差別轉錄特性或差別表現模式的產生(Lemmel et al.450-54；Weinschenk et al.5818-27)。然而，對腫瘤組織或人腫瘤細胞株中過量表現或選擇性表現的基因的辨識並不提供在免疫療法中使用這些基因所轉錄抗原的準確資訊。這是因為，有著相應TCR的T細胞必須要存在而且對這個特定表位的免疫耐受性必須不存在或為最低水平，因此，這些抗原的表位只有一部分適合這種應用。因此，只選擇那些蛋白過量表現或選擇性表現的胜肽，並且這些胜肽是與可找到對抗性功能性T細胞的MHC分子結合在一起被呈現，這一點非常重要。這種功能性T細胞被定義為在以特異性抗原刺激後能夠克隆地擴展並能夠執行效應子功能(「效應子T細胞」)的T細胞。
考慮到治療癌症相關的嚴重副作用和費用，迫切需要更好的預後和診斷方法。
本文所用「胜肽」這一術語，系指一系列胺基酸殘基，通常透過相鄰胺基酸的α-氨基和羰基之間的胜肽鍵來連接。這些胜肽的長度較佳為9個胺基酸，但長度可短至8個胺基酸，以及可長至10、11、12、13或14個胺基酸長度。
本文使用的術語「寡胜肽」是指一系列胺基酸殘基，通常透過相鄰胺基酸的α-氨基和羰基之間的胜肽鍵來連接。寡胜肽的長度對於本發明來說並不十分關鍵，只要在寡胜肽中保持正確的表位即可。通常，寡胜肽長度約小於30個胺基酸殘基，約長於14個胺基酸。
「多胜肽」這一術語是指一系列胺基酸殘基，通常 透過相鄰胺基酸的α-氨基和羰基之間的胜肽鍵來連接。多胜肽的長度對於本發明來說並不十分關鍵，只要保持正確的表位即可。與術語胜肽或寡胜肽相對，「多胜肽」這一術語是指包含多於約30個胺基酸殘基的分子。
胜肽、寡胜肽、蛋白質或編碼此類分子的核苷酸如果能誘導免疫反應，則具有「免疫原性」(因此是本發明中的一種「免疫原」)。在本發明的情況下，免疫原性的更具體定義是誘導T細胞反應的能力。因此，「免疫原」是一種能夠誘導免疫反應的分子，並且在本發明的情況下，是一種能誘導T細胞反應的分子。
T細胞「表位」要求的是一種結合至MHC I類受體上的短胜肽，從而形成一種三元複合體(MHC I類α鏈、β-2-微球蛋白和胜肽)，其可以透過T細胞負載匹配T細胞受體與具有適當親和力的MHC/胜肽複合物結合來辨識。結合至MHC I類分子的胜肽的典型長度為8-14個胺基酸，最典型的長度為9個胺基酸。
在當前的描述中，以癌症為例對本發明進行說明。然而，只要各自的免疫應答是涉及MHC I類分子的應答，則本發明的方法也可以應用於感染性疾病、自體免疫疾病和寄生蟲感染。
下列實施例將進一步對本發明進行說明，但是，不僅限於此。在隨附的圖和序列表中， 第1圖：顯示了根據本發明的實驗方法的一般示意圖 概述。
第2圖：顯示了TUMAP混合物與表1每TUMAP 10fmol的比較MS分析。每個胜肽導致不同的MS信號，顯示胜肽依賴性檢測能力。胜肽5未在表1中列出，即表1中序列1-4對應於第2圖中的第1-4項，表1中序列5-11對應於第1圖中第6-12項。
此外，第2圖中的胜肽19、21和22未在表2中列出，即第2圖中序列13-18對應於表2中的第12-17項，第2圖中序列20對應於表2中的第18項，第2圖中序列23-28對應於表2中的第19-24項。
第3圖：顯示了內部標準方法的原則。校準曲線由TUMAP同位素標記版本(淺灰色示出)的滴定產生。對於所有的MS測量值，TUMAP內標胜肽(暗灰色示出)另一同位素標記版本的恒定量摻入MS取樣。校準曲線函數根據MS信號的比值用邏輯回歸法來計算。LLOQ用目視檢查法決定，並考慮與線性的偏差。「定量取樣」(以綠色示出)表示選擇用於TUMAP數量絕對定量的腫瘤取樣中測得的信號強度。
第4圖：顯示了選擇用於絕對定量的HLA-A*02 TUMAP的校準曲線。每個圖表中包括了用於每個細胞絕對TUMAP數量(「定量取樣」)分析的腫瘤組織取樣中各TUMAP的MS結果。
第5圖：顯示了選擇用於絕對定量的HLA-A*02 TUMAP的其他校準曲線。每個圖表中包括了用於每個細胞絕對TUMAP數量(「定量取樣」)分析的腫瘤組織取樣中各 TUMAP的MS結果。
第6圖：顯示了選擇用於絕對定量的HLA-A*24 TUMAP的校準曲線。每個圖表中包括了用於每個細胞絕對TUMAP數量(「定量取樣」)分析的腫瘤組織取樣中各TUMAP的MS結果。
第7圖：顯示了選擇用於絕對定量的HLA-A*24 TUMAP的其他校準曲線。每個圖表中包括了用於每個細胞絕對TUMAP數量(「定量取樣」)分析的腫瘤組織取樣中各TUMAP的MS結果。
第8圖：顯示了所分析的所有TUMAP的MS反覆測量值的估計變化。每個點表示一個特定組織取樣個體TUMAP MS複製的變異係數(CV，%)。所有TUMAP的中值CV被認為MS複製操作的平均變異。
第9圖：顯示了胜肽MHC分離的效率。對於胜肽MHC分離的效率，A*02 TUMAP在8個A*02陽性取樣中決定(A)，A*24 TUMAP在6個A*24陽性取樣決定(B)。平均來說，對於分離效率，A*02 TUMAP變化為24%，A*24 TUMAP為32%(C)。
第10圖：顯示了DNA含量分析的評價方法。A.給定DNA量細胞計數插補三種不同方法比較：使用來自腫瘤細胞系(深灰)、來自健康供體PBMC(灰色)並使用人二倍體基因組理論重量(淺灰色)繪製的標準曲線。生物學複製，即來自相同腫瘤不同部分的獨立組織溶解液製備品(以灰色突出顯示)。B.PBMC標準曲線繪製圖，其用於決定TUMAP絕 對定量中分析組織取樣的總細胞計數。
第11圖顯示了固體、冷凍組織取樣細胞計數的測定。A*02-和A*24陽性腫瘤取樣的細胞計數分析(A)和細胞計數分析估計變異(B)。生物學複製用灰色突出顯示。
第12圖顯示了HLA-A*02 TUMAP的每細胞胜肽拷貝數的結果。分析了八種不同GC腫瘤，其中三種重複(生物重複進行群組，並以灰色突出顯示)。LLOQ指一種MS實驗中的定量範圍，並外推至一種取樣和TUMAP特異性LLOQ，即一種特定TUMAP特定取樣的可定量最低拷貝數(以灰色示出)。
第13圖顯示了HLA-A*02 TUMAP的每細胞胜肽拷貝數的其他結果。分析了八種不同GC腫瘤，其中三種重複(生物重複進行群組，並以灰色突出顯示)。LLOQ指一種MS實驗中的定量範圍，並外推至一種取樣和TUMAP特異性LLOQ，即一種特定TUMAP特定取樣的可定量最低拷貝數(以灰色示出)。
第14圖顯示了HLA-A*24 TUMAP的每細胞胜肽拷貝數的結果。分析了六種不同GC腫瘤，其中三種重複(生物重複進行群組，並以灰色突出顯示)。LLOQ指一種MS實驗中的定量範圍，並外推至一種取樣和TUMAP特異性LLOQ，即一種特定TUMAP特定取樣的可定量最低拷貝數(以灰色示出)。
第15圖顯示了HLA-A*24 TUMAP的每細胞胜肽拷貝數的其他結果。分析了六種不同GC腫瘤，其中三種重複(生 物重複進行群組，並以灰色突出顯示)。LLOQ指一種MS實驗中的定量範圍，並外推至一種取樣和TUMAP特異性LLOQ，即一種特定TUMAP特定取樣的可定量最低拷貝數(以灰色示出)。
第16圖顯示了在MHC/胜肽單體製備中使用500fmol遊離胜肽測試取樣進樣的影響。分析中游離胜肽對所示的胜肽無實質性影響。
第17圖顯示了使用Qubit HS(螢光)與標準曲線的DNA分離再現性測試的結果。取樣(癌組織取樣，如NSCLC)顯示出足夠的同質性。從3 X 50μl等分取樣中分離DNA。
SEQ ID No.1至24顯示了表1和表2中根據實施例選定用於絕對定量的胜肽。
以下實施例描述了在TAA/癌症情況下的發明方法。本發明不僅限於這些實施例，因為他們僅僅是本發明的一個較佳實施方案。考慮到本發明的目的，文中引用的所有參考文件透過引用的方式併入在本文中。
實體腫瘤取樣中每個細胞的TUMAP拷貝數定量需要(子)定量
a)分離的TUMAP，b)分離期間TUMAP的損失，以及c)所分析的組織取樣細胞計數。
第1圖中提供了根據本發明所述實驗方法的概述。
nanoLC-MS/MS胜肽定量
為了透過質譜法準確定量胜肽，首先需要學習胜肽量和MS信號胜肽特異性相關性的基礎知識。例如，每胜肽10fmol胜肽混合物的MS測定值顯示，MS信號存在較大的胜肽特異性差異(第2圖)。這也暗示了MS可靠量化胜肽的範圍取決於個體的胜肽特性。
此外，只能在一定範圍內預期特定胜肽的量和MS信號之間線性相關。因此，發明人決定每種胜肽的個體校準曲線。選定的每個校準曲線的範圍可不僅反映胜肽的個體定量範圍，而且也可反映先前分析的腫瘤取樣中每種胜肽的MS信號範圍。目標是，每個校準曲線應包含至少80%一般取樣的胜肽特異性MS信號範圍。
精確校準曲線的產生需要合成標準，其必須用採用一種獨立的方法進行定量，並與天然TUMAP具有相同的特性 。發明人使用了雙同位素標記版本的TUMAP，即TUMAP合成期間納入2個同位素標記的胺基酸。根據標記的胺基酸，雙標記版本可採用12-18道爾頓的品質差異與天然TUMAP區分。除了品質外，同位素標記不會改變MS中胜肽的性質，即，具有相同序列但不同同位素標記的胜肽MS信號強度相同(Anderson et al.,2012)。合成後，雙標記TUMAP透過氮分析法精確定量，以得出胜肽量和MS信號之間的精確相關性。
校準曲線用至少三種不同的矩陣繪製，即，來自於類似於一般MS取樣的天然取樣的HLA胜肽洗脫液，並且每個製備品以重複MS運行進行測量。為了補償MS運行之間的任何技術變化，內標胜肽被納入所有的測量中。對滴定胜肽與固定內標物MS信號的比例進行作圖，並且校準曲線採用邏輯回歸進行計算(第3圖)。定量下限(LLOQ)採用目視法決定，並考慮與線性的偏差。如果線性偏差不明顯，如：胜肽FAP-003(第4圖)，在使用最低胜肽量的平均比值來計算LLOQ。定量上限，即在較高濃度時線性偏差，在任何校準曲線上均未達到。
在實際定量實驗中，相同量的內標物被加入各取樣中以作出校準曲線，並計算天然胜肽與內標胜肽的比率。這種「內部標準法」是基於MS蛋白質定量的一種常用方法，例如，用於生物取樣的生物標誌物分析(Sturm et al.,2012；Prasad and Unadkat,2014；Sato et al.,2012)。對於選定絕對定量的所有TUMAP，校準曲線和實際腫瘤取樣中測得的值，示於第4圖和第5圖(HLA-A*02)以及第6圖和第7圖(HLA-A*24) 中。
為了估計定量MS測量值的變化，計算了每個MS取樣胜肽含量的變異係數(CV，%)。對每個MS取樣的CV進行作圖，並且MS測量值的整體變化估計為中值CV(第8圖)。
胜肽/MHC分離的效率
對於任何蛋白質純化程序，來自組織取樣蛋白的分離與相關蛋白的一定損失相關聯。為了決定TUMAP分離的效率，針對選定為絕對定量的所有TUMAP產生了胜肽MHC複合物。為了能夠區別天然胜肽MHC複合物與加樣物，使用了單同位素標記版本的TUMAP，即TUMAP合成期間引入1個同位素標記的胺基酸。這些複合物被摻入新製備的組織裂解物中，例如，在TUMAP分離程序中最早可能時間點，然後在之後的親和純化中像天然胜肽MHC複合物被獲取。因此，測量單標記TUMAP的恢復可得到個體TUMAP分離效率相關的結論。
分離效率在被選作絕對TUMAP定量的13個取樣(7個HLA-A*02陽性取樣、5個HLA-A*24陽性取樣和1個HLA-A*02/A*24雙陽性取樣)中進行了測定。8個A*02陽性取樣進行了A*02 TUMAP分離效率分析，6個A*24陽性取樣進行了A*24 TUMAP分離效率分析(第9圖A、B)。結果表明，在不同組織取樣中，大部分胜肽的分離效率相當。與此相反，個體胜肽之間的分離效率不同。這表明，分離效率雖然只在有限數量的組織取樣中進行測定，但可外推至任何其他組織製備品中。但是，由於分離效率不能從一種胜肽外推至其他胜肽，因此，有必要單獨分析每個TUMAP。
在少數情況下，對於胜肽NCAPG-001，分離效率不切實際的高及/或變化強烈(第9圖A)。分離效率例如由於定量胜肽依賴性困難無法決定(例如，胜肽CCNB1-002、ASPM-001的高LLOQ水平)或分離效率經計算高於100%的情況下，發明人假定分離效率為100%。這是一種保守的方法，其中最有可能高估了分離效率，從而最終導致低估了每個細胞的胜肽拷貝量。
為了估算TUMAP分離效率的變化，繪製了來自6-8個取樣的個體TUMAP分離的變異係數(CV，%)(第9圖C)。整體來說，A*02 TUMAP的平均偏差為24%，A*24 TUMAP為32%。
固體、冷凍組織中細胞計數的測定
用於計算每個細胞胜肽拷貝數的另一個關鍵因素是用於TUMAP分離組織取樣的總細胞計數的估計值。發明人決定使用DNA含量分析法，因為此方法適用於不同來源的廣泛取樣，而最重要的是，冷凍取樣(Forsey and Chaudhuri,2009；Alcoser et al.,2011；Alcoser et al.,2011；Silva et al.,2013)。
考慮腫瘤內的異質性，有必要決定來自代表用於TUMAP分離的完整組織取樣的組織片段的細胞計數。TUMAP分離期間製備的組織裂解液進行DNA分析的合適取樣，因為它相比於固體組織片段更均勻。DNA分離後，用基於螢光的測定法對總DNA濃度進行定量(Life Technologies公司，Qubit HS DNA分析法)並計算取樣的總DNA含量。
為了計算來自給定DNA量的細胞數，發明人考慮了 兩種不同的方法：首先，細胞數可使用人類基因組的理論品質(被估計為每二倍體基因組約6.67 pg DNA)進行計算(Alcoser et al.,2011；Konigshoff et al.,2003)。另外，可使用含已知細胞數的取樣以採用組織取樣同樣的方法來繪製DNA標準曲線。這種方法已補償了DNA分離和定量程式的任何影響，從而提高了我們結果的準確性。發明人繪製了兩個不同的標準曲線，一個來自七種不同腫瘤細胞系和另一個來自六個不同健康供體的外周血單個核細胞(PBMC)。
為了比較所有三種評價方法(理論DNA品質和兩種不同基於細胞的標準曲線)，計算了幾個取樣的每1g組織的細胞數(第10圖A)。與使用PBMC標準相比，使用細胞系標準的計算導致細胞計數大大降低(最大3.6倍的低估。這是預期情況，因為考慮到與健康二倍體PBMC相比，腫瘤細胞系常常非整倍體細胞比例更高且DNA含量較高。在文件中，不同研究中二倍體胃腫瘤的比例為25-67%(Hiyama et al.,1995；Tamura et al.,1991；Wiksten et al.,2008；Zhang et al.,2005；Sugai et al.,2005)。由於組織取樣的倍性和非整倍體細胞的分數未知，因此，這兩種標準曲線可能只對真實細胞計數提供估計，但沒有考慮個體組織取樣的所有特性。變化的另一個來源是組織取樣的未知增殖狀態或壞死細胞的存在。特別是，增殖細胞中DNA含量的倍增增加了相對於細胞數的DNA量，並因而導致細胞計數計算值的偏差。在兩種正常胃組織取樣中，發明人用三種方法均計算出每1g組織相較於腫瘤取樣，細胞數較低。
作為一種保守方法，發明人決定使用PBMC標準曲線(第10圖B)，這可能會導致過高估計超二倍體組織取樣部分中的細胞計數，從而低估此類取樣中每個細胞的胜肽拷貝數，但決不應過高估計任何取樣中每個細胞的胜肽拷貝數。
為了分析選定作為絕對TUMAP定量的組織取樣，發明人從2-3等份組織溶解液中分離出DNA，並且採用基於螢光的測定法以2-3次複製定量每種DNA製備品。使用PBMC標準曲線(第11圖A)根據DNA含量計算總細胞數和每1g組織的細胞計數。為了獲得細胞計數分析的整體變化的估計值，首先在每個取樣的水平或如果可行用生物複製物(即來自相同腫瘤不同部分的獨立組織裂解製備液)測定變異係數(%)。該計算考慮到了組織裂解液的等分試樣之間的變化以及螢光測定法重複測量值之間的變化。這些CV示於第11圖B中，整體變化決定為所圖示CV的中位數。變化可部分地由以下事實進行說明：組織裂解物並非完全均質化，即含有未解離細胞的剩餘組織顆粒導致個體分離複製物細胞計數較高(例如，參見第11圖A的GC816T)。
每細胞的胜肽拷貝數
採用nanoLC-MS/MS運行中胜肽定量資料(「總胜肽」)，TUMAP分離效率(「分離效率，%」)以及每個腫瘤取樣可用的細胞計數，能夠根據以下公式計算每個細胞的TUMAP拷貝數：總胜肽的量根據2-4個nanoLC-MS/MS實驗結果使用第4圖至第7圖中所示的校準曲線計算(「胜肽/運行[fmol]」 )。
(total peptide：總胜肽量；peptide：胜肽；run：運行；peptide eluate：胜肽洗脫物：MS sample per run：每次運行MS樣本；% of lysate used for TUMAP isolation：用於TUMAP分離的裂解液%)
只有使用校準曲線定義高於LLOQ的MS測量值用於絕對胜肽拷貝數的計算。此LLOQ是指nanoLC-MS/MS實驗中的TUMAP量(「LLOQ/運行[fmol]」)。
可量化的所有胜肽每個細胞的拷貝數從每個細胞50至30000的拷貝數(見表3)。
為了使「每個細胞胜肽拷貝數」背景下的LLOQ可視，使用上面所示的兩個公式計算每個取樣中每個TUMAP的「每個細胞的LLOQ」。由於取樣的總細胞計數不同，每個取樣的每個細胞LLOQ不同(A*02 TUMAP參見第12圖和第13圖，A*24 TUMAP參見第14圖和第15圖)。
絕對TUMAP定量誤差估計
為了估計絕對TUMAP定量的變化，發明人考慮了以下三個主要實驗結果的相對變化：
a)分離TUMAP的數量：相對偏差1.8%(A*02)和2.1%(A*24)
b)TUMAP分離的效率：相對偏差24%(A*02)和32%(A*24)
c)組織取樣的細胞計數：相對偏差27%
假定變數值為正態分佈，「每個細胞拷貝數」的相對誤差(σ)可計算為每個變數的二次相對誤差總和的平方根：
根據上面提供的值，每個細胞絕對胜肽拷貝數的變異係數HLA-A*02胜肽約為36%，HLA-A*24胜肽約為42%。為 了提供結果變化的影響，計算了模型胜肽和取樣的每個細胞胜肽拷貝數的絕對和相對誤差(表4)。
該模型計算表明，對於絕對定量複雜的多步驟分析，結果的變化仍在可接受的範圍內。對於個體TUMAP，相對誤差可能偏離此處算出的平均誤差。每個細胞的TUMAP拷貝數可在不同TUMAP之間進行定量比較，從而最佳化TUMAP以選擇合適的抗體及/或可溶性T細胞受體靶標。
TUMAP定量方法與已發表方法的比較
以前未曾顯示每個細胞MHC相關胜肽拷貝數絕對定量的準確方法。最重要的是，先前發表的使用MS分析定量 MHC結合胜肽的方法沒有考慮取樣製備程序中的抗原損失(Tan et al.,2011；Hogan et al.,2005)。Peter A.von Velen小組最近發表了「MHC結合胜肽準確定量」的一種方法(Hassan et al.,2014)。在此技術說明中，一種方法被用來量化EBV-LCL JYpp65細胞上的兩種小組織相容性抗原-LB-NISCH-1A和LB-SSR1-1S。但是，各個實驗步驟大不相同，總結於下表：
Hassan等人分析的兩種胜肽拷貝數在生物複製物中每個細胞為800至5300(相對偏差74%)和3000至12000(相對偏差60%)拷貝。這種偏差的原因沒有明確討論，但可能是由於使用不同的MS儀器所致。
總之，本發明中改良的方法預期有助於得出更準確和可靠的結果。
低拷貝數胜肽的定量
為了顯示本發明方法的功效，產生了如下表中呈現的資料。胜肽經決定只有非常少量的拷貝數存在，在他們之中有胜肽PDE11-001。由此可以看出，該方法可測定少至每個細胞約10個拷貝的胜肽。
表6：低拷貝數胜肽的定量PC-攝護腺癌-序列PDE11-001為ALLESRVNL(序列
PDE11-001是一種源自磷酸二酯酶11A(PDE11A)的HLA-A*02結合胜肽，其催化cAMP和cGMP的水解，從而下調各信號通路。PDE11A突變與腎上腺皮質增生以及家族性睾丸生殖細胞腫瘤相關聯。該胜肽在攝護腺癌取樣上檢測到，也在肝細胞癌、胰腺癌和腎細胞癌中檢測到，並且不能在任何正常組織中檢測到。
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Claims (13)

  1. 一種細胞上的至少一種MHC胜肽配體的絕對定量方法，該方法包括以下步驟：a)製備呈現來自包含細胞的一生物取樣的該至少一種MHC胜肽配體的細胞，b)測定步驟a)製備的細胞數，c)添加已知量待量化的該至少一種胜肽-MHC配體及/或胜肽-MHC配體複合物至步驟a)的製備品(「加樣(spiking)I」)，d)分離來自步驟c)的製備品的至少一種MHC胜肽配體，以獲得一胜肽洗脫物，e)添加已知量待量化的該至少一種MHC胜肽配體至該胜肽洗脫物(「加樣II」)，f)對該至少一種MHC胜肽配體進行質譜分析，以產生至少一個aa)用於步驟d)中分離效率的信號，bb)步驟e)中添加的已知量的該至少一種MHC胜肽配體的信號，及cc)來自步驟a)的製備細胞的該至少一種MHC胜肽配體的信號，以及；g)基於步驟f)中獲得的信號與下列各者的比較來定量該至少一種MHC胜肽配體：aa)獲得的細胞計數， bb)步驟c)中添加的待量化的已知量的該至少一種胜肽-MHC配體及/或胜肽-MHC配體複合物，及cc)步驟e)中添加的待量化的已知量的該至少一種MHC胜肽配體，藉此實現了細胞上至少一種MHC胜肽配體的絕對定量。
  2. 如請求項1所述的方法，其中該至少一種MHC胜肽配體選自腫瘤相關胜肽(TAA)或疾病相關胜肽(DAA)。
  3. 如請求項1或2所述的方法，其中該包括細胞的生物取樣選自組織取樣、血液取樣、腫瘤取樣或受感染組織取樣。
  4. 如請求項1至3任一項所述的方法，其中製備細胞包括組織的酶分解及/或細胞溶解。
  5. 如請求項1至4任一項所述的方法，其中該細胞計數使用選自計數細胞核、光度DNA測定法、螢光DNA測定法或定量PCR的方法來進行測定。
  6. 如請求項1至5任一項所述的方法，進一步包括測定在步驟a)的製備品中至少一種類型HLA分子的量。
  7. 如請求項1至6任一項所述的方法，其中添加的至少一種MHC複合物及/或添加的至少一種MHC胜肽配體被標記，較佳 被同位素差異性標記。
  8. 如請求項1至7任一項所述的方法，其中分離包括層析，例如親和層析。
  9. 如請求項1至8任一項所述的方法，進一步包括選擇用於分析的過量呈現、過量表現及/或腫瘤特異性MHC胜肽配體。
  10. 如請求項1至9任一項中所述的方法，其中該方法能夠在高通量的基礎上被執行或在高通量的基礎上執行。
  11. 如請求項1至10任一項所述的方法，其中該方法由所示步驟組成。
  12. 如請求項1至11任一項所述的方法，其中該生物取樣源自一個個體或有相同病症的一群個體。
  13. 如請求項12所述之方法，進一步包括基於量化的該MHC胜肽配體來產生個人化MHC配體圖，較佳為個人化疾病特異性MHC配體圖的步驟。
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