JP4336198B2 - 細胞の選択、および／または定性および／または定量検出のための方法および診断キット - Google Patents

細胞の選択、および／または定性および／または定量検出のための方法および診断キット Download PDF

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Description

本発明は、サンプルにおける細胞の選択、および/または定性および/または定量検出のための方法および診断キットに関する。このタイプの検出法および診断キットは、腫瘍疾患の診断および治療コントロールにおいて特に必要とされている。癌前-または後-治療の領域において、血液中の転移腫瘍細胞の発生を用いて、適当な時点で悪性腫瘍または再発性の悪性腫瘍を検出できることが非常に重要である。本方法および本診断キットは、しかし、ここにおいて用いることができるのみならず、生物細胞を含むサンプル中の異常な細胞を検出および認識するために、非常に基礎的に用いることもできる。本発明は、例えば、母体血液中の胎児細胞を検出するためにも、または幹細胞を同定するためにも行うことができる。
精巣癌は、男性における、腫瘍の全悪性新形成の2％未満を構成する原因である。明らかに、40歳未満の男性の全癌疾患の20-30％が、精巣癌に関係する。例えば、ドイツ連邦共和国における毎年の新たな疾患数は、約3,600であり、およそ240人の男性が精巣癌で死亡している。それによれば最高の発症は、25歳〜40歳に見出される。腫瘍学的治療の進歩により、今日、全てのこれらの患者の90％以上が、長期間にて、治療され得る。これに関し、高い生存率は、シスプラチナムに基づく化学治療の際立った有効性に基づくものである。
女性において腫瘍疾患が確認される場合、乳癌が最も頻繁に認められる診断結果である(全新疾患の26.4%である)。初期の検出、治療、およびアフターケアについてなされている非常な努力にも関わらず、この疾患は、今だ、女性における死亡の、癌が関連する原因の主要な位置に位置づけられている。西洋工業国における該疾患の数は、初期の検出に関する努力がますますなされているにも関わらず、過去の数年においてさらに増加してきている。問題は初期治療後の高い転移率であるが、これは、症例の大部分において、1-3年後に患者の死亡をすでに導いている。これに関する主な原因は、腫瘍の進行の初期段階における腫瘍細胞の播種である。乳癌の初期検出に加えて、これが、特に転移細胞をできるだけ早い時期に同定し得ることが、なぜ治療において成功を収めるのに非常に重要であるかの理由である。同様に、患者が化学治療か手術のどちらで治療されなければならないかの決定がされなければならない場合に、臨床段階１において、決定的にネガティブな検出が役立ち得る。
結腸一次腫瘍の症例において、切開後の腫瘍の進行は、主に、残っている腫瘍細胞が原因である。これらの細胞は、手術前または手術中に一次腫瘍から切り離されたものであり、全生物体における播種の可能性を持つ。
結腸癌の初期検出に加えて、特に転移細胞を最も初期に検出し得ることが、治療が成功を治めるのに非常に重要である。
これに関して、治療が永久的に成功を治めるには、化学治療および/または手術のいずれを受けなければならないかを疾患の臨床段階１に決定することが必要である。転移の確かな検出はなされないのだが、多数の患者がこれにより化学治療で治療される。純粋な測定に基づくコンセプトにおいては、しかし、症例の25％において再発し、一部死亡を伴う。
現在用いられる試験法の場合、癌患者の症例においてはいわゆる腫瘍マーカーをタンパク質レベルで(免疫学的または酵素的に)、血液または他の体液において定量測定する。これらの検出法は、しかし、体液中の増加した腫瘍マーカー値は、例えば、胃腸管の炎症、肝硬変、ウイルス感染、またはヘビースモーキングなどの非腫瘍疾患によっても生じる可能性があるために、腫瘍の症例における腫瘍の診断または治療コントロール/アフター-ケアのためのコンディショナル方法に適しているのみである。
腫瘍細胞の静脈血への横断が転移プロセスの開始時に起こり得るので、分子遺伝学的方法が、抹消血において腫瘍細胞を検出するのに有用であると考えられる。
EP0520794B1は、転移を体組織または体液中で検出するこのような方法を開示する。核酸が、例えば、ポリメラーゼ鎖反応による複製を用いて検出される。該方法は、現在のところ、検出される核酸配列が腫瘍の元の組織の細胞、即ち腫瘍細胞において、およびマーカーに依存して元の組織の健康な細胞においても発現されるという事実に決定的に基づく。その組織が試験されるこれらの細胞において、通常はこの配列が発現されないということが、さらなる条件である。それゆえ、対応する配列が試験サンプルで見出されたならば、これは、遠位の腫瘍の、運搬された細胞、すなわち転移細胞起源のはずである。つまり、この方法は、健康な人の血液サンプルに生じるはずのない細胞の検出に、究極的には基づくものである。
転移段階において化学治療を行った後の残余腫瘍の悪性潜在性の評価に関する場合、現在用いられる診断法は非常に不正確であることが、総じて強調されなければならない。適当な時点での種々の主要な治療上有効な治療オプションへの分類を可能とする、潜伏性または残余性転移の指標を見出すことが、それゆえ必要である。ここにおいて、検出すべき細胞、例えば抹消血中に腫瘍細胞が非常に少数でしか生じないことが、実際上の問題である。
当該分野のこの状況から始まって、簡単な、信頼できる、および反復可能な方法で、生物細胞を含んでいるサンプルにおいて、異常な生物細胞を高い感受性および特異性で選択および/または検出することができる方法および診断キットを提供することが、本発明の対象である。
この方法は、請求項１記載の方法により、および請求項２９記載の診断キットにより達成される。本発明記載の方法および本発明記載の診断キットに関する有利な開発事項は、各従属請求項に示す。
本発明による方法において、まず、選択または検出すべき細胞を、抗体または抗体誘導体の組み合わせを用いて、または二特異的抗体または抗体誘導体によりマークすることがここで重要である。結果として、特に探索する細胞をマークする、分離する、およびそれゆえ濃縮することが可能となる。これは、組み合わせの免疫学的検出または選択を、最初のステップにおいて行うことを意味する。本願中、抗体誘導体により、例えば、一本鎖抗体、抗体フラグメント、FABフラグメントなど、または組み換え抗体などの、結合部位を有する改変された抗体または抗体フラグメントのあらゆるタイプがあることが理解される。「抗体」を以下において記載する場合、抗体および/または抗体誘導体を常に意味する。
第２ステップにおいて、少なくとも１つのマーカーを、検出試薬の予め規定された組み合わせを用いて、分子生物学に基づき検出するが、ここで、該マーカーは探索される細胞に特異的であり、後者において選択的に見出され得、結果的に、再び探索される細胞が特異的に選択される。これはそれゆえ、組み合わせ分子生物学的検出に関する。本発明の基本的概念は、それゆえ、免疫学的パラメータの組み合わせによる検出を分子生物学的パラメータの組み合わせによる検出と組み合わせることである。驚くべきことに、非常に優れた検出結果が結果として得られ、それと共に、当該分野の水準から公知の全方法に対してこれまで達成できなかった進歩が、検出の分野でなされる。それゆえ、５ml当たり２細胞を下る、血液サンプル中の探索細胞濃度を検出することができる。このタイプの特異性および感受性は、当該分野の技術水準において、これまで達成されていない。
真核生物は、その細胞表面上に多様な異なる分子を有する。個々の細胞の起源および機能に対応して、発現される表面分子の組み合わせは異なり、その結果、細胞タイプ-特異的パターンが生じる。抗体を用いて、これらの細胞タイプ-特異的パターンが検出される。抗体は、高い特異性でその抗原に、即ち、選択される表面分子に結合する。この特性を用いて、特異的抗体結合を用い、細胞特異的パターンを用いて、細胞を見分け、およびそれらを互いに区別する。
例えば、腫瘍細胞の特異的表面タンパク質の発現は、この細胞タイプの非形質転換細胞とは異なる。
標的細胞の選択を、探索される細胞への種々の抗体の結合によるマーカーの検出の前に行う。特定の表面タンパク質の発現により、１つのタイプの細胞が他のタイプの細胞と区別されるがゆえに、例えば、特定の表面タンパク質の発現により、腫瘍細胞がこの細胞タイプの非形質転換細胞から区別される。
例えば腫瘍細胞の場合、表面抗原の特定のパターンは血液細胞に典型的なパターンとは異なるので、血液中の腫瘍細胞を区別することができる。特定の表面タンパク質を特異的に認識する抗体を道具として用いて、腫瘍細胞を同定する。特異的抗体結合を、種々の分析および分離法のために用いる。
その表面エピトープによる細胞の検出に加えて、この目的のために特に選択される免疫グロブリンの強い結合により、非検出細胞からの検出細胞の選択が可能である。
種々の分離法が可能である。
１.液相に基づく分離法：例；フローサイトメトリー：
フローサイトメトリー分析に関しては、抗体を蛍光着色剤と結合させる。単離細胞に、一定の液流にて個々に光源(レーザー)を通す。細胞を照射すると、抗体に結合した蛍光着色剤が励起し、特定の波長の光を放射する。放射光を検出し、測定されたシグナルをディジタル形態で保存する。光シグナルにより、個々の細胞を指定することができる。抗体でマークされた細胞をこうして検出し、他の細胞から分離することができる。分離に関しては、細胞は最少の滴へと単離される。抗体でマークされた細胞の検出後、対応する滴を収集容器へと入れる。このタイプの濃縮は、例えば、FACSフローサイトメトリーにより行うことができる。例えば、腫瘍特異的表面タンパク質に対する蛍光マークモノクローナル抗体と共に、濃縮された細胞をインキュベートする。マークされた細胞を2回PBSにて洗浄し、その後、107個の細胞を1mlのPBSに再懸濁する。腫瘍細胞の単離に関しては、FACSヴァンテージSEフローサイトメーター(Becton Dickinson)を用いる。データの記録、装置のコントロール、およびデータの評価を、セルクエストプログラムにより行う。ソートされた細胞を1.5mlの反応容器(１mlのPBSで満たした)に移す。RNAを次いで、後に記載するごとく単離することができる。
２.固相に基づく分離法；例、磁気分離：
抗体を、磁気分離のために、擬-磁性粒子に結合させる。磁気フィールドへ擬-磁性粒子を導入後、粒子が磁気フィールドを移動する。この磁気フィールドにおける移動の間、これらの結合抗体が結合した細胞が運び去られ、他の細胞から分離される。
磁性粒子を用いる細胞の検出に関しては、抗体を、その表面上に規定数の化学的活性化部位を有する擬-磁性粒子に結合させる。結合法は、例えば、R.F. Masseyeff, W.H. Albert N. A.Staines (eds), 免疫学的分析法、Vol. 1, VCH
Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, pp 507-529中のJames P. Gosling, 固相概念および設計から公知である。分離の特異性は、抗体の特異性により決定する。標的細胞を含んでいる血液サンプルを抗体結合磁性粒子と混合し、粒子および血液を、例えば、密封容器中に位置するサンプルの「オーバーヘッドローテーション」により、または磁気フィールドを変化させることによる粒子の移動により、互いに対して移動させる。固相に結合させた、つまり安定に結合させた抗体により検出されるこれらの標的細胞は、粒子の移動に従う。結果として、細胞を結合した粒子を血液から(例えば分離容器の壁上に)取り出すことができる。この方法にて標的細胞が枯渇する血液は、他の溶液、インサイチュに残っている、磁性粒子により分離される細胞と、磁気フィールドのスイッチングオフ/除去、およびさらなる適用のために利用されるまで、交換することができる。
前記分離法に対する別法として、当該分野の技術水準からの、細胞を抗体でマークすることに基づくあらゆる他の分離法を用いることができる。
発明に従い、特定の抗体混合物を腫瘍細胞の検出のために都合よく用いる。例えば、抗体MOC-31びBer-EP4の組み合わせが、血液中の腫瘍細胞を検出するのに適している。
Figure 0004336198
前記表１の抗体混合物を用いて、腫瘍細胞が、選択的であるが、高い特異性で検出される。これは、癌細胞を他の細胞から区別する特異的表面タンパク質の選択的発現に基づく。
このタイプの抗体混合物は、細胞検出および細胞分離に関し、それぞれ別個に用いる抗体と比較して、適用される方法に依存して、増加した感受性を示す。
本発明は、実質上さらに、患者の血液中の細胞マーカーが、例えば免疫学的または酵素的レベルでは検出されないが、サンプル、例えば血液サンプル中の探索される細胞の分子生物学的マーカー、例えば、mRNA(メッセンジャーリボ核酸)は検出されるという事実に基づく。
個々のマーカーは、治療依存式に異なって発現されるので、血液中に循環している全腫瘍細胞を検出するために、腫瘍マーカーの組み合わせを都合よく試験する。結果として、特定のマーカーの発現が患者において、または疾患の段階において相対的に低い場合に、腫瘍細胞を検出することもでき、さもなくばこれは、おそらくネガティブな結果を導き得る。マーカーの使用は、しかし、単核血液細胞が、正確な分析を妨げるバックグラウンド発現(「不適切な転写」)を有するという理由のために、通常制限される。
表２に示す遺伝子の発現を、例えば腫瘍のマーカーとして検出する。検出は、１または２のマーカーに関してなすことができ、または互いの組み合わせにて、これらの腫瘍マーカーのあらゆる数に関してなすこともできる。本発明によるキットは、それゆえ、１つ、２つ、またはいくつかの選択のための、または全ての腫瘍マーカーのための、２つのオリゴヌクレオチド対を含むことができる。
Figure 0004336198
結果として、例えば他の病気に基づき腫瘍マーカーが同様に発現され、およびタンパク質として血流に生じるにすぎない全てのこれらの場合は、適切に無視する。第一の免疫学的選択段階のおかげで、一方で、それ自体血液サンプル中に存在し、および他方で、個々の腫瘍マーカーまたは腫瘍マーカーを発現する細胞のみが結果的に検出される。その結果、これは、その起源の腫瘍組織から生じ、患者の血液中に出現する腫瘍細胞に関係する。腫瘍を有しないヒトに血液中では、試験されるマーカーのmRNAは通常発現されないので、転移プロセスの初期の段階においてすでに、関連するmRNAの発生と転移の間に、直接的な関連性が明らかになる。
単一の腫瘍マーカーのmRNAを都合よく検出するだけでなく、マーカーの組み合わせを試験する。結果として、血液中に転移しているその細胞により、癌の形態を検出することが可能となる。これは、精巣腫瘍の場合には、両精液および非精液精巣癌形態、または精母細胞瘤の成分との混合腫瘍、およびそれゆえ、精巣の全悪性腫瘍、即ち、全生殖細胞腫瘍の90-95％が検出されることを意味する。
精巣腫瘍細胞の検出に関しては、以下のマーカーの少なくとも２つの組み合わせを、本発明に従い提案する。
-GA733.2
-GCAP/PLAP
-HMGI-C
-GRPR
乳癌細胞の検出に関しては、以下のマーカー群の少なくとも２つの腫瘍マーカーの組み合わせを、本発明に従い提案する。
a)EGFR、CEA、スタニオカルシン、MAGE 3、CK20、クラウジン7、Her-2/neu、MUC1、およびGA733.2；
b)CK20、MAGE3、およびMUC1
c)Her-2/neuおよびクラウジン7、および、
d)EGFR、CEA、およびスタニオカルシン
腸(結腸)癌細胞の検出のためには、以下のマーカー群の少なくとも２つの腫瘍マーカーの組み合わせを、本発明に従い提案する。
a)CK20、EGFR、GA733.2、CEA、およびスタニオカルシン
b)CK20、EGFR、CEA、およびスタニオカルシン、および、
c)EGFR、CEA、および733.2
本発明による方法を用いて先行技術においてすでに公知のいずれをも有意に超える検出感受性が達成されることを示すいくつかの例を、以下に示す。図１〜１０は、異なる試験プロトコルの結果を示す。
基本操作は、全実施例において共通しており、該操作は、標的細胞の免疫学的濃縮を含む第一ステップ、および免疫学的に濃縮された細胞におけるmRNAマーカーの検出の第二ステップを含む。以下に、これらのステップを、それらが全実施例に関して同様である限り、一般形態にて記載する。
１.抹消血からの標的細胞の免疫学的濃縮
まず、抹消血サンプルを採取し、規定数の標的細胞、例えば、2、10、100細胞の特定の腫瘍タイプを、それに添加した。
さらに、抗体を磁性粒子に結合させた。抗体としては、以下の表３に示す抗体を用いた。
Figure 0004336198
磁性粒子は、4×108ビーズ/ml(CELLectionTM Pan
Mouse IgGキット、Dynal Co.)の粒子濃度で用いた。抗体濃度と結合抗体の間の割合を表４に再現する。
Figure 0004336198
こうして調製した磁性粒子を、試験バッチおよび検出システムに従い血液に添加した。ml血液当たり初期濃度4×108ビーズ/ml粒子にての、対応する抗体結合磁性粒子の添加を、表５に示す。
Figure 0004336198
オーバーヘッドシェイカー中での２時間のインキュベーション後、細胞抗体磁性粒子複合体としておそらくは生じる磁性粒子を、磁性粒子コンセントレイター(MPC(登録商標)-S, Dynal Co.)を用いて、3回PBS(リン酸緩衝塩水)を用いて洗浄し、接着した細胞を次いで、後に記載するRNA単離プロトコルに従い、処理した。
磁性粒子を用いる分離に対する別法として、フローサイトメトリー(蛍光-結合細胞ソーティング、FACS)を用いる免疫学的分離を用いることができる。
腫瘍細胞の第一の相対的濃縮は、赤血球の枯渇により行う。この目的のために、全ての血液(EDTAを含む)を低張赤血球溶解バッファーと混合し、30分間室温にてインキュベートする。残る核含有細胞を遠心分離し、次いでPBS/BSAに再懸濁する。こうして得られた細胞を次いで、フルオロフォアにてマークされる抗体とインキュベートする。抗体への結合を用いて蛍光化にてマークされる標的細胞を、FACSにより分離した。
別法として、密度勾配遠心分離により濃縮することができる。種々の密度勾配を用いるこのタイプの遠心分離を用いて、異なる平均体積密度の細胞を互いに分離する。単核血液細胞を、Ficoll-Hypaque勾配(Pharmacia Co., Uppsala, Sweden)を用いて分離し、次いで２回PBS/１％FCSにて洗浄する。次いで、標的細胞の固相結合濃縮(例えば、磁性粒子による)、または液相に基づく分離(FACS)を、前記のごとく行う。
２.mRNA単離
まず、前記のごとく単離された細胞の全RNAの単離を行う。これは、製造業者の指示に従いQIAamp RNA血液Miniキット(Qiagen Co., Hilden)を用いて行い、ここで、溶解バッファーを、磁性粒子に結合した細胞に対して直接適用する。カラム上の追加のDNA消化により、ゲノムDNAでのコンタミネーションが回避される。このDNA消化は、RNAseを含まないDNAseセット、Qiagen Co., Hildenを用いて行う。
別法として、さらに、例えば、オリゴ(dT)-結合磁性粒子、Dynabeads(登録商標)mRNA(登録商標)Microキット(Dynal Co.)を用いて、mRNAの単離を行うことができる。この単離は、キットにて示される製造業者の指示に従って行う。
RNA単離に対する更なる別法として、単離細胞を、トリゾール試薬(Gibco
Co. BRL, NY, USA)の添加により溶解し、ピペットを用いてホモジェナイズする。次なるクロロホルム抽出後、RNAを含んでいる水相をイソプロパノール中に、-80℃にて沈殿させる。2回洗浄し、80％エタノールにて遠心分離した後、ペレットを空気乾燥し、次いで、RNAseを含まない水に再懸濁する。この再プロセシングステップも同様に、常套のプロトコルに従い行う。
３.逆転写
mRNAをcDNAへ転写する逆転写を、RNAの単離後に行う。
加えて、オリゴ(dt)15プライマー(Promega Co., Mannheim)を含む表６の反応バッチに従う対応する体積の水にて、5分間65℃にてRNAを変性し、次いで直接氷上にてインキュベートする。
Figure 0004336198
cDNA合成は、37℃にて1時間行い、その後、リバーストランスクリプターゼを、5分間95℃にて加熱しおよびその後氷上にて冷却することにより不活性化する。この目的のために、Sensiscriptリバーストランスクリプターゼキット、Quiagen Co., Hildenを、ここに示すプロトコールに従い用いた。
mRNAを単離するためのオリゴ(dT)−結合磁性粒子をすでに用いている場合は、オリゴ(dT)プライマーの添加は省略する、即ち、オリゴ(dT)-リンカーが逆転写のためのプライマーとして同時に役立ち、磁性粒子がバッチに残る。
４.PCR
mRNAのcDNAへの転写に次いで、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)を、内部コントロールとしてβ-アクチンを用いてなす。
表７に記載するオリゴヌクレオチドを、第一欄に示す種々のマーカー遺伝子に対応するcDNAの増幅のためのPCRプライマーとして用いた。
Figure 0004336198
Figure 0004336198
表７は、第１欄に、検出すべき腫瘍マーカーについてのデータを含み、２つのオリゴヌクレオチドそれぞれ(センスおよびアンチセンス)をプライマー対として示す。第２欄に示すプライマーにより作製されるPCR産物の長さを第三３欄に示す。PCRは、表８に示すバッチを用いて行う。
Figure 0004336198
表９は、特定のプライマーの組み合わせおよびPCRバッチ中の最終濃度としてのプライマー濃度のリストを示す。種々の腫瘍タイプ、乳癌、腸癌、および精巣癌それぞれに関する以下の例においては、例として表９に示すごとく、これらのプライマーの複数の組み合わせを示す。
Figure 0004336198
PCR条件(サイクル数、サイクルプロセスなど)を、表１０および１１に示す。
Figure 0004336198
Figure 0004336198
こうして生じたcDNAの増幅物を、バイオアナライザー2100(Agilent Co.)を用いて、電気泳動分離した。この目的のために、1μlのPCR産物を、DNAチップ(500)上でバイオアナライザーにて分離し、分離結果を電子的に記録した。図１−１０は、この方法で作製した。
別法として、25μlのPCR産物を2.5％のアガロースゲルにより分離し、次いでDNAバンドをエチジウムブロマイドで着色した。記録は、例えば、Intas CoのDUOストアシステムを用いて行う。
別法として、フラグメント分析はまた、ABIプリズム310ジェネティックアナライザー(PEアプライド バイオシステム カンパニー、Weitertstadt)を用いて行うことができる。この目的のために、１μlのPCR産物を、次いで希釈1：50にて用いる。この場合、蛍光マークされたプライマーを用いる。
ここで、図１は、血液中の乳癌細胞の検出のための、本発明による方法の結果を示す。この目的のために、規定量の乳癌細胞系統腫瘍細胞を健康な人の血液に添加した。これにより添加した細胞の数は、血液のミリリットル当たり10細胞(10c)または100細胞(100c)であった。図１Aおよび１Bはそれぞれ、電気泳動分離を示し、バンドは、ここおよび以下において、同じ用語を用いて番号づけする。コンダクターは、50-600bp長の目盛検定を示し、mRNAを含まないコントロールはRT−Koにて示し、PCR前にcDNAを含まないコントロール測定は、PCR−Koにて示す。「血液」により、インキュベートされた腫瘍細胞を含まない血液サンプルを示し、10cにより、ミリリットル当たり10個の接種腫瘍細胞を含む血液サンプルを示し、100cにより、ミリリットル当たりまたは5ミリリットル当たり100個の接種腫瘍細胞を含む血液サンプルを示す。「細胞系統」により、サンプルにおいて多細胞数の腫瘍細胞系統を用いたコントロール測定を示す。
図１に結果を示すが、ここで、選択は、以下の抗体HMPV.2、GP1.4、およびBer-EP4の1つだけ、2つ、または全3つを用いる第一ステップにおいて、行った。１つの抗体のみを用いる場合、わずかしか腫瘍マーカーCA15.3(Muc1)が検出されないことを、直接的に検出することができる。2つの抗体、即ち、HMPV.2およびBer-EP4またはGP1.4およびBer-EP4を検出に用いる場合に、最良の結果が得られる。腫瘍マーカーCA15.3に関するバンドの強度により検出することができるように、全3つの抗体の組み合わせも、より効果的である。すなわち、特定の数の特異的抗体を適当に選択して腫瘍細胞を検出する場合に、有意に改良された結果を得ることができることが確証される。複数の抗体を用いる場合に感受性が必然的に増加すると簡単に結論づけることができないことが、特に明らかである。抗体数の増加とともに、非-特異的非特異的反応が起こる可能性が増すので、逆も言い得る。抗体の適当な組み合わせを実験的に決定することが、特に重要である。
図２は検出法の結果を示す。図２Aにおいては、抗体のマーキングを用いる前選択は行っておらず、図２Bにおいては、抗体マーキングを用いる前選択を行った。図２では、抗体HMPV.2、Ber-Ep4、およびGP1.4の組み合わせを、２または全３つの抗体の組み合わせとして測定した。同時に、全４つのマーカー、即ちGA733.2、CA15.3、Her2/neu、およびさらにクラウジン7の複数の検出を行った。ここにおいても、10、100、または1000個の乳癌細胞系統の腫瘍細胞を血液中でインキュベートし、次いで検出した。抗体選択を用いない場合、mRNAマーカーのいくつかに関してバックグラウンド発現(GA733．2、CA15.3、およびHer2/neu)が検出されることが示される。このタイプのバックグラウンドは、mRNAに関して試験されるべき細胞の前選択のために、図２Bに示す抗体の組み合わせのそれぞれを用いた場合に、回避することができる。図２Bにおいては、3つの抗体の使用が２つの抗体、例えば、GP1.4とBer-Ep４の使用に対して完全に優れているわけではないことがまた、興味深い。特異的抗体の組み合わせの選択およびさらに特異的mRNAマーカーの選択により、非特異的バックグラウンドを全く示すことなく、血液１ミリリットル当たり10細胞を下る個数で対応する探索腫瘍細胞を検出することが可能となる。バックグラウンド発現を排除することができ、感受性が増した(クラウジン７に関するバンドを参照されたい。)。
図３においては、血液中でインキュベートされた精巣癌細胞系統由来の腫瘍細胞系統を用いた本発明による方法の結果を示す。ここでは、記載した抗体の１つによりマークされる腫瘍細胞の全てを、血液サンプルから選択する。次いで、試験を、全４つのmRNAマーカー(GCAP、GA733.2、GRPR、およびHGMI-C)に関して行う。Ber-Ep４などの１つの抗体のみを用いる場合は、血液1ミリリットル当たり10細胞を下る個数でのみ、マーカーHGMI-Cを用いて細胞が検出され、抗体MOC-31を用いる場合、精巣癌細胞は全く検出されないことが示される。抗体8B6に関して同じ方法を適用するが、低い感受性しか示されない。
抗体Ber-Ｅpおよび8B6の組み合わせにより、同様に、マーカーHGMI-Cを用いて不完全な検出しか導かれず、およびまた、抗体Ber-EP4およびMOC-31の組み合わせを用いても同様である。トータル3つの抗体Ber-Ep4、MOC-31および8B6にて用いる場合、全４つの試験したマーカーに関して最適の検出結果が得られ、この場合、血液１ミリリットル当たり2個を下る個数の細胞が、個々のマーカーにより、信頼性を持って検出される。2つの検出反応を用いる本発明に従い2つのマーカーを検出する場合、バックグラウンドの検出を同時に回避して、最少の細胞数に関するより信頼できる検出を、図３に関して用いられるマーカーからの2つのマーカーを選択する場合に、なすことができる。
図４は、健康な人の血液中に接種した腸癌細胞の検出を示す。ここで、抗体Ber-Ep4およびMOC-31の組み合わせの使用により、mRNAマーカーEGF-Rに対して感受性が改良されるに至ることが、直接的に示される。同時に２つの抗体を用いる場合、血液1ミリリットル当たり100個の細胞の検出感受性が得られるが、1つの抗体のみを用いる場合、感受性は、血液1ミリリットル当たり約1000細胞である。
図５は、Ber-Ep４、HMPV.2、およびGP1.4の抗体の組み合わせを用いて、抗体の少なくとも１つでマークされた細胞を選択し、次いで、mRNAマーカーGA733.2、CA15.3、Her2、およびクラウジン7に関して試験した。明らかに、ここにおいて健康な人の血液には腫瘍細胞は添加されていないが、規定量の上皮細胞は添加した。図５から直接的に理解されるように、マーカーの2つのみが、上皮細胞が非常に多数である場合にポジティブな結果を示す。
図６においては、2つの異なる乳癌細胞系統(MCF-7およびSKBR-3)の腫瘍細胞を血液サンプルに添加した。抗体Ber-Ep4、HMPV.2、およびGP1.4を、抗体としての組み合わせにおいて用いた。すぐに検出することができるように、４つのmRNAマーカー、GA733.2、CA15.3、Her2、およびクラウジン7をそれぞれ用いることによる乳癌細胞の検出が、１ミリリットルにつき個々の細胞系統１０個を確実に下る個数にて確認される。乳癌細胞を含まない血液中では、非特異的反応は生じなかった。明らかに、腫瘍マーカーGA733.2およびCA15.3は細胞系統2(SKBR-3)に関してより感受性があり、一方、腫瘍マーカーHer2は細胞系統1(MCF-7)に関してより感受性がある。つまり、乳癌細胞の個々のサブタイプを、生じるマーカーパターンを用いて互いに区別することもできる。
図７においては、異なる細胞系統の乳癌細胞、図７AにおいてはMCF-7および図７BにおいてはSKBR3を、血液中に接種した。血液サンプルから細胞を選択するための抗体としては、抗体Ber-Ep4、HMPV.2、およびGP1.4を組み合わせにて用いた。mRNAマーカーGA733.2、CA15.3、Her2、およびクラウジン7の組み合わせを用いる場合に、各場合に、少なくとも1つのマーカーが、腫瘍細胞が発現バックグラウンドを示すことなく、血液５ミリリットル当たり2個を下る個数にて、細胞とポジティブに反応することをすぐに検出することができる。ここでもまた、4つの異なるmRNAマーカーに対する２つの細胞系統の異なる反応動態を検出することができる。
しかし、両細胞系統が例えば1つの血液サンプルに存在する場合、両細胞系統の検出が、選択されるマーカーの組み合わせにより、血液5ミリリットル当たり2個を下る個数の細胞にて、確認される。即ち、血液中の乳癌細胞の検出が、乳癌細胞系統の細胞タイプとは無関係に、高い感受性で可能である。
図８は、血液中に接種された腸癌細胞の検出を示す。細胞の選択を、2つの抗体Ber-Ep4およびMOC-31を用いてなした。分子生物学的検出ステップは、mRNAマーカーGA733.2、CEA、およびEGF-Rを用いてなした。2つの腫瘍細胞が、5ミリリットルの血液中に検出された。
図９は、3つの抗体Ber-EP4、MOC-31、および8B6の組み合わせ、およびmRNAマーカー、GCAP/PLAP、GA733.2、GRPR、およびHMGI-Cの組み合わせを、精巣癌細胞を接種した血液中で用いた測定を示す。
分子生物学的マーカーのそれぞれを用いて、5ミリリットル当たり2個を下る細胞の検出が、免疫学的選択ステップにおいて、細胞の選択のために抗体のこの3つの組み合わせを用いた場合に、成功する。
図１０は、生検材料の細胞混合物からの異常な細胞の分離を最終的に示すものである。この目的のために、疑わしい一次腫瘍を有する腫瘍組織を含む乳房組織からの生検材料を機械的に単離し、細胞残渣、結合組織などからガーゼにより分離した。疑わしい腫瘍組織とその周囲の健康な組織の両細胞を含む得られた細胞混合物を、固相(抗体GP1.4、HMPV.2、およびBer-Ep4を有する磁性粒子)に結合させた抗体混合物による細胞選択物と混合し、抗原-抗体結合を得るためのインキュベーション後に、磁気的に分離する。次いで、mRNAの検出を、マーカーGA733.2およびHer2に対して行った。コントロールとして、乳癌の細胞系統を、同様に、同じ時点で平行して決定した。検出し得たごとく、生検が実際に乳癌腫瘍を含むというポジティブな検出が生じる。
「ポジティブコントロール」を含む図８および９において特徴づけられるバンドは、腸腫瘍に関する細胞系統HT29(図８)または精巣腫瘍に関するTera/1(図９)を含むサンプルに関する結果を示す。
血液中の乳癌細胞の検出のための、本発明による方法の結果を示す。 検出法の結果を示す。 血液中でインキュベートされた精巣癌細胞系統由来の腫瘍細胞系統を用いた本発明による方法の結果を示す。 健康な人の血液中に接種した腸癌細胞の検出を示す。 Ber-Ep４、HMPV.2、およびGP1.4の抗体の組み合わせを用いて、抗体の少なくとも１つでマークされた細胞を選択し、次いで、mRNAマーカーGA733.2、CA15.3、Her2、およびクラウジン7に関して試験した結果を示す。 2つの異なる乳癌細胞系統(MCF-7およびSKBR-3)の腫瘍細胞を血液サンプルに添加した結果を示す。 異なる細胞系統の乳癌細胞、図７AにおいてはMCF-7および図７BにおいてはSKBR3を、血液中に接種し、血液サンプルから細胞を選択するための抗体として、抗体Ber-Ep4、HMPV.2、およびGP1.4を組み合わせにて用いた結果を示す。 血液中に接種された腸癌細胞の検出を示す。 3つの抗体Ber-EP4、MOC-31、および8B6の組み合わせ、およびmRNAマーカー、GCAP/PLAP、GA733.2、GRPR、およびHMGI-Cの組み合わせを、精巣癌細胞を接種した血液中で用いた測定を示す。 生検材料の細胞混合物からの異常な細胞の分離を最終的に示す。

Claims (26)

  1. 生物細胞を含んでいるサンプルからのまたは当該サンプルにおける、予め決定された生物細胞の定性および/または定量検出のための方法であって、
    検出されるべき細胞に選択的に存在する別個のエピトープに対してその結合部位にて結合する少なくとも２つの抗体および/または抗体誘導体の予め決定された組み合わせ；および/または、検出されるべき細胞に選択的に存在する別個のエピトープに対して、共にその２つの結合部位にて結合する少なくとも１つの二特異的抗体および/または抗体誘導体と、サンプルを混合すること、
    少なくとも１つの抗体および/または抗体誘導体でマークされた細胞を、サンプルから分離すること、
    次いで、分離された細胞を、少なくとも２つの分子生物学的検出試薬の予め決定された組み合わせで、少なくとも２つのmRNA部分の予め決定された組み合わせの発現に関して試験し、ここで該発現は検出されるべき細胞において選択的にもたらされ、かつ、当該mRNA部分の少なくとも１つが発現されるかどうかを検出すること、
    を特徴とする方法。
  2. マークされた細胞の分離を液相または固相にて行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. サンプルから標的細胞を分離するために、固相結合抗体または抗体誘導体を用いることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. フルオロフォアでマークした抗体または抗体誘導体を用いること、およびサンプルからのマークされた細胞の分離をフローサイトメトリーを用いて行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 磁性または擬−磁性粒子に結合した抗体または抗体誘導体を用いること、およびマークされた細胞をサンプルから分離するのに、サンプルと混合後、抗体を結合した磁性または擬−磁性粒子をサンプルから磁気的に分離することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 抗体または抗体誘導体が、腫瘍細胞に結合する結合部位を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 抗体または抗体誘導体が、１つまたはそれ以上の特定の腫瘍タイプまたはサブタイプの細胞に結合する結合部位を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 特定の腫瘍タイプまたはサブタイプの腫瘍細胞または細胞を分離するために、抗体または抗体誘導体が、上皮抗原、上皮膜抗原、抗原MUC1、および/または抗原PLAPのエピトープに結合する結合部位を有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 抗体GP1.4、MOC-31、Ber-EP4、HMPV.2、8B6、E29、および131-11741の少なくとも１つを用いることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 一般の、または特定タイプもしくはサブタイプの腫瘍細胞を分離するために、抗体Ber-EP4およびMOC31、または抗体HMPV.2、GP1.4およびBer-EP4の少なくとも２つを含む抗体の組み合わせを用いることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 乳癌細胞を分離するために、抗体131-11741、GP1.4、E29、およびHMPV.2の少なくとも２つ、または抗体HMPV.2、GP1.4、およびBer-EP4の少なくとも２つを含む抗体の組み合わせを用いることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 腸腫瘍細胞を分離するために、抗体Ber-EP4およびMOC-31を含む抗体の組み合わせを用いることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 精巣腫瘍細胞を分離するために、抗体MOC-31 、Ber-EP4および8B6の少なくとも２つを含む抗体の組み合わせを用いることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 特定の腫瘍タイプまたはサブタイプの腫瘍細胞または細胞を検出するために、遺伝子GA733.2、EGFR、CEA、HER2/neu、クラウジン-7(CLDN7)、GCAP(ALPPL2)/ALPP、GRPR、HMGIC、CK20、MAGE3、MUC1、およびスタニオカルシン(STC1)の少なくとも２つの配列部分に対応するmRNA部分を含むmRNA部分の組み合わせを試験することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 特定の腫瘍タイプまたはサブタイプの腫瘍細胞または細胞を検出するために、遺伝子EGFR、GA733.2、およびHER-2/NEUの少なくとも２つの配列部分に対応するmRNA部分を含むmRNA部分の組み合わせを試験することを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 乳癌細胞を検出するために、遺伝子GA733.2、MUC1、Her-2/neu、クラウジン7、CK20、MAGE-3、スタニオカルシン、EGFR、およびCEAの少なくとも２つの配列部分に対応するmRNA部分を含むmRNA部分の組み合わせを用いることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  17. 乳癌細胞を検出するために、２つの遺伝子GA733.2およびMUC1の配列部分に対応している、２つの遺伝子Her-2/neuおよびクラウジン7の配列部分に対応している、遺伝子CK20、MAGE-3、およびMUC1の少なくとも２つの配列部分に対応している、および/または遺伝子スタニオカルシン、EGFR、およびCEAの少なくとも２つの配列部分に対応しているmRNA部分を含むmRNA部分の組み合わせを用いることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  18. 結腸腫瘍細胞を検出するために、遺伝子CK20、EGFR、GA733.2、CEA、およびスタニオカルシンの少なくとも２つの配列部分に対応するmRNA部分を含むmRNA部分の組み合わせを用いることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  19. 結腸腫瘍細胞を検出するために、遺伝子CK20、EGFR、CEA、およびスタニオカルシンの少なくとも２つの配列部分に対応する、および/または遺伝子EGFR、CEA、およびGA733.2の少なくとも２つの配列部分に対応するmRNA部分を含むmRNA部分の組み合わせを用いることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
  20. 精巣腫瘍細胞を検出するために、遺伝子ALPP/ALPPL2(GCAP)、GA733.2(＝EGP-40)、HMGI-C、GRPRの少なくとも2つの配列部分に対応するmＲＮＡ部分を含むmRNA部分の組み合わせを用いることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  21. mRNA部分を、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)、LCR、NASBA RT-PCRおよび/またはハイブリダイゼーション法を用いて増幅および/または検出することを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 分離された細胞のmRNAをcDNAに逆転写し、cDNAを増幅し、次いで検出すべきmRNA部分の存在または不在を検出することを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 増幅されたcDNAを適当な制限酵素で消化し、検出すべきmRNAの存在または不在を生じたcDNAフラグメントを用いて検出することを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
  24. 検出すべきmRNAに対応するcDNAを蛍光に基づくリアルタイム−PCRを用いて検出することを特徴とする、請求項２２または請求項２３に記載の方法。
  25. タンパク質β−アクチンのmRNAを内部コントロールとして検出することを特徴とする、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 体液、抹消血、痰、腹水、リンパ液、尿、骨髄、および生検材料から成る群から選択されるサスペンションおよび細胞混合物中の、腫瘍細胞、上皮細胞、および内皮細胞から成る群から選択される異常タイプの細胞を検出するための、および/または、羊水または母体抹消血中の胎児細胞を検出するための、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
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